JP2003532377A - ニトリラーゼの選択性を調整する方法、前記方法によって得られるニトリラーゼおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、調整された選択性を備えた改変ニトリラーゼに関し、それが位置１６２に本来のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を含むことをことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は選択性を高めた新しいニトリラーゼ、それらを得る方法および前記ニ
トリラーゼの用途に関する。

【０００２】 ニトリラーゼ ニトリル基を対応するカルボン酸とアンモニウムイオンにする加水分解を触媒
するのがニトリラーゼである（Ｆａｂｅｒ，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒ
ｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、１９９２、ＩＳＢＮ３−５４０
−５５７６２−８）。しかしながら、最終結果がニトリル基の加水分解で構成さ
れる、ニトリル基の対応するカルボン酸へのこの生物学的変換は２段階で実施す
ることも可能であり、最初のステップはニトリルヒドラターゼでニトリルを対応
するアミドに生物学的に変換することで構成され、第２のステップは得られたア
ミドをアミダーゼで対応するカルボン酸に加水分解することで構成される。

【０００３】 ニトリラーゼは最初に植物中で発見され（Ｔｈｉｍａｎｎ ａｎｄ Ｍａｈａ
ｄｅｖａｎ、１９６４、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０５：
１３３−１４１）、その後、多くの代表的な土壌微生物相で単離された（Ｋｏｂ
ａｙａｓｈｉ ａｎｄ Ｓｈｉｍｉｚｕ、１９９４、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２０：２１７−２２４）：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｒｈ
ｏｄｏｃｃｏｃｕｓ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ。さ
らに最近になって、好熱性細菌中でニトリラーゼが特性分析された（Ｃｒａｍｐ
ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４３：２３１３−２３２０）。
ニトリラーゼは多様な基質特異性を有するが、それらの特異性によって３つのグ
ループに分類することができる。すなわち脂肪族ニトリルに特異的なニトリラー
ゼ、芳香族ニトリルに特異的なもの、またはアリルアセトニトリルに特異的なも
のである（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２４７−２５１；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａ
ｎｄ Ｓｈｉｍｉｚｕ、１９９４、前出；Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌ ｅｔ ａｌ．
、１９９５、Ｇｅｎｅ １６１：１５−２０；Ｌａｙｈ ｅｔ ａｌ．、１９９
８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ５：４６７−４７４）
。

【０００４】 ニトリラーゼは、多くの合成過程がニトリル基の加水分解を含むので生体触媒
作用で価値がある（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．５７：３０２８−３０３２；Ｆａｂｅｒ，Ｂｉｏ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，２ｎｄ ｅｄｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９９５
；Ｌｅｖｙ−Ｓｃｉｌ ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｇｅｎｅ １６１：１５−２
０；Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ ２：
２０７−２１６）：アジポニトリルのシアノ吉草酸塩またはアジピン酸塩への変
換、ニコチン酸、アミノ安息香酸、トラネキサム酸の合成、マンデロニトリルの
エナンチオ選択的加水分解。特に、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ
ＡＴＣＣ８７５０のニトリラーゼ（本出願ではＮｉｔＢと呼ぶ）およびＣｏｍ
ａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのそれ（本出願ではＮｉｔＡと呼ぶ）
はメチオニンのヒドロキシ類似体を得るために使用することができる（ＦＲ９４
１１３０１、ＷＯ９６０９４０３、ＦＲ９６１３０７７）。

【０００５】 ニトリラーゼは、約３０％から始まって様々な同一度でアラインする一次構造
を有する。いくつかのニトリラーゼの配列をアラインすると、ＮｉｔＢニトリラ
ーゼの配列の位置１６３のシステイン残基を含むいくつかの残基の保存が明らか
になる。この残基はニトリラーゼの反応メカニズムに含まれる（Ｋｏｂａｙａｓ
ｈｉ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９０：２４７−２５１）。

【０００６】 本発明に関しては、基準配列はＮｉｔＢ配列であって、特定のアミノ酸位置の
規定および表示はＮｉｔＢ一次配列に関して与えられる。添付の図１は当該技術
の現状で述べられている１４種のニトリラーゼの配列であって、ＮｉｔＢを基準
にそれに関して並べられ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｐ＿Ａ
ｔｈａｌｉａ１から４まで（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ３２９６１、Ｐ３２
９６２、Ｐ４６０１０、Ｐ４６０１１）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
のｐ＿Ｔｏｂａｃｃｏ１と２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ６３３３１、Ｄ８３
０７８）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ Ｊ１のｂ＿Ｒｈｏ
ｄｏｃＪ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ１１４２５）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ ＰＡ３４のｂ＿ＲｒｈｏｄｏｃＰＡ３（ＧｅｎｅＢ
ａｎｋ受理番号Ｅ０９０２６）、Ｇｏｒｄｏｎａ ｔｅｒｒａｅのｂ＿Ｇｔｅｒ
ｒａｅ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｅ１２６１６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ Ｋ２２のｂ＿ＲｒｈｏｄｏｃＫ２２（ＧｅｎｅＢａｎｋ
受理番号Ｄ１２５８３）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅのｂ＿Ｋｏｚ
ａｅｎａｅ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ１００４５０）、Ｃｏｍａｍｏｎａ
ｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＮＩ１のｂ＿ＣｔｅｓｔｏｓＮＩ１またはＮｉ
ｔＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｌ３２５８９）、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＭ３のｂ＿ＡｆａｅｃａｌｉｓまたはＮｉｔＢ（Ｓｗ
ｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ２０９６０）の配列を含む。ＮｉｔＢ配列のアミノ酸
の番号がこの図に付され（下部の番号）、その番号付け（上部の番号）と一致す
る配列である。本出願の慣行によって、他のニトリラーゼの残基はこのシステイ
ン残基および基準配列とするＮｉｔＢニトリラーゼの配列に関して番号付けされ
る。そのようなアラインメント、またはいずれかのアラインメントニトリラーゼ
配列に基づいて、ＮｉｔＢアミノ酸の位置と性質により与えられる規定を使用し
て別のニトリラーゼ配列中の対応するアミノ酸の位置を識別することは当業者に
とって容易である。

