CN115725635A

CN115725635A - 一株毕赤酵母突变菌及其在中性植酸酶生产中的应用

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Publication number: CN115725635A
Application number: CN202210893930.9A
Authority: CN
Inventors: 鲍锴; 程斯达; 康丽华; 张静静
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2022-07-28
Filing date: 2022-07-28
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株毕赤酵母突变菌及其在中性植酸酶生产中的应用。所述突变菌株为毕赤酵母ZZ‑1‑69（Pichia pastoris ZZ‑1‑69）的保藏编号为CCTCC NO：M20221139，能大幅度提高中性植酸酶的产量，其摇瓶发酵上清液酶活高达13750 U/ml，比出发菌提高了67%，有利于降低该酶的生产成本，促进其在水产饲料领域中的广泛应用。

Description

一株毕赤酵母突变菌及其在中性植酸酶生产中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株毕赤酵母突变菌及其在中性植酸酶生产中的应用。

背景技术

磷是一种所有动物生长都需要的重要矿物质，参与体内几乎每一种生理生化反应。目前饲料中主要通过添加无机磷来满足动物对磷的需求。但是在以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷，只不过它们主要以动物不能利用的植酸磷的形式存在。植酸磷是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1-5％。但是因动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用，其利用率仅在0-40％。

植酸酶(EC.3.1.3.8)是一种能水解植酸的酶类，它能将植酸磷降解为肌醇和磷酸。植酸酶广泛存在于各种微生物中，如假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、酵母、曲霉等。植酸酶对单胃动物的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷排泄量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此对提高畜牧业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。

目前植酸酶已经广泛应用于饲料行业，因为对单胃畜禽而言，植酸酶的主要作用场所是胃，因而要求植酸酶在酸性条件下要有较高的酶活性，即酶反应的最适pH值为酸性的植酸酶，它们最适pH都在6.0以下，在pH6.5以上基本没有酶活性。目前市售的植酸酶主要为这类植酸酶。

而在无胃水产动物如淡水养殖的主要鱼类（清鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲂鱼）的消化道中，由于没有胃酸的分泌，消化道中pH值约呈中性，因而在鱼类饲料中必需使用在中性pH值条件下有高活性的植酸酶。有研究证明，在水产养殖中植酸酶替代部分磷酸二氢钙表现出了较好的养殖效果和环境效益。罗琳等(2007)在基本花鲈试验研究表明用中性植酸酶部分替代磷酸二氢钙是完全可行的，并得出中性植酸酶1000U/kg替代80％左右的磷酸二氢钙综合生长效果最佳，也证明中性植酸酶存在一定的广谱应用性。高特异性、高活性的中性植酸酶的研究与开发具有重要的理论意义和应用价值，有着广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一株毕赤酵母突变菌及其在中性植酸酶生产中的应用。所述突变菌是通过紫外诱变方法筛选获得的，中性植酸酶产量明显高于出发菌，可广泛应用于中性植酸酶的生产。

本发明一方面涉及一种重组质粒，其携带有中性植酸酶基因。

所述中性植酸酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ IDNO：2。

本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有上述重组质粒。

本发明还涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

所述突变菌株为毕赤酵母ZZ-1-69（Pichia pastoris ZZ-1-69），已于2022年7月20日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221139。

本发明还涉及一种发酵生产中性植酸酶的方法，是以上述毕赤酵母突变菌为发酵菌株。

有益效果

本发明将来源于耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）的中性植酸酶基因转入毕赤酵母宿主细胞中，构建得到重组表达中性植酸酶基因的工程菌毕赤酵母ZZ-1，其摇瓶发酵上清液中中性植酸酶酶活最高达到8240U/ml；然后以毕赤酵母ZZ-1为出发菌，通过紫外诱变筛选获得突变菌株毕赤酵母ZZ-1-69。该突变菌能大幅度提高中性植酸酶的表达量，其摇瓶发酵上清液中中性植酸酶酶活高达13750 U/ml，比出发菌提高了67%，可作为中性植酸酶的发酵生产菌株，有利于降低该酶的生产成本，促进其在水产饲料领域中的广泛应用。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

试剂：植酸钠购自Sigma公司；实验所用的限制性内切酶购自TaKaRa公司；分子试剂盒购自OMEGA公司；T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司； G418购自Invitrogen公司；其它所用试剂为国产分析纯试剂。

