CN103687944B - 合成的植酸酶变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及合成的植酸酶，其具有增加的热稳定性、在pH2对酸增加的稳定性、对胃蛋白酶增加的稳定性，并且具有加宽的活性pH范围，涉及编码合成的植酸酶的分离的核苷酸序列，涉及植酸酶在动物饲料中的用途，用于降低粪便中的磷酸盐含量，并且涉及包含合成的植酸酶的动物饲料添加剂和动物饲料。
Description
本发明涉及植酸酶，涉及编码植酸酶的氨基酸序列和编码植酸酶的核苷酸序列，并涉及制备的方法以及植酸酶的用途和包含这些植酸酶的动物饲料。
磷是活生物生长的必需元素。在动物生产中，通常必须用无机磷补充饲料，以实现良好的生长速率。在谷物和豆类中，磷主要以植酸盐的形式储存。然而，单胃动物如猪、家禽和鱼不能直接吸收植酸盐或植酸而导致植酸盐的排泄，这意味着在家畜集中生产的区域中磷是超载的。此外，与金属如钙、铜或锌结合的植酸是作为对单胃动物的代谢起负作用的物质。为了补偿这些动物的磷酸盐的缺乏，以及确保充分地生长和足够的健康，将无机磷酸盐加入到动物饲料中。无机磷酸盐的这种添加是昂贵的，并且导致了对环境的其他不利影响。通过在动物饲料中使用植酸酶，水解了植酸盐并且导致了粪便(slurry)中较低含量的磷酸肌醇和无机磷酸盐。将植酸酶添加到动物饲料中改进了有机磷的可用性，并降低了排泄的与植酸盐结合的磷酸盐对环境的不利影响。文献描述了真菌和细菌来源的多种天然植酸酶。
植酸酶也称为肌醇六磷酸盐磷酸水解酶，其是能从植酸盐切割至少一个磷酸残基的一类磷酸酶。
EP420358一般性地描述了微生物植酸酶的克隆和表达、WO 2006/38062描述了将来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的微生物植酸酶作为添加剂加入到动物饲料中，并且WO 2007/112739描述了基于来自布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)的天然植酸酶的植酸酶及其制备方法和在动物饲料中的用途。
Haefner等人(Haefner S.，Knietsch A.，Scholten E.，Braun J.，Lohscheidt M.和Zelder O.(2005)Biotechnological production and application of phytases。ApplMicrobiol Biotechnol 68：588-597)描述了植酸酶在人类或动物营养领域中的多种已知用途。植酸酶的其他用途例如，在生物乙醇的产生中水解生物质或淀粉的用途描述于WO2008/097620中。
WO 2008/116878和WO 2010/034835描述了来自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的植酸酶，其蛋白质序列及其变体。Zinin等人(FEMS Microbiology Letters(2004)236：283-290)公开了来自变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus)的植酸酶，其序列以检索号Q6U677存储于UNIPROT数据库中。专利申请WO 2006/043178、WO 2008/097619和WO 2008/092901描述了来自多种布丘氏菌属(Buttiauxella sp)的植酸酶。目前，具有最高特异性活性的天然植酸酶包括来自中间耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)(WO 2007/128160)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)(WO 02/048332)的天然植酸酶。
然而，这些目前可用的植酸酶全部都未表现出用于制备动物饲料添加剂所需的那些性质。目前可用的植酸酶在不会相当大地丧失其活性的情况下，缺少用于制备动物饲料颗粒的足够热稳定性。在动物饲料颗粒的制备中，在高温和高湿度下将植酸酶与其他常规动物饲料组分一起压缩，以作为一个实体喂饲给家畜。在制备期间，只有在80℃以上的温度才能实现沙门氏菌属(salmonella sp.)的有效破坏和淀粉的糊化(Amerah等人WorldsPoulty Science Journal(2011)67：29-45)。在热和潮湿条件下的这种压缩导致植酸酶活性相当大地丧失。防止活性丧失的一种可能是费劲的植酸酶颗粒的涂层，以保护它们免于加热的影响。用于涂层的脂肪或聚合物导致了植酸酶涂层的添加造成了相当大的其他花费。市售植酸酶的剂量通常基于pH 5.5的活性测定(DIN ISO 30024:2009)而确定，并且并没有对其进行修改，以匹配各个消化道中的pH。在非5.5的pH值时活性的变化导致了相当多的错误剂量。