【０００７】 選択性の問題 ニトリラーゼの選択性は、ニトリラーゼの触媒するニトリルの加水分解によっ
て放出されるカルボキシル機能を持たない化合物のパーセンテージとして規定さ
れる。それは相対的に少ないと言われてきたが、一定数のニトリラーゼと基質に
ついては観察される。このように、２−メトキシマンデロニトリルを２−メトキ
シマンデル酸にする加水分解はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ ＤＳＭ７１５５のニトリラーゼによって触媒され、２−メトキシマンデルア
ミドの同時生成につながる（Ｌａｙｈ ｅｔ ａｌ．、１９９８、前出）。同様
に、本出願の実施例で説明するＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ
ＮＩ１のＮｉｔＡニトリラーゼによって触媒される２−ヒドロキシ−４−メチ
ルチオブチロニトリル（ＨＭＴＢＮ）の加水分解（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌ ｅｔ
ａｌ．、１９９５、前出）は２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミド（
ＨＭＴＢＭ）の同時生成を伴なう。そのような酵素／−基質対を使用する生体触
媒処理のケースでは、ニトリラーゼのその基質についての選択性の欠如はアミド
の同時生成につながり、それは処理の収量が損失することを表わす。この収量損
失はかなりの経済的衝撃を有し得る。加えて、この選択性欠如は反応産物を不純
物汚染するアミドの存在につながる。その後にカルボン酸の精製が必要とされ、
ここでもやはり処理に大きな経済的衝撃を与える。したがってニトリラーゼの所
定の基質に関する選択性欠如はこのニトリラーゼとこの基質を使用する生体触媒
処理の開発にとって障害となる。

【０００８】 酵素の選択性の低減は、この低減が基質に対する酵素の触媒活性の増大を伴な
う場合に必要とされることもある。特に、最大の特異的活性酵素で害毒となる分
子を急速に分解することが必要となる汚染除去の方法におけるケースである。こ
のケースでは、酵素によって触媒される反応に由来する生成物の性質は基質の分
解速度に対してあまり重要でない。

【０００９】 したがって、この選択性の向上の見地と低減の見地の両方で、ニトリラーゼの
選択性を調整可能であることが特に大切である。

【００１０】 酵素活性の亢進 方向付けられた酵素の増進は、増進された特性を有する変異種を繰り返し選択
することによって酵素を特定の機能に適合させることで構成される（Ａｒｎｏｌ
ｄ ａｎｄ Ｖｏｌｋｏｖ、１９９９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５４−５９；Ｋｕｃｈｎｅｒ ａｎ
ｄ Ａｒｎｏｌｄ、１９９７、Ｔｉｂｔｅｃｈ １５：５２３−５３０）。これ
らの変異種は研究対象の酵素をコードする遺伝子に対する突然変異誘発（Ｓｋａ
ｎｄａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ４：８８８９−８９８；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１）：化学的突然変異誘発（Ｓｉｎｇｅｒ ａ
ｎｄ Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ、１９６９、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：１−２９）、エラープローンＰＣＲ（Ｌ
ｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５）、
組み合わせＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、１９９８、前出；Ｓｈａｏ
ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：６８
１−６８３）、指向性突然変異誘発（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９１、Ｅｄｉｔｅｄ ｂ
ｙ Ｍ．Ｊ．ＭｃＰＨＥＲＳＯＮ、ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ）、などによる突然変異
誘発といったいくつかの技術によって作製することができる。

【００１１】 ＨＭＴＢＮ（２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリル）に対するＮｉｔＢ
ニトリラーゼの活性を増進するちう背景で、ＮｉｔＢの位置１６２の活性部位で
システイン残基をアスパラガニン残基で置き換える一点置換が研究対象のニトリ
ラーゼの選択性の調整につながることに考案者らは気付いた。他方で、ＮｉｔＡ
ニトリラーゼの配列の位置１６２にシステイン残基を導入することがまた別のそ
れの基質、ＡＭＴＢＮに対する選択性を増進することにつながり、したがってニ
トリラーゼの活性部位の領域の位置１６２は前記ニトリラーゼの選択性に含まれ
るキーとなる位置であり、本来のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることで構
成されるこの位置でのアミノ酸残基の変更がニトリラーゼの選択性の調整につな
がることに気付いた。

【００１２】 したがって本発明は、調整された選択性を備え、位置１６２に本来のアミノ酸
残基とは異なるアミノ酸残基を含むことを特徴とする改変ニトリラーゼに関する
。

【００１３】 本発明によると、「改変ニトリラーゼ」という用語は本来のニトリラーゼに対
して改変がなされたニトリラーゼを意味することを意図しており、その改変は位
置１６２で本来のアミノ酸残基を別のアミノ酸で置き換えることで構成される。

