JPH03504676A - ケラチン質原料の減成方法及びこれに有用な細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ケラチン質原料の減成方法及びこれに宵月な細菌（発明の技術分野） 本発明は一般的に発酵法、特にバチルス・１ケニホーミスａｅ’Ｌ１８　　　　 　ｆｕｌｌ　　　によりケラチン質原料を加水分解する方法に関する＠ （発明の背景技術） 羽毛は養鶏業によって大量に発生する。これらの羽毛は、種々の潜在的用途に対 して安価な原料源である。なかでも、少なからず興味を抱かれているのは、羽毛 を減成する方法の開発であり、これによって羽毛は動物用飼料におけるアミノ酸 及び消化しやすいタンパク質の安価な原料として用いることが可能となる。

羽毛を動物用飼料に変える方法で現在までに開発されたのは、水蒸気加水分解法 、及び水蒸気加水分解と酵素を組み合せた方法の両者である。ｆｉｌ　ｔｌｆ、 　　Ｐａｐｉｄｏｐｏｕｌｏｓ、Ｍ、Ｃ，、Ａｎｉｍａｌ　ＦｅｅｄＳｃ　　ｅ ｅ　ａ　ｄ　　ｅ　ｎ　　　　ｌｊ、１５１（１９８Ｇ）：　Ｐａｐａｄｏｐｏ ｕｌｏｓ、Ｍ、Ｃ，ｅｔａｌ、、　　ｏｕ　ｔ　　Ｓｅ　　　　Ｌｌ、１７２９ （１９８５）；＾ｌｄｅｒｉｂｉｇｄｅ、　Ａ、　Ｏ，ａｎｄＤ、Ｃｈｕｒｅｈ 、　Ｊ、Ａｎｌｍ、Ｓｃ＋、１１９Ｂ（１９８３）：　Ｔｈｏｍａｓ　ａｎｄ　 Ｂｅｅｓｏｎ、　Ｊ。

Ａｎｉｍ、Ｓｃ１．４５．８１９（１９７７）；　Ｍｏｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｂａ １ｌｏｕｎ、　ＰｏｕＩｔｒＳｃｉ５２．８５ｇ（１９７３）；　Ｍｏｒｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、、ｏｕ　ｔ　　Ｓｅ　、４６，４５６（１９６７）：Ｄａｖｉｓ　 ｅｔ　ａｌ、、養鶏副産物の加工と飼料への利用、　　Ｐａｒｔ　Ｉ。

υＳＤＡ　Ｕｔｉｌ、Ｒｅｓ、Ｒｅ　、ｎｏ、３．Ｗｍｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ （１９６１）ｕ土ハ。これらの手法の不利な点、例えば熱に対して敏感なアミノ 酸の水蒸気による減成、得られる生産物の比較的低い消化性は、厳しい水蒸気処 理を必要としない経済的な新しい羽毛減成法についての興味を継続させることと なった。

したがって、本発明の１つの目的は、水蒸気加水分解によらないでケラチン質原 料を加水分解する方法を提供することである。

他の目的は、ケラチン質原料を高い収率でアミノ酸に変える方法を提供すること である。

本発明のさらなる目的は、高度の消化性を有し食餌用タンパク質とアミノ酸の良 質の原料となる飼料成分として宵月な加水分解された羽毛製品を提供することで ある。

本発明のなおさらなる目的は、加水分解された羽毛製品を食餌用アミノ酸源とし て使用する経済的な動物用飼料を提供することである。

本発明の前記及びその他の目的並びに態様は、以下の発明の要約、詳細な記載及 び実施例の各節において詳細に説明する。

（発明の要約） 本発明の第１の態様は、ケラチン質原料の減成方法である。

この方法は、ケラチン質原料をバチルス・リケニホーミスと混合して発酵培地を 形成するステップと、次いで前記原料が減成するのに十分な時間この培地を発酵 させるステップとからなる。

ケラチン質原料の減成に加えて、本発明の方法はアミノ酸を生産するために用い ることができる。この場合には、前記の如くに形成した発酵培地を遊離アミノ酸 が生成するのに十分な時間発酵させ、次いで遊離アミノ酸を培地から回収する。

また、本発明の方法は、加水分解した羽毛製品を作るためにも用いることができ る。この場合には、ケラチン質原料として羽毛を用い、前記の如（に形成した発 酵培地をその消化性を高めるのに十分な時間発酵させる（例えば、消化しゃすい タンパク質及びペプチド濃度の富化による）。好ましくは、次いで培地中の細菌 を殺して飼料成分として有用な加水分解された羽毛製品を形成する（すなわち、 細菌を殺すために細菌を保有する培地を処理する）。

