ES2298163T3 - Procedimiento de modulacion de la selectividad de las nitrilasas, nitrilasas obtenidas con este procedimiento y su utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Nitrilasa modificada, caracterizada por el hecho de que: a) el aminoácido de la posición 162 de la nitrilasa se reemplaza por una cisteína, siendo dicha cisteína diferente del aminoácido de origen de la nitrilasa y definiéndose la posición de los aminoácidos respecto a la secuencia primaria de la nitrilasa NitB de Alcaligenes faecalis representada en la figura 1; y b) se mejora la selectividad de la nitrilasa, definiéndose la selectividad de la nitrilasa como el porcentaje de compuestos carentes de función carboxílica y liberados por la hidrólisis de un nitrilo catalizado mediante la nitrilasa, con excepción de la nitrilasa b_Gterrae de Gordona terrae (N° de acceso GeneBank: E12616) y de la nitrilasa b_Afaecalis de Alcaligenes faecalis (N° de acceso SwissProt: P20960).
Description
Procedimiento de modulación de la selectividad
de las nitrilasas, nitrilasas obtenidas con este procedimiento y su
utilización.
El presente invento hace referencia a nuevas
nitrilasas de selectividad mejorada, al procedimiento para
obtenerlas y a la utilización de dichas nitrilasas.
Las enzimas que catalizan la hidrólisis de
agrupaciones nitrílicas en ácidos carboxílicos correspondientes e
iones de amonio son las nitrilasas (Faber, Biotransformations in
Organic Chemistry, Springer Verlag, Berlín Heidelberg, 1992, ISBN
3-540-55762-8). No
obstante, esta bioconversión de agrupaciones nitrílicas en ácidos
carboxílicos correspondientes, cuyo balance final consiste en una
hidrólisis de agrupaciones nitrílicas, también puede realizarse en
dos etapas, consistiendo la primera en la conversión de los nitrilos
en amidas correspondientes por una nitrilohidratasa, y la segunda
en hidrolizar las amidas obtenidas en ácidos carboxílicos
correspondientes por las amidasas.
Las nitrilasas se descubrieron primero en las
plantas (Thimann and Mahadevan, 1964, Arch. Biochem. Biophys. 105:
133-141) y posteriormente se aislaron en numerosos
representantes de la microflora del suelo (Kobayashi y Shimizu,
1994, FEMS Microbiology Letters 120: 217-224):
Pseudomonas, Nocardia, Arthrobacter, Fusarium, Rhodoccacus,
Klebsielle, Alcaligenes. Más recientemente se han descrito
nitrilasas contenidas en bacterias termófilas (Cramp et al.,
1997, Microbiology, 143: 2313-2320). Las nitrilasas
tienen especificidades de substrato diversas, pero pueden
incorporarse a tres grupos en función de su especificidad: las
nitrilasas específicas de los nitrilos alifáticos, las específicas
de los nitrilos aromáticos o las específicas de los
arilacetonitrilos (Kobayashi et al., 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90: 247-251; Kobayashi y Shimizu, 1994, ya
citado: Lévy-Schil et al., 1995, Gene 161:
15-20; Layh et al., 1998, J. Mol. Catal B:
Enzymatic 5: 467-474).
Las nitrilasas tienen interés en la biocatálisis
porque numerosos procedimientos de síntesis aplican la hidrólisis
de agrupaciones nitrílicas (Yamamoto et al., 1991, Appl.
Environ. Microb. 57: 3028-3032; Faber,
Biotransformations in Organic Chemistry, 2nd edn, Springer Verlag,
Berlín, 1995; Lévy-Schil et al., 1995, Gene
161: 15-20; Cowan et al., 1998,
Extremophiles 2: 207-216): conversión del
adiponitrilo en cianovalerato o adipato, síntesis del ácido
nicotínico, del ácido p-aminobenzoico, del ácido
tranexámico, hidrólisis enantioselectiva de mandelonitrilo. En
particular, la nitrilasa de Alcaligenes faecalis ATCC8750
(denominada "NitB" en la presente solicitud) y la de
Comamonas testosteroni (denominada "NitA" en la presente
solicitud) pueden utilizarse para acceder al hidroxianálogo de la
metionina (FR9411301, W09609403, FR9613077).
Las nitrilasas tienen estructuras primarias que
se alinean con los grados de identidad variables a partir de
aproximadamente un 30%. Una alineación de las secuencias de varias
nitrilasas hace aparecer la conservación de varios residuos, uno de
los cuales es un residuo cisteínico en posición 163 de la secuencia
de la nitrilasa de NitB. Este residuo interviene en el mecanismo
reactivo de las nitrilasas (Kobayashi et al., 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 247-251).
Para el presente invento, la secuencia de
referencia es la NitB, efectuándose todas las definiciones e
indicaciones de posiciones de aminoácidos concretos en relación con
la secuencia primaria NitB. La figura 1 adjunta representa una
alineación de 14 secuencias de nitrilasas descritas en la tecnología
más actual, alineadas respecto a la secuencia NitB como referencia,
comprendiendo las secuencias p_Athalia 1 a 4 de Arabidopsis
thaliana (Nº de acceso SwissProt: P32961, P32962, P46010,
P46011), p_Tobacco1 y 2 de Nicotiana tabacum (Nº de acceso
GeneBank: D63331, D83078), b_RhodocJ1 de Rhodococcus
rhodocrous J1 (Nº de acceso GeneBank: D11425), b_RrhococPA3 de
Rhodococcus rhodocrous PA34 (Nº de acceso GeneBank: E09026),
b_Gterrae de Gordona terrae (Nº de acceso GeneBank: E12616),
b_RrhodocK22 de Rhodococcus rhodocrous K22 (Nº de acceso
GeneBank: D12583), b_Kozaenae de Klebsielia ozaenae
(Nº de acceso SwissProt: P100450), b_CtestosNI1 de Comamonas
testosteroni NI1 ó NitA (Nº de acceso GeneBank: L32589), y
b_Afaecalis de Alcaligenes faecalis JM3 ó NitB (Nº de acceso
SwissProt: P20960). En esta figura se expresa la numeración de los
aminoácidos de la secuencia de NitB (numeración inferior), así como
la secuencia de consenso con su numeración (numeración superior). En
la presente solicitud, la numeración de los residuos de las otras
nitrilasas se realiza respecto a este residuo cisteínico y la
secuencia de la nitrilasa NitB como secuencia de referencia. Tomando
como base dicha alineación, o cualquier alineación de secuencias de
nitrilasas, un experto en estas tecnologías identificará fácilmente
esta NitB a partir de la definición del aminoácido por su posición
y su naturaleza, correspondiendo la posición del aminoácido a otra
secuencia de nitrilasa.