【００１４】 本発明によると、「選択性の調整」という表現は本来のニトリラーゼの選択性
とは異なる選択性を意味することを意図しており、特定すると本来のニトリラー
ゼに対して少なくとも０．５％異なり、少なくとも１％異なるのが好都合である
。

【００１５】 都合がよければ残基１６２はシステイン、アラニン、バリン、アスパラギン、
グルタミン、イソロイシンおよびセリンの中から選択されるアミノ酸で置き換え
られるものであり、本来のニトリラーゼの残基１６２がシステイン、アラニン、
バリン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシンまたはセリンそれぞれと異な
ることは分かっている。

【００１６】 残基１６２はシステイン残基で置き換えられることが好ましい。

【００１７】 本発明の特定の実施形態によると、調整は選択性を増進させることから成る。

【００１８】 本発明の第２の特定の実施形態によると、調整は選択性を低減させることから
成る。

【００１９】 本来の未調整ニトリラーゼは細菌、酵母、菌、植物または動物の起源の中から
選択される。

【００２０】 バクテリアを起源とするニトリラーゼの中で、特に以下のニトリラーゼを記載
することができる。すなわち、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ
Ｊ１のｂ＿ＲｈｏｄｏｃＪ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ１１４２５）、Ｒ
ｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ ＰＡ３４のｂ＿Ｒｒｈｏｄｏｃ
ＰＡ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｅ０９０２６）、Ｇｏｒｄｏｎａ ｔｅｒｒ
ａｅのｂ＿Ｇｔｅｒｒａｅ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｅ１２６１６）、Ｒｈｏ
ｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ Ｋ２２のｂ＿ＲｒｈｏｄｏｃＫ２２
（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｄ１２５８３）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅ
ｎａｅのｂ＿Ｋｏｚａｅｎａｅ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ１００４５０）
、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＮＩ１のｂ＿Ｃｔｅｓｔｏ
ｓＮＩ１またはＮｉｔＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号Ｌ３２５８９）、およびＡ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＭ３のｂ＿Ａｆａｅｃａｌｉｓま
たはＮｉｔＢ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号Ｐ２０９６０）である。植物を起源
とするニトリラーゼの中で、特に記載できるものは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａのｐ＿Ａｔｈａｌｉａ１から４まで（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理
番号Ｐ３２９６１、Ｐ３２９６２、Ｐ４６０１０、Ｐ４６０１１）、およびＮｉ
ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍのｐ＿Ｔｏｂａｃｃｏ１および２（ＧｅｎｅＢ
ａｎｋ受理番号Ｄ６３３３１、Ｄ８３０７８）である。

【００２１】 その他を起源とするニトリラーゼの中で、特に記載できるものは、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのもの（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受理番号
Ｐ４０４４７およびＰ４０４４）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａ
ｎｓのもの（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号ＡＦ０６９９８６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉ
ｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのもの（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号ＡＦ０６９
９８９）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのもの（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番号ＡＦ０
６９９８７）およびＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓのもの（ＧｅｎｅＢａｎｋ受理番
号ＡＦ０６９９８８）である。

【００２２】 本発明のまた別の実施形態によると、本来のニトリラーゼはＤＮＡライブラリ
ー、特にｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングによって得られるニトリ
ラーゼであり、様々な供給源、特にニトリラーゼの無作為の突然変異と組換えを
通じて、指向性の分子進化または土壌ないし他の生態系に由来するＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングによって得られるＤＮＡライブラリーから得られる。

【００２３】 本発明はまた、上記の改変ニトリラーゼをコードする核酸配列、特にＤＮＡ配
列にも関する。

【００２４】 本発明の第１の実施形態によると、本発明による核酸配列は本来のニトリラー
ゼの核酸配列で構成され、それに関して位置１６２で本来の残基のコドンが本来
のものと異なる残基をコードするコドン、特にアラニン、バリン、アスパラギン
、グルタミン、イソロイシンまたはセリン残基をコードするコドンで置き換えら
れている。

【００２５】 本来の配列のコドンは前に規定した酵素の増進のために当業者が知っているあ
らゆる手段、特に指向性の突然変異誘発によって変更することができる。

【００２６】 本発明はまた、キメラ遺伝子ないし発現カセットにも関し、転写の方向で、ホ
スト有機体の中で機能するプロモーター調節配列、本発明による改変ニトリラー
ゼをコードする核酸配列および同じホスト有機体の中で機能するターミネーター
調節配列を含む。

【００２７】 宿主微生物はすべての真核ないし原核生物を含み、それは分化していても未分
化であってもよく、特定すると細菌、酵母、菌、植物細胞および植物体である。

【００２８】 それらは特にバクテリア、例えばＥ．ｃｏｌｉ、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ属の酵母、特にＡｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓまたはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の菌、バキュロウィルス、また
は植物細胞および植物体である。

【００２９】 本発明によると、「植物細胞」という用語は植物体に由来するあらゆる細胞を
意味することを意図されており、カルスのような未分化組織、胚、植物体の一部
、植物体または種子のような分化した組織から構成され得る。

【００３０】 本発明によると、「植物体」という用語は光合成を行ない得るすべての多細胞
微生物を意味するように意図されており、特に単子葉ないし双子葉、さらに特定
するとトウモロコシ、コムギ、アブラナ、ダイズ、イネ、サトウキビ、ビートの
根、タバコ、ワタなどのような動物またはヒトの食料用に意図されるかまたはさ
れていない作物植物である。