本発明の方法を遊離アミノ酸又は加水分解された羽毛製品を生産するために使用 する場合には、発酵ステップは嫌気的発酵ステップであることが好ましい。嫌気 的条件下では、バチルス・リケニホーミスは活発には増殖しない。このために、 バチルス・リケニホーミスによるアミノ酸の使用は減少し、遊離アミノ酸の生産 は増加し又は富化する。さらに、羽毛をバチルス・リケニホーミスと混合するス テップに先だって、好ましくは二チルス・リケニホーミスを先ず好気的条件のも とで（好ましくは液体培地中で）増殖させて、豊富な量の活性細菌を得るように する。以下に詳細に説明するように、これらの手法は、ケラチン質原料を減成し 羽毛を利用する効率的で費泪の点でも効果的な手段を提供する。

本発明の第２の態様は、バチルス・リケニホーミス　ＰＷＤ−１゜ＡＴＣＣＮｏ 、　５３７５７の同定特性を有するケラチン貿減成微生物の純粋培養物である。

パ　ルス・盲ケニホーミス　Ｗ−は前記方法の実施に対して好ましい微生物であ る。

本発明の東３の態様は、加水分解された羽毛製品であって、前記方法によって生 産することができる。この製品は、部分的に加水分解した羽毛と、この部分的に 加水分解した羽毛から分割（ｃｌｓａｖｅ）されたタンパク質と、同じ（この加 水分解した羽毛から分割されたペプチドと、バチルス・リケニホーミス細胞（好 ましくは殺されたバチルス・リケニホーミス細胞）とを含む。

この加水分解した羽毛製品は、炭水化物源、及び好ましくはミネラル、ビタミン と混合して動物用飼料を形成してもよい。飼料には篤２の補足的タンパク源を随 意に含めることができる。

本発明のこれ以外の態様については以下に論議する。

（発明の詳細な記載） 本発明は、毛髪、ひづめ、羽毛を含む全てのタイプのケラチン質原料について実 施することができる。羽毛が好ましい。鶏、シチメンチ璽つ、アヒルの羽毛を含 むどのタイプの羽毛も使用できる。鶏の羽毛が好ましく、これが以下に述べる原 料である。

しかしながら、この明細書の教示は、全てのケラチン質原料の減成と利用に対し て適用することができる。

発酵培地を形成するために羽毛をバチルス・リヶニポーミスと混合するのに先だ って、自然に羽毛に介在し、さもなければ発酵プロセスを中断させるおそれのあ る細１を殺すために、羽毛を滅菌しなければならない。この滅菌のステップは、 どの手段で実施してもよいが、これには、羽毛をホルマリンもしくはエチレンオ キサイドガスと接触させ、羽毛を加圧水蒸気と接触させ、又は両者の組み合わせ による薫蒸消番が含まれる。われわれの発見によれば、羽毛を加圧水蒸気と接触 させると、羽毛を滅菌するには不十分な時間であっても、これに続く羽毛の細菌 による減成を実質的に改善する。したがって、本発明における滅菌のステップは 、好ましくは、たとえそれが羽毛の完全な滅菌を達成しないとしても、次の細Ｉ ！！！！加水分解を促進するために十分な時間と湿度で羽毛を水蒸気と接触させ るステップを含む。われわれの発見によれば、密閉した室内で１２５℃で２分間 という短時間羽毛を加圧水蒸気と接触させれば、次の発酵加水分解を実質的に増 進させるのに十分である。もし羽毛の滅菌を水蒸気のみで行うとすれば、羽毛は １２５℃で少なくとも１５分間加圧水蒸気と接触させなければならない（この温 度でのｌ５−２０分間の処理は、定義により、オートクレーブステップである） 。水蒸気処理の時間と温度は、約３５ｐ、　ｓ、　１．又はこれ以上の水蒸気圧 力で３５分又はこれ以上の処理時間を費やす商業的水蒸気加水分解プロセスより も少なくすべきである。

発酵に先だって、バチルス・１ケニホーミスをいずれかの適当な液体増殖培地（ 好ましくは羽毛ベースの液体増殖培地）中で好気的に増殖させる。細菌は、好ま しくは約４５から約５５℃の温度で増殖させる。十分な量の細菌が増殖したのち （好ましくは１ミリリットル当り約１０’コロニー形成ユニツト）、液体増殖培 地を適当な発酵容器内で羽毛と混合する。好ましくは、液体増殖培地と羽毛は、 羽毛の比率を多くして混合するので、この発酵は半固体的発酵である。好ましい 発酵培地は、重量で、液体増殖培地４部に対し少なくとも乾燥羽毛約１部、より 好ましくは液体増殖培地２部に対し乾燥羽毛約１部からなる。

