CN102575237A - 合成的植酸酶变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有增强的热稳定性的合成的植酸酶，也涉及编码合成的植酸酶的分离的核酸序列，以及在动物饲料中使用该植酸酶来减少粪肥中磷酸盐的含量，和包含该合成的植酸酶的动物饲料添加剂和动物饲料。

Description

合成的植酸酶变体
技术领域
本发明涉及植酸酶、编码植酸酶的氨基酸序列和编码植酸酶的核苷酸序列、生产和使用植酸酶的方法、以及包含这些植酸酶的动物饲料。
背景技术
磷是活生物体生长的必需元素。在畜牧业中，通常必须在饲料中补充无机磷，以获得良好的生长性能。在谷物和豆科植物中，磷主要是以植酸盐的形式储存。然而，单胃动物，例如猪、家禽和鱼，不能直接吸收植酸盐或植酸，因此导致植酸盐的排泄，这意味着在进行密集家畜饲养区域中磷的过度富集。此外，通过结合例如，钙、铜或锌等金属，植酸形成对单胃动物新陈代谢造成不利影响的组合物。为了补偿这些动物中磷酸盐的不足和确保其充分生长和足够健康，需要向动物饲料中添加无机磷酸盐。该无机磷酸盐的添加花费昂贵，并会导致进一步的环境污染。通过在动物饲料中使用植酸酶，可以水解植酸盐，导致粪肥中较低含量的肌醇磷酸盐和无机磷酸盐。向动物饲料中添加植酸酶，提高了有机磷的利用度，减少由排泄的、结合于植酸的磷酸盐所导致的环境污染。在文献中，描述了大量的天然植酸酶，其不仅来源于真菌，也来源于细菌。
植酸酶，也称为肌醇六磷酸磷酸水解酶，是一类能够从植酸释放至少一个磷酸基团的磷酸酶。
EP 420 358一般地描述了微生物植酸酶的克隆和表达，WO 2006/38062描述了作为动物饲料添加剂的来源于弗氏柠檬酸细菌(Citrobacter freundii)的微生物植酸酶，WO 2007/112739描述了基于来自布氏柠檬酸细菌(Citrobacter braakii)的天然植酸酶的植酸酶和其生产及其在动物饲料中使用的方法。
在Haefner等(Haefner S.，Knietsch A.，Scholten E.，Braun J.，Lohscheidt M.和Zelder O.(2005).植酸酶的生物技术生产和应用.ApplMicrobiol Biotechnol 68：588-597)中，描述了植酸酶在人或动物营养方面上的多种已知的用途。WO2008/097620中描述了植酸酶的其它用途，例如用于在生物乙醇生产中水解生物质或淀粉。WO 2008/116878描述了来自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的植酸酶及其蛋白质序列。Zinin等(FEMSMicrobiology Letters(2004)236：283-290)公开了来自变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus)的植酸酶，其序列存在UNIPROT数据库中，登录号为Q6U677。专利申请WO 2006/043178，WO 2008/097619和WO 2008/092901描述了来自各种布丘氏菌(Buttiauxella sp.)的植酸酶。目前具有最高比活的天然植酸酶包括来自中间型耶尔森氏菌(Yersiniaintermedia)(WO2007/128160)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)(WO02/048332)的天然植酸酶。
然而，这些目前可利用的植酸酶中没有一种显示出生产动物饲料添加剂所必需的特性。目前可利用的植酸酶不具备足够的热稳定性来用于动物饲料颗粒的生产中而其活性没有显著的丧失。在动物饲料颗粒的生产中，植酸酶与其它常规动物饲料成分在高温和高湿下被挤压一起，以便作为整体来饲喂农场动物。在这种热和湿的挤压中，植酸酶活性发生大量损失。防止该活性损失的一个可能性是对植酸酶颗粒的复杂包衣，以使它们免受热的作用。这种植酸酶添加剂的包衣会由于包衣所使用的脂或聚合物而产生相当大的成本。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供具有足够的热稳定性的植酸酶，以使其能够被用于饲料颗粒的生产而不需要例如包衣等额外的保护性措施。本发明另外的目的是提供具有足够高比活的植酸酶，以使在饲料生产过程中所使用的总植酸酶的量尽可能低。本发明再一目的是提供可以在广泛的pH范围内使用的植酸酶，以使其在不同动物物种的消化道的不同pH范围内可用，以及即使在由于不同的饲料成分而导致pH范围变化的情况下也保留其活性。
