CN117604004A - D-氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用 - Google Patents
D-氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物化工技术领域，特别涉及D‑氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用。本发明提供了D‑氨基酸氧化酶的突变体、核酸分子、重组菌株及其应用。本发明通过筛选获得了增强对催化底物DL‑草铵膦催化活力的突变型D‑氨基酸氧化酶，并通过添加融合标签或肽标签的方法，使得宿主表达获得的D‑氨基酸氧化酶的活性和可溶性表达进一步提高。利用本发明提供的D‑氨基酸氧化酶制备α‑酮酸的方法实现了外消旋草铵膦的动力学拆分，能够广泛应用到L‑草铵膦的生产应用中。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，特别涉及D-氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用。
背景技术
草铵膦(Phosphinothricin，又名Glufosinate)是一类广谱触杀型灭生性除草剂，化学名为2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，通过抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶来干扰植物的代谢，从而使得植物死亡，具有低毒、杀草谱广、持效期长、活性高及环境相容性好等优点，广泛应用于农田作物、非耕地、免耕地等杂草防治。草铵膦具有手性，通常市售的为D型和L型的外消旋体。而仅有L-草铵膦具有除草效果，若能制备光学纯的L-草铵膦进行使用，则能减少草铵膦的用量，减轻环境压力。
D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类,可氧化D-氨基酸生成相应的酮酸和氨,同时还原型FAD被氧化生成过氧化氢，具有很强的底物专一性。DAAO广泛存在于细菌、真菌、昆虫、鸟类等，其中研究最热门的DAAO包括pkDAAO、RgDAAO以及TvDAAO。由于其自身的高底物专一性以及高催化效率，在医药、环境、农业等领域有了广泛应用。
研究发现D-氨基酸氧化酶可催化外消旋草铵膦底物中的D-草铵膦氧化为相应的α-酮酸，进一步通过L-氨基酸脱氢酶或转氨酶的催化将酮酸转化为L-草铵膦。因此D-氨基酸氧化酶在生产L-草铵膦领域有着巨大的发展前景。但是目前D-氨基酸氧化酶仍然存在催化活力较低以及可溶性表达差等问题，通过多种策略优化D-氨基酸氧化酶的表达从而提升酶活是实现L-草铵膦工业化生产的关键步骤。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于针对来源于Neurospora crassa OR74A的DAAO表达D-氨基酸氧化酶不可溶的问题，提供多种优化策略，优化D-氨基酸氧化酶在大肠杆菌中的表达，以及D-氨基酸氧化酶在制备α-酮酸中的应用。本发明提供了D-氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用。本发明通过筛选获得了增强对催化底物DL-草铵膦催化活力的突变型D-氨基酸氧化酶，并通过添加融合标签或肽标签的方法，使得宿主表达获得的D-氨基酸氧化酶的活性和可溶性表达进一步提高。利用本发明提供的D-氨基酸氧化酶制备α-酮酸的方法实现了外消旋草铵膦的动力学拆分，能够广泛应用到L-草铵膦的生产应用中。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了如下任意项在提高D-氨基酸氧化酶可溶性表达中的应用：
(I)、包含编码野生型的D-氨基酸氧化酶的核酸分子和标签的基因元件；和/或
(II)、编码具有L25P、A79R、T168R、M228P、A254E和G359R中任意一个或多个位点突变的D-氨基酸氧化酶的核酸分子；和/或
(III)、包含编码具有L25P、A79R、T168R、M228P、A254E和G359R中任意一个或多个位点突变的D-氨基酸氧化酶的核酸分子和标签的基因元件；
所述标签选自MBP、NUSA、Fh8、T7B9、6K和NT11中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述野生型的D-氨基酸氧化酶具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了D-氨基酸氧化酶的突变体，其包括L25P、A79R、T168R、M228P、A254E和G359R中任意一个或多个突变位点。
在本发明的一些具体实施方案中，野生型的D-氨基酸氧化酶具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
本发明还提供了编码所述突变体的核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有：
(I)、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或
(II)、与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(IV)、与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了表达单元，其含有启动子、如所述核酸分子和终止子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸分子以单个或多个串联形式与所述启动子、终止子组成表达模块。