本発明による動物用飼料を製造するために用いられる炭水化物源には、例えば、 トウモロコシ、カラスムギ、大麦、モクコシ属、又はこれらの組み合わせが含ま れる。好ましくは、これらの穀物は動物用飼料として用いるためにひき割りにす る。補足のタンパク質源には、例えば、大豆のひき割り、魚粉、血粉、養鶏副産 物（鶏の臓物粉砕物）、食肉粉、及びこれらの組み合わせが含まれる。動物用飼 料は、全タンパク質源（加水分解した羽毛と補足物の両者）からのタンパク質を 重量で約１３％から約２５％まで含む。加水分解した羽毛を唯一のタンパク質源 としてもよいが、飼料に対して重量で約２％から約１５％までが好ましい。他の 少量の栄養物、例えばビタミン、　ミネラル、抗生物質、及び他の物質又は化合 物は必要に応じて飼料に含ませることができる。

バチルス・−ケニホーミス株ＰＷＤ−１は、ブダペスト条約に従いアメリカンタ イプカルチャーコレクシ璽ンに１９８８年３月２３日付けで寄託し、ＡＴＣＣ受 託番号第５３７５７号が付されている。

ＰＷＤ−１は、グラム陽性（しかしグラムバリアプル＞ｍであることが分かった 。これは、まっすぐなロフト形の細菌で、ロッドの長さは約２．１から約３、Ｑ ｉミクロン幅は約０．５から約１．１クロンで、口、ドの末端は丸くなっている 。細菌の細胞は、個々のものと鎖になっているものとがあることが分かっている 。１つのサブターミナルエンドポアが細胞ごとに形成されており、このエンドボ アは中心に位置し円筒形又は卵形である。

ＰＷＤ−１は、不透明な−続きの（ｅｎｔｉｒｅ）　（ムコイド）コロニーを形 成し、形がぎざぎざで不規則である。低度の凸状、高度の凸状（ムコイド）及び 平坦なコロニーが見られる。コロニーは解離（ｄｉｓｉｓｓｏｅｉａｔａ）する ように見える。コロニーは、きらきら光り（ムコイド）くすみ、乾き、滑らか（ ムコイド）でかつ粗いように観察され、不溶解性の褐色の色素を伴っている。細 胞は自動性であり（鞭毛がある）かつ総毛がある（ｐａｒｉｔｒｌｅｈｏｕｓ） 。

ＰＷＤ−１は、約２０℃から約Ｓｓ℃までの温度において増殖するが、６０℃に おいても僅かに増殖する。われわれの場合には、この細菌は好熱的であって、４ ５℃から５０℃までの温度において最もよく増殖する。このほか、２１ないし３ ０℃の間が最適増殖温度であるとの他者の報告もある。異なった増殖培地が最適 増殖温度に及ぼす影響を調べる実験が進められている。

ＰＶＤ−１は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース（弱く）、Ｄ−グルコース、 ラクトース（弱＜）、サッカロース、及びＤ−マンニトールから酸を生ずるが、 ガスは生じない。炭素源として、サイトレートとプロピオネートの両者を利用す ることができる。

ＰＷＤ−Ｌは、ポリサツカリド、デンプン、及びカゼインを加水分解するが、ヒ ブブレートを加水分解することはない。ＰＷＤ−１はゼラチンを液状化（ｌｌｑ ｕｌｆｙ）する。メチレンブルーを還元するが、再酸化はしない。ナイトレート をナイトライドに還元するが、ナイトライドを還元することはない。

ＰＷＤ−１は、フォゲスープロスカウエル（５１９ｇ＞陽性、フオゲスープロス カウエル（５１９ａ　ｒｍｔｉＬ　　フオゲスープロスカウエル（５３３１）陽 性テする。これは、ハイドロジエンパーオキサイドを分解するが、チロシンを分 解することはなく、インドールに対し陰仕、ヒドロ亭ジアセトンに対し陽性であ る。ＰＷＤ−１は、リドマスミルクアシ１トチスト陰性、リトマスミルクコオー レイシ璽ンテス）　（Ｌｉｔｍｕｓ　ｍ１ｌｋ　ｅｏａｕｌａｔｌｏｎ　ｔｅｓ ｔ）ｔｌｔ性、　リドマスミルクアルカリンテスト陰性であるが、リトマスミル クベプトナイゼーシ。

ン、リトマスミルクレダクシ嘗ンの両テストには陽性である。

ＰＷＤ−１は、ｐＨｓ、７とｐＨ６、Ｏにおいて増殖する。これは、８，０又は これ以上のｐＨＶＰ５１９ｇを示す。普通ブイヨン（ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏ ｔｈ）の最ｊｌｐｔｌは７．０から７．５までである。好気性であり条件的（ｆ ａｃｕＨａｔｌｖｅ）である。０．０２％のアジド中では増殖しない。密閉され たナイトレートからガスを発生し、密閉されたグルコース中で増殖する。レシチ ナーゼに対して陰性である。