质粒与菌株：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k购自Invitrogen公司。

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。

实施例1 基因克隆

以来源于耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）的中性植酸酶基因（GenBank号为WP_127696848.1）的氨基酸序列为基础，分析该酶的氨基酸序列，去除其自身的信号肽，再根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化，由华大基因公司进行全基因合成。将该中性植酸酶基因命名为ZZ-1，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQID NO：2。

根据基因序列，设计上下游引物，通过PCR反应克隆中性植酸酶ZZ-1的基因片段，引物和反应条件如下：

上游引物1(F)：GCGCGAATTCCATCAAGCTGATGAAGTTAATCATT（下划线处为EcoR I酶切位点）；

下游引物1(R)：TAAAGCGGCCGCTTATTCATCAGATCTATCTTTCAAT（下划线处为Not I酶切位点）。

PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min20s，35个循环后，72℃保温10min。ZZ-1基因全长1071bp。

实施例2毕赤酵母工程菌的构建

1、重组质粒的构建

将克隆得到的中性植酸酶ZZ-1基因和表达载体pPIC9K，分别用限制性内切酶EcoRI和Not I进行双酶切，100 μl酶切体系如下：中性植酸酶ZZ-1基因的 PCR产物/表达载体pPIC9K 40 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、EcoR I 5 μl、Not I 5 μl、ddH₂O 30μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将电泳回收好的双酶切产物ZZ-1片段与表达载体pPIC9K连接，构建表达载体pPIC9K-ZZ-1。连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物5 μl、ZZ-1基因双酶切产物3 μl、10×T₄ ligase buffer 1 μl、T₄ ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0）中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-ZZ-1。

2、酵母转化、筛选和摇瓶发酵

将重组酵母表达质粒pPIC9K-ZZ-1用Sal I进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板（1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油、2%琼脂糖）。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素G418的YPD平板（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）上筛选多拷贝的转化子。

挑取单个多拷贝转化子分别接入BMGY培养基（2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油）中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基（2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇）中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心取上清液进行中性植酸酶酶活力测定。

结果显示，本发明构建得到的毕赤酵母工程菌在摇瓶水平下发酵上清液中中性植酸酶酶活最高达到8240U/ml。将酶活水平最高的转化子命名为毕赤酵母ZZ-1（Pichia pastoris ZZ-1）。

实施例3 紫外诱变筛选

诱变育种是指用物理、化学因素诱导动植物和微生物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以毕赤酵母ZZ-1为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其中性植酸酶的产量。

将毕赤酵母ZZ-1接种于YPD平板，30℃培养2-3天，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1×10⁶个/mL，紫外灯（40W）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板，30℃培养48h。

前两轮紫外诱变共获得了约300个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有200ul BMGY液体培养基的96孔板，30℃、250rpm振荡培养1天后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMMY培养基，30℃、250rpm振荡培养2天，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2天后，离心去除菌体，得到含中性植酸酶的上清液，分别测定上清液中中性植酸酶的活力。

结果显示，前两轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中中性植酸酶酶活高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了41轮诱变筛选，最终获得1株中性植酸酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名毕赤酵母ZZ-1-69（Pichia pastorisZZ-1-69）。

所述突变菌株在摇瓶发酵条件下其发酵上清液中中性植酸酶酶活力高达13750U/ml，比出发菌提高了67%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2022年7月20日将毕赤酵母ZZ-1-69（Pichia pastorisZZ-1-69）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221139。

本发明提供的毕赤酵母突变菌可广泛应用于中性植酸酶的生产，有利于降低该酶的生产成本，促进其在水产饲料领域的广泛应用。

中性植酸酶酶活检测方法

1、酶活力定义

在温度为25℃、pH为6.5的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

2、原理

植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能与钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH₄)₃PO₄NH₄VO₃·16MoO₃]复合物，在波长415nm下进行比色测定。

3 试剂与材料

本标准中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。清洗试验用容器要用不含磷的清洗剂。

3.1 0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅰ)

称取34.02g三水乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O )于1000mL烧杯中，加入900mL水,用玻璃棒搅拌至完全溶解，用冰乙酸酸调节pH至6.50±0.01，并用去离子水定容至1000mL，室温下存放一个月有效，放置2周以上需要重新校准 pH。

3.2 0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅱ)

称取34.02g三水乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O )、0.5g Triton X-100和0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000mL烧杯中，加入900mL水，用玻璃棒搅拌至完全溶解，用冰乙酸酸调节pH至6.50±0.01，并用去离子水定容至1000mL，室温下存放一个月有效，放置2周以上需要重新校准pH。

