CN1166859A - 编码地衣形芽胞杆菌pwd-1角蛋白酶的dna - Google Patents

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J·C·H·施
X·林
E·S·米勒
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North Carolina State University
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Abstract

本发明公开了一种编码角蛋白酶的分离的DNA，该分离的DNA可以为下列DNA中的任何一种：(a)编码图1的地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶的分离的DNA，(b)和寡核苷酸探针杂交的分离的DNA，该探针能和上述(a)的DNA杂交但不能和编码地衣形芽胞杆菌NCIB6816枯草溶菌素Carlsberg丝氨酸蛋白酶的DNA杂交以及(c)由于遗传密码的简并而在核苷酸序列上不同于(a)和(b)的分离的DNA且能编码一种角蛋白酶的分离的DNA。

Description

编码地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶的DNA
本发明是在来自USDA资助的政府支持下完成的。政府对本发明持有某些权利。
本发明的领域
本发明涉及编码地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶的DNA，该DNA用于生产可用来降解诸如羽毛等角蛋白并进而生产出氨基酸的角蛋白酶。
本发明的背景
在养禽业中可大量生产羽毛。这些羽毛为各种潜在用途提供了一个廉价的原料来源。连同其它因素，使得发展降解羽毛的方法以便能在动物饲料中作为氨基酸和可消化蛋白质的一个廉价来源具有相当重要的意义。发展至今，将羽毛转变成动物饲料的方法包括蒸汽水解法以及蒸汽水解和酶法的联合法。参见，例如，Papadopoulos，M.C.，Animal FeedScience and Technology 16：151(1986)；Papadopoulos，M.C.，PoultrySciences 64：1729(1985)；Alderibigde，A.O.等人，J.Animal Science1198(1983)；Thomas和Beeson，J.Animal Science 45：819(1977)；Morris等人，Poultry Science 52：858(1973)；Moran等人，Poultry Science46：456(1967)；Davis等人，Processing of poultry by-products and theirutilization in feeds，Part I，USDA Util.Res.Rep.no.3，Washington，D.C.(1961)。由于这些方法的缺点，诸如蒸汽法会降解热敏氨基酸以及所得产物的消化率相对较低等，使得新的经济的无需剧烈蒸汽处理的羽毛降解法一直具有一定价值。因此，本发明的一个目的是提供一种不依赖于蒸汽水解的水解角蛋白材料的方法。
本发明的另一目的是提供一种将角蛋白材料以高氨基酸产率转变成氨基酸的方法。
本发明进一步的目的是提供一种可用作能高度消化的并作为高质量的食用蛋白质和氨基酸来源的饲料组分的水解羽毛产物。
本发明的另一个进一步的目的是提供一种可作为饲料添加剂而改进饲料中角蛋白和其它蛋白消化率的角蛋白酶。
本发明还有一个目的就是提供一种以水解羽毛产物作为食用氨基酸来源的经济的动物饲料。本发明的上述及其它的目的和方面将在以下的概述，详细描述以及实施例中作详细的解释。
本发明的概述
本发明的第一方面是一种由从(a)到(d)构成的组中选择的能编码角蛋白酶的分离的DNA：
(a)能编码图1的地衣形芽胞杆菌PWD-1(ATCC保藏号53757)角蛋白酶的分离的DNA(SEQ ID NO：1)；
(b)分离的DNA，其在以0.3M的氯化钠，0.03M的柠檬酸钠以及0.1％的SDS于60℃的严格洗涤为代表的条件下和上述(a)的分离的DNA杂交，且和上述(a)的分离的DNA至少有65％的同源性，并编码一种角蛋白酶；
