CN110577946B

CN110577946B - 酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用

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Publication number: CN110577946B
Application number: CN201810578897.4A
Authority: CN
Inventors: 肖志壮; 张稳; 薛海曌; 方安然
Original assignee: Qingdao Red Cherry Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Red Cherry Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2038-06-07
Also published as: CN110577946A

Abstract

本发明提供了酶活性和耐热性提高的β‑甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用。本发明通过对原始基因来源于黑曲霉的β‑甘露聚糖酶突变体使用易错PCR方法对β‑甘露聚糖酶糖酶MAN‑1基因进行进一步改造，再使用高通量筛选方法挑选出正突变，经过一轮易错PCR，最终获得4个酶活显著提高的新的突变体，本发明获得的β‑甘露聚糖酶糖酶突变体与原始基因相比，突变体的酶活性和耐热性得到显著提高，有利于实现其在商业中的应用，从而降低生产成本。

Description

酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

β-甘露聚糖酶作为一种酶制剂，近年来已在饲料、食品、医药等领域得到了广泛的应用。β-甘露聚糖酶(β-l，4-D-mannan mannohy-drolase,EC3.2.1.78)是一类能水解含β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露聚糖(包括均一甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖)的半纤维素酶，具有一般非淀粉多糖(NSP)酶类的作用——降解NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收外，还可以促进类胰岛素生长因子(IGF—I)的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆饼的能量消化率。由于动物摄食、营养和饲料加工过程的特殊需求，提高酸性β-甘露聚糖酶的温度耐受性具有非常重要的意义。

酶分子定向进化是定向改造酶结构和功能的新型策略和有效的技术手段。它模拟酶自然进化的过程，利用基因工程各种技术手段，以较低的比率向目的基因中随机引入突变或将目的基因进行重组，从而获得突变体文库，再借助一定的筛选方法，选出所需特性得到优化的酶。定向进化的目的在于人为地对天然酶的某些性质加以改变，以便能增强其在工业生产环境中的稳定性，创造天然酶所不具备的某些优良特性，甚至创造出新的活性，产生新的催化能力，从而扩大酶作为生物催化剂在工业生产中的应用范围。该技术的优势在于不需要深入了解目标蛋白的结构信息，可简单快速实现对目标蛋白的定向进化。

易错PCR(epPCR)是基于大幅增加DNA Taq聚合酶总体错配频率的一种常用定向进化方法。该法主要是利用提高DNA聚合酶突变频率，在PCR过程中向目的基因中以一定频率引入突变从而获得突变体。

发明内容

本发明的目的是提供了酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用。本发明通过随机突变β-甘露聚糖酶氨基酸序列来提高其酶活性，本发明的另一目的是提供了包含上述突变得到的β-甘露聚糖酶基因的重组载体。将突变得到的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到重组酵母表达质粒。本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体MAN-DE01由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

本发明提供了酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE02，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE02的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的突变体MAN-DE02由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第246位氨基酸由天冬酰胺变为谷氨酰胺、第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

本发明提供了酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE03，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE03的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的突变体MAN-DE03由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第50位氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸、第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

本发明提供了酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE04，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE04的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的突变体MAN-DE04由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第25位氨基酸由亮氨酸变为组氨酸、第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

本发明提供了酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE05，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE05的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述的突变体MAN-DE05由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第51位氨基酸由丙氨酸变为天冬氨酸、第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

本发明提供了所述的MAN-DE01的编码基因、或所述的MAN-DE02的编码基因、或所述的MAN-DE03的编码基因。

本发明提供了所述的MAN-DE04的编码基因、或所述的MAN-DE05的编码基因。

本发明提供了含有所述的MAN-DE01的编码基因的表达载体、或含有所述的MAN-DE02的编码基因的表达载体、或含有所述的MAN-DE03的编码基因的表达载体、或含有所述的MAN-DE04的编码基因的表达载体、或含有所述的MAN-DE05的编码基因的表达载体。

本发明提供了耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01、MAN-DE02、MAN-DE03、MAN-DE04或MAN-DE05在用于制备动物饲料添加剂中的应用。

