JPH0937788A - 新規なニトリラーゼ遺伝子 - Google Patents
新規なニトリラーゼ遺伝子Info
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- JPH0937788A JPH0937788A JP7213061A JP21306195A JPH0937788A JP H0937788 A JPH0937788 A JP H0937788A JP 7213061 A JP7213061 A JP 7213061A JP 21306195 A JP21306195 A JP 21306195A JP H0937788 A JPH0937788 A JP H0937788A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- nitrilase
- genetic
- gene
- amino acid
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
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- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】ニトリラーゼ活性を有し、配列番号１で表
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
新規なニトリラーゼ遺伝子ＤＮＡ。 【効果】遺伝子組換えの方法でクローン化されたニトリ
ラーゼ遺伝子によるニトリルの加水分解では、菌体内に
同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生
物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させるこ
とが期待できる。
されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
新規なニトリラーゼ遺伝子ＤＮＡ。 【効果】遺伝子組換えの方法でクローン化されたニトリ
ラーゼ遺伝子によるニトリルの加水分解では、菌体内に
同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生
物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させるこ
とが期待できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ニトリラーゼ活性
を有する新規なポリペプチドおよびそれをコードする遺
伝子に関する。
を有する新規なポリペプチドおよびそれをコードする遺
伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物あるいは微生物由来の酵素をニト
リル化合物の加水分解触媒として用いることにより、光
学活性なα−ヒドロキシ酸（特開平2-84198 号、特開平
4-99495 号、特開平4-99496 号、特開平4-99497 号、特
開平4-218385号、特開平5-192189号、特開平6-237789号
各公報参照）やアミノ酸（特開平1-317394号、特開平3-
117493号、特開平4-79894 号各公報参照）などのカルボ
ン酸を製造できることが知られている。
リル化合物の加水分解触媒として用いることにより、光
学活性なα−ヒドロキシ酸（特開平2-84198 号、特開平
4-99495 号、特開平4-99496 号、特開平4-99497 号、特
開平4-218385号、特開平5-192189号、特開平6-237789号
各公報参照）やアミノ酸（特開平1-317394号、特開平3-
117493号、特開平4-79894 号各公報参照）などのカルボ
ン酸を製造できることが知られている。
【０００３】遺伝子組換えの方法でクローン化されたニ
トリラーゼ遺伝子によるニトリルの加水分解では、菌体
内に同遺伝子を多コピー存在させることができるため、
微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させ
ることが期待できる。
トリラーゼ遺伝子によるニトリルの加水分解では、菌体
内に同遺伝子を多コピー存在させることができるため、
微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させ
ることが期待できる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、より高い
触媒活性をもつ微生物触媒を調製する目的で、ゴルドナ
テラエ(Gordona terrae) MA-1 株のニトリラーゼ遺伝
子のクローニングを行い、本発明を完成した。
触媒活性をもつ微生物触媒を調製する目的で、ゴルドナ
テラエ(Gordona terrae) MA-1 株のニトリラーゼ遺伝
子のクローニングを行い、本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は、ニトリラーゼ活性を
有する新規なポリペプチドおよびそれをコードする遺伝
子ＤＮＡに関する。さらに、この遺伝子ＤＮＡは遺伝子
コードの同義性に由来する類似体であってもよい。
有する新規なポリペプチドおよびそれをコードする遺伝
子ＤＮＡに関する。さらに、この遺伝子ＤＮＡは遺伝子
コードの同義性に由来する類似体であってもよい。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明は、下記の工程により実施される。
る。本発明は、下記の工程により実施される。
【０００７】(1) ゴルドナ テラエ MA-1 株染色体ＤＮ
Ａの調製 MA-1 株より染色体ＤＮＡを分離、調製する。
Ａの調製 MA-1 株より染色体ＤＮＡを分離、調製する。
【０００８】(2) プローブの調製 各種ニトリラーゼ間においてホモロジーの高い領域に対
応する２種の合成ＤＮＡを作製し、これらをプライマー
とし、 MA-1 株染色体ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ
伸長鎖反応により、ニトリラーゼ遺伝子の一部が増幅さ
れたＤＮＡ断片を得る。
応する２種の合成ＤＮＡを作製し、これらをプライマー
とし、 MA-1 株染色体ＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ
伸長鎖反応により、ニトリラーゼ遺伝子の一部が増幅さ
れたＤＮＡ断片を得る。
【０００９】(3) ＤＮＡライブラリーの作製 染色体ＤＮＡを制限酵素で切断後、プラスミドベクター