因此，本发明的目的是提供具有足够热稳定性的植酸酶，以使在没有其他保护措施如涂层的情况下和在尽可能少的活性丧失的情况下所述植酸酶可以用于制备无沙门氏菌的饲料颗粒。本发明的其他目的是提供可以在宽pH范围(同时酶活性尽可能小的降低)使用的植酸酶，以使甚至在由于改变饲料组分，导致pH范围波动的时候，所述植酸酶可以应用于不同动物物种的消化道的多种pH范围，并且确保消化道中足够的酶活性。
通过合成的植酸酶实现所述目的，所述植酸酶具有的氨基酸序列与SEQ ID 24的氨基酸序列具有至少90％的同一性。
根据本发明合成的植酸酶优选地具有氨基酸序列，其与SEQ ID 24的氨基酸序列具有至少94％，特别优选地95％以及优选地96％、97％、98％或99％的同一性。
根据本发明的植酸酶具有至少80℃的热稳定性，因此适合用于饲料颗粒的制备，且在颗粒化期间，不会由于热和潮湿的条件导致相当大的活性丧失。
此外，所述植酸酶具有3个pH单位以上的宽的pH范围，在该pH范围内，它们保留了在pH 5.5测定的活性的至少50％，因此，当基于5.5的活性测定剂量时，可以在具有不同消化pH的多种动物中使用所述植酸酶并且将其与不同的饲料组分一起使用，而不会有导致活性丧失的过度低剂量，从而增加了通过动物排泄的磷酸盐。
此外，根据本发明的植酸酶令人惊奇地具有增加的蛋白水解稳定性，因此，它们可以在活性基本上不损失的情况下穿过胃，并在肠中的实际作用位点仍保留活性。此外，根据本发明的植酸酶在pH2具有至少85％的稳定性，因此确保在在强酸性范围中仍然保留活性。
两个蛋白质序列或核酸序列之间的同一性定义为通过在2011年4月可得到的版本中的程序needle计算的同一性。Needle是可免费得到的程序包EMBOSS的一部分，其可以从网址http://emboss.sourceforge.net/下载。使用的标准参数为：空位开放10.0(“空位开放罚分”)，空位延伸0.5(“空位延伸罚分”)，就蛋白质而言，使用数据文件EBLOSUM62(矩阵)，而就DNA而言，使用数据文件EDNAFULL(矩阵)。
在特别的实施方案中，本发明不包括具有以下氨基酸序列的植酸酶：SEQ ID 18及其突变体A-4；A-10；A-66；A-73；C-7；C-40；X-1；X-2；A-164；B-16；B-378；C-79；A-11；X-6；B-320；A-508；A-8；A-20；A-507；A-8；A-20；A-507；X-3；A-505；A-501；A-407；A-502；X-4；A-408；A-415；A-501；A-409；A-503；A-406；A-510；A-515；D-5；D-34；F-161；A-504；D-192；A-511；A-514；A-516；F-41；D-207；D-268；F-150；I-117；A-509；H-107；H-159；H-456；A-512；H-464；A-513；A-518；A-521；A-534和A-519(如在表6中所定义)。
在特定的实施方案中，本发明包含根据本发明所述的植酸酶，以及具有由SEQ ID18的氨基酸序列组成的植酸酶，并且不包括表6中所述的突变体。
表6：氨基酸序列SEQ ID 18的突变体
在特定的实施方案中，本发明包括植酸酶，其具有的氨基酸序列与SEQ ID 24的氨基酸序列具有至少90％，优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，以及由SEQ ID 18的氨基酸序列组成的植酸酶，并且不包括表6中所述的突变体。
根据特定的实施方案，基于根据SEQ ID 24的位置，合成的植酸酶在选自以下位置的至少之一处具有氨基酸修饰，所述位置选自位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、16、33、37、67、71、75、76、77、78、92、109、118、119、120、121、123、136、141、144、152、155、156、159、164、166、193、200、217、258、260、261、268、270、276、300、322、345、346、371、374、398和406。对于本发明的目的，理解修饰指的是用另一氨基酸取代序列表的SEQ ID 24中所提及的原始氨基酸。在此，氨基酸指的是常用的单字母密码。通过修饰一个或多个氨基酸，有可能进一步提高合成的植酸酶的热稳定性和/或增加对胃蛋白酶的稳定性或者加宽最佳的pH范围。