La selectividad de las nitrilasas se define como
el porcentaje de compuestos carentes de función carboxílica y
liberados por la hidrólisis de un nitrilo catalizado mediante una
nitrilasa. Aunque su descripción ha sido poco frecuente, se observa
en cierto número de nitrilasas y de substratos. Por ejemplo, la
hidrólisis del 2-(metoxi)-mandelonitrilo en ácido
2-(metoxi)-mandélico catalizada por la nitrilasa de
Peudomonas fluorescens DSM 7155 da lugar a la coproducción
de 2-(metoxi)-mandelamida (Layh et al., 1998,
ya citado). Igualmente, la hidrólisis de 2-hidroxi
4-(metiltio) butironitrilo (HMTBN) catalizado por la nitrilasa NitA
de Comamonas testosteroni N11 (Lévy-Schil
et al., 1995, ya citado) que se describe en los ejemplos de
la presente solicitud se acompaña de la coproducción de
2-hidroxi 4-metiltio butiramida
(HMTBM). En el caso de un procedimiento biocatalítico que aplique
dicho par de enzima/substrato, la falta de selectividad de la
nitrilasa para su substrato da lugar a una coproducción de amida
que representa una pérdida de rendimiento del procedimiento. Esta
pérdida de rendimiento puede tener una repercusión económica
considerable. Además, esta falta de selectividad da lugar a la
presencia de amida que contamina el producto de la reacción. Por
tanto, la purificación del ácido carboxílico es necesaria y también
repercute económicamente en el procedimiento. En consecuencia, la
falta de selectividad de una nitrilasa para un substrato determinado
obstaculiza la creación de un procedimiento biocatalítico que
aplique esta nitrilasa a este substrato.
La disminución de la selectividad de las enzimas
también puede estudiarse si va acompañada de un aumento de la
actividad catalítica de la enzima en su substrato. Éste es
principalmente el caso en los procedimientos de descontaminación en
los que se busca degradar rápidamente una molécula tóxica con una
enzima de actividad específica máxima. En este caso, la naturaleza
de los productos surgidos de la reacción catalizada por la enzima
tiene menos importancia que la velocidad de la degradación del
substrato.
Por tanto, es especialmente importante poder
modificar la selectividad de las nitrilasas, tanto en el sentido de
una mejora de esta selectividad como en el de una disminución.
La evolución dirigida de una enzima consiste en
adaptarla a una función determinada, seleccionando de manera
iterativa variantes que presenten propiedades mejoradas (Arnold y
Volkov, 1999, Current Opinion in Chemical Biology 3:
54-59; Kuchner y Arnold, 1997, Tibtech 15:
523-530). Estas variantes pueden crearse mediante
diversas técnicas de mutagénesis del gen que codifica la enzima
estudiada (Skandalis et al., 1997, Chemistry & Biology
4: 8889-898; Crameri et al., 1998, Nature
391: 288-291); mutagénesis química (Singer y
Fraenkel-Conrat, 1969, Prog. Nucl. Acid Res. Mol.
Biol. 9: 1-29), mutagénesis por reacción en cadena
de la polimerasa en condiciones de error (Leung et al.,
1989, Technique 1: 11-15), por reacción en cadena
combinatoria de la polimerasa (Crameri et al., 1998, ya
citado; Shao et al., 1698, Nucleic Acids Res. 26:
681-683), por mutagénesis de centros específicos
(Directed Mutagenesis: a Practical Approach, 1991, Edited by M.J.
McPHERSON, IRL PRESS), etc.
En el marco de un proceso de mejora de la
actividad de la nitrilasa NitB en HMTBN
(2-amino-4-(metiltio)
butironitrilo), los inventores han constatado que una sustitución
determinada de NitB en la región del centro activo en la posición
162, reemplazando el residuo cisteínico por un residuo de
esparraguina, acarreaba una alteración de la selectividad de la
nitrilasa estudiada. En cambio, han constatado que la introducción
de un residuo cisteínico en la posición 162 de la secuencia de la
nitrilasa NitA ocasionaba una mejora de su selectividad en otro de
sus substratos, el AMTBN, demostrando así que la posición 162 en la
región del centro activo de las nitrilasas es una posición clave
que interviene en la selectividad de dichas nitrilasas y que la
modificación del residuo aminoácido en esta posición consistente en
reemplazar el aminoácido de origen por otro aminoácido da lugar a
una modulación de la selectividad de las nitrilasas.
Por tanto, el presente invento hace referencia a
una nitrilasa modificada de selectividad modulada, caracterizada
por el hecho de comprender en la posición 162 un residuo aminoácido
diferente del residuo aminoácido de origen.