3.3 7.5mmol/L植酸钠溶液

用玻璃烧杯配制，称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂，分子量923.8)于100mL烧杯中，加入80mL乙酸缓冲液Ⅰ，用洁净的玻璃棒间隔性持续搅拌直至溶解，然后用冰乙酸调节pH至6.50，转移至100mL容量瓶中，用缓冲液Ⅰ定容至100mL，现用现配。

3.4 硝酸溶液：1＋2 水溶液。

3.5 100g/L钼酸铵溶液

称取10g钼酸铵于100 mL烧杯中，加入约80mL水，用玻璃棒搅拌至完全溶解，然后加入1 mL氨水(25%) 并混合均匀，转移至100 mL容量瓶，用去离子水定容至刻度，混合均匀。

3.6 2.35 g/L钒酸铵溶液

在分析天平上准确称取钒酸铵0.235g备用，取100 mL烧杯加入50 mL去离子水，电炉上加热至沸腾，沸腾后将沸水从电炉上取下，放在实验台上，立即加入已准备好的钒酸铵粉末，玻璃棒搅拌至完全溶解，然后立即加入40 mL去离子水，搅拌均匀并冷却至室温，然后加入2 mL硝酸溶液，混合均匀，去离子水定容至100 mL，转移至棕色试剂瓶中存放。

注意事项：避光室温保存，1周内使用有效。

3.7 酶解反应终止及及显色液

取2份硝酸溶液、1份钼酸铵溶液、1份钒酸铵溶液，混合均匀后使用，现用现配。

3.8 磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：基准物。

4、标准曲线

准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液Ⅰ溶解，并定容至100mL，浓度为50.0mmol/L。按表1的比例用乙酸缓冲液Ⅰ稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y=ax＋b)。

表 1 标准稀释比例

标准溶液序号	稀释量/ mL	浓度/ (μmol/L)
			1	0.5 → 1	25.000
2	0.5 → 2	12.500
			3	0.5 → 4	6.2500
4	0.5 → 8	3.1250
			5	0.5 → 16	1.5625

5、反应酶液准备

5.1 固体样品

准确称取1g酶制剂样品 (精确至0.0001g) 于100mL三角瓶中，加入50mL乙酸-乙酸钠缓冲液Ⅱ，磁力搅拌30min，4000rpm离心10min，取上清即为浸提酶液。用乙酸-乙酸钠缓冲液Ⅱ稀释至约0.4 U/mL，控制最终比色的吸光值在0.4~0.6范围内。

5.2 包衣固体样品

取3~5g包衣固体酶制剂样品于合适大小的研钵中，碾碎、研磨至包衣破碎。然后同普通固体样品相同操作。

用乙酸-乙酸钠缓冲液Ⅱ稀释至约0.4 U/mL，控制最终比色的吸光值在0.4~0.6范围内。

6、反应

取4支18×180mm 试管(1支作为空白、另外 3 支作为平行) 按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支试管中加入的时间间隔要绝对一致。

反应步骤及试剂、溶液用量见表 2。

表 2 反应步骤及试剂、溶液用量

反应顺序	样品、标准品	样品空白
			1. 加乙酸缓冲液(5.1)	1.8mL	1.8mL
2. 加待反应酶液	0.2mL	0.2mL
			3. 混合	∨	∨
4. 25℃预热 5min	∨	∨
			5. 依次加入底物溶液(5.3)	4mL (第一步)	4mL (第二步)
6. 混合	∨	∨
			7. 25℃水浴中酶解 30min	∨	∨
8. 依次加入终止液(5.7)	4mL (第二步)	4mL (第一步)
			9.混合	∨	∨
总体积	10mL	10mL

7、样品的测定

反应后的试样在室温静置10min显色，若出现浑浊需要在离心机上以4000r/min离心10min，以空气调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A0 )和样品溶液(A)的吸光值，A-A0为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。

8、结果计算

U=F×C / (m×30)。

式中：

U—试样中植酸酶的活性，U/mL（或U/g）；

C—根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的无机磷的量，单位为μmol；

F—试样溶液反应前的总稀释倍数；

m—试样质量，g；

30—反应时间，min。

9、重复性

同一样品两个平行测定值的相对偏差，植酸酶产品不大于5%。

Claims

1.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有中性植酸酶基因。

2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述中性植酸酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有权利要求1或2所述的重组质粒。

4.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述的突变菌是以权利要求3所述的毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

5.如权利要求4所述的毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述突变菌为毕赤酵母ZZ-1-69（Pichia pastoris ZZ-1-69），已于2022年7月20日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221139。

6.一种生产中性植酸酶的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求4或5所述的毕赤酵母突变菌为发酵菌株。