有利地，合成的植酸酶在基于SEQ ID 24的氨基酸序列中具有至少5个修饰，特别地，所述植酸酶具有至少6个、7个、8个、9个或10个以及特别优选地至少15个修饰。
在优选的实施方案中，与SEQ ID 24的氨基酸序列相比，合成的植酸酶具有至少一个以下修饰：
S1-；D2-,E；T3Q,A4G,E；P5A；A6S,D；G7K；F8Y,M；Q9K；K12R；L16V；N33D,M；H37Y；R67L；Q71E；P75N；K76N,I；D77T；N78T；D92A,E,N,T,V；Q109N,E；Q118S；N119A,T；I120L；Q121T；A123V；S136K；Q141K；A144E；T152G,A；E155N；T156G；Q159N；S164E；A166E,H；Q193L；A200N；S217G；D258N；M260I；S261H；K268N；N270Q；Q276N；I300L；T322Q；D345G；N346G；L371A；H374N；D398E；Q406K。
在上下文中，用位置数之后提及的氨基酸之一替换各个位置数(根据SEQ ID 24的位置)之前提及的SEQ ID 24的氨基酸。“-”表示缺失所讨论的氨基酸。在上下文中，所提及的任何可能的氨基酸取代和任何剩余的改变的组合都是可能的。
有利地，本发明合成的植酸酶包含至少5个上述修饰，特别地，至少6个、7个、8个、9个或10个，以及特别优选地至少15个这些修饰。
合成的植酸酶的特别优选的实施方案具有相对于SEQ ID 24的修饰的以下累积和之一，其中“PhV-[编号]”不表示任何突变，而鉴定的突变体的编号与PhV-[编号]相同。
在每种情况下，合成的植酸酶的这些特别优选的累积突变使得热稳定性增加至至少83℃。因此，这些特别优选的实施方案导致热稳定性比来自哈夫尼菌属(Hafnia sp)LU11047的野生型植酸酶的65℃高至少18℃。在每种情况下，根据本发明的一些植酸酶的热稳定性的pH谱显示于图1和2A、B中。
在一个实施方案中，与上述植酸酶之一相比，合成的植酸酶在上述位置处具有至少一个保守氨基酸交换，合成的植酸酶可能具有至少一个上述各个修饰或者上述修饰组之一。对于本发明的目的，保守性意为氨基酸G至A；A至G、S；V至I、L、A、T、S；I至V、L、M；L至I、M、V；M至L、I、V；P至A、S、N；F至Y、W、H；Y至F、W、H；W至Y、F、H；R至K、E、D；K至R、E、D；H至Q、N、S；D至N、E、K、R、Q；E至Q、D、K、R、N；S至T、A；T至S、V、A；C至S、T、A；N至D、Q、H、S；Q至E、N、H、K、R的交换。在此，有可能将一个氨基酸的任一保守交换与另一氨基酸的任一保守交换组合。
有利地，合成的植酸酶是分离的植酸酶。合成的植酸酶并不以纯化的分离的植酸酶存在，而以发酵液存在也是可行的，其中生物质是完全分离的、部分分离的或者根本没有分离。在此，溶液可以是浓缩的或者通过去除液体完全干燥的。在不同的产品中，有可能将这些未纯化的或者部分纯化的植酸酶溶液或植酸酶固体用作添加剂。
与来自生物莫氏耶尔森氏菌和哈夫尼菌属的两种野生型植酸酶(其是构建根据SEQ ID 24的合成的植酸酶构建体的基础)相比，根据本发明合成的植酸酶有利地具有增加的热稳定性、增加的对胃蛋白酶的稳定性和/或增加的特异性活性。
在特定的实施方案中，就氨基酸的类型和氨基酸的位置而言，相对于SEQ ID 24，根据本发明的植酸酶在位置R18、H19、G20、R22、P24、H306和D307处是未经修饰的。
本发明还包括分离的核酸序列，其编码的植酸酶具有氨基酸序列，其与SEQ ID 24的氨基酸序列具有至少90％，优选地95％和特别地96、97、98或99％同一性。
在特定的实施方案中，本发明包含根据本发明的上述分离的核苷酸，以及编码植酸酶的核苷酸序列，所述植酸酶具有选自SEQ ID 18的氨基酸序列，并且不包括表6中所述的突变体。
在特定的实施方案中，本发明包含编码植酸酶的分离的核酸序列，其中所述核酸序列编码根据本发明的植酸酶之一，并且所述植酸酶不包含具有氨基酸序列SEQ ID 18的植酸酶和表6中所述的突变体。
此外，本发明包含重组表达载体，其包含根据本发明的核酸序列之一。
本发明同样包含重组宿主细胞，其包含根据本发明的核酸之一或者包含根据本发明的重组表达载体。
