CN115975992B - 一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用 - Google Patents
一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用。本发明将来源于地衣芽孢杆菌的溶菌酶基因经过优化后，在C末端融合6个氨基酸的输水短肽，然后进行随机突变，筛选获得酶活性提高的突变体LyM1、LyM2、LyM3，和原始溶菌酶相比，酶活性分别提高了33.5％、56％、81％，其具有很好的抑制致病菌的作用。本发明还利用含溶菌酶突变体的工程菌经发酵、过滤干燥制得的酶制剂与胆汁酸进行混合制得胆汁酸酶制剂，可明显提高水产动物的增重率，并明显降低饵料系数，进而促进水产动物的生长，使其在水产养殖中有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用。
背景技术
溶菌酶广泛存在于人体多种组织中，以及鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁中。溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶，其主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，进而具有抑菌作用。但天然来源的溶菌酶一般活性较低，需要较高的添加量才会具有比较理想的抑菌效果，因此在“替抗”的环境下，寻找或设计安全、抑菌效果好的溶菌酶是亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种酶活提高的溶菌酶突变体及胆汁酸酶制剂和应用。本发明通过筛选获得酶活性提高的溶菌酶突变体LyM1、LyM2、LyM3，其具有抑菌作用，且能够与胆汁酸混合制成新的饲料添加剂，用于水产养殖。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种酶活提高的溶菌酶突变体，所述溶菌酶突变体为溶菌酶突变体LyM，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示、或者如SEQ ID NO：7所示、或者如SEQ ID NO：9所示。
进一步的，所述溶菌酶突变体具体为由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的溶菌酶的第47位的缬氨酸变为丙氨酸获得的溶菌酶突变体LyM1；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的溶菌酶的第47位的缬氨酸变为丙氨酸和第130位的甘氨酸变为谷氨酸获得的溶菌酶突变体LyM2；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的溶菌酶的第47位的缬氨酸变为丙氨酸和第154位的天冬酰胺变为天冬氨酸获得的溶菌酶突变体LyM3。
本发明还提供了一种编码基因，其为所述的溶菌酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示、或者如SEQ ID NO：8所示、或者如SEQ ID NO：10所示。
本发明还提供了一种重组工程菌，其包含所述的编码基因。
本发明还提供了一种胆汁酸酶制剂，其中包含所述的溶菌酶突变体和胆汁酸。
进一步的，所述胆汁酸酶制剂是由含溶菌酶突变体的重组工程菌经发酵、过滤、干燥制得的发酵液粉制剂与胆汁酸以2:1～3的质量体积比混合而成的。
本发明还提供了所述的溶菌酶突变体在用于制备抑菌剂中的应用。
进一步的，所述抑菌剂抑制的致病菌为副溶血弧菌、创伤弧菌、无乳链球菌、沙门氏菌。
进一步的，所述的溶菌酶突变体为溶菌酶突变体LyM3。
本发明还提供了所述的溶菌酶突变体或者所述的胆汁酸酶制剂在用于制备水产动物的饲料添加剂中的应用。
进一步的，所述溶菌酶突变体或胆汁酸酶制剂的用量为50mg/kg日粮～200mg/kg日粮。
进一步的，所述水产动物为鲤鱼。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
1、本发明首先将地衣芽孢杆菌来源的溶菌酶进行基因密码子优化，并在C末端添加了6个输水短肽，通过随机突变和筛选获得了酶活性提高的突变体，即分别提供了包含V47A的单点突变体LyM1，分别包含V47A/G130E、V47A/N154D的双位点突变体LyM2和LyM3。本发明改造后的突变体LyM1，LyM2和LyM3和原始融合基因相比，酶活性分别提高了33.5％、56％、81％，且具有很好的抑制副溶血弧菌、创伤弧菌、无乳链球菌、沙门氏菌等致病菌的作用。
2、本发明还利用含溶菌酶突变体的工程菌经发酵、过滤、干燥制得的粉制剂与胆汁酸进行混合，得到的胆汁酸酶制剂可明显提高水产动物的增重率，并明显降低饵料系数，将其用于水产养殖，能够促进水产动物的生长，因此具有良好的应用前景。
附图说明
图1是溶菌酶基因的PCR结果图。
图2是溶菌酶突变体摇瓶发酵酶活性比较。
图3是溶菌酶突变体LyM3在15L发酵罐中的发酵曲线。
图4是溶菌酶突变体LyM3的抑菌结果；其中，编号A-D的靶标菌分别是副溶血弧菌、创伤弧菌、无乳链球菌、沙门氏菌。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
本发明使用的培养基配方如下：
LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl；
MD培养基：1.34％YNB，0.4mg/L生物素，2％葡萄糖；
YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甘油；
BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甲醇；
BSM培养基：26.7mL 85％的磷酸，0.93g二水硫酸钙，14.9g二水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mL PMT1。
以上培养基为固体培养基时，则向原配方中加入2％的琼脂粉即可。
酶活力测定：参照《南京建成-溶菌酶测定试剂盒》中溶菌酶的测定方法。
实施例1：溶菌酶突变体基因构建和筛选
参考地衣芽孢杆菌来源的溶菌酶氨基酸序列(GenBank:TDO63020.1)，将其翻译成对应的核苷酸序列，经过基因序列优化后，在氨基酸序列的C末端加入6个氨基酸(GVAAIP)，并经人工合成，优化后的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对应的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。在此基础上设计引物，在5’端设计EcoR I限制性酶切位点，3’端设计Not I限制性酶切位点，设计的引物如下：
Lys-F：CCGGAATTCATGGGAATTAAGGGTATT(SEQ ID NO：3)；
Lys-R：ATAAGCGGCCGCTTATGGGATTGCTGCTACAC(SEQ ID NO：4)。
用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以人工合成的SEQ ID NO：2的基因为模板，进行随机突变，使用的引物为Lys-F和Lys-R。
将PCR产物进行电泳，电泳结果如图1所示；将扩增好的随机突变PCR产物用EcoR I和Not I双酶切，纯化回收后连接到pET-21a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21-DE3，氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，得到pET-LyMx。同样方法将合成的原始基因连接到pET-21a(+)载体上并转化大肠杆菌BL21-DE3，得到pET-Ly0。
将筛选的单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入2个表达合成的原始溶菌酶Lys0的单菌落为对照。每孔装入300μL LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm震荡培养4小时后，转移50μL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200μL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃、200rpm摇床培养10h诱导表达溶菌酶。将诱导完成的菌液反复冻融进行破碎，将破碎后的细胞液离心取上清，然后检测溶菌酶的活性。
将酶活明显高于对照Ly0的突变体基因进行重复验证和测序分析。筛选到酶活力提升的溶菌酶突变体LyM1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其对应核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。
实施例2：以溶菌酶突变体LyM1基因为模板进行随机突变
以实施例1获得的溶菌酶突变体LyM1为模板，使用与实施例1相同的随机突变方法，进行第二轮随机突变和筛选。以LyM1为对照，经过检测溶菌酶突变体的酶活力，将酶活力高于LyM1的突变体基因进行测序。
最终筛选得到突变体LyM2和LyM3。LyM2突变方式为V47A/G130E，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；LyM3突变方式为V47A/N154D，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
实施例3：溶菌酶突变体转化毕赤酵母SMD168
将实施例1和2的溶菌酶突变体基因用EcoR I和Not I双酶切位点连接到pPIC9K质粒上并转化至大肠杆菌DH5α中，获得表达载体，测序验证。将呈阳性的表达载体用Sal I酶切线性化后电转入毕赤酵母SMD168中，MD平板筛选得到转化子并转接到YPD平板中活化(一般挑24-48个转化子)。活化后的转化子接于摇瓶进行发酵(每瓶含20mL BMGY培养基)，30℃振荡培养18h后，加1％甲醇诱导，继续振荡培养，此后每24h添加培养体积1％的甲醇。诱导表达96h后，将培养液离心获得上清，测定发酵液上清的平均酶活性，溶菌酶突变体在摇瓶发酵条件下，在酵母SMD168中的酶活性约是大肠杆菌BL21中的3倍。
按照溶菌酶测定试剂盒的方法，取发酵液离心后的上清液测定平均酶活力，突变体酶活力水平对比如图2所示，溶菌酶突变后酶活性得到进一步提高，分别比原始的溶菌酶Ly0提高了33.5％、56％、81％。
实施例4：溶菌酶突变体LyM3在15L发酵罐中发酵和制备