【００３１】 プロモーターおよびターミネーター調節要素は当業者にはよく知られており、
宿主微生物によって決まる。

【００３２】 バクテリア内でのプロモーターである調節配列として、バクテリア内で自然に
発現される遺伝子のあらゆるプロモーター調節配列、例えばＥ．ｃｏｌｉのトリ
プトファンオペロンのプロモーター（Ｄｅｎｅｆｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９８７
、Ｇｅｎｅ ５６：６１−７０）が使用可能である。

【００３３】 酵母内でのプロモーターである調節配列として、酵母内で自然に発現される遺
伝子のあらゆるプロモーター調節配列、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｆ
α１遺伝子またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ遺伝子（ｖａｎ
ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
８：１３５−１３９）のプロモーターが使用可能である。

【００３４】 菌内でのプロモーターである調節配列として、菌内で自然に発現される遺伝子
のあらゆるプロモーター調節配列、例えばＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓ
ｏｇｅｎｕｍ酸性ホスファターゼ遺伝子（Ｇｒａｅｓｓｌｅ ｅｔ ａｌ．、１
９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：７５３−７５
６）のプロモーター配列またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアル
コールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子（Ｇｗｙｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１７：３３８−３４０）のプロモーター配列
が使用可能である。

【００３５】 植物細胞および植物体内でのプロモーターである調節配列として、植物内で自
然に発現される遺伝子のあらゆるプロモーター調節配列、特にバクテリア、ウィ
ルスまたは植物を起源とするプロモーターが使用可能であり、例えばリブロース
ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）小型サブユニット遺
伝子のプロモーター、ヒストンプロモーター（ＥＰ０５０７６９８）、イネのア
クチンプロモーター、または例えばカリフラワーモザイクウィルス（ＣＡＭＶ１
９Ｓないし３５Ｓ）のプロモーターやタバコＰＲ−Ｉａのような病原によって誘
導可能なプロモーターといった植物ウィルス遺伝子のプロモーターである。

【００３６】 細菌内でのターミネーターである調節配列として、細菌内で自然に発現される
あらゆるターミネーター調節配列、例えばＥ．ｃｏｌｉリボソームのＲＮＡオペ
ロンのターミネーター調節配列（Ｄｅｎｅｆｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９８７、Ｇ
ｅｎｅ ５６：６１−７０）が使用可能である。

【００３７】 酵母内でのターミネーターである調節配列として、酵母内で自然に発現される
あらゆるターミネーター調節配列、例えばＳ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅのホスホグ
リセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のターミネーターまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｌａｃｔｉｓのラクターゼのターミネーター（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ
ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５−１３
９）が使用可能である。

【００３８】 菌内でのターミネーターである調節配列として、菌内で自然に発現されるあら
ゆるターミネーター調節配列、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの
ピルビン酸キナーゼ遺伝子のターミネーター配列（Ｓｃｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．、１９９３、Ｇｅｎｅ １３０：２７１−２７５）が使用可能である。

【００３９】 植物細胞および植物体内でのターミネーターである調節配列として、植物内で
自然に発現される遺伝子のあらゆるターミネーター調節配列、例えばＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｎｏｓターミネーターを例とした
バクテリア起源、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーターを例としたウィルス起源、ヒ
ストンターミネーター（ＥＰ０６３３３１７）を例とした植物起源の遺伝子のタ
ーミネーターが使用可能である。

【００４０】 本発明はまた、上記で規定したようなキメラ遺伝子を含む形質転換したホスト
有機体にも関し、特にそのゲノムの中に本発明によるキメラ遺伝子が安定に一体
化された上記で規定した微生物。

【００４１】 本発明はまた、増進された選択性をもつ上記に規定の改変ニトリラーゼを生成
する方法にも関し、前記方法は本発明による形質転換宿主微生物を培養し、適切
なところで改変ニトリラーゼを混合物ないし精製された形で分離することで構成
される。

【００４２】 本発明はまた、化合物を合成ないし分解するのに使用する方法の中の生体触媒
反応に本発明による改変ニトリラーゼを使用することにも関する。

【００４３】 最後に、本発明はニトリラーゼの選択性を調整する方法に関し、前記方法は本
来のニトリラーゼの残基１６２を本来のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基で置
き換えることを含む。都合がよければ、残基１６２は、本来の未改変ニトリラー
ゼをコードする核酸配列内に位置１６２の残基をコードする、本来のニトリラー
ゼの残基をコードするコドンとは異なるコドンを導入することによって置き換え
られる。

【００４４】 前記調整方法を使用して得られるニトリラーゼは上記で規定したようなニトリ
ラーゼであることが好ましい。

【００４５】 以下の実施例は、本発明の範囲を限定しようとするものではないが本発明を具
体的に説明することを可能にする。

【００４６】 材料と方法 ２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルに対するニトリラーゼの活性
は次のようにして測定する。

【００４７】 ６６０ｎｍでの吸光度（ＯＤ_６６０）が判っている培養試料を採取して１００
ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．０で洗浄する。ＯＤ_６６０から試料の乾燥重量を
見積もり（１ＯＤ_６６０ユニットは乾燥細胞０．３５ｍｇ／ｍｌの乾燥重量に相
当する）、約１ｍｇのＤＣを１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．０に
とって密閉した２ｍｌのチューブで３５℃にて１０分間インキュベートする。分
析の開始時に反応混合液中で１００ｍＭの濃度となるよう、動力学は７８％でＨ
ＭＴＢＮ溶液１７μｌを加えることによって開始する。撹拌しながら３５℃でイ
ンキュベートして反応させる。１５分毎に１００μｌの懸濁液試料を引き抜き、
９００μｌの１００ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４、ｐＨ２．５を混合して反応を停止させる
。遠心分離した後、以下に述べるようにしてＨＰＬＣによって上清を分析する。