此外，通过重组生产生物实现了该目的，所述重组生产生物是包含根据本发明的核酸序列之一或者包含根据本发明的重组表达载体的非人类生产生物。重组生产生物特别优选地是来自曲霉属(Aspergillus)、毕赤属(Pichia)、木霉属(Trichoderma)、汉森酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、大肠杆菌属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)之一。
此外，通过动物饲料添加剂实现了该目的，所述动物饲料添加剂包含根据本发明的至少一种植酸酶，以及例如用于牛、家禽或猪的其他常规饲料添加剂例如，维生素、矿物质或其他添加剂。
此外，通过动物饲料实现了该目的，所述动物饲料包含至少一种根据本发明所述的合成的植酸酶，以及常规饲料组分。在上下文中，适宜的饲料组分是在用于牛肉、乳牛、家禽或猪肥育的饲料颗粒中常规使用的那些饲料组分。
此外，通过使用根据本发明所述的合成的植酸酶之一或者根据本发明的动物饲料添加剂实现了该目的，所述动物饲料添加剂在动物饲料中包含根据本发明的至少一种合成的植酸酶。在上下文中，在颗粒化剩余的饲料组分之前，可以以添加根据本发明的植酸酶或者根据本发明的动物饲料添加剂的形式使用所述植酸酶。在饲料颗粒制备之后，特别地以液体形式将植酸酶应用于这些颗粒也是可行的。
此外，通过使用根据本发明的上述合成的植酸酶之一、根据本发明的动物饲料添加剂(包含根据本发明的至少一种合成的植酸酶)或者动物饲料(包含至少一种所述合成的植酸酶)实现了本发明，以降低家畜的粪便中的磷酸盐含量。
此外，通过使用根据本发明的上述合成的植酸酶之一、根据本发明的动物饲料添加剂(包含根据本发明的至少一种合成的植酸酶)或者动物饲料(包含至少一种所述合成的植酸酶)解决了本发明，以降低家畜的粪便中的磷酸盐含量。
同时将涉及具有SEQ ID 18的氨基酸序列的植酸酶和表6中所述的突变体的放弃作为参考，以产生本发明的全部特定实施方案的主题。
所述实施方案意在说明和帮助本发明更好的理解，并且不应理解为限制。由下文优选实施方案的说明，以及独立权利要求产生本发明的其他特征。在上下文中，在一个实施方案中，可以认为本发明的各个特征在每种情况下都是个别的或者共同的，并且所述特征并不将本发明限制于任何所述的实施方案。因此，专利权利要求的措辞明确产生了本说明书的主题。
附图简述
图1显示了根据本发明的植酸酶PhV-020、PhV-010、PhV-045、PhV-067、PhV-098的热稳定性。在pH 5.5，在指定的温度加热植酸酶20分钟。冷却后，测定pH 5.5和37℃时的残余活性。为了测定相对残余活性，将参照样品在室温温育20分钟的活性设定为100％。
图2A和B显示了根据本发明的植酸酶PhV-107、PhV-108、PhV-111和PhV-007、PhV-058、PhV-081的pH谱。在各个指定的pH测定植酸酶活性。为了测定相对活性数据，将在pH5.5测量的活性设定为100％。A)在黑曲霉中表达植酸酶，并从培养上清液中测量所述活性。B)在大肠杆菌中表达植酸酶，使用Ni-NtA柱浓缩然后测量所述活性。
图3显示了表达质粒pFus5#2的质粒图谱。
图4显示了表达质粒pH6-Fus5#2的质粒图谱。
图5显示了表达质粒pGLA53-Fus5#2的质粒图谱。
实施例
从哈夫尼菌属LU11047中克隆植酸酶
在与出版物Huang等人(2006)A novel phytase with preferablecharacteristics from Yersinia intermedia。Biochem Biophys Res Commun 350：884-889、Shi等人(2008)A novel phytase gene appA from Buttiauxella sp.GC21 isolatedfrom grass carp intestine。Aquaculture 275：70-75和WO2008116878(实施例1)类似的一系列肠细菌中，使用PCR，在40℃至50℃之间的退火温度，借助于简并寡核苷酸Haf10905’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’(SEQ ID 1)和Haf1092 5’-GGNGTRTTRTCNGGYTG-3’(SEQ ID 2)检索植酸酶。在相同的退火条件下，将形成的PCR产物用作半巢式PCR的模板，使用寡核苷酸Haf1090 5’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’(SEQ ID 1)和Haf1091 5’-GCDATRTTNGTRTCRTG-3’(SEQ ID 3)，进行PCR。