CN1420925A - 调节腈水解酶选择性的方法,用此方法获得的腈水解酶及其用途 - Google Patents

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CN1420925A CN00818244.2A CN00818244A CN1420925A CN 1420925 A CN1420925 A CN 1420925A CN 00818244 A CN00818244 A CN 00818244A CN 1420925 A CN1420925 A CN 1420925A
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Abstract

本发明涉及一种具有调节选择性的修饰的腈水解酶，其特征在于，它包含与不同于原来的氨基酸残基的162位氨基酸残基。

Description

调节腈水解酶选择性的方法，用此方法 获得的腈水解酶及其用途
本发明涉及选择性增强的新型腈水解酶，获得此酶的方法和所述腈水解酶的用途。
腈水解酶
催化腈基水解为相应的羧酸和氨离子的酶是腈水解酶(Fable，有机化学中的生物转化(Biotransformations in Organic Chemistry)，SpringerVerlag，柏林，海德堡，1992，ISBN3-540-55762-8)。但是，这种最终导致腈基水解的将腈基转化为相应羧酸的生物转化也可在两步反应中进行，第一步包括用腈水解酶将腈转化为酰胺的生物转化，第二步包括用酰胺酶水解酰胺而获得相应羧酸。
腈水解酶最先在植物中被发现(Thimann和Mahadevan，1964，Arch.Biochem.Biophys.105；133-141)并然后在许多土壤微生物群落(Kobayashi和Shimizu，1994，FEMS Microbiology letters 120；217-224)；假单孢菌属，诺卡菌属，节杆菌属，镰孢菌属，Rhodoccocus，克雷伯氏杆菌属和产碱菌属中分离到它。最近在嗜热菌中已鉴定出腈水解酶(Cramp等，1997，Microbiology，143，2313-2320)。腈水解酶有不同的底物特异性，但根据其特异性它可分为三类：脂族腈特异性的腈水解酶，芳香腈特异性的腈水解酶或芳基乙腈特异性的腈水解酶(Kobayashi等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90；247-251；Kobayashi和shimizu，1994，前已提及；Lévy-Schil等，1995，Gene 161；15-20；Layh等，J.Mol.Catal B；Enzymatic5；467-474)。
因为许多合成工艺涉及腈基的水解，腈水解酶在生物催化中是有价值的(Yamamoto等，1991，Appl.Environ.Micro.57；3028-3032；Fable，有机化学中的生物转化，第二版，Springer Verlag，柏林，1995；Lévy-Schil等，1995，Gene 161；15-20；Cowan等，1998，Extremophiles 2；207-216)；己二腈转化为腈基戊酸或己二酸，烟酸的合成，对氨基苯甲酸(凝血酸)的合成，扁桃腈的对映体选择性水解。尤其是粪产碱菌ATCC8750中的腈水解酶(本申请中称为NitB)，Comamonas Testosteroni中的腈水解酶(本申请中称为NitA)可用于获得甲硫氨酸的羟基类似物(FR9411301，WO9609403，FR9613077)。
腈水解酶有不同程度相似性排列的一级结构，从大约30％开始，对比几种腈水解酶的序列揭示几个残基的保守性，包括NitB腈水解酶第163位的半胱氨酸残基。这个残基参与了腈水解酶反应的机制(Kabayashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90；241-251)。
对于本发明而言，参考序列是NitB序列，所有特定氨基酸位点的定义和作用均以NitB一级序列为对照。所附的图1列出了至今为止以被描述的14种腈水解酶的序列，以NitB为参照作对比，包括Arabidopsis thaliana的p_Athalia1-4(SwissProt保藏号：P32961，P32962，P46010，P46011)Nicotiana tabacum的p_Tobacco1和2(GeneBank保藏号：D63331，D83078)，Rhodococcus rhodocrous J1的b_RhodocJ1(GeneBank保藏号：D11425)，Rhodococcus rhodocrous PA34的b_RrhodocPA3(GeneBank保藏号：E09026)，Gordona terrae的b_Gterrae(GeneBank保藏号：E12616)，Rhodococcus rhodocrous K22的b_RhodocK22(GeneBank保藏号：D12583)，Klebsiella ozaenae的b_Kozaenae(SwissProt保藏号：P100450)，Camamonasteatosteroni NI1和NitA的b_CtestosNI1(GeneBank保藏号：L32589)，Alacaligenes faecalis JM3或NitB的b_Afaecalis(Swissport保藏号：P20960)。