CN103667228A - 一种催化活力及热稳定性提高的真菌腈水解酶突变体及其构建方法 - Google Patents
一种催化活力及热稳定性提高的真菌腈水解酶突变体及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种催化活力和热稳定性提高的真菌腈水解酶突变体及其构建方法，该突变体是由赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1真菌腈水解酶基因出发，运用多轮定点饱和突变构建突变体库而筛选获得。本发明采用半理性设计的方法获取真菌腈水解酶突变体，其特征在于对真菌腈水解酶活性中心附近第128位Ile和第161位Asn进行了改造，获得的突变体分别为Ile128Leu、Asn161Gln以及Ile128Leu-Asn161Gln。本发明提供的突变体催化活力和热稳定性均得到了显著提高，改造后的真菌腈水解酶突变体可降低生产成本，提高生产效率，具有更高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种催化活力及热稳定性提高了的真菌腈水解酶突变体及其构建方法。
背景技术
腈水解酶(Nitrilase;
EC 3.5.5.1)是其超级家族中一种重要生物催化剂，可用于水解腈类化合物中的腈基(-CN)，在有机酸的生物合成、腈污染物的生物除污等方面能发挥其催化效力和降解作用，因此常被用于食品添加剂、制药工业、化工生产、环境治理等领域。而真菌腈水解酶在近年来逐渐受到关注并成为了非常重要的生物催化剂之一，在烟酸、异烟酸等重要药物中间体和食品添加剂的制造，溴草腈等污染的农业废水以及丙烯腈等污染的工业废水的生物降解中表现出极大的应用潜力(Martínková, et al. Biotechnol
Adv 2009, 27 (6):661-670; Malandra, et al. Appl Microbiol Biotechnol 2009, 85
(2):277-284; Gong, et al. PLoS ONE 2012, 7 (11):e50622)。但是，在工业生产过程中，酶的催化效率不够高、热稳定性较差等问题，成为制约真菌腈水解酶发展与应用的主要因素。因此，获得一株酶活和稳定性提高的真菌腈水解酶突变株具有重要的工业应用价值。
半理性设计方法应用于腈水解酶的催化特性改造在近年来逐步被发展起来，它基于腈水解酶基因序列分析以及与其他腈水解酶基因比对的基础上，找出潜在的关键氨基酸残基位点，进行定点突变，从而获得阳性的突变株。来自捷克的学者Petříčková等人以链胞霉菌Neurospora crassa腈水解酶为目标构建了活性中心附近168位突变体Trp168Ala，发现突变体对扁桃腈和2-苯基丙腈的酶活发生了较大变化，而且该酶的立体选择性几乎完全逆转 (Petříčková, et al. J Mol Catal B: Enzym 2012, 77:74-80)。这证明了该方法在真菌腈水解酶改造中的有效性。
在早期研究中，有文献报道，在腈水解酶蛋白的结构中，其活性中心携带了一个起关键催化作用的氨基酸残基三联体Glu-Lys-Cys (Pace, et al. Curr Biol, 2000, 10(15):907-917)。在本研究中，我们首先利用已知信息对目前的真菌腈水解酶基因进行生物信息学分析，找出活性中心附近的潜在关键位点，再对这些关键位点进行定点饱和突变，构建突变文库，并选择合适的载体和宿主进行表达，最后从中筛选催化特征改善的突变株。本发明以大肠杆菌作为宿主细胞、利用半理性设计改造的方法，以期筛选获得热稳定性和催化活力得到显著提高的真菌腈水解酶突变体。
发明内容
本发明的目的在于，通过基因工程手段对真菌腈水解酶基因进行饱和突变改造，使改造后的真菌腈水解酶在酶活性和热稳定性方面有所提高，最终能达到工业化生产的要求。
本发明的首要目的是对赤霉菌(Gibberella
intermedia)CA3-1（该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4903）提供一种定点饱和突变改造的真菌腈水解酶突变体，所述的真菌腈水解酶具有更好的催化活力和更优的热稳定性。
本发明提供了一种定点饱和突变改造的真菌腈水解酶突变体，由赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1真菌腈水解酶基因出发，运用多轮定点饱和突变、构建突变体库而筛选获得；所述的真菌腈水解酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 7，该成熟蛋白是由SEQ ID No. 8的核苷酸序列所编码的；所述的真菌腈水解酶突变体的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3，其成熟蛋白是由SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 6的核苷酸序列所编码的。