また、ケラチン質原料減成能を有するバチルス・１ケ二ホー＝　ｘ　ＰＷＤ−１ タンパク質混合物からなる細胞フリーの粗抽出物も本発明の１つの態様である。

この粗抽出物は、例えば液体増殖培地からバチルス・１ケ二ホーミスＰＷＤ−１ 細胞を分離することにより調製するので、液体増殖培地が細胞フリーの粗抽出物 となる。

択一的に、バチルス・−ケニホーミスを（化学的又は物理的に）液体増殖培地中 で溶解させて、細胞フリーの粗抽出物を製造することもできる。このような抽出 物を！ｌ！ｌ製する他の手段は、当業者には明かであろう。細胞フリーの粗抽出 物は水性の形で提供することができる。択一的に、凍結乾燥の形としてその貯蔵 寿命を増すこともできる。

実質的に純粋な、ケラチン質原料減成バチルス・１ケニホー二Ｘ　Ｐｌ［＋−１ 酵素も、本発明のさらなる態様である。この実質的に純粋な酵素は、前記細胞フ リーの粗抽出物からなるタンパク質を個々の構成タンパク質に分離することによ って製造される。

いずれかの適当な調製手段を用いることができる。多くのこのような調製手段、 例えばカラムクロマトグラフィーは、当業者によく知られており、かつこの目的 のために日常的に使用されている。次いで、個々の構成タンパク質はケラチン質 原料の減成能に従ってスクリーニングされる。ケラチン質原料を最もよく減成す る構成タンパク質は、実質的に純粋な酵素からなる。

細胞フリーの粗抽出物と同様に、この実質的に純粋な酵素は、水性、凍結乾燥の いずれの形でも提供することができる。

細胞フリーの粗抽出物、実質的に純粋な酵素の両者とも、水性の形で提供された 場合には、これをケラチン質原料（好ましくは羽毛）と混合して発酵培地を形成 し、次いで羽毛を減成するのに十分な時間この発酵培地を発酵させることによっ て、ケラチン質原料を減成するために用いることができる。

本発明のなおさらなる態様は、ケラチン質原料減成と二Ｌ２ヒ２２・１ケニホー ミス＋４０−１酵素又はその活性断片の生産に対してコードするクローン遺伝子 又はその断片を含むＤＮＡ配列である。このクローン遺伝子は次のようにして生 産される。始めに、多数ノパルス・ＩケニホーミスＰＷＤ−Ｉ　ＤＮＡ配列を発 生させる（ゲノムＤＮＡ又は相補Ｄｌｌ＾ライブラリーとして）。次いで、これ らの配列をＤＮＡ表現ベクターに挿入して、組み換え表現ベクターを形成する。

次に、この組み換え表現ベクターを適当な宿主に挿入して、ＤＮＡ配列を表現す る形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を形成する。

最後に、ケラチン質原料減成酵素の生産のために、これらの形質転換体をスクリ ーニングする。このような酵素を表現する形質転換体は、これに含まれるベクタ ー中のインサージｙンとして、所望のＤＮＡ配列を保持している。

多数のバチルス・リケニホーミスＰＷＤ−Ｉ　ＤＮＡ配列は、慣用の技術によっ て生じさせることができる。１つのアプローチは、ゲノムＤＮＡライブラリーの 調製を究極の目標として、１つの／（ｆ　）ｋス・リケニホーミスＰＷＤ−１の ゲノムＤＮ＾をダイジェストすることである。二糺立旦旦、Ｒ，Ｏｌｄ　ａｎｄ 　Ｓ、Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、　Ｐｒ１ｎｅｉ　ｌｅｓ　ｏｆＧｅ　ｅ　Ｍａｎ’　 ｕ　ａｔｌｏ　、　１０２−１０９（３ｄ　ｅｄ−１９８５）１乱立λ上。他の １つのアプローチは、ｃＤ？ｉＡライブラリーのｉｌ製を究極の目標として、バ チルス・書ケニホーミスＰＩＩＤ−１から■ＲＮ＾を分離して、それからｃＤＮ Ａ配列を生じさせることである。二隻夏Ｅ　ｉｔ、Ｒ，０１ｄａｎｄ　Ｓ、Ｐｒ ｌｍｒｏｓｅ、　１旦、１０９−１ｉｔ；　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆｒ１ ｔｓｃｈ　ａｎｄＪ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　Ｍｏ１ｅｃｕ　　ａ　　　Ｃ１ａ ｎ　　ｎ　　：　　＾　　ａｂｏｒａｔｏ　　　　Ｍａｎｕａｌ、１＋１７−２ ４６（１９８２１参照のこと。

