CN109468299B

CN109468299B - 具有高催化功效的新的耐热植酸酶

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Publication number: CN109468299B
Application number: CN201811031544.9A
Authority: CN
Inventors: S·B·佩特科夫; N·S·欧基克洛夫
Original assignee: Huvepharma Eood
Current assignee: Huvepharma Eood
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2038-09-05
Also published as: TWI735801B; US11241029B2; RU2758271C2; ES2834472T3; RU2020109763A3; US20190069584A1; HUE051503T2; EP3453719A1; PT3453720T; HRP20201875T1; CA3074793A1; EP3453720B1; WO2019048440A1; TW201920665A; EP3750912A1; RU2020109763A; BR112020004628A2; EP3453720A1; CN109468299A; DK3453720T3

Abstract

本发明提供了植酸酶，其与商购可获得的植酸酶相比表现出令人惊讶的高热稳定性。此外，一些新的植酸酶变体显示出高达4倍的增加的催化速率，因此大大提高了植酸盐去磷酸化的速度。

Description

具有高催化功效的新的耐热植酸酶

技术领域

本发明提供了植酸酶，其与商购可获得的植酸酶相比表现出令人惊讶的高热稳定性。本发明还公开了具有改善的催化活性的变体。

背景技术

植酸酶是从植酸盐中释放无机磷酸盐的酶。植酸酶用作饲料添加剂以增加无机磷从饲料中的植酸盐的释放。目前在工业中使用的商业植酸酶应该具有高催化功效、单胃动物胃中的稳定性和高热稳定性，以便在饲料造粒期间的热处理后保留其大部分活性。

矿物质是所有生物生长的必需元素。对于单胃动物(例如猪、家禽)和鱼的牲畜生产，饲料通常补充有矿物质。植物种子是丰富的矿物质来源，因为它们含有与植酸的磷酸基团配合的离子。反刍动物不需要无机磷酸盐和矿物质，因为瘤胃中的微生物产生催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)转化为肌醇和无机磷酸盐的酶。在此过程中，释放出与植酸盐配合的矿物质。

植酸盐在几乎所有的植物饲料中作为储存磷的来源出现(Phytic Acid,Chemistry and Applications,E.Graf(Ed.),Pilatus Press:明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国,1986)。在谷物和豆类中，植酸形成种子的正常部分。它起到结合膳食矿物质的作用，该膳食矿物质对于从种子中生长出的新植物来说是必需的。当通过种子酶植酸酶除去植酸的磷酸基团时，结合金属离子的能力丢失并且该矿物质变得可用于植物。在牲畜饲料谷物中，植酸结合的微量矿物质仅部分可供单胃动物吸收，单胃动物缺乏植酸酶活性。尽管植酸盐的一些水解发生在结肠中，但大多数植酸盐通过单胃动物的胃肠道并且在粪便中排泄，导致在密集的牲畜生产区域中的粪便磷酸盐污染问题。结肠中释放的无机磷对家畜没有营养价值，因为无机磷仅在小肠中被吸收。因此，大量营养上重要的膳食矿物质对于单胃动物来说可能无法获得。

植酸盐向肌醇和无机磷的转化可以通过广泛称为植酸酶的微生物酶催化。植酸酶能够催化肌醇六磷酸盐水解成D-肌醇五磷酸盐和正磷酸盐。基于催化作用模式，存在两种类型的植酸酶：3-植酸酶(EC.3.1.3.8)，其去除肌醇环的1位和3位的磷酸基团；和6-植酸酶(EC.3.1.3.6)，其首先在环的6位释放磷酸盐。据报道，某些真菌植酸酶将肌醇五磷酸盐水解成四磷酸盐、三磷酸盐和更低的磷酸盐；例如，据报道，无花果曲霉(A.ficuum)植酸酶产生肌醇二磷酸盐和肌醇单磷酸盐的混合物(Ullah，1988)。产生植酸酶的微生物包括：细菌，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(V.K.Powar and V.J.Jagannathan,J.Bacteriol.151:1102-1108,1982)和假单胞菌(Pseudomonas)(D.J.Cosgrove,Austral.J.Biol.Sci.2:1207-1220,1970)；酵母，如酿酒酵母(Sacchoromycescerevisiae)(N.R.Nayini and P.Markakis,Lebensmittel Wissenschaft undTechnologie 17:24-26,1984)；和真菌，如土曲霉(Aspergillus terreus)(K.Yamada,etal.,Agric.Biol Chem.32:1275-1282,1968)。先前已经报道了能够产生植酸酶作为单胃动物的饲料添加剂的微生物的可能用途(Shieh和Ware等，美国专利第3,297,548号；Nelson,T.S.等,J.Nutrition 101:1289-1294,1971)。

据报道，微生物植酸酶也可用于从某些工业过程(例如小麦和玉米废物产品)生产动物饲料。玉米的湿磨过程产生作为动物饲料出售的麸质。据报道，添加植酸酶可以改善饲料产品的营养价值。

一类特定的6-植酸酶由来自大肠杆菌(E.coli)的appA基因编码。待克隆和测序的第一个appA基因(Gene bank：AAA72086.1)最初被认为是pH 2.5酸性磷酸酶(Dassa等，1990)。随着第二个appA2基因(Gene bank：AAR87658.1)的克隆及其在酵母中的大量生产，Rodriguez及其同事(Rodriguez等，1999)提供了直接证据证明appA酶是植酸酶而不是酸性磷酸酶。AppA和appA2在其成熟蛋白的编码区中含有6个氨基酸差异，即S102P、P195S、S197L、K202N、K298M和T299A(Rodriguez等，1999)。然而，appA和appA2都编码活性6-植酸酶(WO2003037102A3和WO1999067398A3)，因此appA蛋白和appA2蛋白都是大肠杆菌6-植酸酶的天然变体。目前，保存在数据库中的appA基因编码变体的数量约为450。许多保藏的appA蛋白含有在其编码区域中appA和appA2之间不同的六个氨基酸的组合变体。

已经在实验室中产生了其它appA酶变体，目的是实现改善的酶性质，例如固有的热稳定性、酶动力学或者提高在其生产宿主中的appA 6-植酸酶的生产率(Rodriguez等，2000；WO2001036607A1；WO 2006042719 A3；WO 2003037102 A2；WO 2006042719 A3；WO2003057247 A1)。