本发明中还提供了含有所述的核酸或所述的表达模块的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly(A)信号等。
在本发明的一些具体实施方案中，所述启动子包括T7启动子；所述终止子包括T7终止子。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明所述的表达单元还可以包括增强子、内含子、辅助因子、转录元件或其他特异性元件。例如本发明所述的表达单元可以包括启动子、增强子、转录元件、本发明所述的编码D-氨基酸氧化酶的核酸分子和终止子。本发明对此不作限定，任何包含有本发明所述编码D-氨基酸氧化酶的核酸的表达单元都在本发明的保护范围之内。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达单元包括T7启动子、SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、T7终止子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达单元包括T7启动子、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、T7终止子。
本发明还提供了质粒载体，包括如下任意项和骨架载体：
(I)、所述核酸分子；和/或
(II)、所述表达单元。
在本发明的一些具体实施方案中，所述质粒载体还包括标签；
所述标签选自MBP、NUSA、Fh8、T7B9、6K和NT11中的至少一种；
所述骨架载体包括pET载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述MBP具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述NUSA具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述Fh8具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
所述T7B9具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述NT11具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
所述6K具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
在本发明的一些具体实施方案中，所述标签包括肽标签T7B9。
在本发明的一些具体实施方案中，所述骨架载体包括pET-28a。
本发明还提供了质粒组合，包括如下任意项，和含有编码标签的核酸分子的质粒载体；
(I)、所述质粒载体；和/或
(II)、含有编码野生型的D-氨基酸氧化酶的核酸分子的质粒载体；
所述标签选自MBP、NUSA、Fh8、T7B9、6K和NT11中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述编码野生型的D-氨基酸氧化酶的核酸分子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了宿主，包括如下任意项：
(I)、所述核酸分子；和/或
(II)、所述表达单元；和/或
(III)、所述质粒载体；和/或
(IV)、所述质粒组合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述质粒载体转染或转化进入宿主；所述转化的方法包括：化学转化和电转化；所述转染的方法包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、病毒转染。所述的病毒转染包括腺病毒转染、腺相关病毒转染、慢病毒转染等。
进一步的，本发明所述的宿主包括细菌、真菌、病毒或动物。所述细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌；所述革兰氏阳性菌包括但不限于大肠杆菌。所述真菌包括霉菌、酵母、蕈菌；所述酵母包括啤酒酵母、酿酒酵母、毕赤酵母和假丝酵母等。所述病毒包括但不限于包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、朊病毒。所述动物包括人、鼠、兔、猪、斑马鱼等。
在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括大肠杆菌；
所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。
本发明还提供了如下任意项在制备D-氨基酸氧化酶中的应用：
(I)、所述核酸分子；和/或
(II)、所述表达单元；和/或
(III)、所述质粒载体；和/或
(IV)、所述质粒组合；和/或
(V)、所述宿主。
本发明还提供了D-氨基酸氧化酶的制备方法，包括发酵培养所述宿主细胞，获得D-氨基酸氧化酶。
本发明还提供了所述制备方法制得的D-氨基酸氧化酶。
本发明还提供了以下任意项在制备α-酮酸中的应用：
(I)、所述突变体；和/或
(II)、所述核酸分子；和/或
(III)、所述表达单元；和/或
(IV)、所述质粒载体；和/或
(V)、所述质粒组合；和/或
(VI)、所述宿主。
本发明还提供了α-酮酸的制备方法，包括以D-氨基酸或外消旋氨基酸为底物，利用所述D-氨基酸氧化酶进行氧化反应，获得α-酮酸；
所述底物的浓度包括0.2mol/L；所述氧化反应的温度包括30℃，时间包括6h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述底物包括DL-草铵膦。