(c)分离的DNA，其和一寡核苷酸探针杂交，该寡核苷酸探针和上述(a)的DNA杂交，而且在同样的杂交条件下却不和编码地衣形芽胞杆菌NCIB 6816枯草溶菌素Carlsberg丝氨酸蛋白酶(地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶可能是其变种)的DNA杂交；和
(d)由于遗传密码简并而使其核苷酸序列不同于上述(a)和(b)的分离的DNA并编码角蛋白酶的分离的DNA。
本发明的第二方面是一包含载体DNA和一上述编码角蛋白酶的DNA的重组DNA分子。
本发明的第三方面是一包含上述重组DNA序列并能表达所编码的角蛋白酶的宿主细胞。
本发明的第四方面是一种通过在允许所编码的角蛋白酶表达的条件下培养上述宿主细胞并收集所表达的角蛋白酶从而制备角蛋白酶的方法。
本发明的上述以及其它方面在下面的附图，实施例以及详细描述中有详细的解释。
附图的简单描述
图1表明了编码地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶的分离的DNA的序列以及所编码的氨基酸。另外，图1也说明了编码地衣形芽胞杆菌PwD-1角蛋白酶的氨基酸和地衣形芽胞杆菌NCIB6816枯草溶菌素Carlsberg基因的不同之处。
本发明的详细描述
这里所揭示的氨基酸序列是从左到右的氨基到羧基的方向。其中的氨基和羧基没有出现在序列中。这里提供的核苷酸序列则只是从左到右的5’到3’方向的单链。这里是按IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的或(对氨基酸)参照37 CFR§1.822及建立的用法以三字母密码方式描绘核苷酸和氨基酸。参见，例如，Patent In User Manual，99-102(Nov.1990)(美国专利商标局，Office of the Assistant Commissioner forPatents，Washington，D.C.20231)；美国专利No.4,871,670，Hudson等人，第3栏20-43行(申请人特别强调这一公开以及这里所引用的其它所有专利参考文献都作为参考文献合并于此)。
A.编码角蛋白酶的DNAs
编码一种能降解诸如羽毛等角蛋白源的角蛋白酶的DNAs。此定义试图包括DNAs中自发的等位基因突变。一般地，能允许编码表达角蛋白酶的其它DNA序列和一这里所提供的DNA序列杂交的杂交条件是高度严格的。例如，在标准的原位杂交分析中，这样的序列杂交可在以0.3MNaCl，0.03M柠檬酸钠，0.1％SDS在60℃甚至70℃的严格的洗涤为代表的条件下用这里公开的DNA完成。参见J.Sambrook等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual(2d Ed.1989)(Cold Spring HarborLaboratory)。一般地，编码角蛋白酶并和编码这里所公开的地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶的DNA序列杂交的DNA序列至少和这里所公开的角蛋白酶的序列有65％，70％，75％，80％，85％，90％甚至95％或更高的同源性。
另外，那些编码和前述序列所编码的角蛋白酶相同的角蛋白酶但由于遗传密码的简并而在密码子序列上和这些序列不同的DNA序列(或寡核苷酸)也是本发明的一个方面。这种允许不同的核酸序列编码同一种蛋白质或肽的遗传密码简并现象已广泛见于文献中。参见例如美国专利No.4,757,006，Toole等人，第2栏，表1。
那些编码和前述序列所编码的角蛋白酶相同的角蛋白酶但由于定点诱变而在密码子序列上和这些序列不同的DNA序列(或寡核苷酸)是本发明的再一方面。如下所述，用于改进角蛋白酶特性的定点诱变技术是众所周知的。参见例如，美国专利No.4,873,192，Kunkel。
B.基因工程技术
通过基因工程制备克隆基因，重组DNA，载体，转化宿主细胞，蛋白质及蛋白片段已是众所周知的。参见例如，美国专利No.4,761,371，Bell等人，在第6栏第3行至第9栏第65行；美国专利No.4,877,729，Clark等人，在第4栏38行至第7栏第6行；美国专利No.4,912,038，Schilling，在第3栏第26行至第14栏第12行；以及美国专利No.4,879,224，Wallner，在第6栏第8行至第8栏第59行。