这些目的通过合成的植酸酶而得到实现，所述植酸酶与SEQ ID 18的氨基酸序列具有至少70％的同一性。根据本发明的这些植酸酶具有至少63℃的最适温度和至少65℃的热稳定性，并因此适合于在饲料颗粒的生产中使用而其活性不因为造粒过程中的热湿条件而遭受显著的丧失。此外，它们具有3个以上pH单位的宽pH范围，在该pH范围内，它们保留至少50％的相对活性，因此它们能够在多种动物中使用和与不同的饲料成分一起使用，而在其活性上没有损失，并由此不会发生动物对磷酸盐的增加排泄。优选地，根据本发明的合成的植酸酶与SEQ ID 18的氨基酸序列具有至少75％、优选80％、特别优选85％、和优选90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％的同一性。
两个蛋白质序列或核酸序列之间的同一性通过needle程序(2009年10月获得的版本)计算来进行定义。Needle是可自由获取的EMBOSS程序包的一部分，其可以从网站http://emboss.sourceforge.net/上下载。使用标准参数：空位开放10.0(“空位开放罚分”)，空位延伸0.5(“空位延伸罚分”)，就蛋白质来说使用数据文件EBLOSUM62(矩阵)，就DNA来说使用数据文件EDNAFULL(矩阵)。
根据特定的实施方案，合成的植酸酶，基于SEQ ID 18的位置，在选自第1、6、12、17、84、89、92、109、137、138、140、142、143、149、156、202、205、207、208、209、228、234、243、247、248、251、255、256、261、270、304、314、320、349、356、373、382、399、402和413位中的至少一个位置上具有氨基酸的改变。在本发明的上下文中，“改变”意指SEQ ID 18中所规定的原始氨基酸序列被别的氨基酸取代。在该情况下，以传统的一字母代码来命名氨基酸。通过改变一个或多个氨基酸，可以进一步增加合成的植酸酶的热稳定性、或扩大最适pH的范围、或增加比活。
优选地，合成的植酸酶在基于SEQ ID 18的氨基酸序列中具有至少5个改变，特别地，其具有至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个和非常特别优选至少20个改变。
优选地，基于SEQ ID 18中的位置，在至少一个选自第1、6、12、17、84、89、92、109、137、138、140、142、143、149、156、202、205、207、208、209、228、234、243、247、248、251、255、256、261、270、304、314、320、349、356、373、382、399、402和413位的位置上的至少一个氨基酸，被以下氨基酸之一取代，其中，优选地，该新引入的氨基酸在第1位为N、D、Q、H；在第6位为V、I、L、T、S；在第12位为N、D、Q、H、S；在第17位为N、D、Q、H；在第84位为V、I、L、T、S；在第89位为T、S、V；在第92位为E、Q、K、R、N、P、A、S、G、H；在第109位为K、R、E、D；在第137位为L、I、V；在第138位为N、Q、H、S；在第140位为P、A、N；在第142位为T、S、V；在第143位为Y、F、W；在第149位为H、N、S；在第156位为R、K、E、D；在第202位为S、T、A、V；在第205位为R、K、E、D；在第207位为E、Q、D、R、N、T、S、V、A、I、L、M；在第208位为M、L、I；在第209位为S、T；在第228位为Y、F、W；在第234位为N、D、Q、H、S、I、V、L、M；在第243位为K、R、D；在第247位为K、R、E；在第248位为L、I、M、V；在第251位为N、D、Q、H、S、I、V、L、M；在第255位为V、I、L、T、S；在第256位为Y、F、W、H、N、S；在第261位为E、Q、D、K、R、N；在第270位为K、R、E、D；在第304位为V、I、L、T、S；在第314位为G、A；在第320位为L、I、M、V；在第349位为R、K、E、D；在第356位为L、I、M、V；在第373位为I、V、L、M；在第382位为G、A；在第399位为I、V、L、M；在第402位为N、D、Q、H、S；和在第413位为L、I、M、V、Q、E、N、K、R。
在优选的实施方案中，相对于SEQ ID 18的氨基酸序列，合成的植酸酶具有至少一个以下改变：
S1N；A6V；K12N；S17N；A84V；A89T；D92E；D92P；D92A D92N；Q109K；M137L；D138N；S140P；A142T；H143Y；Q149H；T156R；N202S；N202T；G205R；K207E；K207T；K207I；V208M；A209S；H228Y；K234N；K234I；E243K；D247K；S248L；K251N；K251I；A255V；Q256Y；Q256H；S261E；N270K；A304V；S314G；T320L；Q349R；F356L；S373I；E382G；T399I；K402N；H413L；H413Q.
