CN102618563A - 一种真菌腈水解酶及其基因序列 - Google Patents
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Abstract
一种真菌腈水解酶Nit及其基因序列，该真菌腈水解酶Nit基因全长963个核苷酸，编码320个氨基酸；以pET-28a(+)为表达质粒，以大肠杆菌E.coliRosetta-gami(DE3)为表达宿主，实现了真菌腈水解酶基因的高效表达，重组菌株大肠杆菌E.coliRosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit具有腈水解酶活性，能有效地将底物3-氰基吡啶转化为烟酸。该真菌腈水解酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH为7.8，重组酶发酵周期短，催化效率高，适合于工业生产烟酸的需要。
Description
技术领域
一种真菌腈水解酶及其基因序列，本发明涉及源自赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1的一种真菌腈水解酶及其编码的基因序列，属于酶基因工程及酶工程领域。
背景技术
腈水解酶是属于腈代谢酶系中的一种，可以将3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、丙烯腈等腈类化合物水解转化为烟酸、异烟酸、丙烯酸等有机酸；同时该酶可以用于处理毒性很强且难于降解的腈污染有毒废水。腈水解酶作用底物的广泛性使其在食品、制药、饲料、环保等领域具有良好的应用前景，利用腈水解酶降解腈类化合物制备有机酸将成为化工生产中的一道重要工艺。
烟酸是一种重要的医药中间体及饲料添加剂，也称维生素B3或维生素PP，是人体必需的13种维生素之一。烟酸作为维生素类药物，可用于防治糙皮病，亦可用作血扩张药；在饲料工业中，能大量用做食品饲料的添加剂，可提高禽畜的抗病能力，加快生长速度，提高饲料的利用率；作为医药中间体，用于异烟肼、尼可刹米及烟酸肌醇酯等的生产。烟酸的生产可采用化学合成法和生物催化法，目前在工业上，仍主要采用化学法来进行烟酸的生产，如氨氧化法、气相氧化法、电解氧化法和吡啶羟基化法等，所采用原料一般为3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、3-氰基吡啶以及哇琳等。如俄罗斯科学院专利CN95191372.7公开了以3-甲基吡啶为原料，在钒、钛氧化物催化剂存在下，按氧：3-甲基吡啶摩尔比15~40，水：3-甲基吡啶摩尔比10~70条件进行一步气相非均相催化氧化反应，烟酸收率为82~86%，但该法反应温度250-290℃，对设备要求较高，能耗较大，而且收率偏低。昆明理工大学专利CN200810058492.4公开了以吡啶为溶剂，二氧化硒为氧化剂，3-甲基吡啶为原料合成烟酸的方法，反应温度为100~150
℃，反应选择性在98.5%以上，但产品收率仅40~50%。从这些情况可以看出，化学合成法产率较低，产品副产物较多，需采用价格昂贵的催化剂，可再生性差，产品的后续分离纯化困难，而且能耗偏高，污染较严重。因此，化学法应用于烟酸制备仍存在诸多不足之处。
相比而言，生物催化法反应条件温和，环境友好，催化剂易于制备，催化效率较高，选择性强且成本较低，适合于工业化生产，为烟酸的大规模制备提供了一条行之有效的途径。
国外自上世纪80年代以来，采用微生物腈水解酶生物转化腈类化合物制备有机酸开始备受关注，研究者从自然界筛选产腈水解酶的微生物（以细菌为主），采用全细胞作为催化剂进行生物催化反应制备有机酸。为了进一步提高催化剂的稳定性及催化效率，同时为深入了解腈水解酶的分子机理，对野生菌腈水解酶进行了分离纯化及生理生化性质研究，鉴定了酶的编码基因并进行克隆表达，对腈水解酶的晶体结构进行了解析。但是研究工作主要集中在细菌腈水解酶，对于真菌腈水解酶的研究则鲜有报道，仅有捷克科学院微生物所（Journal
of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2009, 59: 243–247；BMC Biotechnology 2011, 11: 2）近年来开始开展了较为细致的研究工作，包括黑曲霉Aspergillus niger和镰刀菌Fusarium solani中真菌腈水解酶的生物转化，酶的分离纯化及黑曲霉A.