所述动物为鱼类、对虾、猪、鸡和鸭。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明通过对来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的β-甘露聚糖酶使用易错PCR方法对β-甘露聚糖酶糖酶MAN-1基因进行改造，再使用高通量筛选方法挑选出正突变，经过两轮易错PCR，最终获得5个酶活显著提高的突变体，分别为MAN-DE01、MAN-DE02、MAN-DE03、MAN-DE04和MAN-DE05，其酶活与原始β-甘露聚糖酶相比，酶活分别提高了32％、58％、80％、99％和89％，在这5个突变体中，MAN-DE03和MAN-DE05的耐热性与原始β-甘露聚糖酶相比也有大幅提高，在85℃处理3min条件下，相对酶活分别是野生型的4.3倍和5.3倍。本发明获得的β-甘露聚糖酶糖酶突变体与野生型相比，突变体的酶活性和耐热性得到显著提高，有利于实现其在商业中的应用，从而降低生产成本。

附图说明

图1为β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01与野生型氨基酸序列比较结果；

图2为β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE02与野生型氨基酸序列比较结果；

图3为β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE03与野生型氨基酸序列比较结果；

图4为β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE04与野生型氨基酸序列比较结果；

图5为β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE05与野生型氨基酸序列比较结果；

图6为β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01、MAN-DE02、MAN-DE03、MAN-DE04和MAN-DE05与野生型的酶活比较测定结果。

图7为β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01、MAN-DE02、MAN-DE03、MAN-DE04和MAN-DE05与野生型的耐热性质比较测定结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。

实施例1：易错PCR(error–prone PCR)方法构建β-甘露聚糖酶MAN-1突变文库

β-甘露聚糖酶MAN-1由362个氨基酸组成(见SEQ ID NO:1)，是由来源于黑曲霉的β-甘露聚糖酶天然氨基酸序列改造而成，根据已公开的MAN-1基因序列信息，全基因合成方法合成了β-甘露聚糖酶MAN-1全基因序列(申请公布号：CN106119219A)。合成的基因两端还带有EcoR I和Not I酶切位点，以便于和表达载体进行连接。采用MAN-1基因序列(见SEQIDNO：2)为模板扩增β-甘露聚糖酶糖酶MAN-1基因，使用

PCRRandomMutagenesis Kit随机突变PCR试剂盒(Clontech)随机引入突变。

所用引物为：

5′-GCGCGAATTCCTGCCGAAAGCCTCCCCTGCACCG-3′(SEQ IDNO：8)，

5′-TAAAGCGGCCGCTTAGGCGCTATCAATAGCAGCAAC-3′(SEQ IDNO：9)。下划线处分别为EcoR I和Not I酶切位点。

反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性60s，58℃退火60s和72℃延伸1min20s，共25个循环。经过1％琼脂糖电泳后，使用胶回收试剂盒回收目的基因片段。

将目的片段用EcoR I和Not I双酶切消化后，与经过相同酶切的pET 21a(+)载体(氨苄抗性基因)用Ligase进行连接反应。将连接好的片段转化至大肠杆菌BL21-DE3，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养，待平板上出现转化子后，挑取单克隆至96孔板，每孔中含有150uL LB培养基(含有1mM IPTG，50μg/mL氨苄青霉素)，同时每个孔板接种野生型基因表达菌株作为对照，30℃220rpm震荡培养12h，将孔板置于-20℃，反复冻融破壁，获得含有β-甘露聚糖酶的粗酶液。用排枪分别取20uL粗酶液加入到新的96孔板，加入20uLβ-甘露聚糖酶底物(角豆胶)反应后，用DNS法测定酶活力。

取酶活力比野生型MAN-1高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选验证。最终筛选到1个突变体，为MAN-DE01，酶活力高于野生型对照，挑取单克隆送基因测序公司测序。

测序结果显示，如图1所示，本轮易错PCR获得了一个含N339F单点突变的突变体MAN-DE01(其氨基酸序列为SEQ ID NO：3)。

Mutation:339N→F(第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸，其对应的DNA序列由AAT变为TTT)。

实施例2：第二轮易错PCR突变文库的构建和筛选突变文库的构建

将第一轮易错PCR方法筛选到的突变体MAN-DE01提取质粒作第二轮易错PCR的模板，突变文库的构建过程，使用的引物，PCR反应条件，同实施例1。通过以上过程，同样获得了大量的突变体基因片段。将构建得到的突变体转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，筛选高活性正突变时以MAN-DE01为对照，其余操作与实施例2相同，取活性比突变型MAN-DE01高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。筛选到4个酶活性提高的突变体，命名为MAN-DE02、MAN-DE03、MAN-DE04和MAN-DE05。挑取单克隆送基因测序公司测序。