在该列中，在各位置编号之前提及的来自SEQ ID 18的氨基酸，被在位置编号之后提及的氨基酸之一取代。在此，任何所提及的可能的氨基酸取代均可以与任何剩余的氨基酸改变进行组合。
优选地，本发明的合成的植酸酶包含至少5个上述改变，特别是至少10、12、14、16、17、18、19和特别优选20个上述改变。
相对于SEQ ID 18，合成的植酸酶非常特别优选的实施方案具有以下组合改变之一：
a)A89T/D92A/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q
b)A89T/D92N/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/F356L/H413Q
c)A89T/D92A/H143Y/T156R/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/S314G/H413Q或
d)A89T/D92A/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/H413Q
根据所取代的位置和氨基酸，各单独的或组合的突变可以使合成的植酸酶的热稳定性增加1至11℃，因此可以通过选择相应的突变数目和类型，来选择对应于各个用途的所需要的热稳定性的植酸酶。
具有编号A-518、A-521、A-534和A-519(其定义见表1)的合成的植酸酶的特别优选的组合突变，分别使热稳定性比SEQ ID 18(Fus5#2)的合成的植酸酶增加至少10℃。对于这些特别优选的实施方案，热稳定性由此超过65℃(已经被植酸酶Fus5#2(SEQ ID 18)所实现的)至少10℃。SEQ ID 18的植酸酶的温度曲线、pH曲线和热稳定性分别示于图1、2和3中。
在一个实施方案中，相对于下面的上述植酸酶之一，
S1N；A6V；K12N；S17N；A84V；A89T；D92E；D92P；D92A D92N；Q109K；M137L；D138N；S140P；A142T；H143Y；Q149H；T156R；N202S；N202T；G205R；K207E；K207T；K207I；V208M；A209S；H228Y；K234N；K234I；E243K；D247K；S248L；K251N；K251I；A255V；Q256Y；Q256H；S261E；N270K；A304V；S314G；T320L；Q349R；F356L；S373I；E382G；T399I；K402N；H413L；H413Q；
A89T/D92A/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q；
A89T/D92N/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/F356L/H413Q；
A89T/D92A/H143Y/T156R/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/S314G/H413Q和
A89T/D92A/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/H413Q，
合成的植酸酶在基于SEQ ID 18的所述位置上具有至少一个保守的氨基酸取代，其中该合成的植酸酶可以具有至少一个提及的单改变或所述改变集合之一。用于本发明中时，“保守的”指氨基酸G被A取代；A被G、S取代；V被I、L、A、T、S取代；I被V、L、M取代；L被I、M、V取代；M被L、I、V取代；P被A、S、N取代；F被Y、W、H取代；Y被F、W、H取代；W被Y、F、H取代；R被K、E、D取代；K被R、E、D取代；H被Q、N、S取代；D被N、E、K、R、Q取代；E被Q、D、K、R、N取代；S被T、A取代；T被S、V、A取代；C被S、T、A取代；N被D、Q、H、S取代；Q被E、N、H、K、R取代。在本申请中，可以将任何氨基酸的保守取代与任何别的氨基酸的保守取代组合起来。
优选地，合成的植酸酶是分离的植酸酶。也可想到的是，合成的植酸酶不是作为纯化的分离的植酸酶，而是作为发酵液的形式呈现，其中生物质被完全、部分除去或完全没有除去。在该情况下，可以通过移除液体来对发酵液进行浓缩或完全干燥。可以将这些未纯化的或部分纯化的植酸酶溶液或固体用作不同产品中的添加剂。
根据本发明的合成的植酸酶，相对于来自莫氏耶尔森氏菌(Yersiniamollaretii)和哈夫尼菌(Hafnia sp)的两个野生型植酸酶(其是构建SEQ IDNO：18的合成植酸酶构建体的基础)而言，有利地具有提高了的热稳定性和/或提高了的比活。
本发明还包括分离的核酸序列，其编码如上所述的在单个位置或多个位置上具有所述可能改变的本发明植酸酶之一，特别是基于SEQ ID 18在以下氨基酸位置上具有改变的植酸酶：
a)A89T/D92A/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q或
b)A89T/D92N/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/F356L/H413Q或
c)A89T/D92A/H143Y/T156R/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/S314G/H413Q或
d)A89T/D92A/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/H413Q。