AppA植酸酶变体已经在酵母系统中生产，例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(也称为Komagataella phaffii)(Lee，2005；WO 1999067398 A9)和里氏木霉(Trichoderma reesei)(WO 1994003612 A1)。

除氨基酸195P、197S外，AppA2C与appA2(AAR87658.1)相同。最后两个与appA(AAA72086.1)相同。appA2C的序列在本文中如SEQ ID NO.1所示。因此，Appa2C是appA和appA2的杂交，具有天然存在的氨基酸变异。

本发明的总体目的是提供appA2C变体，其与appA2C相比表现出改善的热稳定性。优选地，这些变体保持相同的酶特征，例如宽的最适pH和快的酶动力学。此外，本发明的目的是提供表现出与WO 2003057247 A1和US2015132383A1中公开的植酸酶相比可比的或更高的热稳定性的appA2C变体。因此，将新的appA2C热稳定变体与两种商购可获得的植酸酶，即OptiPhos和Quantum Blue 5G(两者都基于来自大肠杆菌的appA基因变体)进行比较。新的appA2C热稳定变体应优选具有比这些植酸酶更高的或至少可比的热稳定性。

发明内容

本发明人惊奇地发现，与OptiPhos相比，appA2C的特定变体表现出显著改善的热稳定性。这些变体表现出特定的突变，即至少在SEQ ID NO.1(appA2C)的第26、84、159、181、207、233、277和349位。

具有令人惊讶的改善的热稳定性的第一亚变体是命名为PhOP-0093(SEQ IDNO.2)的变体。发现该变体与appA2C相比表现出改善的热稳定性，当在大肠杆菌中表达时，其在比appA2C高13.5℃的温度下保持50％的热稳定性(在79.5℃对比66℃时50％的热稳定性)；当在巴斯德毕赤酵母中表达时，其比appA2C高20℃(在86℃对66℃时50％热稳定性)。

PhOP-0093(即具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的植酸酶)的热稳定性与QuantumBlue 5G的热稳定性是可比的(89℃时50％热稳定性)。

本发明人还惊奇地发现，SEQ ID NO.2中的某些进一步的突变带来更高的热稳定性。在SEQ ID NO.1(appA2C)的第26、84、159、181、207、233、277和349位处显示突变，优选保留SEQ ID NO.2的氨基酸E26、W84、V159、Y181、N207、W233、D277和Y349的变体表现出热稳定性，即使SEQ ID NO.2中进行进一步的变化以产生SEQ ID NO.2的变体。因此，本发明提供：

1.选自下列的植酸酶

a)包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列[PhOP-0093的序列]的多肽，

b)包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的变体，其

(i)保留SEQ ID NO:2的以下氨基酸位置E26、W84、V159、Y181、N207、W233、D277和Y349，并且优选包括在第57、95、129、161、179、198、201、249、275、309位的一个或多个另外的突变，

(ii)在SEQ ID NO.2的E26、W84、V159、Y181、N207、W233、D277和Y349以外的位置含有一个或多个取代，

c)包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的变体，其

(i)保留SEQ ID NO.2的以下氨基酸位置E26、W84、V159、Y181、N207、W233、D277和Y349，以及

(ii)表现出与SEQ ID NO.2至少90％、优选95％、更优选98％、最优选99％的序列同一性；

d)包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列的蛋白的变体，其

(i)保留SEQ ID NO:2的以下氨基酸位置E26、W84、V159、Y181、N207、W233、D277和Y349，以及

(ii)与SEQ ID NO.2相比含有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。

优选地，本发明提供选自下列的植酸酶：

d’)包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列的蛋白的变体，其

(ii)与SEQ ID NO.2相比含有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，

其中与SEQ ID NO.2相比，所述变体含有1至10个、1至5个、优选1至3个氨基酸取代，和/或1至10个、1至5个、优选1至3个氨基酸添加，和/或1至10个、1至5个、优选1至3个氨基酸缺失。

在一个最优选的实施方案中，与SEQ ID NO.2相比，所述变体含有1至3个氨基酸取代，和/或1至3个氨基酸取代和/或1至3个氨基酸缺失。

e)与SEQ ID NO.2相比表现出一个或多个取代、添加或缺失的蛋白。

优选地，本发明提供选自下列的植酸酶：

e’)与SEQ ID NO.2相比表现出一个或多个取代，添加和/或缺失的蛋白。

其中与SEQ ID NO.2相比，所述蛋白含有1至10个、1至5个、优选1至3个氨基酸取代，和/或1至10个、1至5个、优选1至3个氨基酸添加，和/或1至10个、1至5个、优选1至3个氨基酸缺失。

2.根据实施方案1的植酸酶，其在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃表现出50％的热稳定性。

3.根据实施方案1或2的植酸酶，其在75℃表现出70％、80％、85％、90％或95％的热稳定性。

4.根据实施方案1-3中任一项的植酸酶，其在95℃表现出50％、55％、60％或65％的热稳定性，在80℃表现出80％的热稳定性，在85℃表现出80％的热稳定性，或者在90℃表现出80％的热稳定性。

5.根据实施方案1-4中任一项的植酸酶，其选自包含SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQID NO.11的氨基酸序列的多肽。

6.根据实施方案1b)的植酸酶，其中所述一个或多个另外的突变选自SEQ ID NO.2中的57Y、95P、129G、161R、179R/S/N、198P、201K、249E、275Y和309S。

7.根据实施方案6的植酸酶，其中一个或多个另外的突变位于第47、65和/或247位，优选47F、65P和/或247Y。

8.根据实施方案1-7中任一项的植酸酶，其在真菌宿主细胞，优选酵母宿主细胞中表达。

9.根据实施方案1-7中任一项的植酸酶，其在细菌宿主细胞，优选大肠杆菌中表达。

10.编码实施方案1-7中任一项的任何植酸酶的核酸序列。

11.包含实施方案10的核酸的载体。

12.包含实施方案10的核酸或实施方案11的载体的宿主细胞。

13.根据实施方案12的宿主细胞，其是真菌宿主细胞，优选酵母宿主细胞或细菌宿主细胞，优选大肠杆菌。

14.实施方案1-7中任一项的植酸酶用于从植酸盐中释放磷酸盐的用途。

15.实施方案1-7中任一项的植酸酶作为饲料成分的用途。

16.通过在根据实施方案12或13的宿主细胞中重组表达实施方案1-7中任一项的植酸酶来制备所述酶的方法。

17.实施方案1-7中任一项的植酸酶用于增加或改善饲料转化率的用途。

所述饲料转化率(FCR)是饲料投入(以kg计)与饲喂后获得的体重增加(以kg计)之比。

优选地，实施方案17中的植酸酶包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6之一的氨基酸序列。更优选地，所述植酸酶是PhOP-0136或PhOP-0161。