クローン遺伝子を製造するために、種々のベクター−宿主の組み合わせを用いる ことができる。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、宿主細胞が細菌細 胞である場合には、グラム陰性でもグラム陽性でもよい。有用な宿主には、例え ば友１！！（例えばＥ、ｃｏｌｌ　ｘ１７７６、　Ｅ、ｃｏｌｉ　１２２１１２ ．　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯｌ、　Ｅ。

ｃｏｌｔ　ＭＲＣＩを含む）、サルモネラ種（例えばＳ、ｔ　　ｈｉｍｕｒｉｕ ｍ、　Ｓ。

鯨ｕＬ工匡ｎ、　Ｓ−■且ｎを含む）、プソイドモナス種（例えばＰ、ａｅｒｕ 　１ｎｏｓａ、　Ｌ匹■口を含む）及び１１皇を含む。

本発明の実施に用いられるベクターは、選択された宿主細胞内でクローニングベ クター又は表現ベクターとして作用することが可能であるように選択される。ベ クターとしては、例えばバクテリオファージ、プラスミド、ウィルス又はこれら のハイブリッドであろう。友１１において有用なベクターには、プラスミド（例 えばｐｓｃｌｏｌ、　Ｃｏ１Ｅ１．　ＲＳＰ２１２４．ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３ ２４，ｐＢＲ＄２５゜ｐＡＴ１ｓ３．　ｐｕｃ−ａ、ｐｏｃ−ａ）、バクテリオ ファージ５ｊａダ、コスミド、ファスミド、及び線状コリファージが含まれる。

サルモネラ種は、例えばプ５Ｘ！＋’、例えばｐＪＣ２１７，ｐＢＲＤＯＯｌ、 ｐＢＲＤ０２Ｂを用いて形質転換することができる。グラム陰性細菌において有 用なベクターには、一般的に広い宿主範囲（例えばＳａ、ＲＰ４．ＲＳＦＩＯＩ Ｏ）を有する不和合性グループＰ、Ｑ又はＶのプラスミド及びトランスポゾン例 えばＴｎＴが含まれる。先見１、グラム陽性細菌、はＳ、ａｕｒｅｕｓプラスミ ド（例えばｐｃ１９４．ｐＥ１９４．ｐｓＡＯ５０１，ｐＵＢｌｌｏ。

ｐＴ１２７）を用いて形質転換することができる。

各特定ベクター内においては、分離したＤＮＡ配列を挿入するために種々の座位 を選択することができる。これらの座位は通常これらを切り取るＩＩ＠酵素又は エンドヌクレアーゼＪこよって呼ばれる。例えば、ｐＢＲ３２２において、Ｐｓ ｔｌ座位は、ペニシリナーゼタンパク質のアミノ酸１８１と１８２に対してコー ドするヌクレオチドトリブレットの間のベニ７リナーゼに対する遺伝子に位置バ チルス・リケニホーミスＰＩＩＤ−Ｉ　ＤＮＡ配列は、既知の技術によって所望 のベクターに挿入することができる。しかしながら、もしベクターが表現ベクタ ーとしての役割を持つべきものであるならば、このベクターはプロモーターを持 つべきであり、ＤＮＡ配列はプロモーターの下流においてベクターに挿入され、 かっこのプロモーターと作用的に連携させるべきである。ベクターの選択は、ベ クターが挿入されるはずの宿主細胞内において、プロモーターの作用が可能であ るように行うべきである（すなわち、プロモーターは宿主細胞のＲ１１＾ポリメ ラーゼによって認識されなければならない）。そのうえ、ベクターは、プロモー ターとＤＮＡ配列の挿入座位との間に位置し、リポソーム結合座位に対してコー ドする領域を持つべきであり、これによっていったん挿入されたバチルス・リヶ ニポーミスＰＷＤ−Ｉ　ＤＮＡ配列と作用的に連携する（好ましくは、正確な翻 訳読み取りフレームにおいて）。ベクターは、ベクターが挿入されるはずの宿主 細胞のリポソームによって認識されるリポソーム結合座位に対してフードする領 域を備えるように選択しなければならない。例えば、宿主細胞が友１１のような 原核細胞である場合には、リポソーム結合座位に対してコードする領域は、シャ インーダルガルノの配列に対してフードするであろう。

形質転換体は、ケラチン質原料減成酵素、又はその活性断片の生産のために、慣 用のいずれかの手法によってスクリーニングすることができる。好ましくは、形 質転換体は、粉末状ケラチン基質を含有する寒天培地で増殖させる。いずれの粉 末状ケラチンでも用いることができるが、粉末状羽毛、特に粉末状白色羽毛が好 ましく、清澄化ゾーン（ｃｌｅａｒｉｎｇ　ｚｏｎｅ＞が最も容易に観察できる 。培地上に清澄化ゾーンを示すコロニーは、所望の酵素又は酵素断片を生成して いる。