本发明所述的一种真菌腈水解酶突变体，它是由氨基酸序列为SEQ ID No. 7的来源于赤霉菌的真菌腈水解酶进行定点饱和突变而产生的，其特征在于所述的基因工程腈水解酶氨基酸序列相对于原始的真菌腈水解酶氨基酸序列的第128位异亮氨酸Ile和第161位天冬酰胺Asn发生突变。
本发明还提供了一种DNA分子，其编码如前所述的真菌腈水解酶突变体。
本发明还提供了一种突变质粒，其含有如前所述的DNA分子。
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如前所述的DNA分子，或含有如前所述的突变质粒。
将饱和定点突变获得的真菌腈水解酶突变质粒转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta-gami
(DE3)宿主中，构建饱和突变库，筛选其中的阳性突变株，进行测序验证确认，得到128位和161位的两个酶活和稳定性提高的优秀突变体，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示真菌腈水解酶突变体中突变的氨基酸，所述的真菌腈水解酶突变体为：Ile128Leu和Asn161Gln。
以Ile128Leu突变质粒为模板，以携带Asn161Gln突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行进一步的组合突变，构建组合突变体Ile128Leu-Asn161Gln。
所述催化活力和热稳定性提高的真菌腈水解酶突变体的构建方法，包括如下步骤：
以来自于能够甲基化的大肠杆菌宿主的携带真菌腈水解酶基因的重组质粒为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行反向PCR，扩增突变质粒全长，采用Dpn I限制性内切酶进行酶切消化，取消化的PCR产物热击转化大肠杆菌E. coli DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的固体LB平板培养。挑取单菌落，接入LB液体培养基培养，提取质粒，送至上海生工测序。测序结果正确者转化大肠杆菌E. coli Rosetta-gami (DE3)感受态细胞，在含卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板上培养过夜，筛选阳性转化子。
所述的催化活力和热稳定性提高的真菌腈水解酶突变体可应用于食品添加剂的生产、药物中间体的合成、化工生产和环境治理中。
本发明的优点和有益效果：
通过定点饱和突变，对真菌腈水解酶活性中心附近第128位异亮氨酸Ile和第161位天冬酰胺Asn进行了改造，构建了真菌腈水解酶突变体，大大提高了真菌腈水解酶的催化活力和热稳定性。本发明对催化活力的改善有利于提高催化工艺的生产效率；而热稳定性的提高则能延长酶的使用寿命。本发明所获得催化性能改善的突变体分别为Ile128Leu、Asn161Gln和Ile128Leu-Asn161Gln，更适合于工业生物催化工艺的应用。这三株突变体的酶活和热稳定性均具有不同程度的提高。其中，突变体I128L-N161Q的酶活相比野生型提高约2倍左右，酶的热稳定性可通过半衰期来表示，突变体I128L在30℃的半衰期较野生型提高约2.5倍。改造后的真菌腈水解酶突变体具有较高的应用价值和广阔的市场前景。
附图说明
图1 真菌腈水解酶突变体的酶活力检测。
图2 真菌腈水解酶突变体的热稳定性。
具体实施方式
实施例1
本发明利用已知信息对目前的真菌腈水解酶基因进行生物信息学分析，确立活性中心附近的第128位异亮氨酸Ile和第161位天冬酰胺Asn对于催化特征的重要功能。以携带真菌腈水解酶基因的重组质粒为模板，该模板来自于能够甲基化的大肠杆菌宿主E. coli DH5α，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行饱和突变，采用反向PCR技术，扩增128位和161位的突变质粒。
饱和突变引物序列如下：
NNN代表突变位点，将该位点分别突变为其他19种氨基酸，构建饱和突变库。
反向PCR反应体系为：
PCR程序条件设定为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸8 min，35个循环；72℃终延伸60 min。扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用DNA胶回收试剂盒对目的片段进行割胶回收。
实施例2
割胶回收获得的线性突变质粒采用Dpn I限制性内切酶进行酶切消化，酶切条件：37℃温浴0.5 h。酶切反应体系如下：
消化产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，其余产物用于后续实验。
实施例3