18.实施方案1-7中任一项的植酸酶用于提高动物饲料中可利用磷酸盐含量的用途。

骨骼(例如胫骨)中灰分(灰分主要由钙和磷酸盐组成)的百分比是饲料中可获得的膳食磷的量度。

优选地，实施方案18中的植酸酶包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6之一的氨基酸序列。更优选地，所述植酸酶是PhOP-0161或PhOP-0136。

19.实施方案1-7中任一项的植酸酶用于提高平均日增重的用途。

所述平均日增重(ADG)是动物每天平均体重增加。优选地，实施方案19中的植酸酶包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。更优选地，所述植酸酶是PhOP-0161。

附图说明

图1示出了与PhOP-wt(appA2C)和商购可获得的植酸酶Quantum Blue 5G相比，在毕赤酵母中表达的本发明的9个实施方案的热稳定性曲线。

图2示出了与PhOP-0093和PhOP-0122相比，在大肠杆菌中表达的本发明的11个实施方案的热稳定性曲线。

图3示出了来自产生appA2C、PhOP-0136、PhOP-0142、PhOP-0161、PhOP-0175和Quantum Blue 5G的巴斯德毕赤酵母的上清液的SDS-PAGE分析。

图4示出了纯化的植酸酶appA2C、PhOP-0136、PhOP-0142、PhOP-0161、PhOP-0175和Quantum Blue 5G的SDS-PAGE分析。

图5示出了将无机磷酸盐浓度P_i与820nm处的吸光度(A₈₂₀)相关联的校准曲线。包括四个不同微量滴定测定板(“Fag 1-12-1”、“Fag 1-12-2”、“Fag 1-17-1”、“Fag 1-17-2”)的数据点。

图6示出了与糊状物(即造粒之前)相比造粒后的植酸酶活性单位中活性酶的回收百分比。与OptiPhos在80℃和90℃下相比和与Quantum blue在90℃下相比，都获得了更高量的PhOP-0136、PhOP-0142、PhOP-0161和PhOP-0175。

图7示出了不同植酸酶对肉鸡生长性能的影响。第35天的最终体重和FCR。PhOP-136和PhOP-161表现出优异的性能，部分优于OptiPhos。

图8示出了不同植酸酶对肉鸡骨矿化的影响。第21天的胫骨灰分数据。PhOP-161表现出优异的性能，优于OptiPhos。

具体实施方式

与appA2C相比或者与OptiPhos相比，本发明提供了具有增加的热稳定性的植酸酶变体。所述变体命名为PhOP-变体(“植酸酶大肠杆菌”变体)。一些明确的变体如SEQ IDNO.2-11所示。这些变体中氨基酸的编号遵循SEQ ID NO.1(appA2C)的编号，其对应于Rodriguez等，1999中公布的野生型植酸酶appA2(AAR87658.1)的编号。AppA2和appA2C包含432个氨基酸，包括天然信号序列(22个氨基酸)，随后是成熟的植酸酶序列(410个氨基酸)。所述天然信号序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明的植酸酶变体表现出优异的热稳定性。通过将植酸酶加热15分钟至一定温度，随后冷却至37℃后，在37℃(体温)的温度下测量残留的植酸酶的酶活性来确定“热稳定性”。将酶暴露15分钟至25℃，并随后在37℃下测量酶活性来测定参考酶活性。通过与该后者酶活性比较计算相对活性。

50％热稳定性(“TM50值”)是酶在热处理后保持其活性的50％的温度。TM50值指示酶热稳定性的评估和比较。

AppA基因变体可以在任何真核或原核表达系统中表达。优选地，在密码子使用优化后，在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中生产appA植酸酶变体。优选地，将编码PhOP-变体植酸酶的合成基因变体克隆到质粒中，用于在大肠杆菌中使用强启动子(如T7启动子)表达或者在巴斯德毕赤酵母中使用强启动子(如AOX)表达。为了实现到周质(大肠杆菌)或培养基(毕赤酵母)中的分泌，使用天然信号序列(大肠杆菌，长22个氨基酸)或α交配因子(毕赤酵母，长89个氨基酸)作为N末端信号序列并融合到appA2C成熟蛋白。

优选地，PhOP-植酸酶变体在摇瓶中或96孔板中在大肠杆菌中表达。一个优选的启动子是强T7启动子。优选地，过夜培养每个孔中含有一个单克隆的预培养物。收获后，通过使细胞悬液在裂解缓冲液(100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)、2mM MgCl₂、0.5mg/ml溶菌酶，20U/ml NuCLEANase)中进行三次冷冻-解冻循环来裂解细胞。离心并在分离细胞碎片同时收集上清液之后获得粗细胞提取物。

优选地，植酸酶的酶活性通过如下筛选实验来测定：植酸酶在宿主细胞中表达，优选大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母宿主细胞。将来自大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母的酶提取物在选择用于加热步骤的温度下以及在冰上培养和离心后的室温(参考)下培养15分钟。然后在37℃(体温)下测定植酸酶活性。通过改编Kim和Lei,J.Anim.Sci.2005.83:1062–1067的方法进行96孔板中的植酸酶的酶活性。

通过两步法从植酸盐中释放的磷酸盐通过光度法测定：

第一步：通过植酸酶从植酸盐中释放Pi

第二步：测定Pi(作为磷钼酸盐配合物)

方案1：植酸酶活性测定的反应方案

表1描述了9个明确的变体(SEQ ID NO.3-11)以及SEQ ID NO.2(PhOP-0093)。这些变体表现出非凡的热稳定性。

表1：与appA2C相比的九种明确的appa2C变体(SEQ ID NO.3-11)。这些变体表现出非凡的热稳定性。

SEQ ID NO:2是PhOP-0093的序列，SEQ ID NO:3是PhOP-0136的序列，

SEQ ID NO:4是PhOP-0138的序列，SEQ ID NO:5是PhOP-0142的序列，

SEQ ID NO:6是PhOP-0161的序列，SEQ ID NO:7是PhOP-0169的序列，

SEQ ID NO:8是PhOP-0175的序列，SEQ ID NO:9是PhOP-0176的序列，

SEQ ID NO:10是PhOP-0179的序列，SEQ ID NO:11是PhOP-0180的序列。

令人惊讶地发现，appA2C(SEQ ID NO.1)在第26、84、159、181、207、233、277和349位处的突变对于热稳定性的增加是必需的。虽然氨基酸序列的其它突变或变化是可能的，甚至是有益的，但导致PhOP-0093的appA2C序列的这8个突变(相对于SEQ ID NO:1具有突变26E、84W、159V、181Y、207N、233W、277D和349Y)是改善热稳定性的关键。如果植酸酶在细菌细胞(优选大肠杆菌)中表达，则热稳定性增加(参见表2)。