【００４８】 溶離液は５０ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４に希釈したＨＰＬＣ等級のアセトニトリル（０
．９リットルの５０ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４と０．１リットルのアセトニトリルを混合
）で構成される。濾過されて脱ガスされたこの溶離液が流速１ｍｌ／分および１
４０バールの圧力でカラムに浸透する。使用するカラムは５μｍ Ｃ１８ Ｎｕ
ｃｌｅｏｓｉｌカラム（ＩＮＴＥＲＣＨＩＭ，Ｒｅｆ．Ｎ５ＣＣ１８−２５Ｆ）
で長さ２５０ｍｍ、直径４．６ｍｍである。注入する容量は５μｌであり、検出
は波長２１５ｎｍにおける吸収を読み取ることによって実施される。これらの条
件下で、ＨＭＴＢＭ、ＨＭＴＢＳ（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタン酸）
およびＨＭＴＢＮ（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブタンアミド）のピークは
９分、１１分および１５．８分というそれぞれの保持時間を有する。ＨＭＴＢＮ
、ＨＭＴＢＭおよびＨＭＴＢＳの量はピークの面積測量および既知の組成の較正
用混合液のピーク面積との比較から演繹される。

【００４９】 ２−アミノ−４−チオブチロニトリルに対するニトリラーゼの活性は次のよう
にして測定する。

【００５０】 細胞ペレット（０．４から２０ｍｇの間のＤＣ）を２００ｍＭホウ酸バッファ
、ｐＨ９．２に懸濁し、密閉２ｍｌチューブで３０℃にて１０分間インキュベー
トする。分析の開始時で反応混合液中の終濃度が５０ｍＭとなるようにＡＭＴＢ
Ｎの溶液を添加することによって動力学が開始される。撹拌しながら３０℃でイ
ンキュベートして反応させる。１５分毎に５０μｌの懸濁液試料を引き抜き、９
５０μｌのＨＰＬＣ溶離液（下記の組成参照）と混合して反応を停止させる。遠
心分離した後、以下に述べるようにしてＨＰＬＣによって上清を分析する。

【００５１】 溶離液は０．５％のＨ_３ＰＯ_４水溶液に希釈した１％のＨＰＬＣ等級のアセト
ニトリルで構成される。濾過されて脱ガスされたこの溶離液が１ｍｌ／分の流速
でカラムに浸透する。使用するカラムは５μｍ Ｃ１８ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌカ
ラム（ＩＮＴＥＲＣＨＩＭ，Ｒｅｆ．Ｎ５ＣＣ１８−２５Ｆ）で長さ２５０ｍｍ
、直径４．６ｍｍであり、４０℃の温度に維持される。注入される容量は２０μ
ｌであり、検出は波長２１０ｎｍにおける吸収を読み取ることによって実施され
る。これらの条件下で、ＡＭＴＢＭ、ＡＭＴＢＳ（２−アミノ−４−メチルチオ
ブタン酸）およびＡＭＴＢＮ（２−アミノ−４−メチルチオブタンアミド）のピ
ークは４．０分、４．５分および５．０分というそれぞれの保持時間を有する。
ＡＭＴＢＮ、ＡＭＴＢＭおよびＡＭＴＢＳの量はピークの面積測量および既知の
組成の較正用混合液のピーク面積との比較から演繹される。

【００５２】 使用するその他の技術は当業者によく知られた分子生物学および微生物学の普
遍的な技術であって、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７（Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．、１９９７（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）によって述べられている。

【００５３】 実施例 実施例１：発現プラスミドｐＢＣＡＴ２９およびｐＢＣＡＴ４１の作製 図２はプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１のマップを表わす。カッコ内の部分
はクローニングの間で除去された部分である。Ｐｔｒｐはトリプトファンプロモ
ーター、ｎｉｔＢはニトリラーゼ遺伝子、ＴｒｒｎＢは転写ターミネーター、ｅ
ｎｄ ＲＯＰはＲＯＰタンパク質をコードする遺伝子（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ
ａｌ．、１９８８、Ｇｅｎｅ ６８：１３９−１４９）の末端、ＯＲＩは複製
起点、ＲＮＡＩ／ＩＩは複製に含まれるＲＮＡ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ
．、前出）、Ｔｃはテトラサイクリン耐性遺伝子である。