可以从哈夫尼菌属(哈夫尼菌属LU11047)的细菌菌株分离片段。按照厂商说明，借助“TOPO TA试剂盒”(Invitrogen)的亚克隆分离的片段，随后测序。从这部分序列开始，通过所称作的TAIL-PCR方法扩增植酸酶的全长序列(Yao-GuangLiu和Robert F.Whittier(1995)Thermal asymmetric interlaced PCR：automatableamplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clonesfor chromosome walking。Genomics 25，674-681)。为此，使用以下寡核苷酸：
3’末端的扩增：
1.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’,SEQ ID 4)和
Haf1167(5’-CTTCGAGAGCCACTTTATTACCGTCG-3’，SEQ ID 5)
2.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’，SEQ ID 4)和
Haf1168(5’-CCAATGTTGTGCTGCTGACAATAGG-3’，SEQ ID 6)
3.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’，SEQ ID 4)和
Haf1169(5’-CCGAACTCATCAGCGCTAAAGATGC-3’，SEQ ID 7)
5’末端的扩增：
1.Haf1077(5’-CAWCGWCNGASASGAA-3’，SEQ ID 8)和
Haf1170(5’-CGCAGTTTGACTTGATGTCGCGCACG-3’，SEQ ID 9)
2.Haf1077(5’-CAWCGWCNGASASGAA-3’，SEQ ID 8)和
Haf1171(5’-GTCGCGCACGCCCTATATCGCCAAGC-3’，SEQ ID 10)
3.Haf1077(5’-CAWCGWCNGASASGAA-3’，SEQ ID 8)和
Haf1172(5’-CTGCAAACCATCGCACACGCACTGG-3’，SEQ ID 11)
借助于“TOPO TA试剂盒”(Invitrogen)克隆获得的DNA片段，并测序。核苷酸序列给出了基因SEQ ID 12，其编码哈夫尼菌属LU11047植酸酶。来源于SEQ ID12的氨基酸序列SEQ ID 13与来自WO200811678的蜂房哈夫尼菌植酸酶的植酸酶序列具有98％的同一性。
使用软件SignalP 2.0，预测氨基酸1-33是信号肽。因此，成熟的酶从位置34的丝氨酸开始。
1.合成的植酸酶Fus5#2
克隆植酸酶Fus5#2
从来自哈夫尼菌属LU11047的染色体DNA起始，通过PCR扩增植酸酶的碱基1-1074片段(SEQ ID 14)。寡核苷酸来源于用于扩增核苷酸1057-1323的来自莫氏耶尔森氏菌ATCC43969，NCBI Sequenz ID ZP_00824387的推定植酸酶(或酸性磷酸酶)的DNA序列。所述寡核苷酸用于扩增来自莫氏耶尔森氏菌ATCC43969的染色体DNA的第二植酸酶片段(SEQ ID15)。基于两种植酸酶片段的扩增，借助于所使用寡核苷酸，产生了分别为其他植酸酶片段的20bp重叠(都位于哈夫尼菌属片段的3’末端和耶尔森氏菌属片段的5’末端)。以这种方式，可以通过PCR融合合并两种片段，以产生植酸酶序列SEQ ID 16，其编码合成的植酸酶Fus5#2。对于来源于SEQ ID 16的氨基酸序列SEQ ID 17，通过软件SignalP 2.0预测氨基酸1-33为信号肽。核苷酸序列SEQ ID 19编码成熟的植酸酶Fus5#2(SEQ ID 18)。
为了克隆用于大肠杆菌的表达质粒，在植酸酶DNA片段SEQ ID 16的5’末端产生了NdeI限制性切割位点，并在3’末端产生了HindIII限制性切割位点和终止密码子。借助于作为模板的植酸酶SEQ ID 16和所使用的引物进行PCR反应以引入所需要的其他序列。使用这些切割位点，将编码植酸酶的基因克隆入大肠杆菌表达载体pET22b(Novagen)中。通过使用NdeI限制性切割位点和引入终止密码子，从载体中去除了pelB信号序列，并且防止通读至质粒上存在的6xHis标签。因此，将产生的质粒pFus5#2(SEQ ID 20)转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Invitrogen)中。