表2：在大肠杆菌中表达的植酸酶的热稳定性(TM50值)。在加热15分钟至各自的温度后测定热稳定性曲线；与“加热”15分钟至25℃相比较测定相对活性。

表3：巴斯德毕赤酵母中植酸酶的热稳定性(TM50值)。在加热15分钟至各自的温度后测定热稳定性曲线；参考“加热”15分钟至25℃测定相对活性。

在酵母宿主细胞而不是细菌宿主细胞中表达的植酸酶表现出甚至更高的热稳定性。这如表3中所示。所有变体表现出与Quantum Blue 5G可比的或更高的热稳定性。原始数据如图1所示。

表现出令人惊讶的高热稳定性的PhOP-0093的其它变体如下所示。

本发明的一些植酸酶变体具有SEQ ID NO:2-11的植酸酶变体的氨基酸序列。本发明的所有植酸酶变体的特征在于催化植酸盐水解成肌醇和游离磷酸盐，同时从植酸配合物中释放出矿物质，并具有改善的热稳定性。

本发明还包括具有与植酸酶多肽的序列“基本上相同”的序列的多肽。“基本上相同”的氨基酸序列是仅通过保守氨基酸取代而与参考序列不同的序列，例如，将一个氨基酸取代为另一个相同类别的氨基酸(例如，用一种疏水性氨基酸，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，取代另一种，或用一种极性氨基酸取代另一种，例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺)。

本发明的植酸酶变体的片段保留至少一种植酸酶特异性活性或表位。通过检查植酸盐转化为肌醇和游离磷酸盐可以测定植酸酶活性。

例如，含有例如至少8-10个氨基酸的片段可用作植酸酶特异性抗体生产中的免疫原。除了它们作为肽免疫原的用途之外，上述植酸酶片段可用于免疫测定，例如ELISA，以检测样品中植酸酶特异性抗体的存在。

本发明中包括的其它植酸酶变体是具有与SEQ ID NO.2表现出至少90％，优选为95％，更优选为98％，最优选为99％的序列同一性的氨基酸序列的变体。

用于测定氨基酸序列同一性的氨基酸序列的长度可以是，例如，至少20个氨基酸，例如，至少25或35个氨基酸。优选地，用于确定氨基酸序列同一性的氨基酸序列的长度是400个氨基酸，更优选410个氨基酸，最优选432个氨基酸。可以使用标准序列分析软件(例如，遗传计算机组的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package of theGenetics Computer Group)，威斯康星大学生物技术中心(University of WisconsinBiotechnology Center)，1710大学街，麦迪逊，威斯康星53705；也参见之前的Ausubel等)测量同一性。这样的程序和算法包括例如BLAST程序(国家生物信息中心的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center forBiological Information))、ALIGN、AMAS(多重比对序列分析(Analysis of MultiplyAligned Sequences))、AMPS(蛋白多序列比对(Protein Multiple SequenceAlignment))、ASSET(比对区段统计评估工具(Aligned Segment Statistical EvaluationTool))、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(生物序列比较分析节点(Biological SequenceComparative Analysis Node))、BLIMPS(区块改进搜索器(BLocks IMProved Searcher))、FASTA、Intervals&Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman算法、DARWIN、Las Vegas算法、FNAT(强制核苷酸比对工具(Forced Nucleotide Alignment Tool))、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky序列分析包(Fristensky Sequence Analysis Package))、GAP(全球比对程序(Global Alignment Program))、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(敏感序列比较(Sensitive Sequence Comparison))、LALIGN(本地序列比对(Local SequenceAlignment))、LCP(本地内容程序(Local Content Program))、MACAW(多重比对构建和分析工作台(Multiple Alignment Construction&Analysis Workbench))、MAP(多重比对程序(Multiple Alignment Program))、MBLKP、MBLKN、PIMA(模式诱导的多序列比对(Pattern-Induced Multi-sequence Alignment))、SAGA(遗传算法的序列比对(Sequence Alignmnetby Genetic ALgorithm))和WHAT-IF。

本发明的植酸酶多肽可以使用重组表达系统(见下文)，化学合成(该方法可能更适合于小植酸酶肽片段)，或从天然表达它们的生物体中纯化而获得。

本发明还提供了编码上述植酸酶多肽的分离的核酸分子。例如，编码SEQ ID NO:2-11中任一个的核酸包括在本发明中。这些核酸可含有天然存在的核苷酸序列，或仍然编码相同氨基酸序列的简并序列。本发明的核酸序列可含有DNA或RNA核苷酸，或者它们的组合或修饰。

本发明还涉及包括本发明的核酸序列的载体，经遗传工程改造以包括本发明的载体的宿主细胞和通过重组技术进行本发明的酶的生产。

用含有本发明的核酸序列的载体对宿主细胞进行遗传工程改造(转导或转化或转染)。这些载体可以是例如克隆载体或表达载体。所述载体可以是例如以质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。工程改造的宿主细胞可以在适当改进的常规营养培养基中培养，以活化启动子、选择转化子或扩增本发明的基因。诸如温度、pH等的培养条件是适合于选择用于表达的宿主细胞的培养条件，并且对于普通技术人员会是显而易见的。

本发明的核酸序列可用于通过重组技术生产酶。因此，例如，核酸序列可以包括在用于表达酶的多种表达载体中的任何一种中。这些载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病)的组合的载体。然而，可以使用任何其它载体，只要它在宿主中是可复制的和可存活的。

可以通过多种方法将合适的核酸序列插入载体中。通常，通过本领域已知的方法将DNA序列插入到一个或多个合适的限制性内切核酸酶位点。这些方法和其它方法被认为是在本领域技术人员的知识范围内。