Más exactamente, el presente invento hace
referencia a una nitrilasa modificada que se caracteriza por el
hecho de que: a) el aminoácido de la posición 162 de la nitrilasa se
reemplaza por una cisteína, siendo dicha cisteína diferente del
aminoácido de origen de la nitrilasa y definiéndose la posición de
los aminoácidos respecto a la secuencia primaria de la nitrilasa
NitB de Alcaligenes faecalis representada en la figura 1, y
b) se mejora la selectividad de la nitrilasa, definiéndose la
selectividad de la nitrilasa como el porcentaje de compuestos
carentes de función carboxílica y liberados por la hidrólisis de un
nitrilo catalizado mediante la nitrilasa; con excepción de la
nitrilasa b_Gterrae de Gordona terrae (Nº de acceso GeneBank:
E12616) y de la nitrilasa b_Afaecalis de Alcaligenes
faecalis (Nº de acceso SwissProt: P20960).
Por nitrilasa modificada se entiende, según el
presente invento, una nitrilasa modificada respecto a una nitrilasa
de origen, consistiendo la modificación en reemplazar el residuo
aminoácido de origen en la posición 162 por otro aminoácido.
Por modulación de la selectividad se entiende,
según el presente invento, una selectividad de la nitrilasa
modificada diferente de la selectividad de la nitrilasa de origen,
en particular de al menos un 0,5% respecto a la nitrilasa de
origen, preferiblemente de al menos el 1%.
Es preferible que el residuo 162 se reemplace
por un aminoácido escogido entre la cisteína, la alanina, la
valina, la esparraguina, la glutamina, la isoleucina o la serina,
entendiéndose que el residuo 162 de la nitrilasa de origen es
diferente de una cisteína, alanina, valina, esparraguina, glutamina,
isoleucina o serina, respectivamente.
Es preferible que el residuo 162 se reemplace
por un residuo de cisteína.
La nitrilasa de origen sin modificar se escoge
entre las nitrilasas de origen bacteriano, de levadura, fúngico,
vegetal o animal.
Entre las nitrilasas de origen bacteriano cabe
citar principalmente las siguientes: b_RhodocJ1 de Rhodococous
rhodocrous J1 (Nº de acceso GeneBank: D11425), b_RhodocPA3 de
Rhodococous rhodocrous PA34 (Nº de acceso GeneBank: E09026),
b_Gterrae de Gordona terrae (Nº de acceso GeneBank: E12616),
b_RrhodocK22 de Rhodococous rhodocrous K22 (Nº de acceso
GeneBank: D12583), b_Kozaenae de Klebsiella ozaenae
(Nº de acceso SwissProt: P100450), b_CtestosN11 de Comamonas
testosteroni NI1 ó NitA (Nº de acceso GeneBank: L32589) y
b_Afaecalis de Alcaligenes faecalis JM3 ó NitB (Nº de acceso
SwissProt: P20960). Entre las nitrilasas de origen vegetal cabe
citar principalmente: p_Athalia 1 a 4 de Arabidopsis thaliana
(Nº de acceso SwissProt: P32961, P32962, P46010, P46011), p_Tobacco
1 y 2 de Nicotiana tabacum (Nº de acceso GeneBank: D63331,
D83078).
Entre las nitrilasas de otros orígenes cabe
citar principalmente: las de Saccharomyces cerevisiae (Nº de
acceso Swiss-Prot P40447 y P4044), de
Caenorhabditis elegans (Nº de acceso GeneBank AF069986), de
Drosophila melanogaster (GeneBank AF069989), de Homo
sapiens (Nº de acceso GeneBank AF069987) y de Mus
musculus (Nº de acceso GeneBank AF069988).
Según otro modo de realización del presente
invento, la nitrilasa de origen es una nitrilasa obtenida por
cribado de bancos de ADN, principalmente de ADNc o ADN genómico de
diversas fuentes, sobre todo de bancos de ADN obtenidos por
recombinaciones y mutaciones aleatorias de nitrilasas, por evolución
molecular dirigida, o por cribado de un banco de ADN del suelo o de
otros biotopos.
El presente invento también hace referencia a
una secuencia de ácido nucleico, en particular a una secuencia de
ADN que codifica una nitrilasa modificada como ya se ha
indicado.
Según un primer modo de realización del presente
invento, la secuencia de ácido nucleico según el presente invento
está constituida por la secuencia de ácido nucleico de la nitrilasa
de origen, para la cual se ha reemplazado el codón del residuo de
origen en la posición 162 por un codón que codifica un residuo
diferente del residuo de origen, en particular los codones que
codifican los residuos de alanina, valina, esparraguina, glutamina,
isoleucina o serina.
La modificación de los codones de la secuencia
de origen puede efectuarse por cualquier medio que conozcan los
especialistas en la mejora de las enzimas anteriormente definidas,
en particular por mutagénesis de centros específicos.
El presente invento también hace referencia a un
gen quimérico o módulo de expresión, comprendiendo en el sentido de
la transcripción una secuencia reguladora de iniciación funcional en
un organismo anfitrión, y codificando la secuencia de ácido
nucleico una nitrilasa modificada según el presente invento y una
secuencia reguladora de conclusión funcional en el mismo organismo
anfitrión.
El organismo anfitrión comprende cualquier
organismo eucariótico o procariótico, diferenciado o indiferenciado,
en particular las bacterias, las levaduras, los hongos, las células
vegetales y las plantas.
Se trata en particular de bacterias, por ejemplo
E. coli, de levaduras, en particular de los géneros
Saccharomyces, Kluyveromyces o Pichia, de hongos, en
particular de los géneros Aspergillus o Penicilium,
de un baculovirus, o incluso de células vegetales y de plantas.
Por "célula vegetal" se entiende, según el
presente invento, cualquier célula surgida de una planta y que
pueda constituir tejidos indiferenciados como los callos, tejidos
diferenciados como los embriones, partes de plantas, plantas o
semillas.