本发明还提供了以下任意项在制备L-草铵膦中的应用：
(I)、所述突变体；和/或
(II)、所述核酸分子；和/或
(III)、所述表达单元；和/或
(IV)、所述质粒载体；和/或
(V)、所述质粒组合；和/或
(VI)、所述宿主。
本发明还提供了L-草铵膦的制备方法，包括以D-氨基酸或外消旋氨基酸为底物，加入所述D-氨基酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、过氧化氢酶、NAD+混合，搅拌，制得L-草铵膦；
所述底物的浓度包括0.2mol/L；所述搅拌时的温度包括40℃；所述搅拌时的pH包括8.0。
本发明提供了包括但不限于取得了如下有益效果：
本发明提供了一种D-氨基酸氧化酶突变体，所述D-氨基酸氧化酶的核酸序列分别如SEQ ID NO：2所示。将SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的第25位亮氨酸突变为脯氨酸，第79位的丙氨酸突变为精氨酸，第168位的苏氨酸突变为精氨酸，第228位的甲硫氨酸突变为脯氨酸，第254位的丙氨酸突变为谷氨酸，第359位的甘氨酸突变为精氨酸。突变后的工程菌的酶活得到了提高。
本发明通过筛选出6个融合标签或肽标签，将其分别构建于野生型D-氨基酸氧化酶质粒骨架上表达基因，提高了D-氨基酸氧化酶的酶活性以及可溶性表达。
本发明通过将筛选出的肽标签构建于突变体D-氨基酸氧化酶质粒骨架上表达基因，进一步提高了D-氨基酸氧化酶的酶活性。
本发明提供的以DL-草铵膦为底物，利用D-氨基酸氧化酶进行氧化反应和动力学拆分，获得相应的酮酸和L-草铵膦的方法，工艺简单，反应条件温和，催化剂成本低廉且过程高效绿色，是制备L-草铵膦的理想方案，能够广泛应用于市场。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示野生型D-氨基酸氧化酶基因工程菌的蛋白电泳图；
图2示添加标签后基因工程菌的蛋白电泳图；
图3示突变菌株c2DAAO添加T7B9标签后工程菌的蛋白电泳图；
图4示多酶级联反应制备L-草铵膦技术路线图；
图5示多酶级联反应过程中D-草铵膦、L-草铵膦含量及ee值变化。
具体实施方式
本发明公开了D-氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明将来源于Neurospora crassa OR74A的D-氨基酸氧化酶的核酸构建到质粒载体上并经宿主表达后，通过测定D-氨基酸氧化酶对底物是否有酶活性。结果表明Neurospora crassa OR74A的D-氨基酸氧化酶对底物DL-草铵膦有活性。通过蛋白电泳方法检测D-氨基酸氧化酶的可溶性表达。结果表明，Neurospora crassa OR74A的D-氨基酸氧化酶的表达量很低。后续对D-氨基酸氧化酶的核酸进行可溶性表达优化，包括Camsol预测蛋白质聚集热点，添加融合标签以及肽标签，结果表明优化后的所述核酸在宿主中的表达量更高，D-氨基酸氧化酶的酶活性更高，同时可溶性表达量也提高了。本发明实施例中，优化后的编码D-氨基酸氧化酶的核酸的序列分别如SEQ ID NO：2所示。添加的标签序列分别如SEQ ID NO：3～8的核酸序列所示。
本发明中，所述的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中，所述核酸为DNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。
本发明所述的质粒载体，是指核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对细菌中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子，核糖体结合位点及可能的其它序列。本发明中所述的质粒载体，可为线形，也可为环形，其可以为单链的也可为双链的，本发明对此不做限定。本发明所述的质粒载体，包含有如前所述的D-氨基酸氧化酶表达单元。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明所涉及带有D-氨基酸氧化酶基因的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)以及所用载体pET-28a(+)购自TAKARA公司。常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。在本申请文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37,1984)。
采用高效液相色谱(HPLC)检测产品浓度，具体方法为：色谱条件：色谱柱型号：QS-C18,5μm,4.6mm×250mm。流动相：50mM磷酸氢二铵溶液，加入0.9％的10％四丁基氢氧化铵水溶液，用50％磷酸溶液(质量分数)调节pH至3.6，加入8％乙腈。检测波长：205nm。流速：0.8mL/min。柱温：40℃。
采用高效液相色谱(HPLC)检测草铵膦光学纯度，具体方法为：采用柱前衍生测定。衍生化反应与测定：取100μL样品加入100μL衍生化试剂，混匀后至于25℃保温5min。色谱条件：色谱柱/QS-C18；检测波长：338nm；柱温：30℃；进样量：20μL；流动相：50mM醋酸钠水溶液：乙腈＝9：0.5；流速：1mL/min。
0.2M硼酸缓冲液：称取7.62g十水合四硼酸钠，用去离子水定容至100mL备用；
衍生化试剂：称取0.03g邻苯二甲醛和0.1g N-乙酰-L-半胱氨酸，加入400μL无水乙醇和4mL硼酸缓冲液，超声使其完全溶解，现配现用。