表达载体中的核酸序列与合适的表达控制序列(启动子)可操作地连接以指导mRNA合成。作为此类启动子的代表性实例，可提及：LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λP_L启动子和其它已知控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的启动子。所述表达载体还可含有用于翻译起始和转录终止子的核糖体结合位点。所述载体还可以包括用于扩增表达的合适序列。

此外，表达载体优选含有一个或多个选择标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，例如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、博来霉素或新霉素抗性，或如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

含有如本文以上所述的合适的DNA序列以及合适的启动子或控制序列的载体可用于转化合适的宿主以允许宿主表达多肽。

作为合适宿主的代表性实例，可提及：细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，例如果蝇S2(Drosophila S2)和夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)；动物细胞腺病毒；植物细胞等。根据本文的教导，合适宿主的选择认为是在本领域技术人员的知识范围内。优选的宿主细胞是细菌和真菌宿主细胞。更优选的是酵母，包括例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)、假丝酵母属(Candida)和卡尔文斯基属(Karwinskia)的种类。酵母可以是甲基营养菌株，例如毕赤酵母属、汉逊酵母属、球拟酵母属、假丝酵母属和卡尔文斯基属的菌株。如上所述，所述宿主细胞可以是非酵母细胞。特别感兴趣的非酵母细胞包括例如曲霉属(Aspergillus)种类、木霉属(Trichoderma)种类、脉孢属(Neurospora)种类、毁丝霉属(Myceliopthora)种类、青霉属(Penicillium)种类、芽孢杆菌属(Bacillus)种类和乳球菌属(Lactococcus)种类。

重组植酸酶可以通过使用细胞内表达或通过细胞外分泌进入细胞培养基来生产。

通常通过离心收获宿主细胞，通过物理或化学方法破碎宿主细胞，并保留所得粗提取物用于进一步纯化。

用于表达酶的宿主细胞可以通过任何方便的方法破碎，包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员公知的。

可以通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱的方法从重组细胞培养物中回收和纯化酶。必要时，在完成成熟蛋白的构型中可以使用蛋白质重折叠步骤。最后，高效液相色谱(HPLC)可用于最终的纯化步骤。

本发明的酶可以是纯化的天然产物，或化学合成程序的产物，或通过重组技术从原核或真核宿主获得(例如，通过培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞)。取决于重组生产程序中使用的宿主，本发明的酶可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的酶可以包括或不包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。

本发明的酶可用于任何其中这种酶活性是必要的或需要的目的。在一个优选的实施方案中，所述酶用于催化植酸酶的水解。植酸盐的降解可能对动物饲料有益。

实施例

1一般方法和分析

1.1在大肠杆菌中的表达和在筛选程序(微量滴定板(MTP)形式)中制备PhOP-野生型和变体

PhOP-在大肠杆菌中的表达：用携带具有其天然N-末端信号序列的PhOP-基因的质粒pLE1A17(pRSF-1b的衍生物，Novagen)转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在补充卡那霉素(50mg/l)的ZYM5052培养基中培养(F.William Studier,Protein Expression andPurification 41(2005)207–234)并在30℃下生长过夜。收获细胞并在裂解缓冲液(100mM柠檬酸钠缓冲液，pH 5.5，2mM MgCl₂，0.5mg/ml溶菌酶，20U/ml NuCLEANase(c-LEctaGmbH))中通过三次冻-融循环裂解。离心并从细胞碎片中收集上清液后获得粗细胞提取物。

1.2植酸酶体积活性(volumetric activity)的测定

一般原理是通过如方案1中所示的两步反应光度测定从植酸盐释放的Pi。

第一步：通过植酸酶从植酸盐中释放Pi

第二步：测定Pi(作为磷钼酸盐配合物)

方案1：植酸酶活性测定的反应方案

在由1％(w/v)植酸盐、0.2M柠檬酸钠组成的缓冲液(pH 5.5)中通过植酸酶的作用从植酸盐中释放无机磷酸盐(Pi)。在37℃培养30分钟后，通过加入1体积的15％三氯乙酸(TCA)停止植酸酶反应。通过将植酸酶样品与15％TCA混合，然后与底物缓冲液混合，获得用于测定植酸酶样品的潜在磷酸盐污染的空白测定对照。在第二步中，在植酸酶反应期间释放的Pi通过与钼酸铵配合来确定。将停止的反应测定用H₂O稀释10倍，并将75μl稀释的样品与75μl配合试剂(0.5％钼酸铵、0.6M硫酸、2％抗坏血酸)混合。在37℃培养60分钟后，测量波长820nm处的吸收。通过与磷酸盐校准曲线比较进行定量。

通过这种方法，可以在很宽的范围内非常精确地确定Pi浓度。在一个优选的实施方案中，测定在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中表达的植酸酶的植酸酶活性。

1.3 Tm50值的测定(热稳定性)

Tm50值定义为酶在热处理后保留其活性的50％的温度，因此是评价指标并且与酶的热稳定性的比较相关。将含有植酸酶的样品在58-99℃的温度下进行热处理15分钟，并与在25℃培养的样品进行比较，以使残余活性标准化。在冰上进行再生步骤30分钟并离心除去沉淀的蛋白后，使用1.2节中描述的筛选试验测定样品中的体积活性。通过绘制残余活性针对培养温度的图，从这些图中得到Tm50值。

1.4毕赤酵母中PhOP-变体的亚克隆和表达

通过在大肠杆菌系统中筛选而选择的变体的基因亚克隆到毕赤酵母表达质粒pLE3B06中，在AOX-启动子的控制下。为了实现分泌到培养基中，大肠杆菌系统中使用的天然N-末端信号序列被α-交配因子信号序列取代。用线性化的pLE3B06-PhOP-构建体完成巴斯德毕赤酵母菌株LE3A100的转化。通过用100μg/ml博来霉素补充毕赤酵母标准培养基YPD来选择阳性转化克隆。将PhOP-克隆在BMGY培养基中在30℃下摇瓶预培养过夜。在甲醇诱导AOX启动子后，在毕赤酵母标准培养基BMMY中进行表达。BMGY和BMMY培养基描述于ThermoFisher Scientific的毕赤酵母表达试剂盒K1710-01手册中。用1/30体积的BMGY预培养物接种BMMY培养物。每24小时通过加入0.5％(v/v)诱导剂甲醇而培养表达培养物。表达进行72小时，然后离心并回收培养上清液。为了除去BMMY标准培养基中存在的磷酸盐，在活性测定之前将上清液重新缓冲到0.2M柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)中。使用来自GEHealthcare的PD-10柱按照制造商的方案进行重新缓冲。