Se entiende por "planta", según el presente
invento, cualquier organismo multicelular diferenciado capaz de
fotosíntesis, en particular las plantas monocotiledóneas o
dicotiledóneas, más particularmente las plantas de cultivo
destinadas o no a la alimentación animal o humana, como el maíz, el
trigo, la colza, la soja, el arroz, la caña de azúcar, la
remolacha, el tabaco, el algodón, etc.
Los especialistas conocen perfectamente los
elementos reguladores de iniciación y conclusión, en función de los
organismos anfitriones.
Como secuencia reguladora de iniciación en las
bacterias puede emplearse cualquiera secuencia reguladora de
iniciación de un gen que se manifieste de manera natural en las
bacterias, por ejemplo el iniciador del operón triptófano de E.
coli (Denèfle et al., 1987, Gene 56:
61-70).
Como secuencia reguladora de iniciación en las
levaduras puede emplearse cualquiera secuencia reguladora de
iniciación de un gen que se manifieste de manera natural en las
levaduras, por ejemplo el iniciador del gen Mf\alpha1 de S.
cerevisiae, o del gen de lactasa de Kluyveromyces
lactis (van den Berg et al., 1990, Bio/Technology 8:
135-139).
Como secuencia reguladora de iniciación en los
hongos puede emplearse cualquiera secuencia reguladora de iniciación
de un gen que se manifieste de manera natural en los hongos, por
ejemplo la secuencia de iniciación del gen de la fosfatasa ácida de
Penicillium chrysogenum (Graessle et al., 1997, Appl.
Environ. Microbiol. 63: 753-756) o la secuencia de
iniciación del gen del alcohol deshidrogenasa de Aspergillus
nidulans (Gwyne et al., 1989, Biochem. Soc. Trans. 17:
338-340).
Como secuencia reguladora de iniciación en las
células vegetales y las plantas puede utilizarse cualquiera
secuencia de iniciación de un gen que se manifieste de manera
natural en las plantas, en particular un iniciador de origen
bacteriano, vírico o vegetal como, por ejemplo, el de un gen de la
pequeña subunidad de ribulosa bifosfato carboxilasa (RuBisCo), un
iniciador de histona (EP 0 507 698) o un iniciador de actina de
arroz, o de un gen de virus de planta como, por ejemplo, el de la
enfermedad del mosaico de la coliflor (CAMV 19S ó 35S), o un
iniciador inducible por los microbios patógenos como el
PR-la del tabaco, pudiendo utilizarse cualquier
iniciador conveniente conocido.
Como secuencia reguladora de conclusión en las
bacterias puede emplearse cualquiera secuencia reguladora de
conclusión de un gen que se manifieste de manera natural en las
bacterias, por ejemplo la secuencia reguladora de conclusión del
operón de los ARN ribosómicos de E. coli (Denèfle
et al., 1987, Gene 56: 61-70).
Como secuencia reguladora de conclusión en las
levaduras puede emplearse cualquiera secuencia reguladora de
conclusión de un gen que se manifieste de manera natural en las
levaduras, por ejemplo el gen de conclusión del fosfoglicerato
cinasa (PGK) de S. cerevisiae, o el gen de conclusión
de la lactasa Kluyveromyces lactis (van den Berg et
al., 1990, Bio/Technology 8: 135-139).
Como secuencia reguladora de conclusión en los
hongos puede emplearse cualquiera secuencia reguladora de conclusión
de un gen que se manifieste de manera natural en los hongos, por
ejemplo la secuencia reguladora de conclusión del gen de la
piruvatocinasa de Trichoderma reesei (Schindler et
al., 1993, Gene 130: 271-275).
Como secuencia reguladora de conclusión en las
células vegetales o las plantas puede utilizarse cualquiera
secuencia reguladora de conclusión de un gen que se manifieste de
manera natural en las plantas, por ejemplo el gen de conclusión de
un gen de origen bacteriano, como por ejemplo el gen de conclusión
nos de Agrobacterium tumefaciens, de origen vírico,
como por ejemplo el gen de conclusión del CaMV 35S, o incluso de
origen vegetal, como por ejemplo un gen de conclusión de la histona
EP 0 633 317).
El presente invento también hace referencia a un
organismo anfitrión transformado que comprende un gen quimérico
como el definido anteriormente, en especial a un organismo anfitrión
definido anteriormente en cuyo genoma se ha integrado de manera
estable el gen quimérico según el presente invento.
El presente invento también hace referencia a un
procedimiento de producción de nitrilasas modificadas con
selectividad mejorada definidas anteriormente, consistiendo dicho
procedimiento en cultivar el organismo anfitrión según el presente
invento, y en su caso en aislar la nitrilasa modificada, en mezcla o
en una forma purificada.
El presente invento también hace referencia a la
utilización de una nitrilasa modificada según el presente invento
en una reacción de biocatálisis integrada en un procedimiento de
síntesis o de degradación de compuestos químicos.
Por último, el presente invento hace referencia
a un procedimiento para mejorar la selectividad de una nitrilasa,
definiéndose la selectividad de la nitrilasa como el porcentaje de
compuestos carentes de función carboxílica y liberados por la
hidrólisis de un nitrilo catalizado mediante la nitrilasa,
caracterizado por el hecho de que consiste en reemplazar el
aminoácido de la posición 162 de la nitrilasa por una cisteína,
siendo dicha cisteína diferente del aminoácido de origen de la
nitrilasa, y definiéndose la posición de los aminoácidos respecto a
la secuencia primaria de la nitrilasa NitB de Alcaligenes
faecalis representada en la figura 1.
Es preferible que el emplazamiento del residuo
162 se obtenga introduciendo en la secuencia de ácido nucleico que
codifica la nitrilasa de origen sin modificar un codón que codifique
un residuo en la posición 162 diferente del codón que codifica el
residuo de la nitrilasa de origen.
Es preferible que la nitrilasa obtenida mediante
dicho procedimiento de modulación sea una nitrilasa como la
definida anteriormente.