图中给出了NitB序列的氨基酸(编号在底部)，还有带编号的共有序列(编号在顶部)。根据本申请中的约定，其他腈水解酶的残基根据这个半胱氨酸残基编号，并根据NitB腈水解酶的序列作为参照序列。基于这样的排列，或此排列中的任一腈水解酶的序列，本领域的技术人员运用已给出其定位和性质的NitB氨基酸的定义可以容易地识别出另一个腈水解酶序列中相应氨基酸的位点。
选择性问题
腈水解酶选择性被定义为不带由腈水解酶催化的腈水解所产生的羧基的化合物的百分数。这的数字相对而言是较小的，但在某些腈水解酶和底物中是明显的。因此，在由假单孢荧光菌DSM7155的腈水解酶催化的2-甲氧基扁桃腈水解为2-甲氧基扁桃酸的反应同时有副产物2-甲氧基扁桃酰胺产生(Layh等，1998，前已提及)。与之相似，本申请的实施例中，在由Comamonas testosteroni NI1的NitA腈水解酶催化的2-羟基-4-甲硫基-丁腈(HMTBN)水解伴随着副产物2-羟基-4-甲硫基-丁酰胺(HMTBM)的产生。若使用这样的酶/底物配对的生物催化工艺，腈水解酶对于其底物缺乏选择性会导致酰胺副产物的产生，这意味着工艺的产率的丢失。此产率的丢失会有相当大的经济上的影响。另外，这种选择性的缺乏导致存在的酰胺污染反应产物。从而羧酸的纯化是必要的，并且，同样的，这对工艺带来了经济上的影响。因此，对于一指定的底物，缺乏腈水解酶的选择性为开发使用这种酶和这一底物的生物催化工艺带来了障碍。
如果酶选择性的下降伴随着此酶对它的底物的催化活力上升，那么这种下降也可能是我们所需要的。特别是在除污染的方法情况下，其中需要寻找一种具有最大比活力的酶来快速降解有毒分子。在这种情况下，酶催化反应所得的产物的性质相对于底物降解的速率而言就不重要了。
因此，特别重要的是能调节腈水解酶的选择性，既增强该选择性，又能产生上述的降低选择性。
酶的强化
酶的直接进化包括了通过对有增强功能的酶突变体反复筛选，获取有特定功能的酶。(Arnold和Volkov，1999，Current Opinion in ChemicalBiology 3：54-59；Kuchner和Arnold，1997，Tibtech 15：523-530)。这些突变体是通过对基因编码待研究的酶的一些突变技术得到的(skandalis等，1997，Chemistry & Biology 4：8889-898；Crameri等，1998，Nature 391：288-291)：化学突变(Singer和Fraenkel-Conrat，1969，Prog.Nucl.Acid Res.Mol.Biol.9；1-29)，易错聚合酶链式反应的突变(Leung等，1989，Technique 1：11-15)，组合PCR的突变(Crameri等，1998，上已提及；Shao等，1998，Nucleic Acid Res.26：681-683)，直接突变(直接突变：实际运用，1991，M.J.McPHERSON编，IRL出版社)等。
在用于增强NitB腈水解酶对HMTBN(2-羟基-4-甲硫基-丁腈)活性的方法中，发明者业已注意到在NitB的162位的活性位点处将半胱氨酸置换为天冬酰胺残基，会改变所研究的腈水解酶的选择性。另一方面，他们业已发现在NitA腈水解酶序列的162位引入半胱氨酸残基导致其对其另一个底物，AMTBN选择性的增强，这显示了在腈水解酶活性位点区域中的162位是涉及所述腈水解酶选择性的一个关键位点，而且修饰此位点的氨基酸残基，包括用另一个氨基酸替换原来的氨基酸，会导致对腈水解酶选择性的调节。
本发明因此涉及具有调节的选择性的修饰的腈水解酶，其特征在于，它包括在162位上，氨基酸残基和原来的氨基酸残基不同。
根据本发明，术语“修饰的腈水解酶”指相对于原来的腈水解酶已有修饰的腈水解酶，所述的修饰包括将162位的原来氨基酸残基用另一个氨基酸置换。
根据本发明，术语“选择性的调节”指修饰的腈水解酶的的选择性和原来的腈水解酶的选择性不同，尤其是与原腈水解酶相比相差0.5％，更好的是至少1％。
有利的是，162位残基由选自半胱氨酸，丙氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，谷氨酰氨，异亮氨酸和丝氨酸的一种氨基酸替代。应当理解，原来的腈水解酶的162位残基不是半胱氨酸，丙氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，谷氨酰氨，异亮氨酸或丝氨酸。