对于改进植酸酶蛋白的纯化，克隆具有N-端6xHis标签的植酸酶变体。使用正义寡核苷酸引物H6：
5’-ctatggatccgcatcatcatcatcatcacagtgataccgcccctgc-3’(SEQ ID 21)扩增PCR产物，所述引物不仅引入了6xHis标签，还引入了BamHI切割位点，并作为编码成熟植酸酶蛋白的序列SEQ ID 19的模板。在PCR产物的3’末端，使用相同的反义寡核苷酸，再次引入终止密码子和NdeI切割位点。从而，通过BamHI/NdeI将产生的片段克隆到载体pET22b中，产生质粒pH6-Fus5#2(SEQ ID 22)，同样地将所述质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在该构建体的情况下，将pET22b中包含的pelB信号序列用于运输到周质中。
植酸酶测定法
在微量滴定板中测定植酸酶活性。在反应缓冲液(250mM乙酸钠、1mM CaCl2、0.01％ Tween 20，pH 5.5)中稀释样品。在37℃，在反应缓冲液中，将10μl酶溶液与140μl底物溶液(6mM植酸钠(Sigma P3168))温育1小时。通过加入150μl三氯乙酸溶液(15％ w/w)终止反应。为了检测释放的磷酸盐，用280μl新鲜制备的显色试剂(60mM L-抗坏血酸(SigmaA7506)、2.2mM四水合钼酸铵，325mM H2SO4)处理20μl终止的反应溶液，并在50℃温育25分钟，随后测定820nm处的光吸收。对于空白值，在37℃温育底物缓冲液，在用三氯乙酸终止后仅加入10μl的酶样品。与剩余测量类似地进行显色反应。通过用已知浓度的磷酸盐溶液进行的显色反应的校准曲线测定释放的磷酸盐的量。
在大肠杆菌中表达
在37℃，在补充了氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基中培养携带质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，所述质粒具有植酸酶表达盒。通过加入1mM IPTG，在0.6的OD(600nm)诱导植酸酶表达。诱导4小时后，加入10％(v/v)的10x BugBuster溶液(Novogen)，并在室温温育混合物15分钟。离心后，将上清液用于测量植酸酶活性。
通过Ni亲和层析纯化
为了纯化经6xHis-标记的植酸酶变体，用300mM NaCl、无EDTA的CompleteTM蛋白酶抑制剂(按照厂商Roche Applied Science的说明)，以及10％(v/v)的10x BugBuster溶液(Novogen)处理经诱导的表达植酸酶的大肠杆菌培养液，并在室温温育混合物15分钟。离心后，按照厂商说明，将上清液与Ni-NTA柱/试剂盒(Qiagen)结合。使用冰冷的洗脱缓冲液(50mM乙酸钠缓冲液、300mM NaCl、500mM咪唑、1mM CaCl2)进行洗涤步骤后的洗脱。通过透析，将样品对pH 5.5的2mM柠檬酸钠进行缓冲液交换，之后测定蛋白质含量。
在黑曲霉(Aspergillus niger)中表达
为了在黑曲霉中表达植酸酶Fus5#2，首先制备表达构建体，其包含在非编码3’-glaA区侧翼的黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)启动子控制下的植酸酶基因。以这种方式，意在将构建体整合到黑曲霉中的3’-glaA区中。用于胞外蛋白分泌的信号序列是无花果曲霉(A.ficuum)植酸酶的信号序列。用于表达构建体的碱基是质粒pGBGLA-53(在WO9846772中也称为pGBTOPFYT-1)，其在EP0635574B1中详细描述。借助于本领域技术人员已知的基于PCR的克隆技术，用编码成熟Fus5#2植酸酶的基因区段SEQ ID 19替换pGBGLA-53中的无花果曲霉植酸酶的基因区段，其编码从氨基酸序列ASRNQSS起始的成熟植酸酶蛋白。这产生了最终的质粒pGLA53-Fus5#2(SEQ ID 23)。将使用HindIII从最终质粒分离的线性表达盒和从质粒pGBLA50(EP0635574B1)/pGBAAS-1(WO9846772中相同质粒的名称)分离的amdS标志物盒共转化到glaA缺失的黑曲霉表达菌株中，并如在两个引用的专利说明书中所述，在摇瓶中进行植酸酶的后续表达。离心去除细胞后，每天测定培养上清液中植酸酶的活性。在第3天至第6天之间达到了最大活性。