pUC119 に挿入しライブラリーとする。
pUC119 に挿入しライブラリーとする。
【００１０】(4) 形質転換体の作製および組換え体ＤＮ
Ａの選別 工程(3) で作製した組換え体ライブラリーによる大腸菌
形質転換体を作製し、工程(2) で作製したＤＮＡ断片を
プローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション
法により目的の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体を選別
する。
Ａの選別 工程(3) で作製した組換え体ライブラリーによる大腸菌
形質転換体を作製し、工程(2) で作製したＤＮＡ断片を
プローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション
法により目的の組換え体ＤＮＡを含む形質転換体を選別
する。
【００１１】(5) 組換え体プラスミドの調製 工程(4) で作製された組換え体よりプラスミドを調製す
る。
る。
【００１２】(6) 制限酵素地図の作成およびニトリラー
ゼ遺伝子領域の特定 工程(5) で得られたプラスミドについて制限酵素地図を
作成し、プローブがハイブリダイズする領域（ニトリラ
ーゼ遺伝子領域）を特定する。
ゼ遺伝子領域の特定 工程(5) で得られたプラスミドについて制限酵素地図を
作成し、プローブがハイブリダイズする領域（ニトリラ
ーゼ遺伝子領域）を特定する。
【００１３】(7) 塩基配列の決定 工程(6) で特定された領域周辺の塩基配列を決定する。
なお、MA-1株は Gordona terrae MA-1(FERM BP-4535)と
して、ニトリラーゼ遺伝子を含むプラスミド pMA001 は
これを含有する形質転換体 E. coli JM109/pMA001(FERM
P-14994) として、工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されている。
なお、MA-1株は Gordona terrae MA-1(FERM BP-4535)と
して、ニトリラーゼ遺伝子を含むプラスミド pMA001 は
これを含有する形質転換体 E. coli JM109/pMA001(FERM
P-14994) として、工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されている。
【００１４】以下、実施例により詳細に説明する。ただ
し、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。
し、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。
【００１５】
実施例１ (1) ゴルドナ テラエ MA-1 株染色体ＤＮＡの調製 MA-1 株を１００ｍｌのＭＹ培地（０．５％ポリペプト
ン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモ
ルトエキス、１％グルコース）中、３０℃にて７２時間
振盪培養した後集菌し、この菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤ
ＴＡ溶液（０．１M ＥＤＴＡ、０．１５M ＮａＣｌ(pH
8.0)４ｍｌに懸濁し、リゾチーム８ｍｇを加えて３７℃
で１〜２時間振盪した後凍結した。次に、１０ｍｌのＴ
ｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１M ＮａＣｌ、
０．１M Ｔｒｉｓ (pH 9.0) を穏やかに振盪しながら加
え、さらに、プロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度
０．１ｍｇ）を加え３７℃で１時間振盪した。次に、等
量のＴＥ飽和フェノールを加え撹拌後（ＴＥ：１０mM
Ｔｒｉｓ、１mM ＥＤＴＡ (pH 8.0) ）遠心し、上層を
とり２倍量のエタノールを加えたのち、ガラス棒でＤＮ
Ａを巻きとり、９０％、８０％、７０％のエタノールで
順次フェノールを取り除いた。次に、ＤＮＡを３ｍｌの
ＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１０
０℃、１５分間の加熱処理済）を１０μg ／ｍｌになる
よう加え３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイ
ナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴ
Ｅ飽和フェノールを加え遠心し上層と下層に分離させ
た。上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量の
クロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え
同様の抽出操作を繰り返した（以後この操作をフェノー
ル処理と呼ぶ）。その後、上層に２倍量のエタノールを
加えガラス棒でＤＮＡを巻きとり回収し、染色体ＤＮＡ
標品を得た。
ン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモ
ルトエキス、１％グルコース）中、３０℃にて７２時間
振盪培養した後集菌し、この菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤ
ＴＡ溶液（０．１M ＥＤＴＡ、０．１５M ＮａＣｌ(pH
8.0)４ｍｌに懸濁し、リゾチーム８ｍｇを加えて３７℃
で１〜２時間振盪した後凍結した。次に、１０ｍｌのＴ
ｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１M ＮａＣｌ、
０．１M Ｔｒｉｓ (pH 9.0) を穏やかに振盪しながら加
え、さらに、プロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度
０．１ｍｇ）を加え３７℃で１時間振盪した。次に、等
量のＴＥ飽和フェノールを加え撹拌後（ＴＥ：１０mM
Ｔｒｉｓ、１mM ＥＤＴＡ (pH 8.0) ）遠心し、上層を
とり２倍量のエタノールを加えたのち、ガラス棒でＤＮ
Ａを巻きとり、９０％、８０％、７０％のエタノールで
順次フェノールを取り除いた。次に、ＤＮＡを３ｍｌの
ＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１０
０℃、１５分間の加熱処理済）を１０μg ／ｍｌになる
よう加え３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイ
ナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴ
Ｅ飽和フェノールを加え遠心し上層と下層に分離させ
た。上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量の
クロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え
同様の抽出操作を繰り返した（以後この操作をフェノー
ル処理と呼ぶ）。その後、上層に２倍量のエタノールを
加えガラス棒でＤＮＡを巻きとり回収し、染色体ＤＮＡ
標品を得た。
【００１６】(2) プローブの調製 工程(1) で得られた染色体ＤＮＡ１０μｌ（1/20希
釈）、１０倍濃度の反応緩衝液１０μｌ、５０mM Ｍｇ
Ｃｌ2 ３μｌ、１０mM ｄＮＴＰ２μｌ、プライマー#1
として配列番号４に示すオリゴヌクレオチド、プライマ
ー#2として配列番号５に示すオリゴヌクレオチド各１μ
ｌ（100 pmol濃度相当）、Taq ＤＮＡポリメラーゼ（GI
BCO BRL 社）１μｌを加えて１００μｌとした。プライ
マーはいずれもすでに公知の各種ニトリラーゼのホモロ
ジーの高い領域のアミノ酸配列を参考にして作成した。
この溶液について、９３℃、３０秒間（変性ステッ
プ）、５５℃、３０秒間（アニーリングステップ）、７
２℃、２分間（伸長ステップ）のインキュベーションを
３０サイクル行った。反応終了後、クロロホルム抽出を
３回行い、エタノール沈殿により増幅されたＤＮＡを回
収した。これを０．７％アガロースゲル電気泳動で分離
後、MA-1ニトリラーゼ遺伝子をコードすると考えられる
約５００ｋｂ（４５０〜５５０ｋｂ）のＤＮＡ断片を得
た。こうして得られたＤＮＡ断片を DIG DNA Labeling
Kit （ベーリンガー・マンハイム株式会社）を用いて標
識し、プローブとした。
釈）、１０倍濃度の反応緩衝液１０μｌ、５０mM Ｍｇ
Ｃｌ2 ３μｌ、１０mM ｄＮＴＰ２μｌ、プライマー#1
として配列番号４に示すオリゴヌクレオチド、プライマ
ー#2として配列番号５に示すオリゴヌクレオチド各１μ
ｌ（100 pmol濃度相当）、Taq ＤＮＡポリメラーゼ（GI
BCO BRL 社）１μｌを加えて１００μｌとした。プライ
マーはいずれもすでに公知の各種ニトリラーゼのホモロ
ジーの高い領域のアミノ酸配列を参考にして作成した。
この溶液について、９３℃、３０秒間（変性ステッ
プ）、５５℃、３０秒間（アニーリングステップ）、７
２℃、２分間（伸長ステップ）のインキュベーションを
３０サイクル行った。反応終了後、クロロホルム抽出を
３回行い、エタノール沈殿により増幅されたＤＮＡを回
収した。これを０．７％アガロースゲル電気泳動で分離
後、MA-1ニトリラーゼ遺伝子をコードすると考えられる
約５００ｋｂ（４５０〜５５０ｋｂ）のＤＮＡ断片を得
た。こうして得られたＤＮＡ断片を DIG DNA Labeling
Kit （ベーリンガー・マンハイム株式会社）を用いて標
識し、プローブとした。
【００１７】(3) ＤＮＡライブラリーの作製 MA-1 株染色体ＤＮＡ５０μｌに１０倍濃度制限酵素緩
衝液１０μｌ、滅菌水３７μｌ、制限酵素 Sau3AI ０．
５μｌを加え３７℃にて１０〜２０分間反応させた後、
エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。アガロース電
気泳動を行い、６ｋｂ以上のＤＮＡ断片をゲルから切り
出しDNA PREP（株式会社ダイアヤトロン）を用いて回収
した。このＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造
株式会社）を用いて大腸菌ベクターpUC118のBamHI 部位
に挿入し、組換え体ＤＮＡライブラリーを作製した。ラ
イゲーションに用いたpUC118断片は次のように作製し
た。pUC118１０μｌに対し１０倍濃度制限酵素緩衝液１
０μｌ、滅菌水７７μｌ、制限酵素BamHI ２μｌを加え
３７℃で２時間反応後、フェノール処理、エタノール沈
澱させた後、乾燥して５０μｌの滅菌水に溶解した。さ
らに、アルカリフォスタファーゼ（宝酒造株式会社）１
μｌ、１０倍濃度緩衝液１０μｌ、滅菌水３９μｌを加
え６５℃で反応後、フェノール処理、エタノール沈澱を
行い乾燥して滅菌水に溶解した。
衝液１０μｌ、滅菌水３７μｌ、制限酵素 Sau3AI ０．
５μｌを加え３７℃にて１０〜２０分間反応させた後、
エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。アガロース電
気泳動を行い、６ｋｂ以上のＤＮＡ断片をゲルから切り
出しDNA PREP（株式会社ダイアヤトロン）を用いて回収
した。このＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造
株式会社）を用いて大腸菌ベクターpUC118のBamHI 部位
に挿入し、組換え体ＤＮＡライブラリーを作製した。ラ
イゲーションに用いたpUC118断片は次のように作製し
た。pUC118１０μｌに対し１０倍濃度制限酵素緩衝液１
０μｌ、滅菌水７７μｌ、制限酵素BamHI ２μｌを加え
３７℃で２時間反応後、フェノール処理、エタノール沈
澱させた後、乾燥して５０μｌの滅菌水に溶解した。さ
らに、アルカリフォスタファーゼ（宝酒造株式会社）１
μｌ、１０倍濃度緩衝液１０μｌ、滅菌水３９μｌを加
え６５℃で反応後、フェノール処理、エタノール沈澱を
行い乾燥して滅菌水に溶解した。
【００１８】(4) 形質転換体の作製および組換え体ＤＮ
Ａの選別 大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％バクトトリプト
ン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣ
ｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間前培養し、この培養
物１００μｌをＳＯＢ培地５０ｍｌ（２％バクトトリプ
トン、０．５％バクトイーストエキス、１０mM ＮａＣ
ｌ、２．５mM ＫＣｌ、１mM ＭｇＳＯ4、１mM Ｍｇ
Ｃｌ2 ）に加え、１８℃で２０時間培養した。遠心によ
り集菌した後、冷１３ｍｌＴＦ溶液（２０mM ＰＩＰＥ
Ｓ−ＫＯＨ (pH 6.0) 、２００mMＫＣｌ、１０mM Ｃａ
Ｃｌ2 、４０mM ＭｎＣｌ2 ）を１３ｍｌ加え、０℃で
１０分放置後、再度遠心した。上澄を除いた後、沈澱し
た大腸菌に冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し０．２２ｍｌ