162位残基优选的是被半胱氨酸所替换。
根据本发明的一个特定实施方案，调节包括增强选择性。
根据本发明的第二种实施方案，调节包括降低选择性。
未经修饰的原腈水解酶选自源自细菌，酵母，真菌，植物或动物源的腈水解酶。
在源自细菌的腈水解酶中，尤其要提及下列腈水解酶：紫红红球菌(Rhodococcus rhodocros)J1的b_RhodocJ1(GeneBank保藏号：D11425)，紫红红球菌(Rhodococcus rhodocros)PA34的b_RrhodocPA3(GeneBank保藏号：E09026)，土生戈登氏菌(Gordona terrae)的b_Gterrae(GeneBank保藏号：E12616)；紫红红球菌(Rhodococcus rhodocros)K22的b_RrhodocK22(GeneBank保藏号：D12583)，肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(Klebsiella ozaenae)的b_Kozaenae(SwissProt保藏号：P100450)，睾丸酮假单胞菌(Comamonas testosteroni)NI1或NitA的b_CtestosNI1(GeneBank保藏号：L32589)，和粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)JM3或NitB的b_Afaecalis(Swissport保藏号：P20960)。在源自植物的腈水解酶中，尤其要提及下列腈水解酶：Arabidopsis thaliana的p_Athalia1-4(SwissProt保藏号：P32961，P32962，P46010，P46011)，和Nicotiana tabacum的p_Tobacco1和2(GeneBank保藏号：D63331，D83078)。
在其他来源的腈水解酶中，尤其要提及下列腈水解酶：那些源自Saccharomyces cerevisiae(SwissProt保藏号：P40447和P4044)，Caenorhabditis elegans(GeneBank保藏号：AF069986)，Drosophilamelanogaster(GeneBank保藏号：AF069989)，Homo sapiens(GeneBank保藏号：AF069987)和Mus musculus(GeneBank保藏号：AF069988)的腈水解酶。
根据本发明的另一个实施方案，可这样得到原腈水解酶：筛选DNA文库，特别是不同来源的cDNA或基因组DNA，特别是通过腈水解酶随机突变和重组而获得的DNA文库，直接分子进化，或筛选来自土壤或其他群落环境的DNA文库。
本发明还涉及一种核酸序列，尤其是DNA序列，编码上述修饰的腈水解酶。
根据本发明的第一种实施方案，本发明的核酸序列含有原腈水解酶的核酸序列，其中162位残基原残基的密码子已被编码不同于原残基的残基的密码子，特别是编码丙氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，谷氨酰氨，异亮氨酸或丝氨酸的密码子所替代。
为了强化前述的酶，原序列的密码子可用本领域技术人员所知的任何方法，特别是通过直接突变来加以修饰。
本发明还涉及嵌合DNA或表达盒，包括，以转录方向来看，一个在宿主生物体内有效用的启动子调控序列，编码本发明修饰的腈水解酶的核酸序列，和一个在同一宿主生物体内有效用的终止子调控序列。
宿主生物体包括任何真核生物或原核生物生物体，它可以是分化的或未分化的，尤其是细菌，酵母，真菌，植物细胞和植物。
它们尤其是细菌，例如：大肠杆菌；酵母，尤其是Saccharomyces，Kluyvermyces或Pichia种属；真菌，尤其是Aspergillus或Penicillium，杆状病毒种属，或植物细胞和植物。
根据本发明，术语“植物细胞”是指任何源自植物的细胞，和能构成诸如愈伤组织的未分化组织，诸如胚，植株的部分，植株或种子的分化组织的细胞。
根据本发明，术语“植物”是指能进行光合作用的任何分化的多细胞生物，尤其是单子叶植物或双子叶植物，更特指适用于或不适用于动物或人的食物的植物，如玉米，小麦，菜籽，大豆，大米，甘蔗，甜菜，烟草，棉花等。
根据宿主生物体，启动子和终止子调控要素是本领域技术人员所熟知的。
作为细菌中的启动子的调控序列，可使用细菌天然表达的基因的任一启动子调控序列，例如大肠杆菌色氨酸操纵子启动子调控序列(Denèfle等，1987，Gene，56：61-70)。
作为酵母中的启动子的调控序列，可使用酵母天然表达的基因的任一启动子调控序列，例如S.cerevisiae的Mfα1基因的启动子或Kluyveromyces lactis的乳糖酶基因的启动子(Van Den Berg等，1990，Bio/Technology，8：135-139)。