2.植酸酶Fus5#2的植酸酶变体
借助PCR，通过突变基因序列SEQ ID 19产生植酸酶的变体。将“Quickchange定点诱变试剂盒”(Stratagene)用于实施定向诱变。借助于“GeneMorph II随机诱变试剂盒”(Stratagene)在SEQ ID 19的完整编码序列或者仅在其编码序列的一部分上进行随机诱变。通过所使用的模板DNA的量，将诱变率设定为1-5个突变的期望量。通过定向组合单个突变或者通过顺次进行几个诱变循环产生多个突变。
在具有高通量能力的测定法中，测试产生的植酸酶变体的植酸酶活性和温度稳定性。为此，在用基于pET22b的表达构建体转化获得大肠杆菌BL21(DE3)克隆后，在LB培养基(2％葡萄糖，100mg/l氨苄青霉素)中，在96孔微量滴定板中培养所述克隆(30℃，900转/分钟，振动偏移2mm)。在OD(600nm)大约0.5时，用1mM IPTG实施诱导4小时。然后，加入10％(v/v)的10x BugBuster溶液(Novogen)，并在室温温育混合物15分钟。测定植酸酶活性，以及温度胁迫20分钟后的剩余活性。
术语SEQ ID 24指由于以下突变：A89T D138N A142T H143Y N202S K207E A209QH228Y K234V T242N Q244S D247K K251N Q256H T277A A279S H280N G283N S284P I286AA287T S288E R289S P290K S314G T320N F356I H413Q，而不同于SEQ ID 18的植酸酶变体。认为全部其他突变体(参见表1)都基于SEQ ID 24，并且在基于SEQ ID 24的氨基酸序列位置的修饰方面被表征。类似于前面章节中所述的方法，将这些植酸酶变体克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(Novagen)中，随后借助于大肠杆菌BL21(DE3)表达。此外，克隆适合于黑曲霉的表达构建体，以使植酸酶可以在转化入黑曲霉后表达。
热稳定性(T50)的测定
为了记录热失活曲线，在各个温度加热在反应缓冲液(250mM乙酸钠，1mM CaCl2，0.01％ Tween 20，pH 5.5)中稀释的酶样品20分钟，然后冷却到4℃。将没有经历热处理的参照样品放置在室温20分钟，然后同样地冷却到4℃。热预处理后，通过植酸酶测定法测定样品的酶活性。将参照样品的热稳定性归一化至100％。将不同植酸酶变体的热稳定性表征为所称作的T50值。T50指热失活后，与没有经历热处理的参照样品比较，仍存在50％残余活性时的温度。以℃表示的两种植酸酶变体的热稳定性的改变由于各个T50值的差异造成。
表1：以℃表示的植酸酶变体的热稳定性(T50)(也参见图1)。以[原始氨基酸][位置][新氨基酸]的形式指出在SEQ ID 24上的各个氨基酸交换处的改变。在这种情况下，符号“-”指缺失所讨论的氨基酸。氨基酸位置的编号始终参照SEQ ID 24。
pH谱的测定
为了测定pH谱，将改良的反应缓冲液(100mM乙酸钠，100mM甘氨酸，100mM咪唑，1mMCaCl2，0.01％ Tween 20)用于植酸酶测定法，使用稀释的盐酸使所述反应缓冲液pH值在pH1.5-7之间。为了测定相对活性，将在pH5.5测量的活性设定为100％。结果显示于表2和3中。
表2：一些植酸酶变体的pH谱。在黑曲霉中表达植酸酶，并直接从培养上清液中测量植酸酶活性。将植酸酶活性以％显示为在pH5.5测定的活性的相对值。
| pH | 1.5 | 2 | 3 | 4 | 5.0 | 5.5 | 6 | 7.0 |
| PhV-107 | 8 | 24 | 51 | 78 | 117 | 100 | 60 | 3 |
| PhV-108 | 8 | 30 | 57 | 81 | 123 | 100 | 68 | 4 |
| PhV-109 | 6 | 24 | 49 | 76 | 127 | 100 | 59 | 3 |
| PhV-110 | 6 | 27 | 48 | 85 | 134 | 100 | 70 | 4 |
| PhV-111 | 7 | 38 | 76 | 105 | 134 | 100 | 57 | 3 |
| PhV-124 | 7 | 41 | 61 | 76 | 125 | 100 | 67 | 4 |
表3：一些植酸酶变体的pH谱。在大肠杆菌中表达植酸酶，并通过镍亲和层析纯化。将植酸酶活性以％显示为在pH5.5测定的活性的相对值(参见图2B)。