【００５４】 Ｐ_ｔｒｐプロモーターを含む１．２７ｋｂ断片、λファージｃＩＩ遺伝子（Ｒ
ＢＳｃＩＩ）のリボソーム結合部位、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃ
ａｌｉｓ ＡＴＣＣ８７５０のニトリラーゼ遺伝子（ｎｉｔＢ）が、プラスミド
ｐＲＰＡ６ＢＣＡＴ６（出願ＦＲ９６／１３０７７）からＥｃｏＲＩとＸｂａＩ
制限酵素を使用して、同じ制限酵素で開環したベクターｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出
願番号０８／１９４，５８８に記載）にクローン化させるために抽出された。結
果として得られたプラスミド、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１５を酵素ＳｔｕＩとＢｓｍ
Ｉで開環し、４．３ｋｂ断片をｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４（出願ＦＲ９６／１３０７
７）から精製した１３６ｂｐのＳｔｕＩ−ＢｓｍＩ断片と連結してプラスミドｐ
ＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を作製した。ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９を部分的に配列分析
してニトリラーゼのＡｓｐ２７９残基のコドンがＡｓｎ２７９残基のコドンで置
き換えられていることを確認した。その後、Ｐ_ｔｒｐ：：ＲＢＳｃＩＩ：：ｎｉ
ｔＢ融合体を含むｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ１９の１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ
断片を同じ酵素で開環されたベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２８内にクローン化し
て６．２ｋｂプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９を作製した。ベクターｐＲＰＡ
−ＢＣＡＴ２８は、アンピシリン耐性マーカーをテトラサイクリン耐性マーカー
で置き換えるために、ｐＸＬ６４２（ＣＩＰ出願番号０８／１９４，５８８）の
３．９ｋｂのＳｓｐＩ−ＳｃａＩ断片をｐＨＰ４５ΩＴｃ（Ｆｅｌｌａｙ ｅｔ
ａｌ．、１９８７、Ｇｅｎｅ ５２：１４７−１５４）の２．１ｋｂのＳｍａ
Ｉ断片と連結することによって得た。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ２９の複製
起点に近いＮｄｅＩ部位の部分的ＮｄｅＩ切断とＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ（
Ｋｌｅｎｏｗ切断）の作用による破壊でプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を作
製した。そのマップは図１に表わされる。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１を
Ｘｃｍ１切断および連結処理して０．５５ｂｐのＸｃｍ１断片を除去することに
よってプラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７２を作製した。

【００５５】 実施例２：ＮｉｔＢのシステイン１６２のアスパラギンとの置換 ｎｉｔＢ遺伝子のシステイン１６２のコドンは、プライマーＮｉｔＢ１６２（
ＣＧＣＧＴＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＭＡＳＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣ、ここでＭ＝Ａ／
ＣおよびＳ＝Ｇ／Ｃ）およびＳＲ（ＣＧＧＣＡＡＴＧＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＧ
ＧＣ）を使用した部位特異的突然変異誘発によって変更した。

【００５６】 プライマーＮｉｔＢ１６２とＳＲ、マトリックスｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１、Ｐ
ｗｏポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）および次のインキュベーションプロ
グラムを使用してＰＣＲ反応によって内部の３６１断片を増幅した。すなわち９
５℃で５分、（９５℃１分、５８℃１分、７２℃１分）５サイクル、（９５℃４
５秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒）３５サイクル、７２℃で５分である。

【００５７】 増幅した断片をアガロースゲルに移し、「ＱｉａＥｘ」キット（Ｑｕｉａｇｅ
ｎ）を使用して断片を抽出することによって精製した後、制限酵素ＳｔｕＩとＢ
ａｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で３７℃にて供給
者の推奨するバッファ中で１６時間ＤＮＡをインキュベートした。別の内部断片
、４９８ｂｐをプライマーＰＣＲＡＦ１（出願ＦＲ９６／１３０７２に記載）お
よびＮｉｔＢ１（ＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＣ）を使用して同様
の方式で増幅した。

【００５８】 増幅した断片をアガロースゲルに移し、「ＱｉａＥｘ」キット（Ｑｕｉａｇｅ
ｎ）を使用して断片を抽出することによって精製した後、制限酵素ＮｄｅＩとＢ
ａｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で３７℃にて供給
者の推奨するバッファ中で１６時間ＤＮＡをインキュベートした。

【００５９】 ベクターｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７２を酵素ＮｄｅＩとＳｔｕＩで開環し、５．４
３ｋｐをアガロースゲルで精製してＱｉａＥｘキットを使用して抽出した。

【００６０】 その後、以上に述べた３つの断片を連結し、連結反応混合物をエレクトロポレ
ーションによってＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株に導入した。１．２６ｋｂの挿入物
を有するプラスミドを選別するために、得られたクローンを酵素ＥｃｏＲＩとＸ
ｂａＩで制限処理することによって分析した。ニトリラーゼ遺伝子のコドン１６
２を含む領域の配列分析をした後、所望のコドン（ＴＧＣの代わりにＡＡＣ）を
持っている２つのプラスミドを選別し、ｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７５と命名した。

【００６１】 これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株に導入し
て菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５２６と５２７を得た。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９
６株はＷ菌株（ＡＴＣＣ９６３７）に相当し、その中にプラスミドｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ３４が前もって導入されている。プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ３４はプ
ラスミドｐＸＬ２０３５（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌ ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｇ
ｅｎｅ １６１：１５−２０）に相当し、その中にＰｔｒｐプロモーターの調節
因子をコードするｔｒｐＲ遺伝子を持つ４７５ｂｐ断片が、ＥｃｏＲＩとＮｏｔ
Ｉの切断部位の間でクローン化されている。この断片をプラスミドｐＲＰＡ−Ｂ
ＣＡＴ３０から抽出し、ベクターｐＳＬ３０１（Ｂｒｏｓｉｕｓ、１９８９、Ｄ
ＮＡ ８：７５９−７７７）にクローニングすることによってプラスミドｐＲＰ
Ｇ９（Ｇｕｎｓａｌｕｓ ａｎｄ Ｙａｎｏｆｓｋｙ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７１１７−７１２１）から抽出され
たｔｒｐＲ遺伝子およびそのプロモーターを持つ４３４ｂｐのＡａｔＩＩ−Ｓｔ
ｕＩ断片を作製した。