测序结果显示，如图2所示，本轮易错PCR获得了一个含N339F和N246Q两点突变的突变体MAN-DE02(其氨基酸序列为SEQ ID NO：4)。

MAN-M02：Mutation:246N→Q(第246位氨基酸由天冬酰胺变为谷氨酰胺，其对应的DNA序列由AAC变为CAA)；

如图3所示，本轮易错PCR获得了含N50D和N339F两点突变的突变体MAN-DE03，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5。

MAN-DE03：Mutation:339N→F(第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸，其对应的DNA序列由AAT变为TTT)；

Mutation:50N→D(第50位氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸，其对应的DNA序列由AAC变为GAT)。

如图4所示，本轮易错PCR获得了含L25H和N339F两点突变的突变体MAN-DE04，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6。

MAN-DE04：Mutation:25L→H(第25位氨基酸由亮氨酸变为组氨酸，其对应的DNA序列由CTC变为CAC)；

如图5所示，本轮易错PCR获得了含N339F和A51D两点突变的突变体MAN-DE05，其氨基酸序列为SEQ ID NO：7。

MAN-DE04：Mutation:51A→D(第51位氨基酸由丙氨酸变为天冬氨酸，其对应的DNA序列由GCG变为GAC)。

实施例3：毕赤酵母工程菌株的构建

使用实施例1中所述引物，以实施例1和实施例2获得的突变体作为模板进行PCR扩增，得到了5条两端带有EcoR I和Not I酶切位点的β-甘露聚糖酶突变体基因。PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min20s，30个循环，72℃延伸10min。

将上述克隆得到的β-甘露聚糖酶突变体基因片段和原始β-甘露聚糖酶基因MAN-1基因片段经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，和同样经过双酶切的pPIC9k载体相连接，构建表达载体pPIC9K-MAN-DE01、pPIC9K-MAN-DE02、pPIC9K-MAN-DE03、pPIC9K-MAN-DE04、pPIC9K-MAN-DE05和pPIC9K-MAN-1。

将以上表达载体用Sac I进行线性化，线性化片段用片段纯化试剂盒(TaKaRaMiniBEST DNA Fragment Purifibation Kit)纯化收集后，通过电转化方法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。将在MD平板上生长出的菌落涂布到浓度依次逐渐升高(1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL)的遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的阳性转化子，得到毕赤酵母重组菌株。

将5个基因的转化子分别命名为毕赤酵母MAN-DE01(Pichia pastoris MAN-DE01)、毕赤酵母MAN-DE02(Pichia pastoris MAN-DE02)、毕赤酵母MAN-DE03(Pichiapastoris MAN-DE03)、毕赤酵母MAN-DE04(Pichia pastoris MAN-DE04)、赤酵母MAN-DE05(Pichia pastoris MAN-DE05)和毕赤酵母MAN-1(Pichia pastorisMAN-1)，分别挑取每个基因的转化子转接于BMGY培养基中，30℃，220rpm振荡培养18h后，离心获得菌体，将适量菌体转入BMMY培养基中，使菌体浓度达到OD600＝1，30℃，220rpm继续振荡培养，每24h添加培养体积1％的甲醇。诱导表达3d后，将培养液离心获得上清，将上清液进行β-甘露聚糖酶活力测定和耐热性质测定。

β-甘露聚糖酶酶活力检测方法：

β-甘露聚糖酶活性的测定：吸取2mL经过适当稀释的酶液，加入到刻度试管中，再加入2mL浓度为0.6％(w/v)的甘露聚糖溶液，震荡3s，50℃下温育30min。加入5mLDNS试剂，震荡均匀，沸水浴加热5min，冷却至室温，加水定容到25mL，在540nm处测定吸光度。

β-甘露聚糖酶耐热特性测定：将待测酶液使用pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至约20U/mL，在75℃、80℃和85℃条件下分别处理3min后，测定残余酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算相对酶活。

DNS试剂配制方法：称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌后水浴至45℃，缓慢加入100mL 0.2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。冷却至室温后，用去离子水定容至1000ml。此时溶液应清澈透明(如浑浊应重新配制)，储存在棕色瓶中并混合均匀，避光保存。室温下存放7天后标定标准曲线，有效期为6个月，每2个月重新标定曲线。