| pH | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | 3.5 | 4 | 4.5 | 5 | 5.5 | 6 | 6.5 | 7 |
| PhV-007 | 7 | 23 | 43 | 80 | 126 | 155 | 160 | 142 | 100 | 45 | 13 | 4 |
| PhV-058 | 3 | 22 | 44 | 75 | 108 | 138 | 147 | 132 | 100 | 51 | 15 | 4 |
| PhV-067 | 6 | 32 | 70 | 123 | 171 | 201 | 182 | 158 | 100 | 52 | 17 | 5 |
| PhV-071 | 4 | 23 | 44 | 77 | 119 | 151 | 157 | 143 | 100 | 53 | 16 | 4 |
| PhV-081 | 4 | 23 | 55 | 79 | 110 | 125 | 131 | 130 | 100 | 53 | 16 | 1 |
在pH2时测定的稳定性
为了测定在pH2时的稳定性，在缓冲液(250mM甘氨酸，3mg/ml BSA，pH 2)中将植酸酶样品稀释成30U/ml。在37℃温育样品30分钟。然后，用反应缓冲液(250mM乙酸钠，1mMCaCl2，0.01％ Tween 20，pH 5.5)将样品直接稀释成植酸酶活性测定的最佳测量范围(大约0.6U/ml)，并测量植酸酶活性。对于参照，在37℃，在反应缓冲液中以30U/ml的浓度平行温育样品30分钟，并同样地分析植酸酶活性。将pH胁迫的样品的活性标准化成参照值(设定为100％稳定性)。为了比较，在测定法中同样地使用市售植酸酶(BASF)。
表4：一些植酸酶变体和植酸酶Fus5#2以及市售植酸酶在pH2时的稳定性的测定。将稳定性>90％的样品标记为“稳定的”。为了更好地区分不稳定样品，以％表示测量的稳定性。
对胃蛋白酶的稳定性的测定
为了测定对胃蛋白酶的稳定性，在含胃蛋白酶的缓冲液(250mM甘氨酸，3mg/mlBSA，pH 2，10mg/ml胃蛋白酶(Sigma P-7000，445U/mg))中将植酸酶样品稀释成30U/ml。在37℃温育样品30分钟。然后，用反应缓冲液(250mM乙酸钠，1mM CaCl2，0.01％ Tween 20，pH5.5)将样品直接稀释成植酸酶活性测定的最佳测量范围(大约0.6U/ml)，并测量植酸酶活性。对于参照，在37℃，在反应缓冲液pH 5.5中以30U/ml的浓度平行温育样品30分钟，并同样地分析植酸酶活性。将胃蛋白酶处理的样品的活性标准化成参照值(设定为100％稳定性)。为了比较，在测定法中同样地使用市售植酸酶(BASF)
表5：一些植酸酶变体和植酸酶Fus5#2以及市售植酸酶对胃蛋白酶的稳定性的测定。将稳定性>80％的样品标记为“稳定的”。为了更好地区分不稳定样品，以％表示测量的稳定性。
Claims (13)
1.衍生自SEQ ID NO:24的植酸酶，所述植酸酶与SEQ ID NO:24相比的修饰是选自下述的累积修饰：
2.根据权利要求1的植酸酶，与根据权利要求1的植酸酶之一相比，所述植酸酶在至少一个位置具有至少一个保守氨基酸交换。
3.根据前面权利要求任一项的植酸酶，其是分离的植酸酶。
4.根据前面权利要求任一项的植酸酶，与来自莫氏耶尔森氏菌和哈夫尼菌属的两种野生型植酸酶相比，所述植酸酶具有增加的对胃蛋白酶的稳定性、增加的热稳定性和/或增加的特异性活性。
5.根据前面权利要求任一项的植酸酶，其中相对于SEQ ID NO:24，所述植酸酶在位置R18、H19、G20、R22、P24、H306和D307是未经修饰的。
6.编码植酸酶的分离的核酸序列，其编码根据权利要求1-5任一项的植酸酶之一。
7.重组表达载体，其包含根据权利要求6的核酸序列。
8.重组宿主细胞，其包含根据权利要求6的核酸序列或者根据权利要求7的载体。
9.重组生产生物，其包含根据权利要求6的核酸序列或者根据权利要求7的载体。
10.动物饲料添加剂，其包含根据权利要求1-5任一项的植酸酶中的至少一种和其他饲料添加剂。
11.动物饲料，其包含根据权利要求1-5任一项的植酸酶中的至少一种。
12.根据权利要求1-5任一项的植酸酶或者根据权利要求10的动物饲料添加剂在动物饲料中的用途。
13.根据权利要求1-5任一项的植酸酶或者根据权利要求10的动物饲料添加剂或者根据权利要求11的动物饲料的用途，用于降低家畜粪便中的磷酸盐含量。
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