のジメチルスルホキシドを加え０℃で１０分間放置し
た。こうして作製したコンピテントセル２００μｌに工
程(3) で作製した組換え体プラスミドを含有する溶液
（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ加え、０℃で３０分
放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え０℃で
２分間冷却後、ＳＯＣ培地５０ｍｌ（２％バクトトリプ
トン、０．５％バクトイーストエキス、２０ｍＭグルコ
ース、１０mM ＮａＣｌ、２．５mM ＫＣｌ、１mM Ｍ
ｇＳＯ4 、１mM ＭｇＣｌ2 ）を０．８ｍｌ加え３７℃
にて６０分間振盪培養した。これを２００μｌずつアン
ピシリン１００μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天培地にまき、
３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コ
ロニーについてコロニーハイブリダイゼーション法にて
ニトリラーゼ遺伝子を持つ形質転換体を選別した。すな
わち、寒天培地上に生育した形質転換体をナイロンメン
ブレン（バイオダインＡ：日本ポール株式会社）上に移
し、菌体を溶かしてＤＮＡを固定した後、これを工程
(2) で作製したプローブ（約５００ｋｂ断片）で処理
し、DIG Luminescent Detection Kit （ベーリンガー・
マンハイム株式会社）を用い、目的の組換え体ＤＮＡを
含むコロニーを選択した。
Ａの選別 大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％バクトトリプト
ン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣ
ｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間前培養し、この培養
物１００μｌをＳＯＢ培地５０ｍｌ（２％バクトトリプ
トン、０．５％バクトイーストエキス、１０mM ＮａＣ
ｌ、２．５mM ＫＣｌ、１mM ＭｇＳＯ4、１mM Ｍｇ
Ｃｌ2 ）に加え、１８℃で２０時間培養した。遠心によ
り集菌した後、冷１３ｍｌＴＦ溶液（２０mM ＰＩＰＥ
Ｓ−ＫＯＨ (pH 6.0) 、２００mMＫＣｌ、１０mM Ｃａ
Ｃｌ2 、４０mM ＭｎＣｌ2 ）を１３ｍｌ加え、０℃で
１０分放置後、再度遠心した。上澄を除いた後、沈澱し
た大腸菌に冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し０．２２ｍｌ
のジメチルスルホキシドを加え０℃で１０分間放置し
た。こうして作製したコンピテントセル２００μｌに工
程(3) で作製した組換え体プラスミドを含有する溶液
（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ加え、０℃で３０分
放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え０℃で
２分間冷却後、ＳＯＣ培地５０ｍｌ（２％バクトトリプ
トン、０．５％バクトイーストエキス、２０ｍＭグルコ
ース、１０mM ＮａＣｌ、２．５mM ＫＣｌ、１mM Ｍ
ｇＳＯ4 、１mM ＭｇＣｌ2 ）を０．８ｍｌ加え３７℃
にて６０分間振盪培養した。これを２００μｌずつアン
ピシリン１００μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天培地にまき、
３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コ
ロニーについてコロニーハイブリダイゼーション法にて
ニトリラーゼ遺伝子を持つ形質転換体を選別した。すな
わち、寒天培地上に生育した形質転換体をナイロンメン
ブレン（バイオダインＡ：日本ポール株式会社）上に移
し、菌体を溶かしてＤＮＡを固定した後、これを工程
(2) で作製したプローブ（約５００ｋｂ断片）で処理
し、DIG Luminescent Detection Kit （ベーリンガー・
マンハイム株式会社）を用い、目的の組換え体ＤＮＡを
含むコロニーを選択した。
【００１９】(5) 組換え体プラスミドの調製 工程(4) で選択した形質転換体を１００ｍｌのＬＢ培地
にて３７℃で一晩培養し、集菌後、滅菌水により洗浄
し、溶液Ｉ（２ｍＭグルコース、１０mM ＥＤＴＡ、２
５mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ (pH 8.0) を５ｍｌ、リゾチー
ムを２５ｍｇ加え、０℃で３０分間放置した。溶液II
（１N ＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）を１０ｍｌ加え０℃で５
分間放置し、溶液III （３Ｍ酢酸ナトリウム (pH 4.8)
）を７．５ｍｌ加え０℃で３０分間放置した。これを
遠心し、その上澄みに５０ｍｌのエタノールを加え、さ
らに遠心し上清を取り除き５ｍｌの溶液IV（１０ｍＭ酢
酸ナトリウム、５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ (pH 8.0) ）
とリボヌクレアーゼＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を２．５
μｌ加え室温で２０分間放置した。これに１２ｍｌのエ
タノールを加え、遠心によりプラスミドを回収、７０％
エタノールでリンスし、乾燥後０．４ｍｌの滅菌水に溶
解した。さらにフェノール処理後、エタノール沈殿によ
りプラスミドを回収し、乾燥後０．４ｍｌの滅菌水に溶
解した。こうして得られた組換え体プラスミドを pMA00
1 と名付けた。
にて３７℃で一晩培養し、集菌後、滅菌水により洗浄
し、溶液Ｉ（２ｍＭグルコース、１０mM ＥＤＴＡ、２
５mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ (pH 8.0) を５ｍｌ、リゾチー
ムを２５ｍｇ加え、０℃で３０分間放置した。溶液II
（１N ＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）を１０ｍｌ加え０℃で５
分間放置し、溶液III （３Ｍ酢酸ナトリウム (pH 4.8)
）を７．５ｍｌ加え０℃で３０分間放置した。これを
遠心し、その上澄みに５０ｍｌのエタノールを加え、さ
らに遠心し上清を取り除き５ｍｌの溶液IV（１０ｍＭ酢
酸ナトリウム、５０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ (pH 8.0) ）
とリボヌクレアーゼＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を２．５
μｌ加え室温で２０分間放置した。これに１２ｍｌのエ
タノールを加え、遠心によりプラスミドを回収、７０％
エタノールでリンスし、乾燥後０．４ｍｌの滅菌水に溶
解した。さらにフェノール処理後、エタノール沈殿によ
りプラスミドを回収し、乾燥後０．４ｍｌの滅菌水に溶
解した。こうして得られた組換え体プラスミドを pMA00
1 と名付けた。
【００２０】(6) 制限酵素地図の作製およびニトリラー
ゼ遺伝子領域の決定 工程(5) で得られたプラスミド pMA001 を数種の制限酵
素を用いて切断し制限酵素地図を作製した（図１）。さ
らに、 pMA001 を制限酵素 KpnI 、XhoI、PstI、SalI等
で切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、サザーンハ
イブリダイゼーション法によりプローブがハイブリダイ
ズする断片を特定した。
ゼ遺伝子領域の決定 工程(5) で得られたプラスミド pMA001 を数種の制限酵
素を用いて切断し制限酵素地図を作製した（図１）。さ
らに、 pMA001 を制限酵素 KpnI 、XhoI、PstI、SalI等
で切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、サザーンハ
イブリダイゼーション法によりプローブがハイブリダイ
ズする断片を特定した。
【００２１】(7) 塩基配列の決定 工程(6) で特定された領域周辺の塩基配列をファルマシ
ア社蛍光シーケンサーALF IIを用いて決定した。その結
果、配列番号３に示される塩基配列が得られ、配列番号
１に示されるアミノ酸配列をもつオープンリーディング
フレームが見い出された。アミノ酸配列データーベース
NBRF （National Biomedical Research Foundation)と
の比較より本遺伝子は既知のニトリラーゼとアミノ酸配
列レベルで３０〜５０％のホモロジーを有しているこ
と、既知のニトリラーゼ間でホモロジーの高い領域は本
ニトリラーゼでも高いホモロジーを有していることか
ら、本ニトリラーゼは新規なニトリラーゼであることが
考えられた。また、これらのオープンリーディングフレ
ームの塩基配列を配列番号２に示した。
ア社蛍光シーケンサーALF IIを用いて決定した。その結
果、配列番号３に示される塩基配列が得られ、配列番号
１に示されるアミノ酸配列をもつオープンリーディング
フレームが見い出された。アミノ酸配列データーベース
NBRF （National Biomedical Research Foundation)と
の比較より本遺伝子は既知のニトリラーゼとアミノ酸配
列レベルで３０〜５０％のホモロジーを有しているこ
と、既知のニトリラーゼ間でホモロジーの高い領域は本
ニトリラーゼでも高いホモロジーを有していることか
ら、本ニトリラーゼは新規なニトリラーゼであることが
考えられた。また、これらのオープンリーディングフレ
ームの塩基配列を配列番号２に示した。
【００２２】実施例２ MA-1 株を培地（グリセロール２０ｇ、酵母エキス３
ｇ、リン酸一カリウム６．８ｇ、リン酸二ナトリウム
７．１、硫酸ナトリウム２．８ｇ、塩化マグネシウム
０．４ｇ、塩化カルシウム０．０４ｇ、硫酸マンガン
０．０３ｇ、塩化鉄０．００６ｇ、硫酸亜鉛０．００３
ｇ、ベンジルシアニド０．５ｇ／ｌ）中で、30℃、72時
間好気的に培養した。培地から遠心により菌体を回収
し、５０ｍＭリン酸緩衝液(pH 8.2)で洗浄後、同緩衝液
に再懸濁した。超音波処理により菌体を破砕し、遠心後
上清（細胞抽出液）を得た。この一部についてSDS ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行い、ウエスタンブロッ
ティングによりタンパク質をPVDFメンブレン（Immobilo
n PSQ （ミリポア社））に転写した。メンブレンをコマ
シーブルーにより染色後、培地に誘導剤を加えた場合に
のみ現れる分子量約４０kDa のバンドを切り取り、「島
津製作所製PSQ-1 型アミノ酸配列分析装置」によりＮ末
端アミノ酸配列を分析した。その結果得られた配列Thr-
Thr-Asp-Tyr-Ser は塩基配列（配列番号２）より求めら
れるＮ末端アミノ酸配列（Ｎ末端Met を除く）と一致し
た。また、アミノ酸配列分析結果より、Ｎ末端Met の一
部は切り取られず、残っていることも示唆された。
ｇ、リン酸一カリウム６．８ｇ、リン酸二ナトリウム
７．１、硫酸ナトリウム２．８ｇ、塩化マグネシウム
０．４ｇ、塩化カルシウム０．０４ｇ、硫酸マンガン
０．０３ｇ、塩化鉄０．００６ｇ、硫酸亜鉛０．００３
ｇ、ベンジルシアニド０．５ｇ／ｌ）中で、30℃、72時
間好気的に培養した。培地から遠心により菌体を回収
し、５０ｍＭリン酸緩衝液(pH 8.2)で洗浄後、同緩衝液
に再懸濁した。超音波処理により菌体を破砕し、遠心後
上清（細胞抽出液）を得た。この一部についてSDS ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行い、ウエスタンブロッ
ティングによりタンパク質をPVDFメンブレン（Immobilo
n PSQ （ミリポア社））に転写した。メンブレンをコマ
シーブルーにより染色後、培地に誘導剤を加えた場合に
のみ現れる分子量約４０kDa のバンドを切り取り、「島
津製作所製PSQ-1 型アミノ酸配列分析装置」によりＮ末
端アミノ酸配列を分析した。その結果得られた配列Thr-
Thr-Asp-Tyr-Ser は塩基配列（配列番号２）より求めら
れるＮ末端アミノ酸配列（Ｎ末端Met を除く）と一致し
た。また、アミノ酸配列分析結果より、Ｎ末端Met の一
部は切り取られず、残っていることも示唆された。
【００２３】
【発明の効果】遺伝子組換えの方法でクローン化された
ニトリラーゼ遺伝子によるニトリルの加水分解では、菌
体内に同遺伝子を多コピー存在させることができるた
め、微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大
させることが期待できる。
ニトリラーゼ遺伝子によるニトリルの加水分解では、菌
体内に同遺伝子を多コピー存在させることができるた
め、微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大
させることが期待できる。