编码角蛋白酶的DNA可按照任何已知技术制备。例如，该DNA可使用BIO-RAD公司的MUTA-GENETM噬粒体外诱变试剂盒进行构建。该试剂盒是基于Kunkel在美国专利No.4,873,192中所描述的方法。(也见于T.Kunkel，Proc.Natl Acad.Sci.USA 82：488(1985)；T Kunkel等人，Methods in Enzymol.154：367(1987))美国专利No.4,873,192提供了一个对双链DNA的非诱变链非常有力的选择。当DNA在dut-ung-双突变细菌中合成时，作为dut突变的结果使新生的DNA在胸腺嘧啶位置携带了一定量的尿嘧啶，从而灭活了dUTPase酶并导致了细胞内高水平的dUTP。Ung突变灭活了尿嘧啶N-糖基化酶，从而使组合于其中的尿嘧啶保存在DNA中。然后，用这种包含尿嘧啶的链作为模板且以含有所需突变的寡核苷酸作为引物在体外合成互补链。当将所得双链DNA转化入带有高效的尿嘧啶N-糖基化酶的细胞时，含有尿嘧啶的链将高效率地失活而使不合尿嘧啶的存活体进行复制(一般参见BIO-RAD目录号170-3576操作说明)。
包括编码角蛋白酶的DNA以及调控元件在内的角蛋白酶基因可通过扩增一所选择的或靶核酸序列而构建。扩增可用任何适合的方式进行。一般地参见D.Kwoh和T.Kwoh，Am.Biotechnol.Lab.8：14(1990)。合适的扩增技术的例子非局限性地包括，聚合酶链式反应，连接酶链式反应，链置换扩增(一般参见G.Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：392(1992)；G.Walker等人，Nucleic Acids Res.20：1691(1992))，基于转录的扩增(参见D.Kwoh等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 86：1173(1989))，自动维持序列扩增(或“ 3SR”)(参见J.Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874(1990))，Qβ复制酶系统(参见P.Lizardi等人，Biotechnology 6：1197(1988))，基于核酸序列的扩增(或“ NASBA”)(参见R.Lewis，Genetic Engineering News 129：1(1992))，修复链反应(或“RCR”)(参见R.Lewis，见上文)以及自返式(boomerang)DNA扩增(或“BDA”)(参见R.Lewis，见上文)。目前，优选聚合酶链式反应。
诸如前述的DNA扩增技术包括使用能特异地结合于编码所需靶蛋白的DNA的一个探针，一对探针或两对探针。
聚合酶链式反应(PCR)可按照已知的技术进行。参见，例如，美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159以及4,965,188。一般地，PCR包括，首先，在杂交条件下用待测特定序列的每条链的一种寡核苷酸引物处理核酸样品(例如，在热稳定的DNA聚合酶存在下)，从而合成与每一条核酸链互补的每一引物的延伸产物，由于引物和与其杂交的特定序列的每一条链充分互补从而当将从每一引物合成的延伸产物和其互补链分开时，其可以作为其它引物的延伸产物的合成模板，然后，如果存在待测序列，则可在变性条件下处理样品从而将引物延伸产物从其模板上分开。循环重复这些步骤直到获得所需的扩增度。扩增序列的检测可以如下进行：在反应产物中加入一个能和该反应产物杂交的寡核苷酸探针(如，本发明的寡核苷酸探针)，该探针带有可检测标记，随后按照已知的技术或者通过直接在凝胶上观察而检测这种标记。
也可按照已知的技术进行连接酶链式反应(LCR)。参见，例如，R.Weiss，Science 254：1292(1991)。一般地，该反应用两对寡核苷酸探针进行，一对和待测序列的一条链连接；而另一对和待测序列的另一条链连接。每对均和其相应的链完全重叠。该反应如下进行，首先，变性(如，分离)待测序列的链，然后在热稳定连接酶的存在下将该链和两对寡核苷酸探针反应从而使每对寡核苷酸探针连接在一起，然后分离反应产物，再循环重复上述步骤直到该序列扩增至所需程度。然后可以按与上述PCR相同的方法进行检测。