将消化后的线性突变质粒直接42℃热击转化大肠杆菌E. coli DH5α宿主细胞，涂布含卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养10~12 h。挑取单菌落，接入LB液体培养基培养，提取质粒，进行酶切及PCR验证。选择阳性克隆质粒送至上海生工测序。测序结果正确者转化大肠杆菌E. coli Rosetta-gami
(DE3)表达宿主，在含卡那霉素和氯霉素抗性的LB平板上37℃培养过夜，筛选阳性转化子，即为真菌腈水解酶突变体。采用0.5 mM的IPTG进行产酶诱导培养，离心收集细胞制成菌悬液，检测突变体的酶活性，如图1所示。将突变体游离细胞在水浴中进行温浴，不同时间取样检测残留酶活，计算突变体的半衰期。突变体在30℃的半衰期如图2所示。
进行测序验证确认，得到128位和161位的两个酶活和稳定性提高的优秀突变体，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示真菌腈水解酶突变体中突变的氨基酸，所得真菌腈水解酶突变体为Ile128Leu和Asn161Gln。
实施例4
以Ile128Leu突变质粒为模板，以携带Asn161Gln突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行进一步的组合突变，构建组合突变体Ile128Leu-Asn161Gln。真菌腈水解酶组合突变体的催化活力和半衰期如图1和图2所示。
SEQ ID No. 1
真菌腈水解酶突变体Ile128Leu的氨基酸序列
1
METSerLysThrLeuLysValAlaAlaIleGlnAlaGluProValTrpAsnAspLeuGln
21
GlyGlyValAsnLysSerIleGlyLeuIleGlnGluAlaAlaLysAsnGlyAlaAsnVal
41
IleGlyPheProGluValPheIleProGlyTyrProTrpSerIleTrpAlaAsnSerPro
61 ThrGluAsnAlaProTrpValAsnGluTyrPheLysAsnSerLeuGluArgGluSerPro
81
GluMETAspGlnIleArgAlaAlaValArgGluAlaGlyValPheValValLeuGlyTyr
101
SerGluArgTyrArgGlyThrLeuTyrIleAlaGlnSerPheIleAspGluThrGlyThr
121 IleValLeuHisArgArgLysLeuLysProThrHisValGluArgAlaIleTyrGlyAsp
141
GlyGlnGlyGluSerLeuThrAsnValAlaAspThrLysPheGlyArgValAlaGlyLeu
161
AsnCysTrpGluHisThrGlnThrLeuLeuArgTyrTyrGluTyrSerGlnAspValAsp
181
IleHisValSerSerTrpProSerIlePheProGlnAsnValProGluTrpProTyrHis
201 IleThrProGluCysCysLysAlaPheSerHisValValSerMETGluGlyAlaCysPhe
221
ValLeuLeuAlaSerGlnIleMETThrGluGluAsnHisLysLysAlaAsnValGluGly
241
TyrAspTyrThrLysLysSerGlyGlyGlyPheSerMETIlePheSerProPheGlyGlu
261
GluLeuValLysProLeuAlaProAsnGluGluGlyIleLeuTyrAlaAspIleAsnLeu
281
GluGluLysTyrLysAlaLysGlnAsnLeuAspIleValGlyHisTyrSerArgProAsp
301
GlnLeuSerLeuArgValAsnLysHisAlaAlaLysProValPhePheAlaAsnAspLeu
321 ***
SEQ ID No. 2
真菌腈水解酶突变体Asn161Gln的氨基酸序列
1
METSerLysThrLeuLysValAlaAlaIleGlnAlaGluProValTrpAsnAspLeuGln
21
GlyGlyValAsnLysSerIleGlyLeuIleGlnGluAlaAlaLysAsnGlyAlaAsnVal
41
IleGlyPheProGluValPheIleProGlyTyrProTrpSerIleTrpAlaAsnSerPro
61 ThrGluAsnAlaProTrpValAsnGluTyrPheLysAsnSerLeuGluArgGluSerPro
81
GluMETAspGlnIleArgAlaAlaValArgGluAlaGlyValPheValValLeuGlyTyr
101
SerGluArgTyrArgGlyThrLeuTyrIleAlaGlnSerPheIleAspGluThrGlyThr
121 IleValLeuHisArgArgLysIleLysProThrHisValGluArgAlaIleTyrGlyAsp
141
GlyGlnGlyGluSerLeuThrAsnValAlaAspThrLysPheGlyArgValAlaGlyLeu