【００２４】配列番号：１ 配列の長さ：３４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ゴルドナ テラエ（Gordona terrae） 株名：MA-1 XaaThrThrAspTyrSerGlyThrPheLysAlaAlaValThrGln 15 AlaGluProValTrpPheAspLeuSerAlaThrValAspLysThr 30 IleAlaLeuValGluGluAlaSerArgAlaGlyAlaAspLeuIle 45 AlaPheProGluThrTrpIleProGlyTyrProTrpPheLeuTrp 60 LeuAspSerValAlaTrpGlnSerGlnTyrPheIleArgTyrPro 75 GlnAsnSerLeuAspLeuAspGlySerGluPheAlaAlaIleArg 90 GluAlaAlaArgLysAsnAspIleAlaIleThrMetGlyPheSer 105 GluArgGlyHisGlySerLeuTyrMetGlyGlnAlaValIleGlu 120 ArgAspGlyValValValArgThrArgArgLysLeuLysProThr 135 HisValGluArgThrLeuPheGlyGluGlyAspGlySerAspLeu 150 ValValAspGlnThrSerLeuGlyArgValGlySerLeuCysCys 165 TrpGluHisLeuGlnProLeuThrLysTyrAlaMetTyrSerGln 180 HisGluGlnIleHisIleAlaAlaTrpProSerPheSerIlePhe 195 ProGlyAlaValTyrAlaLeuGlyProGluValAsnThrAlaAla 210 SerGlnGlnTyrAlaValGluGlyGlnThrTyrValLeuAlaPro 225 CysAlaValIleGlyAspAlaGlyTrpGluAlaPheAlaAspThr 240 GluGluLysArgGlnLeuIleHisLysGlyGlyGlyTyrAlaArg 255 IleTyrGlyProAspGlyArgSerLeuAlaGluProLeuAlaPro 270 AsnAspGluGlyIleLeuTyrAlaAspIleAspLeuSerAlaIle 285 LeuAlaAlaLysAsnProAlaAspProValGlyHisTyrSerArg 300 ProAspValLeuArgLeuGlyPheAsnLysAlaProGlnProLys 315 ValAsnIleLeuGlyThrGluProSerArgThrThrSerThrGln 330 CysArgProThrThrIleArgArgSerTrpArgPheProGlu 344 （上記式中Xaa は欠失またはMet を表す）
【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：１０３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ゴルドナ テラエ（Gordona terrae） 株名：MA-1 配列： ATG ACC ACC GAC TAT TCC GGC ACG TTC AAG GCA GCG GTG ACC CAG 45 GCC GAA CCG GTG TGG TTC GAC CTC TCG GCC ACC GTC GAC AAG ACC 90 ATT GCG CTC GTC GAA GAG GCG TCC CGG GCC GGC GCC GAT CTG ATC 135 GCG TTC CCG GAG ACC TGG ATA CCG GGG TAC CCG TGG TTC CTG TGG 180 CTT GAC TCG GTG GCC TGG CAG AGC CAG TAC TTC ATC CGG TAT CCG 225 CAG AAC TCG CTC GAT CTC GAC GGC AGC GAG TTC GCG GCG ATC AGG 270 GAA GCC GCA CGA AAG AAC GAC ATC GCG ATC ACC ATG GGA TTT AGT 315 GAG CGC GGT CAT GGT TCG CTG TAC ATG GGC CAG GCG GTC ATC GAG 360 CGT GAC GGG GTC GTC GTA CGC ACA CGC CGC AAA CTG AAG CCG ACC 405 CAC GTC GAG CGG ACC CTG TTC GGT GAG GGT GAT GGT TCC GAT CTG 450 GTC GTG GAC CAG ACC AGT CTC GGC CGA GTC GGG TCG CTG TGC TGT 495 TGG GAA CAT CTG CAG CCG TTG ACC AAG TAC GCC ATG TAC TCG CAG 540 CAC GAG CAG ATT CAC ATC GCC GCA TGG CCC AGC TTC TCG ATC TTC 585 CCG GGC GCG GTG TAT GCG CTC GGG CCC GAG GTC AAC ACC GCG GCC 630 TCT CAG CAA TAC GCC GTA GAA GGG CAG ACC TAC GTT CTC GCT CCA 675 TGC GCG GTC ATC GGC GAT GCA GGT TGG GAG GCG TTT GCC GAT ACC 720 GAG GAG AAG CGA CAG CTC ATC CAC AAA GGA GGC GGA TAT GCC CGT 765 ATC TAC GGT CCC GAC GGT CGT TCA CTC GCG GAA CCG CTC GCG CCC 810 AAT GAC GAG GGA ATC CTG TAC GCG GAC ATC GAT CTG TCT GCG ATT 855 CTG GCC GCA AAG AAC CCG GCG GAC CCG GTT GGG CAC TAC TCG CGT 900 CCG GAC GTA CTG CGT CTC GGA TTC AAC AAA GCG CCT CAG CCG AAG 945 GTC AAC ATC TTG GGA ACG GAG CCG TCT CGG ACG ACG TCG ACG CAG 990 TGC CGA CCG ACG ACG ATT CGG AGG TCA TGG CGG TTT CCT GAG TGA 1035