2.PhOP工程

提高酶性能及其在工业过程中的适用性的方法是酶工程。该技术涉及开发具有改进性质的起始酶的变体(例如参见综述，S.Lutz,U.T.Bornscheuer,Protein EngineeringHandbook,Wiley VCH,Weinheim,2009)。使用1.1和1.2中描述的方法在大肠杆菌中产生和筛选PhOP-的变体库。用于酶工程的模板酶是PhOP-0093(SEQ ID NO.2)。

在一般的酶工程策略中，筛选具有单个氨基酸突变的植酸酶变体，随后将有益突变重组在一起以产生新的库。

首先，在PhOP-0093的变体库筛选中，鉴定了一系列具有改善的热稳定性的酶变体(表4)。

表4：测试的变体的活性数据

进一步重组单个突变和库筛选产生了一系列具有显著改善的热稳定性并且在第57、95、129、161、179、198、201、249、275和309位含有多种氨基酸交换组合的变体(表5)。

表5：非常有前景的变体：测试的那些中最稳定的20种变体

对于11种变体的选择(在表5中的右列中标记)，生成热稳定性曲线以确定与PhOP-0093和PhOP-0122相比的Tm50值(图2)。热稳定性曲线显示：通过有益突变的重组，相对于来自突变体库中最稳定的变体PhOP-0122，Tm50值的提高了约6-8℃，或与PhOP-0093相比提高了约8-10℃。考虑到PhOP-0093(来自大肠杆菌)相对于OptiPhos参考稳定性提高了13.5℃，来自大肠杆菌的重组变体比OptiPhos参考更稳定21.5-23.5℃。数据示出在表6中。

预期由毕赤酵母制备的变体比在大肠杆菌中表达的变体更稳定。因此，根据1.4节选择在大肠杆菌中测试的8种变体和在所有10个位置携带有益突变的另外的第9种变体(PhOP-0180)用于随后的亚克隆和在毕赤酵母中的表达。这些变体的热稳定性如表7和图1所示。

表6：在大肠杆菌中表达的本发明的优选实施方案

表7：在巴斯德毕赤酵母中表达的本发明的优选实施方案

热稳定性曲线的比较(图1)显示，与OptiPhos参考相比，所产生的所有最终PhOP-变体的稳定性都有很大提高。增强的Tm50值显示热稳定性增加24.5℃至>33℃。与模板变体PhOP-0093相比，热稳定性进一步提高4.5℃至13℃。因此，所有最终变体显示出比商购可获得的植酸酶Quantum Blue 5G更高的热稳定性。最稳定的变体PhOP-0161和PhOP-0175比Quantum Blue 5G至少稳定约10℃。由毕赤酵母表达和糖基化的变体比来自大肠杆菌的酶更稳定，并且它们在高温下不会完全失活，而是保留相当高的30％或更高的残余活性(例如PhOP-0161在99℃培养后具有约60％的残余活性)。

3.具有提高的植酸盐二磷酸化催化速率的新的热稳定变体

在巴斯德毕赤酵母中表达四种新的高度热稳定的植酸酶变体，并纯化至同质。它们的Michaelis-Menten动力学在类似于单胃动物消化道的条件(即pH为2-4，温度为39℃)下进行了非常详细的研究。

图3示出了产生appA2C、PhOP-0136、PhOP-0142、PhOP-0161、PhOP-0175和QuantumBlue 5G商业产品的巴斯德毕赤酵母上清液的SDS-PAGE分析。

使用常规色谱和超滤的组合来纯化重组蛋白，并且使用植酸盐作为底物在体外动力学研究中分析它们的酶性质。

图4示出了纯化的植酸酶的SDS-PAGE分析：appA2C、PhOP-0136、PhOP-0142、PhOP-0161、PhOP-0175和Quantum Blue 5G。

4.动力学参数的确定

在pH范围2.0-4.0和温度39℃的甘氨酸-HCl反应缓冲液中测定植酸盐水解的不同动力学参数，二者均与动物(家禽和猪)消化道相关。使用范围为0.02-0.17mM的底物浓度，由Lineweaver-Burk图计算不同植酸酶制剂的Km和Vmax值。

变体PhOP-0136被认为是特别令人感兴趣的，因为除了其高热稳定性外，它还显示出对植酸盐的高催化速率Kcat。变体PhOP-0161也很令人感兴趣，因为相比于在pH范围2-4的OptiPhos和Quantum Blue 5G，它具有高Kcat/Km比，表明更高的底物特异性和催化效率的组合(也称为催化完美性)(Berg,J.M.,Tymoczko,J.L.,Stryer,L.,Berg,J.M.,Tymoczko,J.L.,&Stryer,L.(2002).Biochemistry(第5版).W H Freeman.第8.4节TheMichaelis-Menten Model Accounts for the Kinetic Properties of Many Enzymes.)。

表8示出了在不同pH值下测定的纯化植酸酶的所有动力学参数(Vmax、Km、Kcat和Kcat/Km)：

5.造粒测试

在造粒实验中测试OptiPhos、Quantum Blue和本发明的四种酶的热稳定性。该试验显示了与OptiPhos和Quantum Blue相反的本发明酶的改善的热稳定性的实际相关性。在80℃和90℃的高温下造粒饲料约1分钟，本发明的酶比OptiPhos和Quantum blue更稳定。该实验的数据示出在图6中。

在用蒸汽调节80℃和90℃的条件下将成批的肉鸡饲料造粒。肉鸡饲料由Cibus NV提供。在立式螺杆混合器中将200,00g酶与200kg肉鸡饲料混合。混合15分钟后，在用蒸汽调节的不同温度下将饲料在具有4×50mm模头的Labor Monoroll Pellet磨机上造粒。

造粒后，在环境空气温度下用强制空气冷却器立即冷却颗粒。

图6示出了：与糊状物(即造粒前)相比造粒后的活性酶的回收百分比(通过活性测定法ISO30024:2009测定)。在80℃和90℃下与OptiPhos相比以及在90℃下与Quantum blue相比，获得了更高量的PhOP-0136、PhOP-0142、PhOP-0161和PhOP-0175。