161 GlnCysTrpGluHisThrGlnThrLeuLeuArgTyrTyrGluTyrSerGlnAspValAsp
181
IleHisValSerSerTrpProSerIlePheProGlnAsnValProGluTrpProTyrHis
201 IleThrProGluCysCysLysAlaPheSerHisValValSerMETGluGlyAlaCysPhe
221
ValLeuLeuAlaSerGlnIleMETThrGluGluAsnHisLysLysAlaAsnValGluGly
241
TyrAspTyrThrLysLysSerGlyGlyGlyPheSerMETIlePheSerProPheGlyGlu
261
GluLeuValLysProLeuAlaProAsnGluGluGlyIleLeuTyrAlaAspIleAsnLeu
281 GluGluLysTyrLysAlaLysGlnAsnLeuAspIleValGlyHisTyrSerArgProAsp
301
GlnLeuSerLeuArgValAsnLysHisAlaAlaLysProValPhePheAlaAsnAspLeu
321 ***
SEQ ID No. 3
真菌腈水解酶突变体Ile128Leu-Asn161Gln的氨基酸序列
1
METSerLysThrLeuLysValAlaAlaIleGlnAlaGluProValTrpAsnAspLeuGln
21
GlyGlyValAsnLysSerIleGlyLeuIleGlnGluAlaAlaLysAsnGlyAlaAsnVal
41
IleGlyPheProGluValPheIleProGlyTyrProTrpSerIleTrpAlaAsnSerPro
61 ThrGluAsnAlaProTrpValAsnGluTyrPheLysAsnSerLeuGluArgGluSerPro
81
GluMETAspGlnIleArgAlaAlaValArgGluAlaGlyValPheValValLeuGlyTyr
101
SerGluArgTyrArgGlyThrLeuTyrIleAlaGlnSerPheIleAspGluThrGlyThr
121 IleValLeuHisArgArgLysLeuLysProThrHisValGluArgAlaIleTyrGlyAsp
141
GlyGlnGlyGluSerLeuThrAsnValAlaAspThrLysPheGlyArgValAlaGlyLeu
161 GlnCysTrpGluHisThrGlnThrLeuLeuArgTyrTyrGluTyrSerGlnAspValAsp
181
IleHisValSerSerTrpProSerIlePheProGlnAsnValProGluTrpProTyrHis
201 IleThrProGluCysCysLysAlaPheSerHisValValSerMETGluGlyAlaCysPhe
221
ValLeuLeuAlaSerGlnIleMETThrGluGluAsnHisLysLysAlaAsnValGluGly
241
TyrAspTyrThrLysLysSerGlyGlyGlyPheSerMETIlePheSerProPheGlyGlu
261
GluLeuValLysProLeuAlaProAsnGluGluGlyIleLeuTyrAlaAspIleAsnLeu
281
GluGluLysTyrLysAlaLysGlnAsnLeuAspIleValGlyHisTyrSerArgProAsp
301
GlnLeuSerLeuArgValAsnLysHisAlaAlaLysProValPhePheAlaAsnAspLeu
321 ***
SEQ ID No. 4
真菌腈水解酶突变体Ile128Leu的核苷酸序列
1 ATGTCCAAGA CTCTCAAAGT CGCTGCCATC
CAAGCCGAAC CCGTCTGGAA CGATCTCCAG
61 GGCGGTGTCA ACAAGTCCAT CGGTCTCATC
CAAGAGGCAG CAAAGAACGG TGCCAACGTA
121 ATCGGCTTCC CTGAAGTCTT CATTCCTGGA TATCCATGGA
GCATCTGGGC CAACTCGCCT
181 ACCGAGAACG CACCATGGGT CAATGAGTAC TTCAAGAACT
CATTGGAGAG AGAGTCACCT
241 GAGATGGACC AGATCCGAGC TGCTGTTCGA GAGGCAGGCG
TCTTTGTAGT CCTTGGATAT
301 AGTGAGAGAT ACAGGGGAAC TCTTTACATC GCACAGTCCT
TCATCGATGA GACCGGCACT
361 ATTGTTCTTC ACCGCCGCAA GTTGAAGCCC ACCCATGTTG
AGCGTGCTAT CTACGGTGAC