Los ejemplos siguientes permiten ilustrar el
presente invento, sin tratar de limitar su alcance.
La medida de la actividad de la nitrilasa en el
2-hidroxi 4-(metiltio) butinonitrilo se realiza como
sigue:
Se toma una muestra de cultivo con una densidad
óptica (DO) conocida de 660 nm (DO_{660}) y se lava en el tampón
de fosfato de 100 mM pH 7,0. Estimando el peso en seco de la muestra
según la DO_{660} (una unidad de DO_{660} corresponde a un peso
en seco de 0,35 mg de Células Secas (CS) (ml)) se toma
aproximadamente 1 mg de CS en 1 ml de tampón de fosfato de 100 mM
ph 7,0 y se incuba en un tubo cerrado de 2 ml a 35ºC durante 10
minutos. La cinética se inicia agregando 17 \mul de la solución de
HMTBN al 78% para obtener la concentración de 100 mM en la mezcla
reactiva al principio del ensayo. La reacción se incuba a 35º con
agitación. Cada 15 minutos se retira una muestra de 100 \mul de
la suspensión y se mezcla con 900 \mul de H_{3}PO_{4} 100 mM
pH2,5 para detener la reacción. Después del centrifugado, el
sobrenadante se analiza por cromatografía líquida de alta presión
(HPLC) como se describe seguidamente.
El eluyente consta de acetonitrilo de calidad
HPLC diluido en el H_{3}PO_{4} 50 mM (0,9 litros de
H_{3}PO_{4} 50 mM mezclados con 0,1 litro de acetonitrilo).
Este eluyente, filtrado y desgasificado, filtra la columna a razón
de 1 ml/min y con una presión de 140 bar. La columna utilizada es
una columna de Nucleosil 5 \mum C18 de 250 mm de longitud y 4,6
mm de diámetro (INTERCHIM. Ref. N5CC18-25F). El
volumen inyectado es de 5 \mul y la detección se realiza por
lectura de la absorbencia con una longitud de onda de 215 nm. En
estas condiciones, los picos de HMTBM, de HMTBS (ácido
2-hidroxi 4-(metiltio) butanoico) y de HMTBN
(2-amino-4(metiltio)butanamida)
tienen tiempos de retención respectivos de 9, 11 y 15,8 minutos.
Las cantidades de HMTBN, HMTBM y HMTBS se deducen de la medida en
la superficie de los picos y de la comparación en la superficie de
los picos de una mezcla de contraste de composición conocida.
La medida de la actividad de la nitrilasa en el
2-hidroxi 4-(metiltio) butinonitrilo se realiza como
sigue:
Se suspende un residuo celular (entre 0,4 y 20
mg de CS) en el tampón de borato de 200 mM ph 9,2 y se incuba en un
tubo cerrado de 2 ml a 30ºC durante 10 minutos. La cinética se
inicia agregando una solución de AMTBN para obtener una
concentración final de 50 mM en la mezcla reactiva al principio del
ensayo. La reacción se incuba a 30ºC con agitación. Cada 15 minutos
se retira una muestra de 50 \mul de la suspensión y se mezcla con
950 \mul del eluyente de HPLC (véase la composición seguidamente)
para detener la reacción. Después del centrifugado, el sobrenadante
se analiza por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) como se
describe seguidamente.
El eluyente está compuesto por un 1% de
acetonitrilo de calidad HPLC diluido en una solución de
H_{3}PO_{4} al 0,5% en agua. Este eluyente, filtrado y
desgasificado, filtra la columna a razón de 1 ml/min. La columna
utilizada es una columna de Nucleosil 5 \mum C18 de 250 mm de
longitud y 4,6 mm de diámetro (INTERCHIM. Ref.
N5CC18-25F) mantenida a una temperatura de 40ºC. El
volumen inyectado es de 20 \mul y la detección se realiza por
lectura de la absorbencia con una longitud de onda de 210 nm. En
estas condiciones, los picos de AMTBM, de AMTBS (ácido
2-amino 4-(metiltio) butanoico) y de AMTBN tienen
tiempos de retención respectivos de 4,0, 4,5 y 5,0 minutos. Las
cantidades de AMTBN, AMTBM y AMTBS se deducen de la medida en la
superficie de los picos y de la comparación en la superficie de los
picos de una mezcla de contraste de composición conocida.
Las otras técnicas aplicadas son técnicas
clásicas de biología molecular y de microbiología, conocidas de los
especialistas y descritas, por ejemplo, por Ausubel et al.,
1987 (Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons,
New York), Maniatis et al., 1982, (Molecular Cloning: a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York), Coligan et al., 1997 (Current Protocols in
Protein Science, John Wiley & Sons, Inc).
Ejemplo
1
La figura 2 representa la carta del plásmido
pRPA-BCAT41. Los puntos o centros entre paréntesis
se han eliminado durante las clonaciones. Ptrp: iniciador
triptófano nitB: gen de la nitrilasa; TrmB: genes de conclusión de
la transcripción; fin ROP: fin del gen que codifica la proteína ROP
(Chambers et al., 1988, Gene 68: 139-149);
ORI: origen de replicación; RNAI/II: los ARN que intervienen en la
replicación (Chambers et al., ya citado); Tc: gen de
resistencia a la tetraciclina.