6.饲料功效测试

在波兰的瓦尔米亚玛祖里大学(University of Warmia and Maszury)的试验中，测试了新植酸酶PhOP-0136和PhOP-0161的效果，并与ROSS 308雄鸡的OptiPhos进行了比较。

该研究的目的是评估不同植酸酶对性能参数的影响，例如体重增加和作为磷酸盐掺入的指示的骨矿化。共有1056只健康的日龄雄性Ross 308肉鸡(原鸡(Gallus gallus))被分成8个处理组(T1-8)：

T1- 阳性对照(P足够)

T2- 阴性对照(P减少)

T3- 阴性对照+PhOP-0136-250FTU/kg

T4- 阴性对照+PhOP-0136-500FTU/kg

T5- 阴性对照+PhOP-0161-250FTU/kg

T6- 阴性对照+PhOP-0161-500FTU/kg

T7- 阴性对照+PhOP-0175-250FTU/kg

T8- 阴性对照+TSP 175-500FTU/kg

这些鸡被放在地面围栏中—总共96个围栏，每个围栏0.7m²。每个处理组具有12个围栏(重复实验)，每个围栏中有11只鸡—每个处理组132只鸡。饲养周期的长度为35天。这些鸡在孵化场进行性别鉴定，以确保只选择雄性，并在运到农场后随机分配到单独的处理组和重复实验。该试验在一个普通的禽舍进行，采用人工照明程序，自动燃气加热和强制通风。加热程序是根据Ross(Ross Manual(2014):www.aviagen.com)的建议进行的。从第1天到第3天，温度约为29-30℃，然后在第21天缓慢降低至21℃，并将该温度保持在21℃直至研究结束。湿度在65-70％之间直到第9天，然后在60-70％之间直到实验结束。随意供应饲料和水。

测试材料是由Huvepharma制备的6-植酸酶制剂：PhOP-0136、PhOP-0161和OptiPhos。对于所有三种植酸酶，每次提供两种预混合物，用载体(小麦粉)预稀释，以实现当以500g/吨添加到饲料中时，进料中的浓度分别为250FTU/kg和500FTU/kg。使用ISO30024:2009方法验证饲料中添加的植酸酶的水平。

不同处理组的用载体(小麦粉)预稀释的植酸酶中的植酸酶活性和相应植酸酶产品的批号如下所示：

在荷兰的饲料厂Research Diet Services中制备基础饲料混合物。将混合物在70℃下造粒。基础饲料混合物的组成和营养价值见表9和表10。为了避免由于饮食中磷不足导致的阴性对照组(T2)的健康问题，来自所有处理组的鸡接受相同的起始饮食至第5天来满足肉鸡的营养需求。(表9)。阳性对照饲料混合物是T1组的实验饮食，阴性对照饲料混合物是T2-T8组的实验饮食。以这样的方式配制饮食以获得约1.5g/kg的阴性对照饮食和阳性对照饮食之间的可利用磷的差异。通过使用阴性对照饮食混合物并添加相应的植酸酶制剂来制备T3-T8的实验饮食。

在饲养期间，使用颗粒形式的饲料阶段：

·1-5天—起始饮食(所有处理组相同)

·6-21天—生长饮食

·22-35天—结束饮食

饮食的组成如表9和10所示

表9.阳性对照饮食的组成，％

表10.阴性对照饮食的组成，％

测量

下面将使用以下缩写

缩写	含义
		BW	体重
FI	采食量
		FCR	饲料转化率
ADG	平均日增重
		ADFI	平均日采食量

在第1、5、21和35天测量肉鸡的体重(BW)(围栏基)。针对实验周期：1-5、6-21、22-35和1-35天测量饲料消耗(采食量，FI)。对于骨灰分析：在每个围栏中取21日龄具有平均体重的鸡2只，然后取出右胫骨并合并两个样品。分析样品的灰分含量百分比，并且如果需要，将灰分残余物分开储存以进行进一步分析。

研究时间表如下：

6.1起始周期的生长表现(1-5天)

在实验开始时，一日龄鸡的平均体重为38.9g。在起始周期(1-5天)，每只鸡平均消耗121.0g饲料，平均饲料转化率为1.100kg/kg。在此周期，所有处理组都接受相同的起始饮食。

6.2体重(BW)和平均日增重(ADG)

在第5天称重后，在主要实验开始之前，当需要在所有处理组中达到相同的平均体重时，在处理组之间交换重复实验。在生长周期(第21天)结束时处理组之间的体重(BW)存在显著差异。来自PC组(T1)的鸡比来自NC组(T2)和所有植酸酶补充组的鸡显著更重，唯一的例外是T6的鸡(500FTU/kg饲料的PhOP-161)，其具有与PC组类似的体重。此外，在生长周期结束时，与NC组(T2)相比，在处理组T3-T8中添加植酸酶制剂显著提高了体重和平均日增重(ADG)。在结束周期中(22-35天)，PC组的鸡和来自所有植酸酶处理组(除了T30—只有接近显著的趋势，P＝0.074)的鸡的ADG显著高于NC处理组(T2)。PC组(T1，10.80％)和来自所有植酸酶处理组(从T7中的7.70到T6中的12.44％)的鸡的实验结束时(第35天)的体重和整个实验(6-35天)的ADG显著比来自NC组(T2)的鸡更高。来自所有植酸酶处理组的鸡在整个测试期间显示出彼此以及与PC相似的最终BW和ADG。所有处理组(NC-T2除外)的最终体重均高于Ross 308标准(2.283kg)。

6.3平均日采食量(ADFI)

总体而言，在生长周期(6-21天；P＝0.055)和整个实验周期(6-35天；P＝0.070)，处理组之间的平均日采食量存在接近显著的差异，在生长周期，来自T5(PhOP-161-250FTU/kg)和T6(PhOP-161-500FTU/kg)组的鸡倾向于比NC(T2)处理组消耗更多的饲料(0.05<p<0.10)。对于整个实验，T6组的鸡比NC组(T2)的鸡倾向于消耗更多的饲料。在结束周期(22-35天)，处理对平均日采食量有显著影响。来自T5组(PhOP-161-250FTU/kg)和T6组(PhOP-161-500FTU/kg)的鸡比NC组(T2)的鸡消耗显著更多的饲料，另外T6组的鸡的消耗量显著高于T3组(PhOP-136-250FTU/kg)的鸡。

6.4饲料转化率(FCR)