载体是一可复制的DNA构建体。载体在这里用于扩增编码这里所提供的角蛋白酶的DNA和/或表达编码这里所提供的角蛋白酶的DNA。表达载体是一种可复制的DNA构建体，其中编码角蛋白酶的DNA序列可控制地连接于能在合适的宿主中进行角蛋白酶表达的合适的调控序列。而此调控序列的需求根据宿主的选择以及所选择的转化方法而变化。一般地，调控序列包括转录启动子，控制转录的可选择的操作基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。
载体的扩增不需要表达调控功能域。所需的一切就是通常由复制起点所提供的在宿主中复制的能力以及一便于识别转化体的选择基因。
载体包括质粒，病毒(如：腺病毒，细胞肥大病毒)，噬菌体以及可整合的DNA片段(如可通过重组整合入宿主基因组的片段)。载体的复制和功能独立于宿主基因组之外而进行，但在一些情况下也可能整合入宿主的基因组中。表达载体应包含启动子以及能可操作地连接于待表达的基因且在宿主机体内可操作的RNA结合位点。
当DNA区域彼此功能性地相关时，它们能可操作地连接或接合。例如，若启动子能调控序列的转录，则其可以可操作地与编码序列连接，如果核糖体接合位点定位以允许翻译，则其可以可操作地和编码序列连接。
转化的宿主细胞是那些已用包含有这里所公开的DNA序列的且使用DNA重组技术构建的载体转化或转染的细胞。已转化的宿主细胞通常地表达角蛋白酶，但为了克隆或扩增角蛋白酶DNA而转化的宿主细胞无需表达角蛋白酶。合适的宿主细胞包括那些对熟练的技术人员来说已知的宿主细胞，诸如原核生物宿主细胞。
原核生物宿主细胞包括革兰氏阴性或阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或芽胞杆菌。较高级的真核细胞包括下述所构建的来源于哺乳动物的细胞系。典型的宿主细胞是E.coli W3110(ATCC 27，325)，E.coli B，E.Coli X1776(ATCC 31，537)，E.coli 294(ATCC 31，446)。合适的原核生物和微生物载体的广泛的变种都可以使用。典型地使用PBR 322转化E.Coli。最常见地使用于重组微生物表达载体的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)以及乳糖启动子系统(Chang等人，Nature 275：615(1987)；以及Goeddel等人，Nature 281：544(1979))，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，Nucleic Acids Res.8：4057(1980))，以及欧洲专利申请公开No.36,776)以及tac启动子(H.DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21(1983))。启动子和shine-Dalgarno序列(用于原核生物宿主表达)可以可操作地连接于编码角蛋白酶的DNA，即它们的定位便于启动从DNA到角蛋白酶的信使RNA的转录。
诸如酵母培养物的真核微生物也可用带有这里所公开的分离的DNA的载体进行转化。参见，例如美国专利No.4,745,057。虽然许多其它菌株也常用，但酿酒酵母却是在低级真核宿主微生物体中最常使用的。酵母载体可以包含一个来自2μm的酵母质粒的复制起始点或者一个自主复制序列(ARS)，一个启动子，这里所提供的编码角蛋白酶的DNA，聚腺苷酸化和转录终止序列以及一个选择基因。一个典型的质粒是YRp7，(Stinchcomb等人，Nature 282：39(1979)；Kingsman等人，Gene 7：141(1979)；Tschemper等人，Gene 10：157(1980)。在酵母载体中合适的启动序列包括金属硫因，磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等人，J.Biol，Chem.255：2073(1980)或者其它糖解酶的启动子(Hess等人，J.Adv.Enzyme Reg.7：149(1968)；以及Holland等人，Biochemistry 17：4900(1978))。在酵母表达中使用的合适的载体和启动子进一步描述于R.Hitzeman等人的欧洲专利公开No.73,657。