niger腈水解酶基因的克隆表达等。
国内对腈水解酶的研究较少，只有少数几所高校，包括华东理工大学、浙江工业大学开展了细菌腈水解酶的野生菌筛选，产酶发酵条件优化和酶基因的克隆表达等工作，尚无工业化生产的实例。
综合目前国内外的腈水解酶研究工作可以发现，细菌腈水解酶的研究仍占主流，真菌腈水解酶作为一种新型的生物催化剂还有待进一步开发。其主要原因是：国内外侧重于开发各方面性质研究已较为深入的细菌腈水解酶，对真菌腈水解酶的研究还未引起足够重视；真菌中腈水解酶的编码基因还没有被大量阐明，无法通过基因重组技术等手段获得大规模酶制品作为研究材料。从已有文献资料来看，真菌腈水解酶具有比细菌腈水解酶催化效率高，选择性强等技术优势，研究真菌腈水解酶具有非常重要的理论价值和实践意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种真菌腈水解酶Nit的氨基酸序列及其编码该蛋白质的基因序列，提供包含本发明基因的质粒及包含本表达质粒的宿主细胞，以及利用该宿主细胞（重组菌）生产真菌腈水解酶Nit的方法。
本发明的技术方案是：
所述的真菌腈水解酶基因的表达方法：由赤霉菌(Gibberella
intermedia)CA3-1（该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC
No. 4903）总RNA通过反转录PCR获得其cDNA序列，以cDNA序列为模板扩增目的编码基因SEQ ID NO: 1，真菌腈水解酶基因以pET-28a(+)为质粒构建重组表达质粒pET28a(+)-Nit，以大肠杆菌E.
coli Rosetta-gami(DE3)为表达宿主，实现赤霉菌(Gibberella
intermedia)CA3-1腈水解酶的高效表达。
（1）赤霉菌(Gibberella
intermedia) CA3-1总RNA的提取
赤霉菌（Gibberella intermedia） CA3-1菌株在产酶培养基（葡萄糖 10 g/L, 酵母膏 7.5 g/L, NaCl 1.16 g/L, KH2PO4
2.72 g/L, FeSO4 0.03 g/L, 己内酰胺 3.39
g/L）中培养2天，培养温度30℃。经真空抽滤收集菌体用无菌水洗涤2-3次，将湿菌体置于玻璃匀浆器中，加入1 mL
Trizol试剂，低温匀浆2 min；匀浆液转移至1.5
mL离心管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡30 s，室温放置 3 min，12,000 rpm 4 ℃离心10 min；吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍无水乙醇 (v/v)，混匀；用移液器将混合液转至吸附柱中，室温下静置 2
min，12,000 rpm 离心 3 min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入 500
µL RPE溶液，静置 2 min，于10,000
rpm 离心 30 s，倒掉收集管中废液；重复该步骤一次；将吸附柱放回收集管中，10,000
rpm 离心 2 min；将吸附柱置于干净的 1.5
mL 离心管中，在吸附膜中央加入 30-50 µL DEPC处理水，静置 5 min，12,000 rpm 离心 2 min，将所得到的RNA 溶液用于后续试验。
（2）反转录反应获得cDNA序列
以总RNA为模板，使用AMV反转录酶进行反转录反应合成cDNA第一条链。反转录反应按如下条件进行：42~60
℃保温15~30 min，99 ℃下5 min灭活AMV反转录酶，然后于5 ℃保存5 min。
在反转录管中加入Ex Taq® HS酶及相关试剂合成cDNA第二条链，并进一步PCR扩增cDNA序列，以核苷酸序列am（ATGTCCAAGWCYCTCAARGT）作为上游引物，M13
Primer M4通用引物为下游序列。PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为在94℃预变性2 min后开始循环；94 ℃变性30 s，53℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。
（3）真菌腈水解酶编码基因的克隆
以赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1的cDNA序列为模板，以下核苷酸序列作为引物，PCR扩增真菌腈水解酶的编码基因。
引物P1： 5’-CCGGAATTCATGTCCAAGACTCTCAAAGTCG-3’。
引物P2： 5’-CCCAAGCTTTCACAGGTCGTTGGCAAAG-3’。
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为在94℃预变性2 min后开始循环；94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，与pMD-19 T载体连接后转化大肠杆菌E.