将溶菌酶突变体LyM3的基因工程菌分别划线于YPD平板上，30℃培养3天长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在YPD平板上划线培养，如此活化三代得到的毕赤酵母单菌落接种于20mL BMGY培养基中，30℃、200rpm培养24h。以2％的接种量接种到300mL BMGY培养基中，30℃、200rpm培养至OD600为5，用作种子液接种发酵罐。发酵生产工艺：BSM培养基，pH 4.8、温度30℃、搅拌速率500rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上发酵过程分为三个阶段：(1)菌体培养阶段：按8％比例接入种子液，30℃培养20～24h，使发酵液中甘油耗尽；(2)饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80％饥饿阶段结束；(3)诱导表达阶段：用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，诱导时间为160～200h；待发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后经喷塔喷干成粉制剂，用于应用测试。
发酵过程曲线如图3所示：每隔8h取样，测定产酶水平，发酵160h后酶活力水平达到最高点。
实施例5：溶菌酶突变体对常见致病菌的抑菌试验
按照琼脂扩散方法，分别以副溶血弧菌、创伤弧菌、无乳链球菌、沙门氏菌为靶标菌。将适量的靶标菌加入到融化后的温热LB琼脂培养基中，倒平板，等平板凝固后进行打孔，每个孔中加入等量发酵液或者抗生素，放置于培养箱中静置培养直至产生抑菌圈，测量抑菌圈直径和抗生素进行比较获得对应的抑菌效价。
溶菌酶突变体发酵液制备：将实施例4制备的LyM3发酵液喷粉配制成0.1g/mL的浓度，并过滤除菌备用。于超净台中，无菌操作，将适量发酵液加入到平板的孔中。
结果如图4所示，溶菌酶突变体LyM3对副溶血弧菌、创伤弧菌、无乳链球菌、沙门氏菌都有较好的抑菌效果。
实施例6：胆汁酸酶制剂的制备及其对鲤鱼生长性能的影响
将溶菌酶突变体LyM1和LyM2按照实施例4的方法制备成发酵液粉制剂，然后分别将溶菌酶突变体发酵液粉制剂与胆汁酸以2:1的质量体积比混合均匀，获得胆汁酸酶制剂。其中，胆汁酸的有效成分组成包括猪胆酸、猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，猪胆酸和猪去氧胆酸之和的重量百分比为78.0％，鹅去氧胆酸的重量百分比为20.0％，其余为水分和灰分(重量百分比总和以100％计算)。
取体重较为接近的鲤鱼鱼苗400尾，体重为10-11g，随机分为4组。每组5个重复，每个重复20尾。采用基础日粮(鱼粉10％，豆粕25％，菜粕20％，棉粕5％，玉米胚芽饼25％，次粉麸皮15％)饲喂，养殖实验为期30天。
对照组只饲喂基础日粮；试验1组在日粮中添加100mg/kg含有溶菌酶突变体LyM1的胆汁酸酶制剂；试验2组在日粮中100mg/kg添加含有溶菌酶突变体LyM2的胆汁酸酶制剂；试验3组在日粮中100mg/kg添加含有溶菌酶突变体LyM3的胆汁酸酶制剂。养殖30天后，将对照组和实验组的所有鲤鱼再饥饿养殖24h，分别捞出吸干鱼体表面水分后进行称重，统计每组的均重、增重率及饵料系数。
表1溶菌酶突变体对鲤鱼生长性能的影响
结果如表1所示，含有溶菌酶突变体的胆汁酸酶制剂可明显提高鲤鱼的增重率，也能明显降低饵料系数，说明溶菌酶及其制剂在水产养殖领域中有重要的应用价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种酶活提高的溶菌酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示、或者如SEQ ID NO：7所示、或者如SEQ ID NO：9所示。
2.一种编码基因，其特征在于，其为权利要求1所述的溶菌酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示、或者如SEQ ID NO：8所示、或者如SEQ ID NO：10所示。
3.一种重组工程菌，其特征在于，其包含权利要求2所述的编码基因。
4.一种胆汁酸酶制剂，其特征在于，所述胆汁酸酶制剂中包含权利要求1所述的溶菌酶突变体和胆汁酸。
5.根据权利要求4所述的胆汁酸酶制剂，其特征在于，所述胆汁酸酶制剂是由含溶菌酶突变体的重组工程菌经发酵、过滤、干燥制得的发酵液粉制剂与胆汁酸以2:1~3的质量体积比混合而成的。
6.权利要求1所述的溶菌酶突变体在用于制备抑菌剂中的应用，其特征在于，所述抑菌剂抑制的致病菌为副溶血弧菌、创伤弧菌、无乳链球菌、沙门氏菌。
7.权利要求1所述的溶菌酶突变体或者权利要求4所述的胆汁酸酶制剂在用于制备水产动物的饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述溶菌酶突变体或胆汁酸酶制剂的用量为50 mg/kg日粮~200 mg/kg日粮。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: No. 9 Yanying North Road, Yanbei Street Office, Qihe County, Dezhou City, Shandong Province, 253000 Applicant after: Shandong Longchang Animal Health Products Co.,Ltd. Address before: 251100 No.1, North Park Road, Qihe Economic Development Zone, Dezhou City, Shandong Province Applicant before: SHANDONG LONGCHANG ANIMAL HEALTH PRODUCT Co.,Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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