本发明也包括编码具有植酸酶活性的酶的分离的核酸序列，其中该核酸序列与SEQ ID 19的核酸序列具有至少70％的同一性，或在高严紧条件下和上述与SEQ ID 19的核酸序列具有至少70％的同一性的序列之一的互补链杂交的核酸序列。在特别的实施方案中，分离的核酸序列与SEQ ID 19具有高于70％的同一性，特别是75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的同一性。
本发明还包括重组表达载体，所述载体包含根据本发明的核酸序列之一。
本发明也包括重组宿主细胞，所述宿主细胞包含根据本发明的核酸序列之一，或包含根据本发明的重组表达载体。
本发明的再一目的是重组生产生物体，其中该生物体是非人生产生物体，其包含根据本发明的核酸序列之一或包含根据本发明的重组表达载体。特别优选地，重组生产生物体为曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、木霉属(Trichoderma)、汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherischia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)之一的生物。
本发明的再一目的是动物饲料添加剂，所述动物饲料添加剂包含至少一种根据本发明的植酸酶，还包含常规饲料添加剂，例如用于牛、家禽或猪的常规添加剂，例如维生素、矿物质或其它添加剂。
本发明的再一目的是动物饲料，所述动物饲料包含与常规动物饲料成分一起的至少一种根据本发明的所述的合成的植酸酶。在该情况下，在用于喂养牛、奶牛、家禽或猪的饲料颗粒中所常规使用的所有饲料成分，均是可以想到的。
本发明还涉及在动物饲料中使用所述的本发明的合成植酸酶之一、或包含至少一种本发明的合成植酸酶的本发明动物饲料添加剂。该应用的形式可以是在造粒之前，将根据本发明的植酸酶或根据本发明的动物饲料添加剂添加到余下的饲料成分中。也可以设想的是，可以在饲料颗粒生产之后，将植酸酶施加(特别是以液态的形式)于这些颗粒。
本发明还涉及使用上述根据本发明的合成的植酸酶之一、包含至少一种本发明的合成植酸酶的根据本发明的动物饲料添加剂、或包含至少一种所述合成的植酸酶的动物饲料来减少农场动物的粪中磷酸盐的含量。
所描述的实施方案用来举例说明和更好地理解本发明，而不以任何方式构成限制。本发明的其他特征从优选实施方式的描述以及后附权利要求中将是显而易见的。在本申请中，本发明的各特征可以单个地或多个地体现在实施方案中，并且不以任何方式将本发明限于所描述的实施方案。由此，权利要求明确规定了本发明的主题。
附图说明
图1显示了植酸酶Fus5#2的温度曲线。在每个所述的温度下测定植酸酶的活性。为了确定相对活性值，将最高的测量活性设为100％。
图2显示了植酸酶Fus5#2的pH曲线。在每个所述的pH下测定植酸酶的活性。为了确定相对活性值，将最高的测量活性设为100％。
图3显示了植酸酶Fus5#2的温度稳定性。将植酸酶于pH 5.5、在所述的温度下加热20分钟。冷却后，在pH 5.5和37℃测定残余活性。为了确定相对残余活性，将在室温孵育20分钟的参照样品的活性设为100％。
图4显示了表达质粒pFus5#2的质粒图谱。
图5显示了表达质粒pH6-Fus5#2的质粒图谱。
图6显示了表达质粒pGLA53-Fus5#2的质粒图谱。
实施例
从哈夫尼菌(Hafnia sp).LU11047中克隆植酸酶
按与出版物Huang等(2006)A novel phytase with preferablecharacteristics from Yersinia intermedia.Biochem Biophys Res Commun350：884-889，Shi等(2008)A novel phytase gene appA from Buttiauxella sp.GC21 isolated from grass carp intestine.Aquaculture 275：70-75和WO2008116878(实施例1)中类似的方式，利用PCR，在肠道杆菌中寻找植酸酶，所述PCR使用简并寡核苷酸Haf10905’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’(SEQ ID NO：1)和Haf10925’-GGNGTRTTRTCNGGYTG-3’(SEQ ID NO：2)，在40℃和50℃之间的退火温度下进行。将所形成的PCR产物用作模板，使用寡核苷酸Haf1090 5’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’(SEQ ID NO：1)和Haf10915’-GCDATRTTNGTRTCRTG-3’(SEQ ID NO：3)，在同样的退火条件下进行半巢式PCR。可以从哈夫尼菌属(Hafnia)的细菌菌株(哈夫尼菌LU11047)中分离片段。使用″TOPO TA Cloning
Figure BDA0000156055650000101
试剂盒″(Invitrogen)，按照生产商的操作指南，对所分离的片段进行亚克隆，并随后进行测序。从该部分序列开始，通过被称为TAIL-PCR的方法(Yao-Guang Liu和Robert F.Whittier(1995)Thermal asymmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1and YAC clones for chromosome walking.Genomics 25，674-681)扩增该植酸酶的全长序列。以下寡核苷酸用于该目的：