421 GGACAGGGCG AGTCTCTGAC CAATGTCGCC GACACGAAAT
TTGGCAGGGT TGCTGGTCTT
481 AACTGCTGGG AGCACACCCA GACACTTCTC CGCTACTATG
AATACTCCCA GGATGTCGAT
541 ATCCACGTCT CCAGCTGGCC TTCCATCTTC CCCCAGAACG
TCCCTGAGTG GCCATACCAT
601 ATCACTCCCG AATGCTGCAA GGCCTTCTCT CACGTCGTCT
CCATGGAGGG AGCCTGCTTC
661 GTTCTTCTGG CAAGTCAGAT CATGACTGAG GAGAACCATA
AGAAGGCGAA CGTTGAAGGC
721 TACGACTATA CTAAGAAGTC TGGTGGCGGC TTCAGTATGA
TCTTCTCGCC TTTCGGAGAG
781 GAGCTTGTCA AGCCCCTTGC TCCTAACGAG GAGGGTATTC
TTTACGCTGA TATCAACCTT
841 GAGGAGAAGT ACAAGGCGAA GCAGAACTTG GACATTGTCG
GCCACTACTC GCGACCCGAC
901 CAGCTGAGCC TTCGCGTCAA CAAACATGCT GCCAAGCCTG
TCTTCTTTGC CAACGACCTG
961 TGA
SEQ ID No. 5
真菌腈水解酶突变体Asn161Gln的核苷酸序列
1 ATGTCCAAGA CTCTCAAAGT CGCTGCCATC
CAAGCCGAAC CCGTCTGGAA CGATCTCCAG
61 GGCGGTGTCA ACAAGTCCAT CGGTCTCATC
CAAGAGGCAG CAAAGAACGG TGCCAACGTA
121 ATCGGCTTCC CTGAAGTCTT CATTCCTGGA TATCCATGGA
GCATCTGGGC CAACTCGCCT
181 ACCGAGAACG CACCATGGGT CAATGAGTAC TTCAAGAACT
CATTGGAGAG AGAGTCACCT
241 GAGATGGACC AGATCCGAGC TGCTGTTCGA GAGGCAGGCG
TCTTTGTAGT CCTTGGATAT
301 AGTGAGAGAT ACAGGGGAAC TCTTTACATC GCACAGTCCT
TCATCGATGA GACCGGCACT
361 ATTGTTCTTC ACCGCCGCAA GATCAAGCCC ACCCATGTTG
AGCGTGCTAT CTACGGTGAC
421 GGACAGGGCG AGTCTCTGAC CAATGTCGCC GACACGAAAT
TTGGCAGGGT TGCTGGTCTT
481 CAATGCTGGG AGCACACCCA GACACTTCTC CGCTACTATG
AATACTCCCA GGATGTCGAT
541 ATCCACGTCT CCAGCTGGCC TTCCATCTTC CCCCAGAACG
TCCCTGAGTG GCCATACCAT
601 ATCACTCCCG AATGCTGCAA GGCCTTCTCT CACGTCGTCT
CCATGGAGGG AGCCTGCTTC
661 GTTCTTCTGG CAAGTCAGAT CATGACTGAG GAGAACCATA
AGAAGGCGAA CGTTGAAGGC
721 TACGACTATA CTAAGAAGTC TGGTGGCGGC TTCAGTATGA
TCTTCTCGCC TTTCGGAGAG
781 GAGCTTGTCA AGCCCCTTGC TCCTAACGAG GAGGGTATTC
TTTACGCTGA TATCAACCTT
841 GAGGAGAAGT ACAAGGCGAA GCAGAACTTG GACATTGTCG
GCCACTACTC GCGACCCGAC
901 CAGCTGAGCC TTCGCGTCAA CAAACATGCT GCCAAGCCTG
TCTTCTTTGC CAACGACCTG
961 TGA
SEQ ID No. 6
真菌腈水解酶突变体Ile128Leu-Asn161Gln的核苷酸序列
1 ATGTCCAAGA CTCTCAAAGT CGCTGCCATC
CAAGCCGAAC CCGTCTGGAA CGATCTCCAG
61 GGCGGTGTCA ACAAGTCCAT CGGTCTCATC
CAAGAGGCAG CAAAGAACGG TGCCAACGTA
121 ATCGGCTTCC CTGAAGTCTT CATTCCTGGA TATCCATGGA
GCATCTGGGC CAACTCGCCT
181 ACCGAGAACG CACCATGGGT CAATGAGTAC TTCAAGAACT
CATTGGAGAG AGAGTCACCT
241 GAGATGGACC AGATCCGAGC TGCTGTTCGA GAGGCAGGCG