本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。これらの実施例は例示の目的 のみに提出するものであって、限定として解釈されるべきではない。

一仁　　　　１」− ・　　と　　・　　によるアミノ　　　の比バチルス・リケニホーミス１４Ｄ− １を、羽毛を唯一の炭素及びエネルギー源として含む２バツチの無菌水性培地中 で増殖させた。

１す、トルの培地中には、ＮＨａＣｌ　０．５グラム、ＮａＣｌ　０．５グラム 、ＫｇＢＰＯｎ　０．３グラム、ＫＨ２ＰＯｎ　０．４グラム、ＭｇＣｌ２・６ Ｈ２００，２４グラム、ハンマーで粉砕した羽毛（粗く刻んだ羽毛）１．０グラ ム、及び酵母抽出物０．１グラムを含有した。培地はｐＨ７，５に調整した。各 カルチャーは５０℃で培養し、そのうちの１つは好気的条件で、他の１つは嫌気 的条件で増殖させた。好気的及び嫌気的の両条件下で、０日（培養前）と培養５ 日後に培地中に見出されたアミノ酸の量を次の表１に示す。

轟−１ 好気的及び嫌気的の両条件下における羽毛減成微生物の増殖培地中の遊離アミノ 酸濃度 ５日 アミノ酸（ｍｇ／ｌ）　　　　１日　　　好気的　　嫌気的ＡＳＰ　（Ｎ）　　 　　　　　０．　Ｇｏ　　　　　０．００　　　３．４０７ＩＩＲ０，７ｇ　　 　　　０．９０　　　９．００ＳＥＲＯ，８３１，１０７，６０ ０Ｌυ（Ｎ）　　　　　　　０．００　　　　１．７０　　１１．８０ＧＬＹ　 　　　　　　　１．６１　　　　０．５０　　　６．６０ＡＬＡ　　　　　　　 　１．３５　　　　１．１０　　１４．５０ＣＹＳ　　　　　　　　Ｏ，１１３ ，００！０．２０ＶＡＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，３６２，１０ １７，１０ＭＥＴ　　　　　　　　Ｏ，００１，９０４，６０ＩＬＨＯ，１９１ ，７０２０，７０ ＬＥＵ　　　　　　　　Ｏ，９１２，１０３２，６０ＴＹＲＯ，０００，００６ ，３０ ＰＨＥ　　　　　　　　Ｏ，００３，３０２２，４０ＯＲＮ　　　　　　　　Ｏ ，０００，７０７，５０ＬＹＳ　　　　　　　　０．９９　　　　３．１０　　 　６．８０Ｉｌｌｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，２２０，００２， フ０ＡＲＧ　　　　　　　　１．０５　　　　１．００　　１１．２０合　　計 　　　　　　　　　　　　　８．４０　　　　　　２４．２０　　　　１９５． ００これらのデータは、嫌気的条件下では好気的条件におけるよりもアミノ酸の 全生産量がほぼ８００％多かったことを示す。

ＰＷＤ−１を、実施例１に記載したのと同様な（１す７トル当りハンマー粉砕の 羽毛１．０グラムの代わりに１０．０グラムを用いたことを除く）液体培地中で ５日間５０℃において好気的条件下で増殖させて、１ミリリットル当り１０”Ｃ ＦＵに達した。ハンマー粉砕の羽毛の追加分は、１２Ｓ”Ｃ（１６ｐ、ｓ、１． ）の水蒸気で１５分間オートクレーブ処理を施した。この羽毛を、増殖培地１リ ットル当り２５０グラムの割合で増殖培地と発酵容器中で混合して発酵培地を形 成し、窒素を吹き込んだ。次に、この発酵培地を嫌気的に５日間５０℃で時々攪 はんしながら培養した。発酵ステップを好気的に行うことを除き、同様な手続き を別途に行った。これらの手続きは、両条件に対して２通り行った。全ての発酵 培地の液相中のアミノ酸濃度を、発酵の５８目に測定したが、そのデータを次の 表２に示す。

表−２− 半固体相発酵の液相中における全遊離アミノ酸濃度（ｇ／ｌ）発酵　　　　嫌気 的　　　好気的 嫌気的条件下では、半固体相発酵により、遊離アミノ酸が量的に１リブトル当り １０グラム余計に生産されることに注意されたい。