3’端的扩增：
1.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’，SEQ ID NO ：4)和
Haf1167(5’-CTTCGAGAGCCACTTTATTACCGTCG-3’，SEQ ID NO：5)
2.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’，SEQ ID NO：4)和
Haf1168(5’-CCAATGTTGTGCTGCTGACAATAGG-3’，SEQ ID NO：6)
3.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’，SEQ ID NO：4)和
Haf1169(5’-CCGAACTCATCAGCGCTAAAGATGC-3’，SEQ ID NO：7)
5’端的扩增：
1.Haf1077(5’-CAWCGWCNGASASGAA-3’，SEQ ID NO：8)和
Haf1170(5’-CGCAGTTTGACTTGATGTCGCGCACG-3’，SEQ ID NO：9)
2.Haf1077(5’-CAWCGWCNGASASGAA-3’，SEQ ID NO：8)和
Haf1171(5’-GTCGCGCACGCCCTATATCGCCAAGC-3’，SEQ ID NO：10)
3.Haf1077(5’-CAWCGWCNGASASGAA-3’，SEQ ID NO：8)和
Haf1172(5’-CTGCAAACCATCGCACACGCACTGG-3’，SEQ ID NO：11)
使用″TOPO TA Cloning
Figure BDA0000156055650000102
试剂盒″(Invitrogen)克隆所获得的DNA片段，并进行测序。该核苷酸序列产生编码来自哈夫尼菌(Hafnia sp.)LU11047的植酸酶的基因SEQ ID NO：12。由此得到的氨基酸序列SEQ ID NO：13与来自WO200811678的蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的植酸酶序列98％同一。
使用软件SignalP 2.0，氨基酸1-33被预测为信号肽。由此，成熟的酶开始于第34位的丝氨酸。
1.合成的植酸酶Fus5#2
克隆植酸酶Fus5#2
从哈夫尼菌LU11047的染色体DNA开始，利用PCR，扩增该植酸酶的第1-1074位碱基的片段(SEQ ID NO：14)。从来自莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)ATCC43969的潜在植酸酶(或酸性磷酸酶)的DNA序列(NCBI序列ID ZP_00824387)，产生了用来扩增第1057-1323位核苷酸的寡核苷酸。由此自莫氏耶尔森氏菌ATCC43969的染色体DNA扩增第二植酸酶片段。在两个植酸酶片段的扩增中，借助所使用的寡核苷酸，在哈夫尼菌片段的3’端和耶尔森氏菌片段的5’端之间造成了20bp的重叠。以这种方式，可以通过PCR融合，将两个片段结合起来，得到植酸酶序列SEQ ID NO：16，其编码合成的植酸酶Fus5#2。对于由其得到的氨基酸序列SEQ ID NO：17，利用软件SignalP 2.0，氨基酸1-33被预测为信号肽。成熟的植酸酶Fus5#2(SEQ ID NO：18)由核苷酸序列SEQ ID NO：19编码。
为了克隆用于大肠杆菌(E.coli)的表达质粒，在植酸酶DNA片段SEQ ID NO：16的5’末端引入NdeI限制性酶切位点，在3’末端引入终止密码子和HindIII限制性酶切位点。用于此目的这些额外序列，利用PCR反应，使用植酸酶SEQ ID NO：16作为模板，通过所使用的引物而引入。利用这些位点，将编码植酸酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(Novagen)中。通过使用NdeI限制性酶切位点和通过引入终止密码子，将pelB信号序列从载体上除去，并阻止通读到存在于质粒上的6xHis标签。将由此产生的质粒pFus5#2(SEQ ID NO：20)转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Invitrogen)中。
为了改进植酸酶蛋白质的纯化，克隆了具有N-末端6xHis标签的植酸酶。使用引入6xHis标签和BamHI位点的有义寡核苷酸引物H6：5’-ctatggatccgcatcatcatcatcatcacagtgataccgcccctgc-3’(SEQ ID NO：21)，以编码成熟植酸酶的序列SEQ ID NO：19作为模板，扩增PCR产物。使用与此前相同的反义寡核苷酸，在PCR产物的3’末端再次引入终止密码子和NdeI限制性酶切位点。通过BamHI/NdeI，将所产生的片段克隆到载体pET22b中，获得质粒pH6-Fus5#2(SEQ ID NO：22)，并同样将其转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中。就该构建体来说，存在于pET22b中的pelB信号序列被用于向外周胞质中的转运。
在大肠杆菌中表达植酸酶Fus5#2