在生长周期(6-21天)处理组的FCR存在显著差异。T2组(NC)的鸡—在数值上显示最差的FCR，并且PC组的鸡(T1)和T6组的鸡(以500FTU/kg的PhOP-161)比来自NC组(T2)的那些鸡显著更好地转化饲料。T5(PhOP-161-250FTU/kg)和T7(OptiPhos-250FTU/kg)是仅有的具有显著差于PC组(T1)的FCR的植酸酶处理组。在结束周期(22-35天)，PC组的鸡和来自所有植酸酶处理组(T6除外—仅接近显著的趋势，P＝0.051)的鸡的FCR值显著低于NC处理组(T2)。

在整个实验期间(6-35天)，PC组的鸡(T1)的FCR显著优于NC组(T2)和T7组(OptiPhos-250FTU/kg)的鸡(分别为-6.49％和-2.86％)。与NC组(T2)相比，来自所有植酸酶补充处理组(T3-T8)的鸡显著改善FCR(分别在T7和T8中从-3.73％至-6.13％)。来自T3-T6和T8组的鸡显示出与T1组(PC)的鸡相似的FCR。

6.5胫骨灰分

与阳性对照的鸡(T1)相比，阴性对照的鸡(T2)的饮食中可利用钙和磷水平的降低导致胫骨灰分含量显著降低。来自所有植酸酶处理组(T3-T8)的鸡的特征在于与阴性对照的鸡(T2)相比显著更高的胫骨灰分含量。来自T6组(PhOP-161-500FTU/kg)和T8组(OptiPhos-500FTU/kg)的鸡具有与T1组(PC)的鸡相似的胫骨灰分含量。

6.6结论

向NC组饮食添加250FTU/kg和500FTU/kg的不同植酸酶制剂对以下方面产生显著的积极影响：

1)实验周期来自所有植酸酶补充组(T3-T8)的鸡的BW和ADWG，

2)来自所有植酸酶补充组的鸡的FCR，

3)来自所有植酸酶补充组的胫骨灰分，

数据示出在下表11至13以及图7和8中。总体而言，PhOP-161在所有实验(BW、ADG、FCR和胫骨灰分)中证明是最有前景的。此外，PhOP-136在所有实验中表现出优异的性能，具有类似于商购OptiPhos的数据。

数据显示，本发明提供的新植酸酶变体从饲料中释放出可利用的磷，并提供优异的肉鸡生长性能参数，例如骨矿化、BW、ADG和FCR。

表11示出了鸡的平均日增重(ADG，以g计)，在第5天和第21天之间、第21天和第35天之间以及第35天针对纯化的植酸酶进行测定。具有不同上标的栏内的值在P<0.05时显著不同：

表12示出了鸡的饲料转化率(FCR，以kg/kg计)，在第5天、第21天和第35天之间以及第5天和第35天之间针对纯化的植酸酶进行测定。具有不同上标的栏内的值在P<0.05时显著不同。

表12的数据也示出在图7中。

表13示出了第35天不同处理组的胫骨中灰分含量的百分比。具有不同上标的栏内的值在P<0.05时显著不同：

表13的数据也示出在图8中。

7.总结

本发明的工程植酸酶的起点是植酸酶变体PhOP-0093，其热稳定性已经比OptiPhos植酸酶提高了20℃。热稳定性的进一步改善取得了很好的成功。大肠杆菌中的诱变和筛选使PhOP-0093的温度提高了3℃。有益突变的重组导致比PhOP-0093进一步明显增强的8-10℃的稳定性。从筛选宿主大肠杆菌到最终生产宿主巴斯德毕赤酵母，很好地完成了这些稳定性改进的转移并且再次通过糖基化作用增强。

与商购植酸酶相比，PhOP-变体获得的整体热稳定性改善在24.5℃至33℃之间(OptiPhos)和1.5℃至10℃(Quantum Blue 5G)之间。

与序列appA2C(PhOP-wt)相比，最终变体携带16-18个突变：

表14：优选突变体中突变的概览

序列表

<110> 浩卫制药股份有限公司（HUVEPHARMA EOOD）

<120> 具有高催化功效的新的耐热植酸酶

<130> FP1F181689ZX

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-wt (AppA2c)

<400> 1

Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val

20 25 30

Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln

50 55 60

Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro

65 70 75 80

Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val

100 105 110

His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu

115 120 125

Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile

130 135 140

Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn

165 170 175

Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln

210 215 220

Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu

260 265 270

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-0136

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-0138

<400> 4

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<210> 5

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-0142

<400> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-0161

<400> 6

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<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-0169

<400> 7

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-0175

<400> 8

Gln Ser Glu Glu Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

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<210> 9

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-0176

<400> 9

Gln Ser Glu Glu Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

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405 410

<210> 10

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-0179

<400> 10

Gln Ser Glu Glu Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

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115 120 125

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130 135 140

Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Asn His Tyr Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Pro

165 170 175

Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asn Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

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His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Tyr Phe Asp Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Ser Ala

275 280 285

Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu

305 310 315 320

Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu

340 345 350

Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

355 360 365

Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu

370 375 380

Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 11

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 从Q23开始的成熟植酸酶变体; PhOP-0180

<400> 11

Gln Ser Glu Glu Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val

20 25 30

Thr Pro Tyr Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg Gln

50 55 60

Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro

65 70 75 80

Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Gly Cys Ala Ile Thr Val

100 105 110

His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu

115 120 125

Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Arg Val Thr Asp Ala Ile

130 135 140

Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Asn His Tyr Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Pro

165 170 175

Leu Cys Lys Asn Arg Glu Lys Gln Asn Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Trp Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln

210 215 220

Gln Ala Glu Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Tyr Phe Asp Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Ser Ala

275 280 285

Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu

305 310 315 320

Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu

340 345 350

Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

355 360 365

Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu

370 375 380

Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 12

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 来自AppA2c（E. coli）的原生周质前导肽

<400> 12

Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr

1 5 10 15

Pro Gln Ser Ala Phe Ala

20

Claims

1.一种植酸酶，其中所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-11中任一所示。

2.编码权利要求1所述的植酸酶的核酸。

3.包含权利要求2所述的核酸的载体。

4.包含权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的载体的宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其是真菌宿主细胞或细菌宿主细胞。

6.权利要求1所述的植酸酶用于从植酸盐中释放磷酸盐的用途。

7.权利要求1所述的植酸酶作为饲料成分的用途。

8.通过在根据权利要求4或5所述的宿主细胞中重组表达权利要求1所述的植酸酶来制备所述植酸酶的方法。