作为真菌中的启动子的调控序列，可使用真菌天然表达的基因的任一启动子调控序列，例如产黄青霉的酸性磷酸酶基因的启动子序列(Graessle等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63；753-756)或Aspergillus nidulans的脱氢酶I基因的启动子序列(Gwyne等，1989，Biochem.Soc.Trans.17；338-340)。
作为植物细胞或植物中的启动子的调控序列，可使用植物天然表达的基因的任一启动子调控序列，尤其是细菌、病毒或植物来源的启动子，如：核糖-双羧化酶/加氧酶(RuBisCo)小亚单位的基因，组蛋白启动子(EP 0 507698)，大米肌动蛋白启动子，或植物病毒基因的启动子，如：花椰菜花叶病毒(CAMV 19S或35S)的启动子，或由致病因子诱导的启动子，如烟草PR-Ia，可能使用任何已知合适的启动子。
作为细菌中的终止子的调控序列，可使用细菌天然表达的基因的任一终止子调控序列，例如大肠杆菌核糖体RNA操纵子的终止子调控序列(Denèfle等，1987，Gene，56：61-70)。
作为酵母中的终止子的调控序列，可使用酵母天然表达的基因的任一终止子调控序列，例如S.cerivisiae的甘油磷酸激酶(PGK)的终止子或Kluyveromyces lactis的乳糖酶终止子(Van Den Berg等，1990，Bio/technology，8：135-139)。
作为真菌中的终止子的调控序列，可使用真菌天然表达的基因的任一终止子调控序列，例如Trichoderma reesei的丙酮酸激酶基因的终止子调控序列(Schindle等，1993，Gene.130；271-275)。
作为植物细胞或植物中的终止子的调控序列，可使用植物天然表达的基因的任一终止子调控序列，尤其是细菌来源的终止子，如：Agrobacteriumtumefaciens的nos终止子，病毒来源的，如CaMV 35S的终止子，植物来源的，如：组蛋白终止子(EP 0 633 317)。
本发明还涉及一种转化的宿主生物体，它包括上述的嵌合基因，尤其是，在上述的宿主生物体中，本发明的嵌合基因已稳定地整合入基因组中。
本发明还涉及一种生产如上所述的选择性增强的腈水解酶的方法，所谓的方法包括培养本发明的转化的宿主生物体，和适合地，以混合形式或纯化形式分离出修饰的腈水解酶。
本发明还涉及本发明的修饰的腈水解酶在合成或降解化学化合物的方法中的生物催化反应中的应用。
最后，本发明涉及调节腈水解酶选择性的方法，所述的方法包括将原腈水解酶的162位氨基酸残基用不同于原氨基酸的其他氨基酸置换。有利的是，162位残基的替换是通过在编码未修饰的原腈水解酶的核酸序列中引入一个和编码原腈水解酶该位残基的密码子不同的编码162位残基的密码子来进行。
更佳地，通过所述调节方法获得的腈水解酶是如上所述的腈水解酶。
下列实施例阐述了本发明的实施，而不是出于限制其范围的目的。
材料与方法
腈水解酶对2-羟基-4甲硫基丁腈的活性测定如下：
收获一份已知其在660nm处光密度(OD660)的培养物，并用100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液清洗。通过OD660估计样品的干重(1个OD660单位相当于每毫升0.35毫克干重的细胞)，取出大约1mg干重的细胞加入到1ml的100mM，pH7.0磷酸盐缓冲液中，在35℃的2ml的密闭试管中孵育10分钟。在加入17μl 78％浓度的HMTBN后开始测定动力学，这样在分析开始时反应化合物中其浓度为100mM。反应在35℃、搅拌进行。每15分钟，取出100μl的上清液样品，加入900μl的pH2.5的100mM磷酸终止反应，离心后，用下述方法以HPLC分析上清液。
洗脱液由HPLC级的乙腈在50mM磷酸中稀释而成(0.9升50mM磷酸和0.1升乙腈混合)。此洗脱液经过滤和脱气，以1ml/分钟的流速和140巴的压力流过柱子。柱是使用5μm的C18 Nucleosil柱，长度为250mm，直径4.6mm(INTERCHIM.Ref.N5CC18-25F)。注射体积为5μl，通过215nm波长吸收的读数来进行检测。在这样的条件下，HMTBM，HMTBS(2-羟基-4-甲硫基丁酸)和HMTBN(2-羟基-4-甲硫基丁酰胺)的保留时间分别为9分钟，11分钟和15.8分钟。HMTBN，HMTBM和HMTBS的数量从峰面积中进行推算，并与已知组成的标准化混合物的峰面积进行比较。
腈水解酶对2-氨基-4-甲硫基丁腈的活性测定如下：
将细胞团块(细胞干重在0.4至20mg)再悬浮在200mM，pH9.2的硼酸盐缓冲液中。在30℃下2ml的密闭试管中孵育10分钟。通过加入AMTBN溶液以得到开始分析时的反应混合物最终浓度为50mM来开始测定动力学。反应在30℃、搅拌下进行。每15分钟，取出50μl上清液样品，加入950μl HPLC洗脱液(成分见下)终止反应，离心后，用下述方法以HPLC分析上清液。