【００２６】配列番号：３ 配列の長さ：１２００ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ゴルドナ テラエ（Gordona terrae） 株名：MA-1 配列： GTTCAAAAAT AGTCGATCGA TCGTGCTGGC AATGCTACGG ACGTCGGCTG 50 TGACGCACCT AACGTTGCTG CCACCAACAA AGAATGGAGT CTCGATGACC 100 ACCGACTATT CCGGCACGTT CAAGGCAGCG GTGACCCAGG CCGAACCGGT 150 GTGGTTCGAC CTCTCGGCCA CCGTCGACAA GACCATTGCG CTCGTCGAAG 200 AGGCGTCCCG GGCCGGCGCC GATCTGATCG CGTTCCCGGA GACCTGGATA 250 CCGGGGTACC CGTGGTTCCT GTGGCTTGAC TCGGTGGCCT GGCAGAGCCA 300 GTACTTCATC CGGTATCCGC AGAACTCGCT CGATCTCGAC GGCAGCGAGT 350 TCGCGGCGAT CAGGGAAGCC GCACGAAAGA ACGACATCGC GATCACCATG 400 GGATTTAGTG AGCGCGGTCA TGGTTCGCTG TACATGGGCC AGGCGGTCAT 450 CGAGCGTGAC GGGGTCGTCG TACGCACACG CCGCAAACTG AAGCCGACCC 500 ACGTCGAGCG GACCCTGTTC GGTGAGGGTG ATGGTTCCGA TCTGGTCGTG 550 GACCAGACCA GTCTCGGCCG AGTCGGGTCG CTGTGCTGTT GGGAACATCT 600 GCAGCCGTTG ACCAAGTACG CCATGTACTC GCAGCACGAG CAGATTCACA 650 TCGCCGCATG GCCCAGCTTC TCGATCTTCC CGGGCGCGGT GTATGCGCTC 700 GGGCCCGAGG TCAACACCGC GGCCTCTCAG CAATACGCCG TAGAAGGGCA 750 GACCTACGTT CTCGCTCCAT GCGCGGTCAT CGGCGATGCA GGTTGGGAGG 800 CGTTTGCCGA TACCGAGGAG AAGCGACAGC TCATCCACAA AGGAGGCGGA 850 TATGCCCGTA TCTACGGTCC CGACGGTCGT TCACTCGCGG AACCGCTCGC 900 GCCCAATGAC GAGGGAATCC TGTACGCGGA CATCGATCTG TCTGCGATTC 950 TGGCCGCAAA GAACCCGGCG GACCCGGTTG GGCACTACTC GCGTCCGGAC 1000 GTACTGCGTC TCGGATTCAA CAAAGCGCCT CAGCCGAAGG TCAACATCTT 1050 GGGAACGGAG CCGTCTCGGA CGACGTCGAC GCAGTGCCGA CCGACGACGA 1100 TTCGGAGGTC ATGGCGGTTT CCTGAGTGAC AAGGTGCTGG CGACCGCCGC 1150 CGGAATGGCG GAAAATCATC AGTAATGGGC GATTGCGCCA CTCGTGCGCC 1200
【００２７】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列： CGBCGBAARCTSAARCCNAC （上記式中 BはG,C または T、 RはG または A、S はG
または C、 NはG,C,A または Tを表す）
または C、 NはG,C,A または Tを表す）
【００２８】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列： GARTARTGRCCSACVGGRTC （上記式中 RはG または A、 SはG または C、 VはG,C
または Aを表す）
または Aを表す）
【００２９】
【図１】pMA001の制限酵素地図 太い線はベクターpUC118を示し、細い線は MA-1 株ＤＮ
Ａ領域を示す。MA-1株ＤＮＡ領域内における矢印は、本
発明において見い出されたニトリラーゼ遺伝子の位置と
方向を示す。
Ａ領域を示す。MA-1株ＤＮＡ領域内における矢印は、本
発明において見い出されたニトリラーゼ遺伝子の位置と
方向を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】 ニトリラーゼ活性を有し、配列番号１で
表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子ＤＮＡ、および遺伝子コードの同義性に由来す
るこの類似体。 - 【請求項２】 ポリペプチドをコードする遺伝子が配列
番号２で表される塩基配列を有する請求項１記載の遺伝
子ＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号２で表される塩基配列またはそ
のフラグメントとハイブリダイズし、且つ、ニトリラー
ゼ活性を示すポリペプチドをコードする遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号４および５で表される合成ＤＮ
Ａで増幅されることを特徴とするサイズが４５０〜５５
０ｋｂのＤＮＡ断片。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7213061A JPH0937788A (ja) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 新規なニトリラーゼ遺伝子 |
| US08/690,493 US5872000A (en) | 1995-07-31 | 1996-07-31 | Nitrilase gene |
| DE69619948T DE69619948T2 (de) | 1995-07-31 | 1996-07-31 | Neues Nitrilase-Gen |
| EP96305632A EP0780471B1 (en) | 1995-07-31 | 1996-07-31 | Novel nitrilase gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7213061A JPH0937788A (ja) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 新規なニトリラーゼ遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0937788A true JPH0937788A (ja) | 1997-02-10 |
Family