所述来源于Neurospora crassa OR74A的ncDAAO的核酸序列为：
ATGCATCTGCGTTTTCCGACCACCACCACCTATAGTCTGCGCCCGAGCAGCACCCGCACCAGCCCTCCTCCTCTGATTGTTAGCTTTGCCCCGCGCCATAGCATTGTGAGTTATACCACCAGTCCGCGCCGCCTGTTTAGTATTATTATGAGCGAACCGAAAGGCCATGTGGTTGTTATTGGCGCAGGCGTGATTGGTCTGAGCAGCGCCCTGGCACTGCTGGAAGCAAATTATGCAACCACCATTCTGGCCAAAGATCTGCCGGCACCGTTTGAAAGTATTGATCCGCGTAGCCAGATTAATTTTACCAGCCCGTGGGGTGGTGCACATAATCGTTGGGTGCCGCCGTTTCCGCCGAGTAGTAGTAGCAGCAGTACCCCGCTGACCCCGACCCAGCAGGCAGAACATGCACTGCGTATTCGTGAACATGCATTTAGCCTGAGCACCTTTCATCGTATGCAGCTGTTTCAGAGCCAGGGTCAGGATCAGCAGGCAGGCATTACCTTTCTGAAAGGCATTGAATATCTGGAAAGCCCGGGCCCGGAATATACCAGCCTGACCCCGCAGCGTGCCAGTCAGGAACTGGGCCTGCCGGGTCATTTTCGTGTGCTGGAAACCCATGAATTTCCGGATGATAAAGTTCAGTGGGGTTGCGAATATGATACCTGGTGCGTGAATCCGATGCAGTATTGCCTGTTTCTGCTGGGTCAGATTATTGCACGCGGTGGTAAAGTGTTTAAACGTGATGTGCGTAGCGTTGCAGAAGTGTTTCAGCTGTTTAGTGATAGCGTTCAGGAATTTGGTGCCACCATTCCGCCGGCCGATGCAGTGGTGAATGCAACCGGTATTGGCCTGGGCGATGATGAAATGGTGTTTCCGACCCGTGGTCAGACCTGCCTGGTGCAGGAACCGTGCGATGCAACCGTGACCCGCCAGAATGCCGATGGTACCTGGACCTTTTGTGTGCCGCGTGGCTTTAAAGCAGGTACCATTATTGGCGGCACCAAAGAACCGGATAATTGGGATCCGAAACCGGATCCGGAAGTTCGTGAACGTCTGCTGCGTGCCTTTGAAGGTACCTATCCGCGTAT TCTGGCCGATGGCAAAACCCGCCTGACCCCGGTGCGCGATATTGTGGGTCGTCGTCCGACCCGCAAAGGTGGCCTGCGTCTGGAAGGCGAAGTGGTTGATGGTGCCGGTTTTGTGATGCATGCCTATGGCCTGGGCGGTCGTGGTTATGAACTGAGTTGGGGTGTTGCCGAAGGTGTTATTGAAGGCATTCAGGGTCATCTGGAAAGCGAAAAAGGCAGTCGTCTGTAA(SEQ ID NO.1)
所述经突变改造的c2-ncDAAO的核酸序列为：
ATGCATCTGCGTTTTCCGACCACCACCACCTATAGTCTGCGCCCGAGCAGCACCCGCACCAGCCCTCCTCCTCCGATTGTTAGCTTTGCCCCGCGCCATAGCATTGTGAGTTATACCACCAGTCCGCGCCGCCTGTTTAGTATTATTATGAGCGAACCGAAAGGCCATGTGGTTGTTATTGGCGCAGGCGTGATTGGTCTGAGCAGCGCCCTGGCACTGCTGGAAGCAAATTATCGTACCACCATTCTGGCCAAAGATCTGCCGGCACCGTTTGAAAGTATTGATCCGCGTAGCCAGATTAATTTTACCAGCCCGTGGGGTGGTGCACATAATCGTTGGGTGCCGCCGTTTCCGCCGAGTAGTAGTAGCAGCAGTACCCCGCTGACCCCGACCCAGCAGGCAGAACATGCACTGCGTATTCGTGAACATGCATTTAGCCTGAGCACCTTTCATCGTATGCAGCTGTTTCAGAGCCAGGGTCAGGATCAGCAGGCAGGCATTCGTTTTCTGAAAGGCATTGAATATCTGGAAAGCCCGGGCCCGGAATATACCAGCCTGACCCCGCAGCGTGCCAGTCAGGAACTGGGCCTGCCGGGTCATTTTCGTGTGCTGGAAACCCATGAATTTCCGGATGATAAAGTTCAGTGGGGTTGCGAATATGATACCTGGTGCGTGAATCCGCCGCAGTATTGCCTGTTTCTGCTGGGTCAGATTATTGCACGCGGTGGTAAAGTGTTTAAACGTGATGTGCGTAGCGTTGAAGAAGTGTTTCAGCTGTTTAGTGATAGCGTTCAGGAATTTGGTGCCACCATTCCGCCGGCCGATGCAGTGGTGAATGCAACCGGTATTGGCCTGGGCGATGATGAAATGGTGTTTCCGACCCGTGGTCAGACCTGCCTGGTGCAGGAACCGTGCGATGCAACCGTGACCCGCCAGAATGCCGATGGTACCTGGACCTTTTGTGTGCCGCGTGGCTTTAAAGCAGGTACCATTATTGGCGGCACCAAAGAACCGGATAATTGGGATCCGAAACCGGATCCGGAAGTTCGTGAACGTCTGCTGCGTGCCTTTGAACGTACCTATCCGCGTATTCTGGCCGATGGCAAAACCCGCCTGACCCCGGTGCGCGATATTGTGGGTCGTCGTCCGACCCGCAAAGGTGGCCTGCGTCTGGAAGGCGAAGTGGTTGATGGTGCCGGTTTTGTGATGCATGCCTATGGCCTGGGCGGTCGTGGTTATGAACTGAGTTGGGGTGTTGCCGAAGGTGTTATTGAAGGCATTCAGGGTCATCTGGAAAGCGAAAAAGGCAGTCGTCTGTAA(SEQ ID NO.2)