C.角蛋白酶的制备和使用
如上述，角蛋白酶可以通过在允许所编码角蛋白酶表达的条件下培养宿主细胞并收集所表达的角蛋白酶而制备。可在细胞生长的条件下培养宿主细胞，然后再在引起所编码角蛋白酶表达的条件下培养，或者也可以使细胞生长和所编码角蛋白酶的表达同时进行。角蛋白酶可以融合到一合适的分泌前导序列上或者表达进入培养基并从培养基中收集，或者角蛋白酶也可以胞内表达，然后溶化细胞并从胞溶产物中收集角蛋白酶。总之，只要本领域的熟练技术人员认可，任何合适的培养和表达转基因蛋白的技术均可使用。
所制备的角蛋白酶可以应用于降解角蛋白材料的方法中。典型的水解方法如Shih等人的美国专利No.5,063,161，和4,959,311所述，其公开内容以整体形式作为参考资料引入本发明。以前Shih等的专利也公开了含有角蛋白酶的发酵培养基。相应地，本发明的角蛋白酶用于制备发酵培养基。
所制备的角蛋白酶也能用于生产水解羽毛产品。水解羽毛产品有几个已知的用途。例如，水解的羽毛可用作动物饲料制品的组分。类似地，所制备的角蛋白酶本身也可组合于动物饲料制品中。以其整体合并于此的Shih等的美国第5,186,961号专利公开了含有角蛋白酶的合适的动物饲料制品。
如同在上述本发明背景中所论述的，所制备的角蛋白酶也应用于从羽毛产品制备氨基酸。
本发明更详细地解释于以下的非限制性实施例中，该实施例只是为说明的目的而提供，并不能当作对本发明范围的限制。
实施例1
通过PCR-步移(walking)技术从地衣形芽胞杆菌中分离并测序角蛋白酶基因
按照本领域熟练技术人员已知的技术用溴化氰断裂角蛋白酶。随后，将对应于N-末端氨基酸序列的5’DNA(N10)序列作为固定引物和一系列单个配对的随机引物一起进行聚合酶链式反应(PCR)。和N10下游的一25体寡核苷酸探针杂交得到被鉴定为包含部份角蛋白酶基因的由N10扩增的638bp的PCR产物以及一个随机的引物。通过同样的方法并使用在+548位点处设计并和随机引物配对的第二固定引物(I10)进行PCR扩增并测序远端的3’基因部份。用相似的方法进行上游序列分析。使用一和随机引物配对的反义的10体固定引物(R10)通过PCR扩增575bp的上游区域。通过组合的PCR产物测定包含地衣形芽胞杆菌角蛋白酶基因以及调控元件在内的完整的1，457bp序列。
所鉴定的基因和地衣形芽胞杆菌NCIB 6816枯草溶菌素Carlsberg基因高度相似，如图1所示。而它们的差别表示为所鉴定的地衣形芽胞杆菌角蛋白酶的相应氨基酸上方画线的不同Carlsberg基因氨基酸。
                    序列表
(1)一般信息
   (i)申请人：Shih，Jason C.H.
              Lin，Xiang
              Miller，Eric S.
   (ii)发明名称：编码地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶的DNA
   (iii)序列数量：2
   (iv)联系地址：
       (A)地址：Kenneth D.Sibley
       (B)街道：Post Office Drawer 34009
       (C)城市：Charlotte
       (D)州：North Carolina
       (E)国别：USA
       (F)邮编：28234
   (v)计算机可读形式：
       (A)介质类型：软盘
       (B)计算机：IBM PC兼容机
       (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
       (D)软件：Patent In Release#1.0，Version#1.25
   (vi)目前申请资料
       (A)申请号：US 08/250,028
       (B)申请日：27-MAY-1994
       (C)分类：
(viii)律师/代理人信息
      (A)姓名：Sibley，Kenneth D.