coli JM109，在含氨苄抗性（100 mg/L）的LB平板上筛选阳性转化子。挑取阳性转化子接入LB液体培养基，37℃培养12~16 h，提取质粒，该质粒命名为pMD19T-Nit，对该质粒进行序列测定。
（4）重组质粒的构建
本研究所采用的表达质粒是pET-28a(+)，带有T7启动子和His-tag标记，将质粒pET-28a(+)和真菌腈水解酶基因分别进行双酶切后割胶回收，用T4连接酶在16 ℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.
coli JM109感受态细胞，在含卡那霉素抗性（10 mg/L）的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子，进行富集培养后提取质粒，命名为pET28a(+)-Nit。
（5）重组菌的筛选
将重组质粒pET28a(+)-Nit在42 ℃热击90 s转化宿主菌大肠杆菌E. coli Rosetta-gami(DE3)感受态细胞，在含卡那霉素（10 mg/L）和氯霉素（35
mg/L）抗性的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子E.
coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit，接入LB液体培养基中37 ℃培养过夜，转接至新鲜的LB培养基中37 ℃培养至OD600达0.6-0.8，添加终浓度0.5 mM的IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）在25 ℃下进行产酶诱导4~24 h，重组菌株表现出腈水解酶活性。
（6）重组真菌腈水解酶Nit的分离纯化与酶学特征
将上述获得的重组真菌腈水解酶Nit的发酵液于4 ℃，8000 rpm离心10 min，去除上清。离心收集的细胞悬浮于缓冲液A（50 mM磷酸钠、500 mM氯化钠，pH7.4）中，制备成菌悬液。菌悬液在冰浴中用超声破碎仪破碎，200 W功率下工作300次，每个循环工作3 s停7 s。样品在稀释一定倍数后用结晶紫进行染色，在显微镜进行观察，直到显示完全裂解为止。细胞裂解液4 ℃下14,000 rpm离心30
min，所得上清液即为无细胞抽提液。取无细胞抽提液用0.22 μm滤膜过滤制备成上样样品，将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用缓冲液A冲洗至平衡，冲柱流速2 mL/min，而后对样品进行上柱，上柱流速1 mL/min，待完全吸附后，分别用含缓冲液A~含400 mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，洗脱流速2 mL/min，洗脱过程实时监控，检测波长为280 nm，分别收集各阶段洗脱峰，通过SDS-PAGE分析纯化后的真菌腈水解酶的分子量大小和纯度。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种真菌腈水解酶基因Nit及其高效表达方法。本发明所涉及的真菌腈水解酶Nit的编码基因为目前国内真菌腈水解酶基因的首例报道。提取赤霉菌(Gibberella intermedia)
CA3-1菌株的总RNA，通过反转录反应获得其cDNA序列，设计引物PCR扩增cDNA编码基因，它具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，全长963个核苷酸，编码320个氨基酸。以pET-28a(+)为表达质粒，以大肠杆菌E. coli Rosetta-gami(DE3)为表达宿主，实现了赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1腈水解酶基因的高效表达，重组菌株E. coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit表现出腈水解酶活性，能有效地将底物3-氰基吡啶转化为烟酸。该真菌腈水解酶Nit的最适反应温度为45 ℃，最适反应pH为7.8，此外，重组酶发酵周期短，催化效率高，适合于工业生产烟酸的需要。
附图说明
图1是重组真菌腈水解酶Nit分离纯化过程的SDS-PAGE图谱
M：标准蛋白分子量；泳道1为无细胞抽提液；泳道2为纯化后的真菌腈水解酶。
图2为真菌腈水解酶Nit的最适反应温度（以3-氰基吡啶为底物反应）。
图3为真菌腈水解酶Nit的最适反应pH（以3-氰基吡啶为底物反应）
pH4-5.8为柠檬酸钠缓冲液，pH5.8-8.5为磷酸钠缓冲液，pH8.5-10为甘氨酸- NaOH缓冲液。
图4为金属离子对真菌腈水解酶转化反应的影响（以3-氰基吡啶为底物反应）。