酶活单位与定义：在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

酶活测定结果：如图5所示。按照上述方法测定得到毕赤酵母MAN-1发酵上清液的酶活为169U/mL，而毕赤酵母MAN-DE01、毕赤酵母MAN-DE02、毕赤酵母MAN-DE03、毕赤酵母MAN-DE04和毕赤酵母MAN-DE05发酵上清液的酶活分别为223U/mL，267U/mL，305U/mL，336U/mL和319U/mL，酶活水平分别提高了32％、58％、80％、99％和89％。

酶的耐热性特性测定结果：如表1和图6所示。按照上述方法测定得到的耐热数据为：原始基因在75℃、80℃和85℃相对酶活分别64％、50％和12％；MAN-DE01在75℃、80℃和85℃相对酶活分别63％、50％和10％；MAN-DE02在75℃、80℃和85℃相对酶活分别67％、53％和11％；MAN-DE03在75℃、80℃和85℃相对酶活分别91％、82％和52％；MAN-DE04在75℃、80℃和85℃相对酶活分别68％、49％和12％；MAN-DE05在75℃、80℃和85℃相对酶活分别95％、88％和64％。经过耐热性质的测定发现，MAN-DE01、MAN-DE02和MAN-DE04的耐热性质与原始基因相比，基本不变，而MAN-DE03和MAN-DE05的耐热性质与原始基因相比有较大幅度提高，尤其在85℃，相对酶活是原始基因的4-6倍。

实施例4：β-甘露聚糖酶的养殖应用实验

4.1实验设计

4.1.1实验分组

实验使用毕赤酵母MAN-DE03(Pichia pastoris MAN-DE03)所发酵生产的甘露聚糖酶酶制剂产品作为饲料添加物。实验分为5组，添加甘露聚糖酶的分为4组，各组添加量分别为300U/kg、600U/kg、1200U/kg、2400U/kg(酶制剂/饲料)，对照组(C)投喂基础饲料，不添加甘露聚糖酶。每组4个重复，即4个水族缸，每个水族缸养殖10尾南美白对虾。实验前选择体重、体长相似的健康南美白对虾200尾，平均体重(9.6±0.1)g，随机分与20个水族缸中，驯养1周后开始实验，饲喂周期为40d。

4.1.2实验管理与粪便收集

室内空调控温，温度在20～24℃。实验期间，每天投喂2次，时间分别为7：00和17：00，日投喂量为体重的5％(根据对虾摄食情况调节投喂量，过量投喂)。每天收集残饵2次，时间为投饵后一小时，即8：00和18：00。饲喂15d后，开始收集粪便，时间为每天换水之前。用虹吸方法将残饵和粪便收集于小烧杯中，用适量淡水清洗，洗去盐份，70℃烘干，共收集25d。每天吸污以后，更换三分之一新鲜海水，5d彻底换水一次。

表2基础饲料营养成分

4.2样品处理与测定指标

实验结束前24h停止投喂。取样时，先将对虾从水中捞出，用干滤纸轻轻吸取表面水分，用1/100的电子天平称量体重，记录重量。

测定指标：

特定生长率(％·day-1)(Specific growth rate，SGR)＝100×(lnWt-lnW0)/t；

饵料系数＝摄食量/增重量＝(W1-W2)/Wt-W0)；

消化率(％)＝(摄食量-粪便量)/摄食量＝[(W1-W2)-W3]/W1-W2；

其中：W0和Wt分别表示初始体重和终末体重，t表示试验天数，W1、W2、W3分别表示投饵量、残饵量、粪便量。

数据分析：

试验数据采用平均值±标准误差表示，采用SPSS 13.0软件进行数据分析和统计，先对数据作单因素方差分析，若组间差异显著，再用Duncan进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

4.3结果与分析

表3.β-甘露聚糖酶对对对虾特定生长率、消化率和饵料系数的影响

处理	特定生长率(％/d)	消化率(％)	饵料系数
				对照	0.75±0.13	84.46±0.65	2.54±0.79
实验1组(300U/kg)	0.88±0.19	87.97±2.96	2.36±0.68
				实验2组(600U/kg)	0.89±0.09	88.07±2.03	2.42±0.47
实验3组(1200U/kg)	1.03±0.07	88.96±3.53	2.08±0.20
				实验4组(2400U/kg)	0.85±0.13	83.62±3.44	2.39±0.57