      (B)注册号：31，665
      (C)委托/备案号：5051-260
(ix)电信信息：
      (A)电话：(919)420-2200
      (B)电传：(919)881-3175(2)SEQ ID NO：1的信息
(i)序列特征：
      (A)长度：1457个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(iii)假拟：无
(iv)反义：无
(vi)原始来源：
      (A)生物体：地衣形芽胞杆菌
      (B)菌株：PWD-1
(ix)特征：
      (A)名称/关键词：CDS
     (B)位置：215..1354
(xi)序列描述：SEQ ID NO：l：CTCCTGCCAA  GCTGAAGCGG  TCTATTCATA  CTTTCGAACT  GAACATTTTT  CTAAAACAGT           60TNNTAATAAC  CAAAAAATTT  TAAATTGGCC  CTCCAAAAAA  ATAGGCCTAC  CATATAATTC          120ATTTTTTTTC  TATAATAAAT  TAACAGAATA  ATTGGAATAG  ATTATATTAT  CCTTCTATTT          180AAATTATTCT  GAATAAAGAG  GAGGAGAGTG  AGTAATGATG  AGGAAAAAGA  GTTTTTGGCT          240TGGGATGCTG  ACGGCCTTCA  TGCTCGTGTT  CACGATGGCA  TTCAGCGATT  CCGCTTCTGC          300TGCTCAACCG  GCGAAAAATG  TTGAAAAGGA  TTATATTGTC  GGATTTAAGT  CAGGAGTGAA         360AACCGCATCT  GTCAAAAAGG  ACGTCATCAA  AGAGAGCGGC  GGAAAAGTGG  ACAAGCAGTT         420TAGAATCATC  AACGCAGCAA  AAGCGAAGCT  AGACAAAGAA  GCGCTTAAGG  AAGTCAAAAA         480TGATCCGGAT  GTCGCTTATG  TGGAAGAGGA  TCATGTGGCC  CATGCCTTGG  CGCAAACCGT         540TCCTTACGGC  ATTCCTCTCA  TTAAAGCGGA  CAAAGTGCAG  GCTCAAGGCT  TTAAGGGAGC         600GAATGTAAAA  GTAGCCGTCC  TGGATACAGG  AATCCAAGCT  TCTCATCCGG  ACTTGAACGT         660AGTCGGCGGA  GCAAGCTTTG  TGGCTGGCGA  AGCTTATAAC  ACCGACGGCA  ACGGACACGG         720CACACATGTT  GCCGGTACAG  TAGCTGCGCT  TGACAATACA  ACGGGTGTAT  TAGGCGTTGC         780GCCAAGCGTA  TCCTTGTACG  CGGTTAAAGT  ACTGAATTCA  AGCGGAAGCG  GATCATACAG         840CGGCATTGTA  AGCGGAATCG  AGTGGGCGAC  AACAAACGGC  ATGGATGTTA  TCAATATGAG         900CCTTGGGGGA  GCATCAGGCT  CGACAGCGAT  GAAACAGGCA  GTCGACAATG  CATATGCAAG         960AGGGGTTGTC  GTTGTAGCTG  CAGCAGGGAA  CAGCGGATCT  TCAGGAAACA  CGAATACAAT        1020TGGCTATCCT  GCGAAATACG  ATTCTGTCAT  CGCTGTTGGT  GCGGTAGACT  CTAACAGCAA        1080CAGAGCTTCA  TTTTCCAGTG  TGGGAGCAGA  GCTTGAAGTC  ATGGCTCCTG  GCGCAGGCGT        1140ATACAGCACT  TACCCAACGA  ACACTTATGC  AACATTGAAC  GGAACGTCAA  TGGTTTCTCC        1200TCATGTAGCG  GGAGCAGCAG  CTTTGATCTT  GTCAAAACAT  CCGAACCTTT  CAGCTTCACA        1260AGTCCGCAAC  CGTCTCTCCA  GCACGGCGAC  TTATTTGGGA  AGCTCCTTCT  ACTATGGGAA        1320AGGTCTGATC  AATGTCGAAG  CTGCCGCTCA  ATAACATATT  CTAACAAATA  GCATATAGAA        1380AAAGCTAGTG  TTTTTAGCAC  TAGCTTTTTC  TTCATTCTGA  TGAAGGTTGT  CCAATATTTT        1440GAATCCGTTC  CATGATC                                                           1457(2)SEQ ID NO：2的信息
(i)序列特征：
   (A)长度：379个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假拟：无
(vi)原始来源：
(A)生物体：地衣形芽胞杆菌
(B)菌株：PWD-1(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met1               5                   10                  15Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro
        20                  25                  30Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val
    35                  40                  45Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Val Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys
50                  55                  60Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp65                  70                  75                  80Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val