具体实施方式
实施例1
本实施例说明赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1总RNA的提取。
赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1菌株在产酶培养基（葡萄糖 10 g/L, 酵母膏 7.5
g/L, NaCl 1.16 g/L, KH2PO4 2.72 g/L, FeSO4
0.03 g/L, 己内酰胺 3.39 g/L）中培养2天，培养温度30℃。经真空抽滤收集菌体用无菌水洗涤2-3次，将湿菌体置于玻璃匀浆器中，加入1 mL Trizol试剂，低温匀浆2 min；匀浆液转移至1.5 mL离心管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡30 s，室温放置 3 min，12,000 rpm 4 ℃离心10 min；吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍无水乙醇 (v/v)，混匀；用移液器将混合液转至吸附柱中，室温下静置 2
min，12,000 rpm 离心 3 min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入 500
µL RPE溶液，静置 2 min，于10,000
rpm 离心 30 s，倒掉收集管中废液；重复该步骤一次；将吸附柱放回收集管中，10,000
rpm 离心 2 min；将吸附柱置于干净的 1.5
mL 离心管中，在吸附膜中央加入 30-50 µL DEPC处理水，静置 5 min，12,000 rpm 离心 2 min，将所得到的RNA 溶液用于后续试验。
实施例2
本实施例说明反转录反应获得cDNA序列的流程。
以总RNA为模板，使用AMV反转录酶进行反转录反应合成cDNA第一条链。反转录反应按如下条件进行：42~60
℃保温15~30 min，99 ℃下5 min灭活AMV反转录酶，然后于5 ℃保存5 min。
在反转录管中加入Ex Taq® HS酶及相关试剂合成cDNA第二条链，并进一步PCR扩增cDNA序列，以核苷酸序列am（ATGTCCAAGWCYCTCAARGT）作为上游引物，M13
Primer M4通用引物为下游序列。PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为在94℃预变性2 min后开始循环；94 ℃变性30 s，53℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。
实施例3
本实施例说明真菌腈水解酶编码基因的克隆方法。
以赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1的cDNA序列为模板，以下核苷酸序列作为引物，PCR扩增真菌腈水解酶的编码基因。
引物P1： 5’-CCGGAATTCATGTCCAAGACTCTCAAAGTCG-3’
引物P2： 5’-CCCAAGCTTTCACAGGTCGTTGGCAAAG-3’
PCR反应在50 μL体系中进行，反应条件为在94℃预变性2 min后开始循环；94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，与pMD-19 T载体连接后转化大肠杆菌E.
coli JM109，在含氨苄抗性（100 mg/L）的LB平板上筛选阳性转化子。挑取阳性转化子接入LB液体培养基，37℃培养12~16 h，提取质粒，该质粒命名为pMD19T-Nit，对该质粒进行序列测定。
实施例4
本实施例说明重组质粒的构建程序。
本研究所采用的表达质粒是pET-28a(+)，带有T7启动子和His-tag标记，将质粒pET-28a(+)和真菌腈水解酶基因分别进行双酶切后割胶回收，用T4连接酶在16 ℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E. coli JM109感受态细胞，在含卡那霉素抗性（10 mg/L）的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子，进行富集培养后提取质粒，命名为pET28a(+)-Nit。
实施例5
本实施例说明转化大肠杆菌宿主细胞及重组菌的筛选方法。
将重组质粒pET28a(+)-Nit在42 ℃热击90 s转化宿主菌大肠杆菌E. coli Rosetta-gami(DE3)感受态细胞，在含卡那霉素（10 mg/L）和氯霉素（35
mg/L）抗性的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子E.