【００６２】 実施例３：ＨＭＴＢＮ加水分解の間でニトリラーゼの選択性に及ぼすＮｉｔＢ
のシステイン１６２の影響 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５２６、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５２７およびＲＰＡ−Ｂ
ＩＯＣＡＴ４９７株（プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１が前もって導入された
ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株に相当）を、出願ＦＲ９６／１３０７２の実施例
５に述べた条件に次の変更を加えて培養した。その変更はすなわち、予備培養を
８時間する点、０．４％のカサミン酸、１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよ
び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭ９グルコース培地に１：５０で植菌す
る点である。

【００６３】 ＨＭＴＢＮのニトリラーゼ活性は、１ｍｌの反応液量に１ｍｇのＤＣを使用し
、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファ、ｐＨ７で洗浄した細胞ペレットに対し
、前述したようにして測定した。菌株の選択性は２時間の加水分解の後に形成さ
れたアミドのピークの面積をアミドと酸のピーク面積の合計と関連させて測定し
た。それはパーセンテージにより表わされ、結果は表１に示す。

【００６４】

【表１】

【００６５】 これらの結果は、システイン１６２のアスパラギンとの置換がＨＭＴＢＮの加
水分解に関するＮｉｔＢの選択性を変えることを示している。

【００６６】 実施例４：ＮｉｔＡのグルタミン１６２のシステインでの置換 ＮｉｔＡニトリラーゼのグルタミン１６２のコドンを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇ
ｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した
部位特異的突然変異誘発によってシステインコドンに変えた。

【００６７】 プライマーＮｉｔＡ１６３（ＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴＣ
ＣＣＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣ）およびＮｉｔＡ１６２（ＧＧＡＡＴＣＴＴＧＧＧＧ
ＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＣＡＴＧＣ）は供給者の推奨する条件下で
プラスミドｐＸＬ２１５８のＤＮＡ（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌ ｅｔ ａｌ．、１
９９５、Ｇｅｎｅ １６１：１５−２０）に対して使用した。

【００６８】 ＰＣＲ反応のインキュベーションプログラムは９５℃で３０秒、および１６サ
イクルの９５℃３０秒−５５℃１分−６８℃１２分を含む。ＤＮＡをＤｐｎＩで
切断し、反応混合液１μｌでＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅを感染させた後、
得られたクローンを酵素ＢｐｍＩを使用したプラスミド制限プロファイルによっ
て分析した。導入した突然変異はＢｐｍＩ切断部位を変えるので、３つのＢｐｍ
Ｉ切断部位のうちの１つを消失した５つのクローンを選別した。それらが有する
プラスミドを別々にＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株に導入してＲＰＡ−ＢＩＯＣ
ＡＴ５７０およびＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７４を得た。

【００６９】 実施例５：位置１６２でシステインによる置換をした後のＨＭＴＢＮの加水分
解に関するＮｉｔＡ Ｃ１６２の選択性増進 プラスミドｐＸＬ２１５８をＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６株に導入してＲＰＡ
−ＢＩＯＣＡＴ５７５を得た。前述した発現条件下でテトラサイクリンをアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌに置き換えて菌株ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７０からＲＰ
Ａ−ＢＩＯＣＡＴ５７５までを培養した。これらの菌株のニトリラーゼ活性は反
応液量１ｍｌに５ｍｇの細胞（ＯＤ_６６０から算定した乾燥重量）を使用して前
述のようにして１時間について分析した。選択性はアミドに相当するピーク面積
の酸に相当するピーク面積に対する比率を計算することによって測定した。それ
をパーセンテージとして表わし、結果を表２に示す。

【００７０】

【表２】

【００７１】 これらの結果は、ＮｉｔＡのグルタミン１６２をシステインで置き換えること
がＨＭＴＢＮの加水分解に関する選択性の４倍の利得を可能にすることを示して
いる。

【００７２】 実施例６：位置１６２でシステインによる置換をした後のＡＭＴＢＮの加水分
解に関するＮｉｔＡの選択性増進 ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７０およびＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７５株を前述の発
現条件下で培養した。これらの菌株のニトリラーゼ活性はホウ酸緩衝液、ｐＨ９
．２中で２−アミノ−４−メチルチオブタンニトリルまたはＡＭＴＢＮ（Ｃ５Ｈ
１０Ｎ２Ｓ）を基質として５０ｍＭで使用して測定した。ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ
５７０細胞１０ｍｇ（乾燥重量で表示）およびＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５７５細胞
０．４ｍｇｍｇ（乾燥重量で表示）相当を反応液量１ｍｌ中で３０℃、２４時間
で使用した。前述したようにＨＰＬＣによってＡＭＴＢＳおよびＡＭＴＢＡの生
成を測定し、同様の方式で選択性を算出した。その結果を表３に示す。

【００７３】

【表３】

【００７４】 これらの結果は、ＮｉｔＡのグルタミン１６２のシステインによる置換がＨＭ
ＴＢＮ以外の基質、このケースではＡＭＴＢＮ、に対する選択性に４倍の利得を
可能にすることを示している。