ID=16632889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7213061A Pending JPH0937788A (ja) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 新規なニトリラーゼ遺伝子 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5872000A (ja) |
| EP (1) | EP0780471B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0937788A (ja) |
| DE (1) | DE69619948T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4758580B2 (ja) * | 1999-11-08 | 2011-08-31 | アジツソ・フランス・エス・アー・エス | ニトリラーゼの選択性を調整する方法、前記方法によって得られるニトリラーゼおよびその用途 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003000840A2 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-03 | Diversa Corporation | Nitrilases |
| US7300775B2 (en) | 1999-12-29 | 2007-11-27 | Verenium Corporation | Methods for producing α-substituted carboxylic acids using nitrilases and strecker reagents |
| US7521216B2 (en) * | 1999-12-29 | 2009-04-21 | Verenium Corporation | Nitrilases and methods for making and using them |
| US7608445B1 (en) | 1999-12-29 | 2009-10-27 | Verenium Corporation | Nitrilases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US20040002147A1 (en) * | 1999-12-29 | 2004-01-01 | Desantis Grace | Nitrilases |
| US20040014195A1 (en) * | 1999-12-29 | 2004-01-22 | Diversa Corporation | Nitrilases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US6704730B2 (en) * | 2000-02-18 | 2004-03-09 | Avamar Technologies, Inc. | Hash file system and method for use in a commonality factoring system |
| WO2003106415A2 (en) | 2002-06-13 | 2003-12-24 | Diversa Corporation | Processes for making (r)-ethyl 4-cyano-3-hydroxybutyric acid |
| AT412157B (de) * | 2002-07-15 | 2004-10-25 | Dsm Fine Chem Austria Gmbh | Screeningmethode zum nachweis von amidase- und nitrilhydrataseaktivitäten und deren verwendung |
| JP4584242B2 (ja) | 2003-02-27 | 2010-11-17 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 改変されたニトリラーゼおよびカルボン酸の製造方法におけるその使用 |
| US7143305B2 (en) * | 2003-06-25 | 2006-11-28 | International Business Machines Corporation | Using redundant spares to reduce storage device array rebuild time |
| US9217164B2 (en) | 2007-03-01 | 2015-12-22 | Basf Enzymes Llc | Nitrilases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
-
1995
- 1995-07-31 JP JP7213061A patent/JPH0937788A/ja active Pending
-
1996
- 1996-07-31 US US08/690,493 patent/US5872000A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-31 EP EP96305632A patent/EP0780471B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-31 DE DE69619948T patent/DE69619948T2/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4758580B2 (ja) * | 1999-11-08 | 2011-08-31 | アジツソ・フランス・エス・アー・エス | ニトリラーゼの選択性を調整する方法、前記方法によって得られるニトリラーゼおよびその用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0780471A3 (en) | 1997-07-30 |
| EP0780471B1 (en) | 2002-03-20 |
| EP0780471A2 (en) | 1997-06-25 |
| US5872000A (en) | 1999-02-16 |
| DE69619948D1 (de) | 2002-04-25 |
| DE69619948T2 (de) | 2002-07-25 |
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