coli Rosetta-gami(DE3)/pET28a(+)-Nit，接入LB液体培养基中37 ℃培养过夜，转接至新鲜的LB培养基中37 ℃培养至OD600达0.6-0.8，添加终浓度0.5 µM的IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）在25 ℃下进行产酶诱导20 h，重组菌株表现出腈水解酶活性。
实施例6
本实施例说明重组真菌腈水解酶Nit的分离纯化与酶学特征。
将重组真菌腈水解酶Nit的发酵液于4 ℃，8000 rpm离心10 min，去除上清。离心收集的细胞悬浮于缓冲液A（50 mM磷酸钠、500 mM氯化钠，pH7.4）中，制备成菌悬液。菌悬液在冰浴中用超声破碎仪破碎，200 W功率下工作300次，每个循环工作3 s停7 s。样品在稀释一定倍数后用结晶紫进行染色，在显微镜进行观察，直到显示完全裂解为止。细胞裂解液4 ℃下14,000 rpm离心30
min，所得上清液即为无细胞抽提液。取无细胞抽提液用0.22 μm滤膜过滤制备成上样样品，将Ni-NTA琼脂糖凝胶柱用缓冲液A冲洗至平衡，冲柱流速2 mL/min，而后对样品进行上柱，上柱流速1 mL/min，待完全吸附后，分别用含缓冲液A~含400 mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，洗脱流速2 mL/min，洗脱过程实时监控，检测波长为280 nm，分别收集各阶段洗脱峰，通过SDS-PAGE分析纯化后的真菌腈水解酶的分子量大小和纯度。结果表明纯化后的真菌腈水解酶达到电泳纯，表观分子量大小为36000道尔顿。纯化过程电泳图见图1。
将重组酶进行3-氰基吡啶的生物转化实验，发现重组酶可有效转化3-氰基吡啶为烟酸，结果表明真菌腈水解酶已实现高效表达。
以3-氰基吡啶为底物时，真菌腈水解酶Nit的最适反应温度为45 ℃（图2），最适反应pH为7.8（图3），金属离子Fe3+，Mg2+，Mn2+对酶活有一定的促进作用，Ag+则能完全抑制该真菌腈水解酶活性（图4）。
序列表
SEQ ID NO: 1
SEQ : 963 bp;
Composition 233 A; 272 C;
239 G; 219 T; 0 OTHER
Percentage:
24.2% A;
28.2% C; 24.8% G; 22.7%
T; 0.0%OTHER
Molecular Weight (kDa): ssDNA: 296.74
dsDNA: 593.72
ORIGIN
1
ATGTCCAAGA CTCTCAAAGT CGCTGCCATC CAAGCCGAAC CCGTCTGGAA CGATCTCCAG
61
GGCGGTGTCA ACAAGTCCAT CGGTCTCATC CAAGAGGCAG CAAAGAACGG TGCCAACGTA
121
ATCGGCTTCC CTGAAGTCTT CATTCCTGGA TATCCATGGA GCATCTGGGC CAACTCGCCT
181
ACCGAGAACG CACCATGGGT CAATGAGTAC TTCAAGAACT CATTGGAGAG AGAGTCACCT
241
GAGATGGACC AGATCCGAGC TGCTGTTCGA GAGGCAGGCG TCTTTGTAGT CCTTGGATAT
301
AGTGAGAGAT ACAGGGGAAC TCTTTACATC GCACAGTCCT TCATCGATGA GACCGGCACT
361
ATTGTTCTCC ACCGCCGCAA GATCAAGCCC ACCCATGTTG AGCGTGCTAT CTACGGTGAC
421
GGACAGGGCG AGTCTCTGAC CAATGTCGCC GACACGAAAT TTGGCAGGGT TGCTGGTCTT
481
AACTGCTGGG AGCACACCCA GACACTTCTC CGCTACTATG AATACTCCCA GGATGTCGAT
541
ATCCACGTCT CCAGCTGGCC TTCCATCTTC CCCCAGAACG TCCCTGAGTG GCCATACCAT
601
ATCACTCCCG AATGCTGCAA GGCCTTTTCT CACGTCGTCT CCATGGAGGG AGCCTGCTTC
661
GTTCTTCTGG CAAGTCAGAT CATGACTGAG GAGAACCATA AGAAGGCGAA CGTTGAAGGC
721
TACGACTATA CTAAGAAGTC TGGTGGCGGC TTCAGTATGA TCTTCTCGCC TTTCGGAGAG