            85                  90                  95Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly
        100                 105                 110Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly
    115                 120                 125Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His
130                 135                 140Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala145                 150                 155                 160Tyr Ash Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val
            165                 170                 175Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val
        180                 185                 190Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr
    195                 200                 205Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp
210                 215                 220Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys225                 230                235                  240Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala
            245                 250                 255Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro
        260                 265                 270Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser
    275                 280                 285Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala
290                 295                 300Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr305                 310                 315                 320Leu Asn Gly Thr Ser Met Val Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala
            325                 330                 335Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn
        340                 345                 350Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly
    355                 360                365Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
370                 375

Claims (10)

1.编码角蛋白酶的分离的DNA，该分离的DNA从如下组中选择：
(a)编码图1的地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶的分离的DNA；
(b)和一寡核苷酸探针杂交的分离的DNA，该寡核苷酸探针和上述(a)的DNA杂交，但在相同的杂交条件下不和编码地衣形芽胞杆菌NCIB6816枯草溶菌素Carlsberg丝氨酸蛋白酶的DNA杂交；和
(c)由于遗传密码的简并而在核苷酸序列上不同于上述(a)和(b)的分离的DNA且编码角蛋白酶的分离的DNA。
2.按照权利要求1的分离的DNA，该分离的DNA编码图1的地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶。
3.按照权利要求1的分离的DNA，该分离的DNA具有图1的DNA序列。
4.包含载体DNA和上述权利要求1的编码角蛋白酶的分离的DNA的重组DNA分子。
5.包括按照权利要求4的重组DNA且能表达所编码的蛋白的宿主细胞。
6.制备角蛋白酶的方法，包括：
在允许所编码的角蛋白酶表达的条件下培养按照权利要求5的宿主细胞，从而提供一个细胞培养物，且从该细胞培养物中收集该角蛋白酶。
7.编码角蛋白酶的分离的DNA，该分离的DNA从如下组中选择：
(a)编码图1的地衣形芽胞杆菌PWD-1角蛋白酶的分离的DNA；
(b)分离的DNA，其和上述(a)的分离的DNA在以用0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠以及0.1％SDS在60℃下严格洗涤为代表的条件下杂交，且与上述(a)的分离的DNA至少65％同源，并编码角蛋白酶；
(c)  由于遗传密码的简并而在核苷酸序列上不同于上述(a)和(b)的分离的DNA且编码角蛋白酶的分离的DNA。
8.包含载体DNA和上述权利要求7的编码角蛋白酶的分离的DNA的重组DNA分子。
9.包含按照权利要求8的重组DNA且能表达所编码的蛋白的宿主细胞。
10.制备角蛋白酶的方法，包括：
在允许所编码的角蛋白酶表达的条件下培养按照权利要求9的宿主细胞，从而提供一细胞培养物，且从该细胞培养物中收集该角蛋白酶。
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