添加不同剂量β-甘露聚糖酶对对虾特定生长率、消化率和饵料系数的影响见表3。从表3可以看出，1200U/kg组的SGR与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，比对照组提高了37.3％，以上结果表明，向饲料中添加不同剂量的复合酶对南美白对虾特定生长率(SGR)有不同程度的促进作用。25天的消化率测定结果显示，各添加剂量对消化率均有一定程度提高作用，1200U/kg组消化率最高，比对照组平均提高了5.3％，差异显著(P<0.05)，此外300U/kg、600U/kg两组消化率介于对照组和1200U/kg组之间，与前后两者均无显著性差异(P>0.05)。对试验对虾40天生长过程中的饵料系数进行了测定，结果显示，与对照组相比，添加不同剂量甘露聚糖酶的实验组，其饵料系数未达到显著差异(P>0.05)，但均有降低趋势。

本实验在对虾基础饲料中添加不同剂量的β-甘露聚糖酶，研究β-甘露聚糖酶对对虾特定生长率、消化率和饵料系数的影响。实验结果表明对虾基础饲料中添加不同剂量的β-甘露聚糖酶可以不同程度提高对虾的特定生长率和消化率，降低饵料系数，从而提高饲料的利用率，降低饲养成本。

本实施例4为了便于体现本发明所述的β-甘露聚糖酶的应用，并不限于对虾的应用，因为所述的β-甘露聚糖酶可以添加到基础饲料中，可以用于其他水产动物及畜禽的饲喂。通常可以在鱼类、猪、肉鸡和鸭等养殖过程中在其基础日粮中添加。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛红樱桃生物技术有限公司

<120> 酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用

<130> HCP12018099

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 362

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ala Ala Ser

1 5 10 15

Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu

20 25 30

Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr

35 40 45

Asp Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro

65 70 75 80

Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr

85 90 95

Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser

100 105 110

Ser Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr

115 120 125

Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr

145 150 155 160

Gln Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala

165 170 175

Val Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp

180 185 190

Thr Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys

195 200 205

Gly Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly

210 215 220

Leu Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly

225 230 235 240

Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr

245 250 255

Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn

260 265 270

Gly Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro

275 280 285

Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu

290 295 300

Gly Pro Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp

305 310 315 320

Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp

325 330 335

Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val

340 345 350

Thr Asp His Val Ala Ala Ile Asp Ser Ala

355 360

<210> 2

<211> 1089

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

ctgccgaaag cctcccctgc accgagcacc agcagcagtg ctgcctccac ctccttcgcc 60

agcacctccg gcctccaatt caccattgat ggcgaaactg gctacttcgc cggaacgaac 120

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taaagcggcc gcttaggcgc tatcaatagc agcaac 36

Claims

1.酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体MAN-DE01由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

2.酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE02，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE02的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的突变体MAN-DE02由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第246位氨基酸由天冬酰胺变为谷氨酰胺、第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

3.酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE03，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE03的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的突变体MAN-DE03由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第50位氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸、第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

4.酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE04，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE04的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的突变体MAN-DE04由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第25位氨基酸由亮氨酸变为组氨酸、第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

5.酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE05，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE05的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述的突变体MAN-DE05由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第51位氨基酸由丙氨酸变为天冬氨酸、第339位氨基酸由天冬酰胺变为苯丙氨酸获得。

6.权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01的编码基因、或权利要求2所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE02的编码基因、或权利要求3所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE03的编码基因。

7.权利要求4所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE04的编码基因、或权利要求5所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE05的编码基因。

8.含有权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01的编码基因的表达载体、或含有权利要求2所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE02的编码基因的表达载体、或含有权利要求3所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE03的编码基因的表达载体、或含有权利要求4所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE04的编码基因的表达载体、或含有权利要求5所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE05的编码基因的表达载体。

9.耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01、MAN-DE02、MAN-DE03、MAN-DE04或MAN-DE05在用于制备动物饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01、MAN-DE02、MAN-DE03、MAN-DE04或MAN-DE05的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7 。

10.根据权利要求9所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-DE01、MAN-DE02、MAN-DE03、MAN-DE04或MAN-DE05在用于制备动物饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述动物为鱼类、对虾、猪、鸡和鸭。