TCTTTGTAGT CCTTGGATAT
301 AGTGAGAGAT ACAGGGGAAC TCTTTACATC GCACAGTCCT
TCATCGATGA GACCGGCACT
361 ATTGTTCTTC ACCGCCGCAA GTTGAAGCCC ACCCATGTTG
AGCGTGCTAT CTACGGTGAC
421 GGACAGGGCG AGTCTCTGAC CAATGTCGCC GACACGAAAT
TTGGCAGGGT TGCTGGTCTT
481 CAATGCTGGG AGCACACCCA GACACTTCTC CGCTACTATG
AATACTCCCA GGATGTCGAT
541 ATCCACGTCT CCAGCTGGCC TTCCATCTTC CCCCAGAACG
TCCCTGAGTG GCCATACCAT
601 ATCACTCCCG AATGCTGCAA GGCCTTCTCT CACGTCGTCT
CCATGGAGGG AGCCTGCTTC
661 GTTCTTCTGG CAAGTCAGAT CATGACTGAG GAGAACCATA
AGAAGGCGAA CGTTGAAGGC
721 TACGACTATA CTAAGAAGTC TGGTGGCGGC TTCAGTATGA
TCTTCTCGCC TTTCGGAGAG
781 GAGCTTGTCA AGCCCCTTGC TCCTAACGAG GAGGGTATTC
TTTACGCTGA TATCAACCTT
841 GAGGAGAAGT ACAAGGCGAA GCAGAACTTG GACATTGTCG
GCCACTACTC GCGACCCGAC
901 CAGCTGAGCC TTCGCGTCAA CAAACATGCT GCCAAGCCTG
TCTTCTTTGC CAACGACCTG
961 TGA
SEQ ID No. 7
真菌腈水解酶的氨基酸序列
1
METSerLysThrLeuLysValAlaAlaIleGlnAlaGluProValTrpAsnAspLeuGln
21
GlyGlyValAsnLysSerIleGlyLeuIleGlnGluAlaAlaLysAsnGlyAlaAsnVal
41
IleGlyPheProGluValPheIleProGlyTyrProTrpSerIleTrpAlaAsnSerPro
61 ThrGluAsnAlaProTrpValAsnGluTyrPheLysAsnSerLeuGluArgGluSerPro
81
GluMETAspGlnIleArgAlaAlaValArgGluAlaGlyValPheValValLeuGlyTyr
101
SerGluArgTyrArgGlyThrLeuTyrIleAlaGlnSerPheIleAspGluThrGlyThr
121
IleValLeuHisArgArgLysIleLysProThrHisValGluArgAlaIleTyrGlyAsp
141
GlyGlnGlyGluSerLeuThrAsnValAlaAspThrLysPheGlyArgValAlaGlyLeu
161
AsnCysTrpGluHisThrGlnThrLeuLeuArgTyrTyrGluTyrSerGlnAspValAsp
181
IleHisValSerSerTrpProSerIlePheProGlnAsnValProGluTrpProTyrHis
201 IleThrProGluCysCysLysAlaPheSerHisValValSerMETGluGlyAlaCysPhe
221
ValLeuLeuAlaSerGlnIleMETThrGluGluAsnHisLysLysAlaAsnValGluGly
241
TyrAspTyrThrLysLysSerGlyGlyGlyPheSerMETIlePheSerProPheGlyGlu
261
GluLeuValLysProLeuAlaProAsnGluGluGlyIleLeuTyrAlaAspIleAsnLeu
281 GluGluLysTyrLysAlaLysGlnAsnLeuAspIleValGlyHisTyrSerArgProAsp
301
GlnLeuSerLeuArgValAsnLysHisAlaAlaLysProValPhePheAlaAsnAspLeu
321 ***
SEQ ID No. 8
真菌腈水解酶的核苷酸序列
1 ATGTCCAAGA CTCTCAAAGT CGCTGCCATC
CAAGCCGAAC CCGTCTGGAA CGATCTCCAG
61 GGCGGTGTCA ACAAGTCCAT CGGTCTCATC
CAAGAGGCAG CAAAGAACGG TGCCAACGTA
121 ATCGGCTTCC CTGAAGTCTT CATTCCTGGA TATCCATGGA
GCATCTGGGC CAACTCGCCT
181 ACCGAGAACG CACCATGGGT CAATGAGTAC TTCAAGAACT
CATTGGAGAG AGAGTCACCT