所述融合标签MBP的核酸序列为：
AAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCC GGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCGAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACT(SEQ ID NO.3)
所述融合标签NUSA的核酸序列为：
ATGAACAAAGAAATTTTGGCTGTAGTTGAAGCCGTATCCAATGAAAAGGCGCTACCTCGCGAGAAGATTTTCGAAGCATTGGAAAGCGCGCTGGCGACAGCAACAAAGAAAAAATATGAACAAGAGATCGACGTCCGCGTACAGATCGATCGCAAAAGCGGTGATTTTGACACTTTCCGTCGCTGGTTAGTTGTTGATGAAGTCACCCAGCCGACCAAGGAAATCACCCTTGAAGCCGCACGTTATGAAGATGAAAGCCTGAACCTGGGCGATTACGTTGAAGATCAGATTGAGTCTGTTACCTTTGACCGTATCACTACCCAGACGGCAAAACAGGTTATCGTGCAGAAAGTGCGTGAAGCCGAACGTGCGATGGTGGTTGATCAGTTCCGTGAACACGAAGGTGAAATCATCACCGGCGTGGTGAAAAAAGTAAACCGCGACAACATCTCTCTGGATCTGGGCAACAACGCTGAAGCCGTGATCCTGCGCGAAGATATGCTGCCGCGTGAAAACTTCCGCCCTGGCGACCGCGTTCGTGGCGTGCTCTATTCCGTTCGCCCGGAAGCGCGTGGCGCGCAACTGTTCGTCACTCGTTCCAAGCCGGAAATGCTGATCGAACTGTTCCGTATTGAAGTGCCAGAAATCGGCGAAGAAGTGATTGAAATTAAAGCAGCGGCTCGCGATCCGGGTTCTCGTGCGAAAATCGCGGTGAAAACCAACGATAAACGTATCGATCCGGTAGGTGCTTGCGTAGGTATGCGTGGCGCGCGTGTTCAGGCGGTGTCTACTGAACTGGGTGGCGAGCGTATCGATATCGTCCTGTGGGATGATAACCCGGCGCAGTTCGTGATTAACGCAATGGCACCGGCAGACGTTGCTTCTATCGTGGTGGATGAAGATAAACACACCATGGACATCGCCGTTGAAGCCGGTAATCTGGCGCAGGCGATTGGCCGTAACGGTCAGAACGTGCGTCTGGCTTCGCAACTGAGCGGTTGGGAACTCAACGTGATGACCGTTGACGACCTGCAAGCTAAGCATCAGGCGGAAGCGCACGCAGCGATCGACACCTTCACCAAATATCTCGACATCGACGAAGACTTCGCGACTGTTCTGGTAGAAGAAGGCTTCTCGACGCTGGAAGAATTGGCCTATGTGCCGATGAAAGAGCTGTTGGAAATCGAAGGCCTTGATGAGCCGACCGTTGAAGCACTGCGCGAGCGTGCTAAAAATGCACTGGCCACCATTGCACAGGCCCAGGAAGAAAGCCTCGGTGATAACAAACCGGCTGACGATCTGCTGAACCTTGAAGGGGTAGATCGTGATTTGGCATTCAAACTGGCCGCCCGTGGCGTTTGTAC GCTGGAAGATCTCGCCGAACAGGGCATTGATGATCTGGCTGATATCGAAGGGTTGACCGACGAAAAAGCCGGAGCACTGATTATGGCTGCCCGTAATATTTGCTGGTTCGGTGACGAAGCG(SEQ ID NO.4)
所述融合标签Fh8的核酸序列为：
ATGCCTAGTGTTCAAGAGGTTGAAAAACTCCTTCATGTTCTCGATCGCAACGGTGACGGGAAGGTTTCTGCCGAGGAGTTGAAAGCCTTCGCTGATGATTCAAAATGTCCTCTGGACTCCAATAAGATCAAGGCTTTCATTAAGGAACACGATAAAAACAAGGATGGCAAGCTTGATTTGAAAGAACTCGTTTCGATTTTGTCATCA(SEQ ID NO.5)
所述肽标签T7B9的核酸序列为：
GAAGAAGCATCCGTGACCTCCACCGAGGAAACTCTGACGCCTGCTCAAGAGGC TGCAGAGACCGAAGCTAACAAGGCGCGCAAAGAAGCGGAACTGGAAGCGGAAACT GCTGAACAG(SEQ ID NO.6)
所述肽标签NT11的核酸序列为：
GTAAGCGAGCCGCATGATTACAATTACGAAAAA(SEQ ID NO.7)
所述肽标签6K的核酸序列为：
AAAAAAAAGAAAAAAAAA(SEQ ID NO.8)