洗脱液由1％HPLC级的乙腈在0.5％磷酸水溶液中稀释而成。此洗脱液经过滤和脱气，以1ml/分钟的流过柱子。柱是使用5μm的C18 Nucleosil柱，长度为250mm，直径4.6mm(INTERCHIM.Ref.N5CC18-25F)温度维持在40℃，注入体积为20μl，通过210nm波长吸收的读数来进行检测。在这些条件下，AMTBM，AMTBS(2-氨基-4-甲硫基丁酸)和AMTBN的保留时间分别为4.0分钟，4.5分钟和5.0分钟。AMTBN，AMTBM和AMTBS的数量从峰面积中进行推算，并与已知组成的标准化混合物的峰面积进行比较。
所用的其他技术是本技术领域的技术人员公知和揭示的分子生物学和微生物学的常规技术，例如：Ausubel等，1987(Current protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons出版社，纽约)，Maniatis等，1982(Molecular Cloning：a laboratory manual.冷泉港实验室，冷泉港，纽约)，Coligan等，(Current Protocols in Protein Science，John Wileyand Sons出版社)。
实施例
实施例1：表达质粒pBCAT29和pBCAT41的构建
图2表示了质粒pRPA-BCAT41的图，括号中的位点表示在克隆过程中去除的位点。Ptrp：色氨酸启动子；nitB：腈水解酶基因；TrrnB：转录终止子；end ROP：编码ROP蛋白的基因的结束(Chambers等，1988，Gene 68：139-149)；ORI：复制起始点；RNAI/II：与复制有关的RNA(Chambers等，见上述)；Tc：耐四环素基因。
使用限制型内切酶EcoRI和XbaI，从质粒pRPA6BCAT6中获取含有Ptrp启动子的1.27kb的片段，噬菌体cII基因的核糖体结合位点(RBScII)和粪产碱菌ATCC8750(nitB)的腈水解酶基因(法国专利申请FR96/13077)，以便其克隆入被同样限制性内切酶切开的载体pXL642(在CIP申请08/194588中有描述)。所得的质粒，pPRA-BCAT15用酶StuI和BsmI切开，4.3kb的片段和从pRPA-BCAT4(法国专利申请FR96/13077)中纯化得到的136bp的StuI和BsmI片段相连接，形成质粒pRPA-BCAT19。对pRPA-BCAT19进行部分测序以确认腈水解酶279位Asp279残基的密码子已被替换为Asn279残基的密码子。含有Ptrp：：RBScII：：nitB融合体的pRPA-BCAT19的1.2kbEcoRI-XbaI片段然后克隆入用同样酶切开的载体pRPA-BCAT28中，形成6.2kb的质粒pRPA-BCAT29。通过将pXL642(CIP申请08/194588)的3.9kb的SspI-ScaI片段与pHP45□Tc(felley等，1987，gene 52：147-154)的2.1kb的SmaI片段相连接，以便用耐四环素的标记替换耐氨苄西林的标记。通过由部分NdeI的消化和大肠杆菌聚合酶I(Klenow片段)的作用来破坏质粒pRPA-BCAT29复制起始点附近的NdeI位点，从而形成质粒pRPA-BCAT41，其图谱见图1。
通过XcmI消化，从质粒pRPA-BCAT41中去除0.55kb的XcmI片段并连接，形成质粒pRPA-BCAT72。
实施例2；NitB的162位半胱氨酸用天冬酰胺替换。
通过位点直接突变法改变nitB基因中162位半胱氨酸的密码子，使用的引物是NitB162(CGCGTCGGTGCCCTGMASTGCTGGGAGC，其中M＝A/C，和S＝G/C)和SR(CGGCAATGATCAGGCCTTCGGC)。
使用引物NitB162和SR，模板pRPA-BCTA41，Pwo聚合酶(Boehringer)，以PCR法扩增内部的361bp片段，孵育程序如下：95℃下5分钟，5个循环，(95℃下1分钟，58℃下1分钟，72℃下1分钟)，35个循环(95℃下45秒，58℃下30秒，72℃下30秒)，72℃下5分钟。
用琼脂糖凝胶迁移法纯化经扩增的片段，并使用“QiaEx”试剂盒(Quiagen)提取片段后，在供应商推荐的缓冲液中，37℃下，该DNA与限制性内切酶StuI和BanI(New England Biolab)一起孵育16小时。另一个498bp的内部片段，使用引物PCRAF1(在法国专利申请96/13072中有阐述)和NitB1(GCAGCACAGGGCACCGACGC)以相似的方法进行扩增。
用琼脂糖凝胶迁移法纯化经扩增的片段，并使用“QiaEX”试剂盒(Quiagen)提取片段后，在供应商推荐的缓冲液中，37℃下，该DNA与限制性内切酶NdeI和BanI(New England BioLab)一起孵育16小时。
载体pRPA-BCAT72用酶NdeI和StuI切开，5.43kb的片段用琼脂糖凝胶纯化并用QiaEx试剂盒提取。