在含有氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基中，于37℃培养携带具有植酸酶表达盒的质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。通过加入1mM的IPTG，于0.6的OD(600nm)下诱导植酸酶的表达。在诱导4小时后，加入10％(v/v)的10x BugBuster溶液(Novogen)，将混合液于室温下孵育15分钟。离心后，使用上清液测定植酸酶的活性。
通过Ni-亲和层析进行纯化
为了纯化6xHis标记的植酸酶变体，将诱导表达植酸酶的大肠杆菌培养液与300mM NaCl、CompleteTM蛋白酶抑制剂(无EDTA)混合(根据制造商Roche Applied Science的资料)，并与10％(v/v)的10x BugBuster溶液(Novogen)混合，于室温下孵育15分钟。离心后，按照生产商的操作指南，将上清液与Ni-NTA柱/试剂盒(Qiagen)结合。在清洗步骤之后，使用冷的洗脱缓冲液(50mM乙酸钠缓冲液、300mM NaCl、500mM咪唑、1mM CaCl2)进行洗脱。在测定蛋白质含量之前，通过透析使样品缓冲液交换为2mM柠檬酸钠(pH 5.5)。
在黑曲霉(Aspergillus niger)中表达植酸酶Fus5#2
为了在黑曲霉中表达植酸酶Fus5#2，首先构建了包含植酸酶基因的表达构建体，所述植酸酶基因处于黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(glaA)启动子的控制之下，其侧翼具有非编码3’glaA区域。通过这种方式，确定构建体在黑曲霉中整合到3’glaA区域中。使用无花果曲霉(A.ficuum)植酸酶的信号序列，作为用于胞外蛋白质分泌的信号序列。使用详细描述于EP0635574B1的质粒pGBGLA-53(在WO9846772中也被称为pGBTOPFYT-1)，作为表达构建体的基础。使用本领域技术人员已知的基于PCR的克隆方法，以编码成熟Fus5#2植酸酶的基因部分SEQ ID NO：19，取代pGBGLA-53中无花果曲霉植酸酶的基因部分(编码以氨基酸序列ASRNQSS起始的成熟植酸酶蛋白质)。得到质粒pGLA53-Fus5#2(SEQ ID NO：23)。利用HindIII从所得到的质粒中分离线性表达盒，将其与从质粒pGBLA50(EP0635574B1)/pGBAAS-1(WO9846772中相同质粒的名称)中分离的amdS标记盒一起共转化到glaA-缺失的黑曲霉表达菌株中，按所引用的两篇专利文献中的描述，在摇瓶中进行植酸酶的表达。每天离心去掉细胞后，测定培养基上清液中植酸酶的活性。在第3天到第6天之间达到了最大活性。
比活的测定
在微量滴定板中测定植酸酶的活性。在反应缓冲液(250mM乙酸钠、1mM CaCl2、0.01％吐温20，pH 5.5)中稀释纯化的酶样品。将10μl的酶溶液与110μl的底物溶液(6mM植酸钠(Sigma P3168)，溶于反应缓冲液中)一起，于60℃孵育20分钟。通过加入80μl的三氯乙酸溶液(15％w/w)终止反应。为了检测释放的磷酸，将20μl终止了的反应溶液与280μl新鲜配制的染色剂(60mM L-抗坏血酸(Sigma A7506)、2.2mM四水合钼酸铵、325mM H2SO4)混合，于50℃孵育25分钟，随后在820nm处测定吸收值。作为空白值，将底物缓冲液于37℃单独孵育，只有在以三氯乙酸终止后，加入10μl的酶样品。按类似的方式进行染色反应。使用已知浓度的磷酸盐溶液，通过染色反应的校准曲线，测定所释放的磷酸的量。将在这些条件下每分钟释放1μmol磷酸的酶活性定义为1U。通过280nm处的吸收值确定所使用的植酸酶溶液的蛋白质浓度。为此目的，使用“Vector NTI”软件(Invitrogen，10.3.0版)确定植酸酶的摩尔消光系数。Fus5#2植酸酶的比活为2300+/-200U/mg。
植酸酶测定试验
在微量滴定板中测定植酸酶的活性。在反应缓冲液(250mM乙酸钠、1mM CaCl2、0.01％吐温20，pH 5.5)中稀释酶样品。将10μl的酶溶液与140μl的底物溶液(6mM植酸钠(Sigma P3168)，溶于反应缓冲液中)一起，于37℃孵育1小时。通过加入150μl的三氯乙酸溶液(15％w/w)终止反应。为了检测释放的磷酸，将20μl终止了的反应溶液与280μl新鲜配制的染色剂(60mM L-抗坏血酸(Sigma A7506)、2.2mM四水合钼酸铵、325mM H2SO4)混合，于50℃孵育25分钟，随后在820nm处测定吸收值。作为空白值，将底物缓冲液于37℃单独孵育，只有在以三氯乙酸终止后，加入10μl的酶样品。按与其余测定值类似的方式进行染色反应。使用已知浓度的磷酸盐溶液，通过染色反应的校准曲线来测定所释放的磷酸的量。
最适温度的测定
为了测定最适温度，在反应缓冲液(250mM乙酸钠、1mM CaCl2、0.01％吐温20，pH 5.5)中稀释酶样品。将10μl预热(5分钟，相应反应温度)的酶溶液与110μl预热的底物溶液(6mM植酸钠(Sigma P3168)，溶于反应缓冲液中)一起孵育30分钟。在梯度加热器中于各种温度下进行孵育。通过加入80μl的三氯乙酸溶液(15％w/w)终止反应。为了检测释放的磷酸，将20μl终止了的反应溶液与280μl新鲜配制的染色剂(60mML-抗坏血酸(Sigma A7506)、2.2mM四水合钼酸铵、325mM H2SO4)混合，于50℃孵育25分钟，随后在820nm处测定吸收值。作为空白值，将底物缓冲液于规定的温度下单独孵育，只有在以三氯乙酸终止后，加入10μl的酶样品。按与其它测定值类似的方式进行染色反应。为了确定相对活性，将最高的测定活性设为100％。结果示于图1中。