El fragmento de 1,27 kb que contiene el
iniciador P_{trp}, el punto de fijación del ribosoma del gen cll
del fago \lambda (RBScll) y el gen de la nitrilasa de
Alcaligenes faecalis ATCC8750 (nitB) se ha extraído
del plásmido pRPA68CAT6 (solicitud FR 96/13077) con ayuda de las
enzimas de restricción EcoRI y XbaI para clonarlo en el vector
pXL642 (descrito en la solicitud CIP Nº 08/194,588) abierto por las
mismas enzimas de restricción. Las enzimas StuI y BsmI han abierto
el plásmido resultante, pRPA-BCAT15, y el fragmento
de 4,3 kb se ha ligado con el fragmento StuI-BsmI
de 136 bp purificado de pRPA-BCAT4 (solicitud FR
96/13077) para obtener el plásmido pRPA-BCAT19. La
secuenciación parcial de pRPA-BCAT19 ha confirmado
la sustitución del codón del residuo Asp279 de la nitrilasa por el
codón de un residuo Asn279. El fragmento de 1,2 kb
EcoRI-XbaI de pRPA-BCAT19 que
contiene la fusión P_{trp}::RBScll::nitB se ha
clonado seguidamente en el vector pRPA-BCAT28
abierto por las mismas enzimas para obtener el plásmido
pRPA-BCAT29 de 6,2 kb. El vector
pRPA-BCAT28 se ha obtenido ligando el fragmento de
3,9 kb SspI-ScaI de pXL642 (solicitud CIP Nº
08/194,588) con el fragmento de 2,1 kb SmaI de pHP45\OmegaTc
(Fellay et al., 1987, Gene 52: 147-154) para
reemplazar el marcador de resistencia a la ampicilina por el
marcador de resistencia a la tetraciclina. Destruyendo el punto NdeI
próximo al origen de la replicación del plásmido
pRPA-BCAT29 por digestión parcial de NdeI y acción
de la polimerasa I de E. coli (fragmento de Klenow),
se ha obtenido el plásmido pRPA-BCAT41, del cual se
representa una carta en la figura 1. Eliminando del plásmido
pRPA-BCAT41 el fragmento Xcm1 de 0,55 bp por
digestión de Xcm1 y ligado, se ha obtenido el plásmido
pRPA-BCAT72.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El codón de la cisteína 162 del gen nitB
se ha modificado por mutagénesis de centros específicos utilizando
los cebadores NitB162 CGCGTCGGTGCCCTGMASTGCTGGGAGC o M = A/C S =
G/C) y SR (CGGCAATGAT
CAGGCCTTCGGC).
CAGGCCTTCGGC).
Se ha ampliado un fragmento interno de 361 bp
por reacción RCP utilizando los cebadores NitB162 y SR, la matriz
pRPA-BCAT41, la polimerasa Pwo (Boehringer) y el
programa de incubación siguiente: 5 min a 95ºC, cinco ciclos (un
minuto a 95ºC, 1 min a 58ºC, 1 a 72ºC), 35 ciclos (45 segundos a
95ºC, 30 seg. a 58ºC, 30 segundos a 72ºC). 5 min a 72ºC.
Después de la purificación del fragmento
ampliado por migración en gel de agarosa, extracción del fragmento
con ayuda del equipo "QiaEx" (Quiagen), se ha incubado el ADN
en presencia de enzimas de restricción StuI y BanI (New England
Biolabs) a 37ºC durante 16 horas en un tampón recomendado por el
proveedor. Se ha ampliado otro fragmento interno de 498 bp de
manera análoga con ayuda de los cebadores PCRAF1 (descripción
incluida en la solicitud FR96/13072) y NitB1
(GCAGCACAGGGCACCGACGC).
Después de la purificación del fragmento
ampliado por migración en gel de agarosa, extracción del fragmento
con ayuda del equipo "QiaEx" (Quiagen), se ha incubado el ADN
en presencia de enzimas de restricción NdeI y BanI (New England
Biolabs) a 37ºC durante 16 horas en un tampón recomendado por el
proveedor.
Las enzimas NdeI y StuI han abierto el vector
pRPA-BCAT72 y el fragmento de 5,43 kp se ha
purificado en gel de agarosa y se ha extraído con ayuda del equipo
QiaEx. Seguidamente se han ligado los tres fragmentos descritos y
la mezcla de ligado se ha introducido por electroporación en la cepa
de E. coli DH5alfa. Los clones obtenidos se han analizado
por restricción con las enzimas EcoRI y XbaI para seleccionar
plásmidos que presentaran un inserto de 1,26 kb. Después de la
secuenciación de la región que abarca el codón 162 del gen de la
nitrilasa, se han retenido dos plásmidos portadores del codón
investigado (AAC en lugar de TGC) y se han denominado
pRPA-BCAT75.
Estos plásmidos se han introducido en la cepa de
E. coli RPA-BIOCAT496 para obtener las cepas
RPA-BIOCAT526 y 527. La cepa
RPA-BIOCAT496 corresponde a la cepa W (ATCC9637) en
la que previamente se ha introducido el plásmido
pRPA-BCAT34. El plásmido pRPA-BCAT34
corresponde al plásmido pXL2035 (Lévy-Schil et
al., 1995. Gene 161: 15-20) en el cual se ha
clonado, entre los puntos EcoRI y NotI, un fragmento de 475 bp
portador del gen trpR que codifica el regulador del
iniciador Ptrp. Este fragmento se ha extraído del plásmido
pRPA-BCAT30, construido por clonación en el vector
pSL301 (Brosius, 1989, DNA 8: 759-777) de un
fragmento AatII-StuI de 434 bp portador del gen
trpR y de su iniciador extraído del plásmido pRPG9 (Gunsalus
y Yanofsky. 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:
7117-7121).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las cepas RPA-BIOCAT526,
RPA-BIOCAT527 y RPA-BIOCAT 497
(correspondiente a la cepa RPA-BIOCAT496, en la que
se ha introducido previamente el plásmido
pRPA-BCAT41) se han cultivado en las condiciones
descritas en el ejemplo 5 de la solicitud FR96/13072 con las
modificaciones siguientes: precultivo de 8 horas, inoculación en
proporción 1:50 en el medio M9 de glucosa que contiene un 0,4% de
casaminoácidos, 12 \mug/ml de tetraciclina y 50 \mug/ml de
kanamicina.