将上述三个片段连接起来，然后用电穿孔的方法将连接的混合物引入大肠杆菌菌株DH5α中。用酶EcoRI和XbaI酶限制性分析所得的克隆以选择带有1.26kb插入物的质粒。对含有腈水解酶基因162位密码子的区域进行测序后，选取了两个带有所要的密码子(AAC取代了TGC)的质粒，并命名为pRRA-BCAT75。
将这些质粒引入大肠杆菌菌株RPA-BIOCAT496中，得到菌株RPA-BIOCAT526和527。RPA-BIOCAT496菌株相当于预先转入质粒pRPA-BACT34的W菌株(ATCC9637)。质粒pRPA-BACT34相当于质粒pXL2035(Levy-Schil等，1995，Gene 161：15-20)，其中在EcorI和NotI位点之间已经克隆了一个带有trpR基因来编码Ptrp启动子的475bp的片段。这个片段是从质粒pRPA-BACT30中提取的，通过克隆入载体pSL301(Brosius，1998，DNA 8：759-777)，一个434bp AatII-StuI片段，该片段带有从质粒pRPG9(Gunsalus和Yanofsky，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77；7117-7121)中提取的trpR基因和其启动子。
实施例3：在水解HMTBM时，NitB 162位上的半胱氨酸对腈水解酶选择性的影响
除了下列条件修改外，其它按照法国专利申请96/13072实施例5所阐述的条件下培养菌株RPA-BIOCAT526，RPA-BIOCAT527和RPA-BIOCAT497(其对应于预先转入质粒pRPA-BACT41的菌株RPA-BIOCAT496)；预培养8小时，以1∶50接种到含0.4％酪蛋白水解物，12μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的M9葡萄糖培养基中。
如前所述，通过经100mM，pH7的磷酸钾缓冲液清洗的细胞团块测定腈水解酶的活性，在1ml的反应体积中使用1mg干重的细胞。水解2小时后通过将所形成的酰胺的峰面积与酸和酰胺的峰面积的总和相比来测定菌株的选择性，用百分数表示，结果见表1
             表1：菌株526，527和497的选择性
RPA-BIOCAT                    活性                      选择性
                       (微摩尔/小时·mgDC1)
497                           65                        0.04％
526                           76                        0.2％
527                           65                        0.2％
1mgDC：细胞干重，通过样品在660nm处的光密度进行估计OD660
(mgDC＝OD660X0.35)
这些结果显示用一个天冬酰胺替换162位的半胱氨酸，改变了NitB对HMTBN水解的选择性。
实施例4：用一个半胱氨酸替换NitA中的162位谷氨酰胺
通过使用QuickChangeTM位点直接突变试剂盒(Stratagene)，以位点直接突变的方法将NitA腈水解酶的162位谷氨酰胺密码子变为半胱氨酸的密码子。
在供应商推荐的条件下，在质粒pXL2158的DNA上使用引物NitA163(GCATGTTCCCAGCAGCAGAGTCCCCCAAGATTCC)和NitA 162(GGAATCTTGGGGGACTCTGCTGCTGGGAACATGC)(Levy-Schil等，1995，Gene 161：15-20)。
PCR反应的孵呼育程序包括95℃30秒，16个95℃30秒-55℃1分钟-68℃12分钟循环。用DpnI消化DNA，并用1μl反应混合物转化大肠杆菌XL1-Blue后，通过使用BpmI酶的质粒限制性图谱来分析获得的克隆。因为所引入的突变修饰了一个BpmI的限制性酶切位点，挑选出失去了3个BpmI位点中一个的5个克隆。它们中含有的质粒分别被转入菌株RPA-BIOCAT496中，从而获得菌株RPA-BIOCAT570到RPA-BIOCAT574。
实施例5：在162位替换为半胱氨酸后，NitA C162对HMTBN水解的选择性增强
将质粒pXL2158引入菌株RPA-BIOCAT496，得到菌株RPA-BIOCAT575，菌株RPA-BIOCAT570到RPA-BIOCAT575在上述的表达条件下培养，用100μg/ml的氨苄西林代替四环素。用上述的方法测定这些菌株的腈水解酶活性，在1ml反应体积中使用5mg细胞(以OD660估测的细胞干重)，作用1小时。通过计算表示酰胺的峰面积与表示酸的峰面积的比值来测定其选择性。这用百分数表示。表2给出了结果：