植酸酶Fus5#2的温度谱：
Figure BDA0000156055650000151
Fus5#2植酸酶的最适温度为约63℃。
最适pH的测定
为了测定最适pH，使用改良的反应缓冲液(100mM乙酸钠、100mM甘氨酸、100mM咪唑、1mM CaCl2、0.01％吐温20)进行植酸酶测定试验，其中使用稀盐酸将该改良的反应缓冲液调节至在pH 1.5-7范围中的pH。为了确定相对活性，将最高的测定活性设为100％。结果示于图2中。
植酸酶Fus5#2的pH谱：
Figure BDA0000156055650000152
Fus5#2植酸酶的最适pH为pH 4.5。
热稳定性(T50)的测定
为了记录热失活曲线，将反应缓冲液(250mM醋酸钠、1mMCaCl2、0.01％吐温20，pH 5.5)中的稀释的酶样品于各温度下加热20分钟，然后冷却至4℃。将非热处理的参照样品于室温放置20分钟，此后同样冷却至4℃。在热预处理后，利用植酸酶测定试验来测定样品的酶活性。将参照样品的活性标化为100％。以T50值表征各种植酸酶变体的热稳定性。T50值给出温度，在该温度下，在热失活后，与没有经过热处理的参照样品相比较，仍然存在50％的残余活性。两种植酸酶变体因为各自的T50值不同而热稳定性不同(以℃表示)。结果示于图3中。
植酸酶Fus5#2的T50测定：
  温度[℃]   21   53.8   55.9   58.6   61.5   64.5   67.4   69.9   72   73.3   73.7
  残余活性[％]   100   88   86   83   77   57   15   2   1   2   3
由此得出Fus5#2植酸酶的T50值为65℃。
2.植酸酶Fus5#2的植酸酶变体
利用PCR，通过基因序列SEQ ID NO：19的突变来产生植酸酶的变体。使用“Quickchange定点诱变试剂盒”(Stratagene)进行定向诱变。使用“GeneMorph II随机诱变试剂盒”(Stratagene)对SEQ ID NO：19的编码序列之全部或仅部分进行随机诱变。通过所使用的模板DNA的量，将诱变率设定为所需的程度(1-5个突变)。通过单点突变的定向组合，或通过连续进行多轮诱变来产生多重突变。将以该方式产生的植酸酶基因的变体，以与原始植酸酶Fus5#2类似的方式，克隆到大肠杆菌(E.coli)表达载体pET22b(Novagen)中，然后使用大肠杆菌(E.coli)菌株BL21(DE3)进行表达。在少数情况下，以与起始植酸酶Fus5#2类似的方式，在黑曲霉(Aspergillus niger)中，使用相应的表达构建体，表达经挑选的植酸酶变体。
在高通量测试中测试所产生的植酸酶变体的植酸酶活性和温度稳定性。为此目的，以基于pET22b的表达构建体转化后，将获得的大肠杆菌BL21(DE3)克隆，在96孔微量滴定板中以LB培养基(2％葡萄糖、100mg/l氨苄青霉素)进行培养(30℃、900rpm、2mm摇床倾斜度)。在OD(600nm)约为0.5时，使用1mM IPTG进行诱导4小时。随后，加入10％(v/v)的10x BugBuster溶液(Novogen)，将混合物在室温孵育15分钟。测定植酸酶的活性和20分钟温度胁迫后的残余活性。对于具有提高了的相对残余活性的变体，测定其热稳定性(T50)。对于一些经挑选的植酸酶变体，测定额外的特征参数(例如，最适温度、比活、最适pH)。
热稳定性
以ΔT表示各植酸酶变体在热稳定性上的增加，其中ΔT给出与植酸酶Fus5#2相比较，T50值的增加(以℃表示)。突变的详细情况是相对于起始分子Fus5#2而言的。
表1、与合成的植酸酶Fus5#2相比较，具有1至14个突变的植酸酶变体在热稳定性上的增加(以℃表示)
Figure BDA0000156055650000171
Figure BDA0000156055650000181
Figure BDA0000156055650000191
表2、与合成的植酸酶Fus5#2相比较，植酸酶变体在比活上的增加
  突变体编号   突变   相对比活[％]
  Fus5#2   SEQ ID NO 18   100
  A-8   K234I/K251I/H413Q   111
  X-5   D92N   120
Figure IDA0000156055740000021
Figure IDA0000156055740000031
Figure IDA0000156055740000041
Figure IDA0000156055740000051
Figure IDA0000156055740000061
Figure IDA0000156055740000071
Figure IDA0000156055740000091
Figure IDA0000156055740000101
Figure IDA0000156055740000121
Figure IDA0000156055740000141
Figure IDA0000156055740000151
Figure IDA0000156055740000161
Figure IDA0000156055740000181
Figure IDA0000156055740000191
Figure IDA0000156055740000201
Figure IDA0000156055740000211