La actividad nitrilásica en HMTBN se ha medido
en un residuo de transferencia celular lavado en el tampón de
fosfato de potasio de 100 mM pH 7 ya descrito, aplicando 1 mg de CS
en un volumen reactivo de 1 ml. La selectividad de las cepas se ha
medido después de 2 horas de hidrólisis agregando la superficie del
pico de amida formado a la suma de las superficies de los picos de
amida y de ácido formados. Se expresa en términos porcentuales. Los
resultados se presentan en la tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que la sustitución de
la cisteína 162 por una esparraguina altera la selectividad de NitB
para la hidrólisis del HMTBN.
\newpage
Ejemplo
4
El codón de la glutamina 162 de la nitrilasa
NitA se ha transformado en un codón de cisteína por mutagénesis de
centros específicos con ayuda del equipo QuickChange^{TM}
site-directed mutagenesis (Stratagene).
Los cebadores NitA163
(GCATGTTCCCAGCAGCAGAGTCCCCCAAGATTCC) y NitA162 (GGAATCTTGGG
GGACTCTGCTGCTGGGAACATGC) se han utilizado en las condiciones indicadas por el proveedor en el ADN del plásmido pXL2158 (Lévy-Schil et al., 1995: Gene 161: 15-20).
GGACTCTGCTGCTGGGAACATGC) se han utilizado en las condiciones indicadas por el proveedor en el ADN del plásmido pXL2158 (Lévy-Schil et al., 1995: Gene 161: 15-20).
El programa de incubación de la reacción de RCP
comprendía 30 segundos a 95ºC y 16 ciclos de 30 segundos a 95ºC - 1
minuto a 55ºC - 12 minutos a 68ºC. Después de la digestión del ADN
por DpnI y la transformación de E. coli
XL1-Blue por 1 \mul de la mezcla reactiva, los
clones obtenidos se han analizado atendiendo al perfil de
restricción plasmídica con ayuda de la enzima Bpm1. Por alterar la
mutación introducida un punto de restricción Bpm1, se han
seleccionado cinco clones que habían perdido uno de los tres puntos
Bpm1. Los plásmidos que contenían se han introducido por separado
en la cepa RPA-BIOCAT496 para obtener las cepas
RPA-BIOCAT570 a RPA-BIOCAT574.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se ha introducido el plásmido pXL2158 en la cepa
RPA-BIOCAT496 para obtener la cepa
RPA-BIOCAT575. Las cepas
RPA-BIOCAT570 a RPA-BIOCAT575 se han
cultivado en las condiciones de expresión ya descritas reemplazando
la tetraciclina por la ampicilina de 100 \mug/ml. La actividad
nitrilásica de estas cepas se ha dosificado como ya se ha descrito,
aplicando 5 mg de células (en peso seco estimado según la
OD_{660}) en un volumen reactivo de 1 ml y durante una hora. La
selectividad se ha medido calculando la relación de la superficie
del pico correspondiente a la amida con la superficie del pico
correspondiente al ácido. Se expresa en términos porcentuales. La
tabla 2 agrupa los resultados.
Estos resultados muestran que la sustitución de
la glutamina 162 de NitA por una cisteína permite una ganancia de
selectividad de un factor de 4 para la hidrólisis del HMTBN.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Las cepas RPA-BIOCAT570 y
RPA-BIOCAT575 se han cultivado en las condiciones de
expresión ya descritas. La actividad nitrilásica de estas cepas se
ha dosificado utilizando como substrato el 2-amino 4
(metiltio) butanonitrilo o AMTBN (C5H10N2S) a razón de 50 mM en el
tampón de borato pH 9,2. En un volumen reactivo de 1 ml, el
equivalente de 10 mg de células (expresados en peso seco) de
RPA-BIOCAT570 y el equivalente de 0,4 mg de células
(expresados en peso seco) de RPA-BIOCAT575 se han
aplicado a 30ºC durante 24 horas. Las producciones de AMTBS y de
AMTBA se han medido por HPLC como ya se ha descrito y la
selectividad se ha calculado de manera análoga. Los resultados se
presentan en la tabla 3.
Estos resultados muestran que la sustitución de
la glutamina 162 de NitA por una cisteína permite una ganancia de
selectividad de un factor de 4 en un substrato distinto al HMTBN, en
este caso el AMTBN.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Por secuenciación de la región que abarca el
codón 162 del gen nitB albergado por los clones surgidos de
la mutagénesis descrita en el ejemplo 2, ha sido posible identificar
clones portadores del codón CAG en lugar de TGC en posición 162.
Los plásmidos correspondientes se han denominado
pRPA-BCAT78 y contienen un inserto nitB que
codifica una nitrilasa NitB Q162 cuya cisteína 162 se ha sustituido
por una glutamina. Estos plásmidos se han introducido en la cepa de
E. coli RPA-BIOCAT496 para obtener las cepas
RPA-BIOCAT530 y 531. Las cepas
RPA-BIOCAT530, RPA-BIOCAT531 y
RPA-BIOCAT 497 se han cultivado en las condiciones
descritas en el ejemplo 3. La actividad nitrilásica en HMTBN se ha
medido en un residuo de transferencia celular lavado en el tampón
de fosfato de potasio de 100 mM pH 7 descrito en el ejemplo 4 de la
solicitud FR96/13072, aplicando 1 mg de CS en un volumen reactivo
de 1 ml. La selectividad de las cepas se ha medido después de 2
horas de hidrólisis agregando la cantidad molecular de amida
formada a la suma de cantidades moleculares de amida y de ácido
formadas. Se expresa en términos porcentuales. Los resultados se
presentan en la tabla 5.
Estos resultados muestran que la sustitución de
la cisteína 162 por una glutamina altera la selectividad de NitB
para la hidrólisis del HMTBN.