241 GAGATGGACC AGATCCGAGC TGCTGTTCGA GAGGCAGGCG
TCTTTGTAGT CCTTGGATAT
301 AGTGAGAGAT ACAGGGGAAC TCTTTACATC GCACAGTCCT
TCATCGATGA GACCGGCACT
361 ATTGTTCTTC ACCGCCGCAA GATCAAGCCC ACCCATGTTG
AGCGTGCTAT CTACGGTGAC
421 GGACAGGGCG AGTCTCTGAC CAATGTCGCC GACACGAAAT
TTGGCAGGGT TGCTGGTCTT
481 AACTGCTGGG AGCACACCCA GACACTTCTC CGCTACTATG
AATACTCCCA GGATGTCGAT
541 ATCCACGTCT CCAGCTGGCC TTCCATCTTC CCCCAGAACG
TCCCTGAGTG GCCATACCAT
601 ATCACTCCCG AATGCTGCAA GGCCTTCTCT CACGTCGTCT
CCATGGAGGG AGCCTGCTTC
661 GTTCTTCTGG CAAGTCAGAT CATGACTGAG GAGAACCATA
AGAAGGCGAA CGTTGAAGGC
721 TACGACTATA CTAAGAAGTC TGGTGGCGGC TTCAGTATGA
TCTTCTCGCC TTTCGGAGAG
781 GAGCTTGTCA AGCCCCTTGC TCCTAACGAG GAGGGTATTC
TTTACGCTGA TATCAACCTT
841 GAGGAGAAGT ACAAGGCGAA GCAGAACTTG GACATTGTCG
GCCACTACTC GCGACCCGAC
901 CAGCTGAGCC TTCGCGTCAA CAAACATGCT GCCAAGCCTG
TCTTCTTTGC CAACGACCTG
961 TGA
Claims (9)
1.一种催化活力和热稳定性提高的真菌腈水解酶突变体，其特征在于，该突变体是由赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1真菌腈水解酶基因出发，运用多轮定点饱和突变构建突变体库而筛选获得；其中突变位点为腈水解酶活性中心附近的第128位异亮氨酸Ile和第161位天冬酰胺Asn。
2.一种DNA分子，其编码如权利要求1所述的真菌腈水解酶突变体。
3.一种突变质粒，其含有如权利要求2所述的DNA分子。
4.一种宿主细胞，其含有如权利要求2所述的DNA分子，或含有如权利要求3所述的突变质粒。
5.根据权利要求1所述的真菌腈水解酶突变体，其特征在于，将饱和定点突变获得的真菌腈水解酶突变质粒转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta-gami (DE3)宿主中，构建饱和突变库，筛选其中的阳性突变株，进行测序验证确认，得到128位和161位的两个酶活和稳定性提高的优秀突变体，分别为：Ile128Leu和Asn161Gln，以Ile128Leu突变质粒为模板，以携带Asn161Gln突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行进一步的组合突变，获得组合突变体Ile128Leu-Asn161Gln。
6.根据权利要求1所述的真菌腈水解酶突变体，其特征在于，第128位异亮氨酸Ile突变为亮氨酸Leu，第161位天冬酰胺Asn突变为谷氨酰胺Gln。
7.根据权利要求1所述的真菌腈水解酶突变体，其特征在于，所述的真菌腈水解酶突变体的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3，其成熟蛋白是由SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 6的核苷酸序列所编码的。
8.权利要求1所述真菌腈水解酶突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
以来自于能够甲基化的大肠杆菌宿主的携带真菌腈水解酶基因的重组质粒为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行反向PCR，扩增突变质粒全长，采用Dpn I限制性内切酶进行酶切消化，取消化的PCR产物热击转化大肠杆菌E. coli DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的固体LB平板培养；挑取单菌落，接入LB液体培养基培养，提取质粒，测序；测序结果正确者转化大肠杆菌E. coli Rosetta-gami
(DE3)感受态细胞，筛选阳性转化子。
9.权利要求1所述真菌腈水解酶突变体的应用，其特征在于，所述的真菌腈水解酶突变体可应用于食品添加剂的生产、药物中间体的合成、化工生产和环境治理中。
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