所述来源于Neurospora crassa OR74A的ncDAAO的氨基酸序列为：
MHLRFPTTTTYSLRPSSTRTSPPPLIVSFAPRHSIVSYTTSPRRLFSIIMSEPKGHVVVIGAGVIGLSSALALLEANYATTILAKDLPAPFESIDPRSQINFTSPWGGAHNRWVPPFPPSSSSSSTPLTPTQQAEHALRIREHAFSLSTFHRMQLFQSQGQDQQAGITFLKGIEYLESPGPEYTSLTPQRASQELGLPGHFRVLETHEFPDDKVQWGCEYDTWCVNPMQYCLFLLGQIIARGGKVFKRDVRSVAEVFQLFSDSVQEFGATIPPADAVVNATGIGLGDDEMVFPTRGQTCLVQEPCDATVTRQNADGTWTFCVPRGFKAGTIIGGTKEPDNWDPKPDPEVRERLLRAFEGTYPRILADGKTRLTPVRDIVGRRPTRKGGLRLEGEVVDGAGFVMHAYGLGGRGYELSWGVAEGVIEGIQGHLESEKGSRL(SEQ IDNO.9)
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1表达野生型D-氨基酸氧化酶的基因工程菌构建及活力测定
1、D-氨基酸氧化酶基因的菌株构建
通过基因数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)检索到来源于Neurospora crassa OR74A的D-氨基酸氧化酶ncDAAO的基因序列相关信息(NCBI登录号：XP_964990)，提交给基因合成公司进行野生型菌株密码子优化的全基因合成，并构建在质粒载体pET-28a(+)(包含T7启动子和T7终止子)上，酶切位点为NheI和NotI；然后将构建好的质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)菌株中，即为基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-ncDAAO。
2、野生型D-氨基酸氧化酶的重组表达
将构建成功的工程菌接种于LB液体培养基中，37℃摇床中，200rpm震荡培养2～3h，当菌体密度OD600值达到0.8时，降温到18℃，并加入IPTG至其终浓度为0.5mM。之后将三角瓶转入18℃摇床中，200rpm继续培养16h。培养结束后，将培养液4000rpm离心30min，弃上清，收集菌体细胞，然后用100mM、pH8.0磷酸盐缓冲液重悬，超声破碎得到菌悬液即为粗酶液。
3、重组野生型D-氨基酸氧化酶的酶活测定
以DL-草铵膦为底物，检测重组D-氨基酸氧化酶的酶活，测定体系为：总反应体系为2mL，包括1mL 200mM DL-草铵膦溶液，1mL粗酶液，以上物质均用100mM、pH8.0磷酸盐缓冲液配制。在30℃下震荡反应6h，加入200μL4 M HCl溶液终止反应。反应混合液4000rpm离心10min，除去细胞和酶蛋白。用高效液相色谱法来测定反应体系中所生成的PPO，酶活定义：在30℃下，1min能转化底物生成1μmol产物的酶量，即为1U。对所有重组D-氨基酸氧化酶进行活力测定。
所有结果均进行独立T检验分析并计算P值，其中“n.s”表示与野生型菌株相比无显著性差异，“*”表示与野生型菌株相比P<0.05，“**”表示与野生型菌株相比P<0.01，“***”表示与野生型菌株相比P<0.001。
4、D-氨基酸氧化酶基因工程菌的可溶表达检测
步骤2中超声破碎后的基因工程菌破胞液统一OD600后在12000rpm，4℃条件下离心10min，取15μL上清液与5μL 4×SDS-PAGE Loading Buffer混匀；弃上清液，沉淀用相同体积缓冲液重悬后，取15μL重悬液与5μL 4×SDS-PAGE Loading Buffer混匀。所有蛋白电泳样品在99℃孵育10min。取10μL蛋白样品进行蛋白质凝胶电泳。结果使用ImageJ软件进行灰度分析其可溶性D-氨基酸氧化酶在总细胞中所占的比例。其中“-”表示存在大量包涵体，蛋白可溶性比例低于10％，“+”表示蛋白可溶性比例为10％～50％，“++”表示蛋白可溶性比例为50％～90％，“+++”表示蛋白可溶性比例为90％～100％。
结果如图1所示，蛋白质凝胶电泳结果显示野生型D-氨基酸氧化酶在前述摇瓶培养条件下为不可溶表达。说明D-氨基酸氧化酶在大肠杆菌里的可溶表达有待优化。
5、多酶级联反应制备L-草铵膦
对D-氨基酸氧化酶的筛选与改造，我们获得了合适的菌株进行多酶级联体系的搭建。从DL-草铵膦出发，利用D-氨基酸氧化酶催化D-氨基酸氧化生成酮酸，L-氨基酸完全保留，再通过谷氨酸脱氢酶将酮酸原位还原为L-氨基酸，实现D,L-氨基酸的去消旋化。40℃，pH8.0和通氧条件下，通过恒温磁力搅拌器制备L-草铵膦。总反应体积为100mL，组分的浓度分别为：200mM DL-草铵膦溶液、300mM异丙醇、0.2mM NAD+，0.1g/L(干细胞重量)CdGluDH，0.2g/L(干细胞重量)乙醇脱氢酶(BsADH)和10g/L(干细胞重量)的D-氨基酸氧化酶(DAAO)与过氧化氢酶(MaCAT)，反应技术路线如图4所示。具体操作步骤为：配置0.2M的(NH4)2SO4水溶液，并使用25％的氢氧化铵将其调节至pH 8.0，获得NH3·(NH3)2SO4缓冲溶液。将DL-草铵膦和异丙醇溶解在缓冲液中，并使用25％氢氧化铵调节pH至8.0，以获得底物溶液(80mL)。将收集的CdGluDH，BsADH，DAAO，MaCAT细胞重新悬浮在缓冲液中，并通过超声破碎，然后加入NAD+以获得酶溶液(20mL)。将底物溶液和酶溶液混合并加入三颈烧瓶中进行反应，在反应期间，通过加入10％氢氧化铵溶液将反应溶液保持在pH 8.0。