781
GAGCTTGTCA AGCCCCTTGC TCCTAACGAG GAGGGTATTC TTTACGCTGA TATCAACCTT
841
GAGGAGAAGT ACAAGGCGAA GCAGAACTTG GACATTGTCG GCCACTACTC GCGACCCGAC
901
CAGCTGAGCC TTCGCGTCAA CAAACATGCT GCCAAGCCTG TCTTCTTTGC CAACGACCTG
961
TGA
SEQ ID NO: 2
Universal code
Total amino acid number: 320, MW=35940
Max ORF starts at AA pos 1(may be DNA pos
1) for 320 AA(960 bases), MW=35940
1
METSerLysThrLeuLysValAlaAlaIleGlnAlaGluProValTrpAsnAspLeuGln
21
GlyGlyValAsnLysSerIleGlyLeuIleGlnGluAlaAlaLysAsnGlyAlaAsnVal
41
IleGlyPheProGluValPheIleProGlyTyrProTrpSerIleTrpAlaAsnSerPro
61
ThrGluAsnAlaProTrpValAsnGluTyrPheLysAsnSerLeuGluArgGluSerPro
81
GluMETAspGlnIleArgAlaAlaValArgGluAlaGlyValPheValValLeuGlyTyr
101
SerGluArgTyrArgGlyThrLeuTyrIleAlaGlnSerPheIleAspGluThrGlyThr
121
IleValLeuHisArgArgLysIleLysProThrHisValGluArgAlaIleTyrGlyAsp
141
GlyGlnGlyGluSerLeuThrAsnValAlaAspThrLysPheGlyArgValAlaGlyLeu
161
AsnCysTrpGluHisThrGlnThrLeuLeuArgTyrTyrGluTyrSerGlnAspValAsp
181
IleHisValSerSerTrpProSerIlePheProGlnAsnValProGluTrpProTyrHis
201
IleThrProGluCysCysLysAlaPheSerHisValValSerMETGluGlyAlaCysPhe
221
ValLeuLeuAlaSerGlnIleMETThrGluGluAsnHisLysLysAlaAsnValGluGly
241
TyrAspTyrThrLysLysSerGlyGlyGlyPheSerMETIlePheSerProPheGlyGlu
261
GluLeuValLysProLeuAlaProAsnGluGluGlyIleLeuTyrAlaAspIleAsnLeu
281
GluGluLysTyrLysAlaLysGlnAsnLeuAspIleValGlyHisTyrSerArgProAsp
301
GlnLeuSerLeuArgValAsnLysHisAlaAlaLysProValPhePheAlaAsnAspLeu
Claims (5)
1.一种编码真菌腈水解酶Nit的基因，其特征为核苷酸序列如下所示：
1 ATGTCCAAGA CTCTCAAAGT
CGCTGCCATC CAAGCCGAAC CCGTCTGGAA CGATCTCCAG
61 GGCGGTGTCA ACAAGTCCAT
CGGTCTCATC CAAGAGGCAG CAAAGAACGG TGCCAACGTA
121 ATCGGCTTCC CTGAAGTCTT CATTCCTGGA
TATCCATGGA GCATCTGGGC CAACTCGCCT
181 ACCGAGAACG CACCATGGGT
CAATGAGTAC TTCAAGAACT CATTGGAGAG AGAGTCACCT
241 GAGATGGACC AGATCCGAGC
TGCTGTTCGA GAGGCAGGCG TCTTTGTAGT CCTTGGATAT
301 AGTGAGAGAT ACAGGGGAAC
TCTTTACATC GCACAGTCCT TCATCGATGA GACCGGCACT
361 ATTGTTCTCC ACCGCCGCAA
GATCAAGCCC ACCCATGTTG AGCGTGCTAT CTACGGTGAC
421 GGACAGGGCG AGTCTCTGAC