<110> Aventis Animal Nutrition
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de modulación de la
selectividad de las nitrilasas, nuevas nitrilasas obtenidas por
este procedimiento y su utilización
\vskip0.400000\baselineskip
<130>PH 99069
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 9914249
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-11-08
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucléotido NitB 162
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgtoggtg ccctgmastg ctgggagc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucléotido SR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcaatgat caggccttcg gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucléotido NitB1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagcacagg gcaccgacgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucléotido NitA 163
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatgttccc agcagcagag tcccccaaga ttcc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucléotido NitA 162
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaatottgg gggactctgc tgctgggaac atgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Nitrilasa modificada, caracterizada
por el hecho de que: a) el aminoácido de la posición 162 de la
nitrilasa se reemplaza por una cisteína, siendo dicha cisteína
diferente del aminoácido de origen de la nitrilasa y definiéndose
la posición de los aminoácidos respecto a la secuencia primaria de
la nitrilasa NitB de Alcaligenes faecalis representada en la
figura 1; y b) se mejora la selectividad de la nitrilasa,
definiéndose la selectividad de la nitrilasa como el porcentaje de
compuestos carentes de función carboxílica y liberados por la
hidrólisis de un nitrilo catalizado mediante la nitrilasa, con
excepción de la nitrilasa b_Gterrae de Gordona terrae (Nº de
acceso GeneBank: E12616) y de la nitrilasa b_Afaecalis de
Alcaligenes faecalis (Nº de acceso SwissProt: P20960).
2. Nitrilasa modificada según la reivindicación
1, caracterizada por el hecho de que la nitrilasa cuyo
aminoácido en posición 162 se reemplaza por una cisteína se escoge
entre las nitrilasas p_Athalia 1 a 4 de Arabidopsis
thaliana, las nitrilasas p_Tobacco 1 y 2 de Nicotiana
tabacum, la nitrilasa b_RhodocJ1 de Rhodococcus
rhodocrous J1, la nitrilasa b_RrhodocPA3 de Rhodococcus
rhodocrous PA34, la nitrilasa b_RrhodocK22 de Rhodococcus
rhodocrous K22, la nitrilasa b_Kozaenae de Klebsiella
ozaenae y la nitrilasa NitA de Comamonas testosteroni
descritas en la figura 1.
3. Nitrilasa modificada según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de
que consiste en la nitrilasa NitA de Comamonas testosteroni
descrita en la figura 1 y cuyo aminoácido en posición 162 se
reemplaza por una cisteína.
4. Secuencia de ácido nucleico, en particular
una secuencia de ADN que codifica una nitrilasa modificada según
una de las reivindicaciones 1-3.
5. Gen quimérico o módulo de expresión,
caracterizado por el hecho de que comprende en el sentido de
la transcripción una secuencia reguladora de iniciación funcional
en un organismo anfitrión, codificando la secuencia de ácido
nucleico según la reivindicación 4 una nitrilasa modificada y una
secuencia reguladora de conclusión funcional en el mismo organismo
anfitrión.
6. Organismo anfitrión transformado no humano,
caracterizado por el hecho de que comprende un gen quimérico
según la reivindicación 5 integrado de manera estable en su
genoma.
7. Organismo anfitrión según la reivindicación
6, caracterizado por el hecho de que se le escoge entre las
bacterias, las levaduras, los hongos, las células vegetales y las
plantas.
8. Procedimiento de producción de nitrilasas
modificadas según una de las reivindicaciones 1-3,
caracterizado por el hecho de que consiste en cultivar un
organismo anfitrión transformado según una de las reivindicaciones
6-7 y, en su caso, en aislar la nitrilasa
modificada, en mezcla o en forma purificada.
9. Utilización de una nitrilasa modificada según
una de las reivindicaciones 1-3 en una reacción de
biocatálisis integrada en un procedimiento de síntesis o de
degradación de compuestos químicos.
10. Utilización de la nitrilasa modificada según
la reivindicación 3 para la hidrólisis del HMTBN o del AMTBN.
11. Procedimiento para mejorar la selectividad
de una nitrilasa, definiéndose la selectividad de la nitrilasa como
el porcentaje de compuestos carentes de función carboxílica y
liberados por la hidrólisis de un nitrilo catalizado mediante la
nitrilasa, caracterizado por el hecho de que consiste en
reemplazar el aminoácido de la posición 162 de la nitrilasa por una
cisteína, siendo dicha cisteína diferente del aminoácido de origen
de la nitrilasa, y definiéndose la posición de los aminoácidos
respecto a la secuencia primaria de la nitrilasa NitB de
Alcaligenes faecalis representada en la figura 1.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado por el hecho de que la nitrilasa cuyo
aminoácido en posición 162 se reemplaza por una cisteína, se escoge
entre las nitrilasas p_Athalia 1 a 4 de Arabidopsis
thaliana, las nitrilasas p_Tobacco 1 y 2 de Nicotiana
tabacum, la nitrilasa b_RhodocJ1 de Rhodococcus
rhodocrous J1, la nitrilasa b_RrhodocPA3 de Rhodococcus
rhodocrous PA34, la nitrilasa b_RrhodocK22 de Rhodococcus
rhodocrous K22, la nitrilasa b_Kozaenae de Klebsiella
ozaenae y la nitrilasa NitA de Comamonas testosteroni
descritas en la figura 1.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado por el hecho de que consiste en reemplazar el
aminoácido en posición 162 por una cisteína en la nitrilasa NitA de
Comamonas testosteroni descrita en la figura 1.
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| FR9914249A FR2800749B1 (fr) | 1999-11-08 | 1999-11-08 | Procede de modulation de la selective des nitrilases, nouvelles nitrilases obtenues par ce procede et leur utilisation |
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