通过底物转化率，转化效率和对映体过量值(enantiomeric excess，ee值)来考察多酶
催化体系的催化效果。其中ee值表示一个对映体对另一个对映体的过量，通常用百分数表示：ee＝([R]-[S]/[R]+[S])*100％。
实施例2 Camsol预测D-氨基酸氧化酶突变体位点的可溶性表达优化
通过Camsol网站https://www-cohsoftware.ch.cam.ac.uk/index.php，输入ncDAAO的PDB文件，输出相关突变位点如表1所示。以野生型ncDAAO质粒为模板，依次进行点突变PCR，引物如表2所示，经DPNI消化后，转化至E.coli BL21(DE3)菌株中，构建为突变菌株c1DAAO-c16DAAO。
表1 Camsol预测野生型ncDAAO突变位点
表2点突变引物表
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按照实施例1步骤2的方法进行重组D-氨基酸氧化酶表达。按照实施例1步骤3的方法进行D-氨基酸氧化酶酶活测定，测定结果如表3所示。由表3可知，c2DAAO在大肠杆菌中表达酶活相比野生型DAAO酶活提高91％(P<0.01)，其余突变菌株酶活均低于野生型DAAO。因此，优选c2DAAO突变菌株。
表3不同突变体中DAAO酶活测定(U/L)
| 酶活(U/L) | P-Value | |
| ncDAAO | 2.42±0.30 | |
| c1DAAO | 2.33±0.42 | n.s |
| c2DAAO | 4.63±0.57 | ** |
| c3DAAO | 0.31±0.12 | *** |
| c4DAAO | 2.44±0.29 | n.s |
| c5DAAO | 0.38±0.29 | ** |
| c6DAAO | 0.28±0.22 | *** |
| c7DAAO | 2.66±0.33 | n.s |
| c8DAAO | 1.99±0.18 | n.s |
| c9DAAO | 1.99±0.31 | n.s |
| c10DAAO | 0.87±0.59 | * |
| c11DAAO | 0.63±0.22 | ** |
| c12DAAO | 1.82±0.33 | n.s |
| c13DAAO | 1.29±0.67 | n.s |
| c14DAAO | 1.89±0.27 | n.s |
| c15DAAO | 1.74±0.38 | n.s |
| c16DAAO | 0.18±0.08 | *** |
实施例3添加标签提高D-氨基酸氧化酶的可溶表达
选择3个常用的融合标签MBP、NusA、Fh8及3个肽标签T7B9、NT11以及6K，经过密码子优化后包括构建于野生型ncDAAO质粒骨架上，6K标签插在目标蛋白C端，其余标签均插在目标蛋白N端，转化至E.coliBL21(DE3)菌株中。将构建成功的工程菌接种于LB培养基中进行培养，按照实施例1步骤2的方法进行重组D-氨基酸氧化酶表达。按照实施例1步骤3的方法进行D-氨基酸氧化酶酶活测定，测定结果如表4所示。由表4可知，融合标签MBP、NUSA、FH8以及肽标签T7B9对野生型ncDAAO菌株酶活有促进作用。按照实施例1步骤4的方法进行D-氨基酸氧化酶的可溶性表达检测，结果如图2和表5所示。由图2可知，融合标签MBP和NUSA蛋白分子量较大，融合目标蛋白后可溶性表达有明显提升，同时NUSA融合蛋白对目标蛋白的酶活影响较大，酶活提升不显著(P<0.05)。添加标签Fh8以及T7B9的蛋白可溶性表达有了显著提升，无不可溶蛋白，两种标签分子量较小，对目标蛋白影响小，酶活有显著提升(P<0.001)。因此，优选Fh8以及T7B9标签提高D-氨基酸氧化酶在大肠杆菌中的可溶性表达。T7B9的氨基酸更少，对目标蛋白的影响更小，因此，更优选T7B9肽标签。
表4添加不同标签的D-氨基酸氧化酶酶活测定(U/L)
| 酶活(U/L) | P-Value | |
| ncDAAO | 5.62±0.79 | |
| MBP | 9.42±1.05 | ** |
| NUSA | 5.78±0.88 | n.s |
| FH8 | 15.99±1.89 | *** |
| T7B9 | 15.99±2.03 | *** |
| 6K | 3.41±0.89 | * |
| NT11 | 4.84±0.96 | n.s |
表5添加不同标签的D-氨基酸氧化酶的蛋白可溶性表达测定
| 蛋白可溶性 | |
| ncDAAO | - |
| MBP | + |
| NUSA | ++ |
| FH8 | +++ |
| T7B9 | +++ |
| 6K | - |
| NT11 | - |
实施例4标签T7B9对突变菌株c2DAAO的影响
进一步探究肽标签T7B9对D-氨基酸氧化酶突变菌株c2DAAO酶活的影响，将肽标签T7B9插入突变菌株c2DAAO质粒骨架N端，构建为T7B9-c2DAAO菌株。按照实施例1步骤2的方法进行重组D-氨基酸氧化酶表达。按照实施例1步骤4的方法进行D-氨基酸氧化酶的可溶性表达检测，测定结果如表6和图3所示，在c2DAAO前添加T7B9标签后，蛋白可溶性表达显著提升，由c2DAAO的蛋白不可溶变为完全可溶。按照实施例1步骤3的方法进行D-氨基酸氧化酶酶活测定，酶活测定结果如表7所示，结果表明肽标签T7B9与6个突变位点结合对于D-氨基酸氧化酶酶活的促进作用更明显(P<0.001)，相比野生型菌株酶活提升2.83倍，相比T7B9菌株酶活提升69％。
表6突变菌株c2DAAO添加T7B9标签后蛋白可溶性表达测定
| 蛋白可溶性 | |
| ncDAAO | - |
| c2DAAO | - |