表2：菌株RPA-BIOCAT570到RPA-BIOCAT575对HMTBN的选择性
  RPA-BIOCAT               活性                      选择性
                (微摩尔/小时·克干细胞重量)
  575                      135                       17％
  570                      8                         4.3
  571                      8                         4.3
  572                      4                         4.5
  573                      7                         4.4
  574                      4                         4.5
这些结果表明，用一个半胱氨酸替换NitA的162位谷氨酰胺使水解HMTBN的选择性4倍的增长。
实施例6：在162位替换为半胱氨酸后，NitA C162对AMTBN水解的选择性增强
菌株BIOCAT570到RPA-BIOCAT575在上述的表达条件下培养，用100μg/ml的氨苄西林代替四环素。用2-氨基-4-甲硫基丁腈或AMTBN(C5H10N2S)为底物测定这些菌株的腈水解酶活性，30℃下，在1ml反应体积中使用相当于10mg RPA-BIOCAT570细胞(细胞干重计)和0.4mg RPA-BIOCAT575细胞(表达为干重)，作用24小时。通过HPLC用前述的方法测定产物AMTBS和AMTBA，用类似的方法计算其选择性。结果由表3给出：
            表3：菌株RPA-BIOCAT570和575对AMTBN的选择性
RPA-BIOCAT      测试                活性           24小时         选择
                数量      (微摩尔/小时·克干重)1  的TT2          性
575              1                  43             98              6.3
575              2                  50             100             5.6
570              3                  1.5            100             1.0
570              2                  2.7            97              0.6
1水解30分钟后测活力
2 TT：(AMTBN的初始量-24小时时AMTBN量)/AMTBN的初始量
这些结果表明用一个半胱氨酸替换NitA的162位谷氨酰胺对水解非HMTBN，此处是AMTBN的选择性有一个4倍的增长。
实施例8：在NitB的162位上的其他替换和对HMTBN选择性的丢失
对用实施例2中的突变法获得的克隆中所含的nitB基因中含有162位密码子的区域进行测序，可以识别在162位上带有CAG代替TGC的密码子的克隆。相应的质粒是pRPA-BCAT78，带有一个编码一种腈水解酶NitBQ162的nitB插入子，其中162位的半胱氨酸已被一个谷氨酰胺替换。这些质粒转入到大肠杆菌RPA-BIOCAT496菌株中，获得菌株RPA-BIOCAT530和531。按实施例3中的条件培养菌株RPA-BIOCAT530，RPA-BIOCAT531和RPA-BIOCAT496。如法国专利申请96/13072的实施例4所述，通过经100mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液清洗的细胞团块测定腈水解酶的活性，在1ml的反应体积中使用1mg干重的细胞。水解2小时后通过将所形成的酰胺的摩尔数与酸和酰胺的摩尔数的总和相比来测定菌株的选择性，用百分数表示，结果见表5：
               表5：菌株530，531和497的选择性
RPA-BIOCAT                    活性              选择性
                     (微摩尔/小时·mgDC1)
  497                         65                0.04％
  530                         18                0.2％
  531                         22                0.2％
1mgDC：细胞干重，通过样品在660nm处的光密度进行估计OD660