CAATGTCGCC GACACGAAAT TTGGCAGGGT TGCTGGTCTT
481 AACTGCTGGG AGCACACCCA
GACACTTCTC CGCTACTATG AATACTCCCA GGATGTCGAT
541 ATCCACGTCT CCAGCTGGCC
TTCCATCTTC CCCCAGAACG TCCCTGAGTG GCCATACCAT
601 ATCACTCCCG AATGCTGCAA
GGCCTTTTCT CACGTCGTCT CCATGGAGGG AGCCTGCTTC
661 GTTCTTCTGG CAAGTCAGAT
CATGACTGAG GAGAACCATA AGAAGGCGAA CGTTGAAGGC
721 TACGACTATA CTAAGAAGTC
TGGTGGCGGC TTCAGTATGA TCTTCTCGCC TTTCGGAGAG
781 GAGCTTGTCA AGCCCCTTGC
TCCTAACGAG GAGGGTATTC TTTACGCTGA TATCAACCTT
841 GAGGAGAAGT ACAAGGCGAA GCAGAACTTG
GACATTGTCG GCCACTACTC GCGACCCGAC
901 CAGCTGAGCC TTCGCGTCAA
CAAACATGCT GCCAAGCCTG TCTTCTTTGC CAACGACCTG
961 TGA。
2.一种真菌腈水解酶Nit，其氨基酸序列如下所示：
1
METSerLysThrLeuLysValAlaAlaIleGlnAlaGluProValTrpAsnAspLeuGln
21
GlyGlyValAsnLysSerIleGlyLeuIleGlnGluAlaAlaLysAsnGlyAlaAsnVal
41
IleGlyPheProGluValPheIleProGlyTyrProTrpSerIleTrpAlaAsnSerPro
61
ThrGluAsnAlaProTrpValAsnGluTyrPheLysAsnSerLeuGluArgGluSerPro
81
GluMETAspGlnIleArgAlaAlaValArgGluAlaGlyValPheValValLeuGlyTyr
101
SerGluArgTyrArgGlyThrLeuTyrIleAlaGlnSerPheIleAspGluThrGlyThr
121
IleValLeuHisArgArgLysIleLysProThrHisValGluArgAlaIleTyrGlyAsp
141
GlyGlnGlyGluSerLeuThrAsnValAlaAspThrLysPheGlyArgValAlaGlyLeu
161
AsnCysTrpGluHisThrGlnThrLeuLeuArgTyrTyrGluTyrSerGlnAspValAsp
181
IleHisValSerSerTrpProSerIlePheProGlnAsnValProGluTrpProTyrHis
201
IleThrProGluCysCysLysAlaPheSerHisValValSerMETGluGlyAlaCysPhe
221 ValLeuLeuAlaSerGlnIleMETThrGluGluAsnHisLysLysAlaAsnValGluGly
241
TyrAspTyrThrLysLysSerGlyGlyGlyPheSerMETIlePheSerProPheGlyGlu
261
GluLeuValLysProLeuAlaProAsnGluGluGlyIleLeuTyrAlaAspIleAsnLeu
281
GluGluLysTyrLysAlaLysGlnAsnLeuAspIleValGlyHisTyrSerArgProAsp
301
GlnLeuSerLeuArgValAsnLysHisAlaAlaLysProValPhePheAlaAsnAspLeu。
3.一种用于编码真菌腈水解酶Nit的表达质粒，其特征在于：含有权利要求1的核苷酸序列，载体为pET28a(+)-Nit。
4.一种用于生产真菌腈水解酶Nit的重组菌株，其特征在于：含有权利要求3中的质粒，将其转入大肠杆菌E. coli Rosetta-gami(DE3)。
5.一种生产真菌腈水解酶并用于转化生产烟酸的方法，其特征在于：将权利要求4所述的重组菌经发酵培养、产酶诱导，编码真菌腈水解酶Nit的基因序列得以表达并在细胞内产生真菌腈水解酶Nit；以3-氰基吡啶为底物时，真菌腈水解酶Nit的最适反应温度为45 ℃，最适反应pH为7.8。
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