Figure IDA0000156055740000221

Claims (19)

1.与SEQ ID 18的氨基酸序列具有至少70％的同一性的植酸酶。
2.根据权利要求1的植酸酶，其中，基于SEQ ID 18的位置，其在选自第1、6、12、17、84、89、92、109、137、138、140、142、143、149、156、202、205、207、208、209、228、234、243、247、248、251、255、256、261、270、304、314、320、349、356、373、382、399、402和413位中的至少一个位置上具有氨基酸的改变。
3.根据权利要求2的植酸酶，其具有至少5个改变。
4.根据权利要求1的植酸酶，其中，基于SEQ ID 18的位置，第1、6、12、17、84、89、92、109、137、138、140、142、143、149、156、202、205、207、208、209、228、234、243、247、248、251、255、256、261、270、304、314、320、349、356、373、382、399、402和413位上的至少一个氨基酸，被相应地置换为以下氨基酸之一：
1N，D，Q，H；6V，I，L，T，S；12N，D，Q，H，S；17N，D，Q，H；84V，I，L，T，S；89T，S，V；92E，Q，K，R，N，P，A，S，G，H；109K，R，E，D；137L，I，V；138N，Q，H，S；140P，A，N；142T，S，V；143Y，F，W；149H，N，S；156R，K，E，D；202S，T，A，V；205R，K，E，D；207E，Q，D，R，N，T，S，V，A，I，L，M；208M，L，I；209S，T；228Y，F，W；234N，D，Q，H，S，I，V，L，M；243K，R，D；247K，R，E；248L，I，M，V；251N，D，Q，H，S，I，V，L，M；255V，I，L，T，S；256Y，F，W，H，N，S；261E，Q，D，K，R，N；270K，R，E，D；304V，I，L，T，S；314G，A；320L，I，M，V；349R，K，E，D；356L，I，M，V；373I，V，L，M；382G，A；399I，V，L，M；402N，D，Q，H，S；413L，I，M，V，Q，E，N，K，R。
5.根据权利要求1的植酸酶，其中，相对于SEQ ID 18的氨基酸序列，其具有至少一个选自以下的改变：
S1N；A6V；K12N；S17N；A84V；A89T；D92E；D92P；D92A D92N；Q109K；M137L；D138N；S140P；A142T；H143Y；Q149H；T156R；N202S；N202T；G205R；K207E；K207T；K207I；V208M；A209S；H228Y；K234N；K234I；E243K；D247K；S248L；K251N；K251I；A255V；Q256Y；Q256H；S261E；N270K；A304V；S314G；T320L；Q349R；F356L；S373I；E382G；T399I；K402N；H413L和H413Q。
6.根据权利要求5的植酸酶，其具有至少5个改变。
7.根据权利要求1的植酸酶，其具有选自下组中的至少之一的改变：
[A89T/D92A/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/H413Q]，
[A89T/D92N/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/F356L/H413Q]，
[A89T/D92A/H143Y/T156R/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/K251N/Q256H/S314G/H413Q]和
[A89T/D92A/A142T/H143Y/N202S/K207E/A209S/H228Y/K234I/D247K/K251N/Q256H/H413Q]。
8.根据上述权利要求之任一的植酸酶，其中，相对于权利要求5-7中任一项的植酸酶之一，其在至少一个位置具有至少一个保守氨基酸取代。
9.根据上述权利要求之任一的植酸酶，其是分离的植酸酶。
10.根据上述权利要求之任一的植酸酶，其相对于来自莫氏耶尔森氏菌和哈夫尼菌的两个野生型植酸酶而言，具有提高了的热稳定性和/或提高了的比活。
11.编码植酸酶的分离的核酸序列，所述核酸序列编码根据权利要求1至10的植酸酶之一。
12.编码植酸酶的分离的核酸序列，所述核酸序列：
a)与SEQ ID 19的核酸序列具有至少70％的同一性，或
b)在高严紧条件下与a)的序列之一的互补链杂交。
13.包含根据权利要求11或12的核酸序列的重组表达载体。
14.包含根据权利要求11或12的核酸序列或根据权利要求13的载体的重组宿主细胞。
15.包含根据权利要求11或12的核酸序列或根据权利要求13的载体的重组生产生物体。
16.动物饲料添加剂，其包含至少一种根据权利要求1至10之任一的植酸酶以及其它饲料添加剂。
17.包含至少一种根据权利要求1至10之任一的植酸酶的动物饲料。
18.根据权利要求1至10之任一的植酸酶或根据权利要求16的动物饲料添加剂在动物饲料中的用途。
19.根据权利要求1至10之任一的植酸酶、根据权利要求16的动物饲料添加剂、或根据权利要求17的动物饲料用于减少农场动物的粪中的磷酸盐含量的用途。
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