工」Ｌ嵐」Ｌ−」二と した・・　　１．　口の　。

５日間の嫌気的発酵ののち、前記実施例２に記載したような半固体発酵培地を１ ２５℃の水蒸気で１５分間オートクレーブ処理し、次いで６０℃で４８時間乾燥 し、続いて！ミリトートルメフ７以下に粉砕した。得られた製品は、部分的に加 水分解した羽毛、短いペプチド、アミノ酸、及び殺されたバチルス・リケニホー ミ五細菌細胞を含む褐色の粉末であった。この製品は、次の実施例４に示すよう に、とりわけ、成育中の鶏に対するタンパク質の食餌源として有用である。

工え１五−１１ バチルス中１　ニホーミス　　　　ゝ・　を　　°んだ勉」Ｌ里」Ｌ社 １２８羽の雛を４つの等しいグループに分け、各グループを４×６に分けた。各 グループは異なりた餌で飼育した。すなわち、グループ（ａ）はトウモロコシ− 大豆飼料／２Ｇ％タンパク質で飼育し、グループ（ｂ）はトウモロコシ−大豆飼 料／　１５％タンパク質で飼育し、グループ（Ｃ）はトウモロコシ−大豆飼料７ １５％タンパク質と加水分解しないハンマー粉砕羽毛５駕七で飼育し、グループ （ｄ）はトウモロコシ−大豆飼料／１５％タンパク質と前記実施例３の手法によ って！Ｉ２造したバチルス・Ｉケニホーミス加水分解羽毛からのタンパク質５％ とで飼育した。全寵を３週齢において計量し、各グループの！量を平均した。こ の平均を次の表３に示す。

老−３ 食餌タンパク資源としての羽毛溶解物（ｆｅａｔｈｅｒ−１ｙｓａｔｅ）の鶏成 育能力 食　　　餌　　　　　　　平均体重（グラム）Ｍ　　ｔｈ　ＳＥＭ 標準トウモロコシー大豆、　　　　　　５５４．７±　８．５２０％タンパク質 標準トウモロコシ−大豆、　　　　　　５０３．９±　８，３１５％タンパク質 トウモロコシ−大豆、　　　　　　　　４５８．８士　７．１１５％タンパク質 ＋５％（無処理羽毛からのタン バク質） トウモロコシ−大豆、　　　　　　　　５２５．６±　８．９１５％タンパク質 ＋５％（羽毛溶解物からのタン バク質） これらのデータは、バチルス・１ケニホ一ミス加水分解羽毛が動物用飼料におけ る安価な食餌タンパク源として使用できることを示している。

前記実施例は、本発明を例示するために提示したものであり、これを限定するも のと捉えるべきではない。本発明の範囲は、以下の請求の範囲により、かつこれ らに含まれるべき請求の範囲と均等なものも含まれる。