【００７５】 実施例８：ＮｉｔＢの位置１６２でのその他の置換およびＨＭＴＢＮへの選択
性の損失 実施例２に述べた突然変異誘発から得たクローンに含まれるｎｉｔＢ遺伝子の
コドン１６２を含む領域を配列分析することによって、位置１６２にＴＧＣの代
わりにＣＡＧコドンを持ったクローンを識別することが可能であった。対応する
プラスミドはｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ７８と命名され、ＮｉｔＢ Ｑ１６２をコード
するｎｉｔＢ挿入を持っており、そこではシステイン１６２がグルタミンで置換
されている。これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９６
株に導入し、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５３０および５３１株を得た。ＲＰＡ−ＢＩ
ＯＣＡＴ５３０、ＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ５３１およびＲＰＡ−ＢＩＯＣＡＴ４９
７株を実施例３に述べた条件下で培養した。反応液量１ｍｌに１ｍｇのＤＣを使
用し、出願ＦＲ９６／１３０７２の実施例４に述べたようにして、１００ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７で洗浄した細胞ペレットについてＨＭＴＢＮに対す
るニトリラーゼ活性を測定した。菌株の選択性は、２時間の加水分解の後に形成
されたアミドと酸の合計のモル量に対する形成されたアミドのモル量の関係で測
定した。それをパーセンテージで表わし、その結果を表５に示す。

【００７６】

【表４】

【００７７】 これらの結果は、システイン１６２の置換がＨＭＴＢＮの加水分解に関するＮ
ｉｔＢの選択性を変えることを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、１４種類のニトリラーゼのアラインメントを示す。

【図２】 図２は、プラスミドｐＲＰＡ−ＢＣＡＴ４１のマップを示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 7/40 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジユルダ，カトリーヌ フランス国、エフ−69110・サント−フオ ア−レ−リヨン、シユマン・ドユ・バロ ン、４ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA11 DA06 EA04 GA14 HA12 4B050 CC04 DD02 LL05 4B064 AD01 AE61 CA21 CB01 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA03 CA31

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 本来のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を位置１６２に
   含むことを特徴とする、選択性を調整された改変ニトリラーゼ。
2. 【請求項２】 調整された選択性がニトリラーゼの選択性から少なくとも０
   ．５％、有利であるのは少なくとも１％異なることを特徴とする、請求項１に記
   載の改変ニトリラーゼ。
3. 【請求項３】 残基１６２がシステイン、アラニン、バリン、アスパラギン
   、グルタミン、イソロイシンおよびセリンの中から選択されるアミノ酸で置き換
   えられることを特徴とし、本来のニトリラーゼの残基１６２がシステイン、アラ
   ニン、バリン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシンおよびセリンそれぞれ
   とは異なることが判る、請求項１または２のいずれか一項に記載の改変ニトリラ
   ーゼ。
4. 【請求項４】 残基１６２がシステイン残基で置き換えられることを特徴と
   する、請求項３に記載の改変ニトリラーゼ。
5. 【請求項５】 調整が選択性の増進であることを特徴とする、請求項１から
   ４までのいずれか一項に記載の改変ニトリラーゼ。
6. 【請求項６】 調整が選択性の低下であることを特徴とする、請求項１から
   ４までのいずれか一項に記載の改変ニトリラーゼ。
7. 【請求項７】 未改変である本来のニトリラーゼが細菌、酵母、菌、植物ま
   たは動物起源のニトリラーゼの中から選択されることを特徴とする、請求項１か
   ら６までのいずれか一項に記載の改変ニトリラーゼ。
8. 【請求項８】 本来のニトリラーゼがＤＮＡライブラリーのスクリーニング
   によって得られるニトリラーゼであることを特徴とする、請求項１から７までの
   いずれか一項に記載の改変ニトリラーゼ。
9. 【請求項９】 請求項１から８までのいずれか一項に記載の改変ニトリラー
   ゼをコードする核酸配列で、特にＤＮＡの配列。
10. 【請求項１０】 本来のニトリラーゼをコードする核酸配列から成り、それ
    に関して位置１６２で本来の残基のコドンが本来の残基とは異なる残基をコード
    するコドンで置き換えられていることを特徴とする、請求項９に記載の核酸配列
    。
11. 【請求項１１】 転写の方向で、ホスト有機体の中で機能するプロモーター
    調節配列、請求項９および１０の両方に記載の改変ニトリラーゼをコードする核
    酸配列および同じホスト有機体の中で機能するターミネーター調節配列を含むこ
    とを特徴とするキメラ遺伝子または発現カセット。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のキメラ遺伝子を安定にゲノム内に一体
    化されて含むことを特徴とする、形質転換されたホスト有機体。
13. 【請求項１３】 細菌、酵母、菌、植物細胞または植物体の中から選択され
    ることを特徴とする、請求項１２に記載のホスト有機体。
14. 【請求項１４】 請求項１２および１３に記載した形質転換ホスト有機体の
    培養、および適切な場所で、改変ニトリラーゼの混合物ないし精製された形での
    分離で構成されることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか一項に記載
    のように規定した増進選択性を持つ改変ニトリラーゼを作製する方法。
15. 【請求項１５】 化合物を合成または分解するための方法の中の生体触媒反
    応における、請求項１から８までのいずれか一項に記載の改変ニトリラーゼの使
    用。
16. 【請求項１６】 本来のニトリラーゼの残基１６２を本来のアミノ酸残基と
    は異なるアミノ酸残基で置き換えることで構成されることを特徴とする、ニトリ
    ラーゼの選択性を調整する方法。
17. 【請求項１７】 ニトリラーゼが請求項２から８までのいずれか一項に記載
    のように規定されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。