(mgDC＝OD660X0.35)
这些结果表明：162位的半胱氨酸替换为谷氨酰胺会改变NitB水解NMTBM的选择性。
                        序列表<110>阿方蒂动物营养素股份有限公司(Aventis Animal Nutrition)<120>调节腈水解酶选择性的方法，用此方法获得的腈水解酶及其用途<130>PH99069<140><141><150>FR9914249<151>1999-11-08<160>5<170>PatentIn 2.1版<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡聚核苷酸NitB162<400>1cgcgtcggtg ccctgmastg ctgggagc                         28<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡聚核苷酸SR<400>2cggcaatgat caggccttcg gc                        22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡聚核苷酸NitB1<400>3gcagcacagg gcaccgacgc                            20<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡聚核苷酸NitA163<400>4gcatgttccc agcagcagag tcccccaaga ttcc               34<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡聚核苷酸NitA162<400>5ggaatcttgg gggactctgc tgctgggaac atgc                   34

Claims (17)

1.一种具有调节的选择性的修饰的腈水解酶，其特征在于，它包括，在162位，一个氨基酸残基与原先的氨基酸残基不同。
2.如权利要求1所述的修饰的腈水解酶，其特征在于，经调节的选择性与腈水解酶选择性相差至少0.5％，更好地，至少1％。
3.如权利要求1或2所述的修饰的腈水解酶，其特征在于，162位残基被选自半胱氨酸，丙氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，谷氨酰氨，异亮氨酸和丝氨酸的氨基酸所替代，应当理解，原腈水解酶的162位残基分别与半胱氨酸，丙氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，谷氨酰氨，异亮氨酸或丝氨酸不同。
4.如权利要求3所述的修饰的腈水解酶，其特征在于，其162位残基被一个半胱氨酸所取代。
5.如权利要求1至4任一所述的修饰的腈水解酶，其特征在于，所述的调节包含选择性的增强。
6.如权利要求1至4任一所述的修饰的腈水解酶，其特征在于，所述的调节包含选择性的降低。
7.如权利要求1至6任一所述的修饰的腈水解酶，其特征在于，未修饰的原腈水解酶选自细菌，酵母，真菌，植物或动物来源的腈水解酶。
8.如权利要求1至7中任一所述的修饰的腈水解酶，其特征在于，原腈水解酶是通过筛选DNA文库获得的腈水解酶。
9.一个核酸序列，尤其是一个DNA序列，它编码如权利要求1至8任一所述的修饰的腈水解酶。
10.如权利要求9所述的核酸序列，其特征在于，它由编码原腈水解酶的核酸序列构成，其中原162位残基的密码子被编码与原残基不同的残基的密码子所替换。
11.一个嵌合基因或表达盒，其特征在于，它包括，在转录方向上，一个在宿主生物体中有效用的启动子调控序列，如权利要求9或10所述的编码修饰的腈水解酶的核酸序列，和一个在同一宿主生物体中有效用的终止子调控序列。
12.一个转化的宿主生物体，其特征在于，它包含如权利要求11所述的嵌合基因，稳定地整合入其基因组。
13.如权利要求12所述的宿主生物体，其特征在于，它选自细菌，酵母，真菌，植物细胞和植物。
14.一种生产如权利要求1至8任一所述的选择性增强的修饰的腈水解酶，其特征在于，它包括培养如权利要求12或13所述的转化的宿主生物体，其中还包括以混合物或纯化物的形式分离此修饰的腈水解酶。
15.如权利要求1至8任一所述的修饰的腈水解酶在合成或降解化学化合物的方法中的生物催化中的应用。
16.一种调节腈水解酶选择性的方法，其特征在于，它包括用不同与原氨基酸残基的氨基酸残基替换原腈水解酶的162位残基。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的水解酶是如权利要求2至8任一所定义。
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