（以下余白） 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ケラチン質原料をバチルス・リケニホーミスＰＷＤ−１（ＰＷＤ−１）混合 して発酵培地を形成するステップと、次いでこのケラチン質原料を減成させるの に十分な時間前記培地を発酵させるステップとを含むケラチン質原料の減成方法 。 ２．ケラチン質原料をＰＷＤ−１と混合する前記ステップに先だって、このＰＷ Ｄ−１を好気的条件下で増殖させて活性細胞を生産するステッブをさらに含む請 求項１に記載の方法。 ３．前記発酵ステップが嫌気的発酵であることからなる請求項１に記載の方法。 ４．前記発酵培地が、重量で、ＰＷＤ−１液状培養物４部に対し少なくとも約１ 部の乾燥ケラチン質原料を含み、これにより前記発酵ステップが半固体発酵ステ ップであることからなる請求項１に記載の方法。 ５．前記混合ステップに先だつて、前記ケラチン質原料を減菌するステップをさ らに含み、これによりこのケラチン質原料に自然に介在し、さもなければ前記発 酵プロセスを中断させるおそれのある細菌を殺すことからなる請求項１に記載の 方法。 ６．ケラチン質原料をＰＷＤ−１と混合する前記ステップに先だって、次の細菌 型加水分解を促進するのに十分な時間と温度で前記ケラチン質原料を水蒸気に接 触させるステップをさらに含むことからなる請求項１に記載の方法。 ７．前記ケラチン質原料が羽毛であることからなる請求項１に記載の方法。 ８．ケラチン質原料をバチルス・リケニホーミスＰＷＤ−１（ＰＷＤ−１）と混 合して発酵培地を形成するステップと、これから遊離アミノ酸を生成するのに十 分な時間前記発酵培地を発酵させるステップと、この発酵培地から前記遊離アミ ノ酸を回収するステップとを含むアミノ酸の製造方法。 ９．ケラチン質原料をＰＷＤ−１と混合する前記ステップに先だって、好気的条 件下でＰＷＤ−１を増殖させて活性細を生産するステップをさらに含む請求項８ に記載の方法。 ｌ０．前記発酵ステップが嫌気的発酵ステップであることからなる請求項８に記 載の方法。 １１．ケラチン質原料をＰＷＤ−１と混合する前記ステップに先だって、好気的 条件下でＰＷＤ−１を増増させて活性細胞を生産するステッブをさらに含む請求 項８に記載の方法。 １２．前記発酵培地が、ＰＷＤ−１の液状培養物４部に対し少なくとも約１部の 乾燥ケラチン質原料を含み、これにより前記発酵ステップが半固体発酵ステップ であることからなる請求項８に記載の方法。 １３．前記混合ステップに先だつて、前記ケラテン質原料を減菌するステップを さらに含み、これによりこのケラチン質原料に自然に介在し、さもなければ前記 発酵プロセスを中断させるおそれのある細菌を殺すことからなる請求項８に記載 の方法。 １４．ケラチン質原料をＰＷＤ−１と４合する前記ステップに先だって、次の細 菌型加水分解を促進するのに十分な時間と温度で前記ケラチン質原料を水蒸気に 接触させるステップをさらに含むことからなる請求項８に記載の方法。 １５．前記ケラチン質原料が羽毛であることからなる請求項８に記載の方法。 １６．飼料成分として有用な加水分解した羽毛製品の製造方法であって、羽毛を バチルス・リケニホーミスＰＷＤ−１（ＰＷＤ−１）と混合して発酵培地を形成 するステップと、その消化性を増加させるのに十分な時間この発酵培地を発酵さ せるステップと、次いでこの培地中の細菌を殺して飼料製品を形成するステップ とを含む飼料成分としての羽毛製品の製造方法。 １７．羽毛をＰＷＤ−１と混合する前記ステップに先だって、好気的条件下でＰ ＷＤ−１を増殖させて活性細胞を生産するステップをさらに含む請求項１６に記 載の方法。 １８．前記発酵ステップが嫌気的発酵ステップであることからなる請求項１６に 記載の方法。 １９．前記発酵培地が、重量で、ＰＷＤ−１の液状培養物４部に対し少なくとも 約１部の乾燥羽毛を含み、これにより前記発酵ステップが半固体発酵ステップで あることからなる請求項１６に記載の方法。 ２０．前記混合ステップに先だつて、前記ケラチン質原料を滅菌するステップを さらに含み、これによりこのケラチン質原料に自然に介在し、さもなければ前記 発酵プロセスを中断させるおそれのある細菌を殺すことからなる請求項１６に記 載の方法。 ２１．ケラチン質原料をＰＷＤ−１と混合する前記ステップに先だって、次の細 菌型加水分解を促進するのに十分な時間と温度で前記ケラチン質原料を水蒸気に 接触させるステップをさらに含む請求項１６に記載の方法。 ２２．前記ケラテン質原料が羽毛であることからなる請求項１６に記載の方法。 ２３．バチルス・リケニホーミスＰＷＤ−１，ＡＴＣＣ受託番号第５３７５７号 の同定特性を有するケラチン質減成微生物の純粋培養物。 ２４．ケラチン質原料を減する能力を有するバチルス・リケニホーミスＰＷＤ− １タンパク質の混合物を含む細胞フリーな粗抽出物。 ２５．ケラチン質原料を減成する、実質的に純粋なバチルスリケニホーミスＰＷ Ｄ−１酵素。 ２６．細菌的にケラチン質原料を減成する酵素又はその活性断片の生産に対して コードするクローン遺伝子又はその断片を含むＤＮＡ配列の同定方法であって、 （ａ）１つ細菌種から多数のＤＤＡ配列を生成するステップと、 （ｂ）このＤＮＡ配列をＤＮＡ表現ベクターへ挿入して、組み換え表現ベクトル を形成するステップと、（ｃ）この組み換え表現ベクターを適当な宿主へ挿入し て、ＤＮＡ配列を表現する形質転換体を形成するステップと、（ｄ）粉末状ケラ チン基質を含む寒天培地上に、この形質転換体をコロニーとして増殖させるステ ップと、（ｅ）このコロニーのあちこちに清澄化ゾーンに対する培地を観察する ステップであって、この清澄化ゾーンの存在が、形質転換体内に含まれているベ クターのＤＮＡインサートが細菌的にケラチン質原料を減成する酵素又はその活 性断片に対してコードするクローン遺伝子又はその断片を含むことを示すステッ プとを含ＤＮＡ配列の同定方法。 ２７．前記ケラチン質原料が白色の粉末状羽毛を含むことからなる請求項２６に 記載の方法。 ２８．バチルス・リケニホーミスＰＷＤ−１ケラチン質原料減成酵素又はその活 性断片の生産に対してコードするクローン遺伝子又はその活性断片を含むＤＮＡ 配列。