| T7B9 | +++ |
| T7B9-c2 | +++ |
表7突变菌株c2DAAO添加T7B9标签D-氨基酸氧化酶酶活测定(U/L)
实施例5多酶级联反应制备L-草铵膦结果
按照实施例1步骤5的方法进行多酶级联反应制备L-草铵膦，整个反应同时测定L-，D-草铵膦含量，并计算ee值，结果如图5所示。由图5可知，在反应840min后D-草铵膦全部转化为L-草铵膦，转化率达到100％。最终，共生成约180.71mM L-草铵膦，测定ee值大于99％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (18)
1.如下任意项在提高D-氨基酸氧化酶可溶性表达中的应用：
(I)、包含编码野生型的D-氨基酸氧化酶的核酸分子和标签的基因元件；和/或
(II)、编码具有L25P、A79R、T168R、M228P、A254E和G359R中任意一个或多个位点突变的D-氨基酸氧化酶的核酸分子；和/或
(III)、包含编码具有L25P、A79R、T168R、M228P、A254E和G359R中任意一个或多个位点突变的D-氨基酸氧化酶的核酸分子和标签的基因元件；
所述标签选自MBP、NUSA、Fh8、T7B9、6K和NT11中的至少一种。
2.D-氨基酸氧化酶的突变体，其特征在于，其包括L25P、A79R、T168R、M228P、A254E和G359R中任意一个或多个突变位点。
3.编码如权利要求2所述突变体的核酸分子。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，其具有：
(I)、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或
(II)、与(I)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(I)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(IV)、与(I)、(II)或(III)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
5.表达单元，其特征在于，其含有启动子、如权利要求3或4所述的核酸分子和终止子。
6.如权利要求5所述的表达单元，其特征在于，所述启动子包括T7启动子；所述终止子包括T7终止子。
7.质粒载体，其特征在于，包括如下任意项和骨架载体：
(I)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或
(II)、如权利要求5或6所述的表达单元。
8.如权利要求7所述的质粒载体，其特征在于，还包括标签；
所述标签选自MBP、NUSA、Fh8、T7B9、6K和NT11中的至少一种；
所述骨架载体包括pET载体。
9.质粒组合，其特征在于，包括如下任意项，和含有编码标签的核酸分子的质粒载体；
(I)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或
(II)、含有编码野生型的D-氨基酸氧化酶的核酸分子的质粒载体；
所述标签选自MBP、NUSA、Fh8、T7B9、6K和NT11中的至少一种。
10.宿主，其特征在于，包括如下任意项：
(I)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或
(II)、如权利要求5或6所述的表达单元；和/或
(III)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或
(IV)、如权利要求9所述的质粒组合。
11.如权利要求10所述的宿主，其特征在于，所述宿主包括大肠杆菌；
所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。
12.如下任意项在制备D-氨基酸氧化酶中的应用：
(I)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或
(II)、如权利要求5或6所述的表达单元；和/或
(III)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或
(IV)、如权利要求9所述的质粒组合；和/或
(V)、如权利要求10或11所述的宿主。
13.D-氨基酸氧化酶的制备方法，其特征在于，包括发酵培养如权利要求10或11所述的宿主细胞，获得D-氨基酸氧化酶。
14.如权利要求13所述的制备方法制得的D-氨基酸氧化酶。
15.以下任意项在制备α-酮酸中的应用：
(I)、如权利要求2所述的突变体；和/或
(II)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或
(III)、如权利要求5或6所述的表达单元；和/或
(IV)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或
(V)、如权利要求9所述的质粒组合；和/或
(VI)、如权利要求10或11所述的宿主。
16.α-酮酸的制备方法，其特征在于，包括以D-氨基酸或外消旋氨基酸为底物，利用如权利要求14所述的D-氨基酸氧化酶进行氧化反应，获得α-酮酸；
所述底物的浓度包括0.2mol/L；所述氧化反应的温度包括30℃，时间包括6h。
17.以下任意项在制备L-草铵膦中的应用：
(I)、如权利要求2所述的突变体；和/或
(II)、如权利要求3或4所述的核酸分子；和/或
(III)、如权利要求5或6所述的表达单元；和/或
(IV)、如权利要求7或8所述的质粒载体；和/或
(V)、如权利要求9所述的质粒组合；和/或
(VI)、如权利要求10或11所述的宿主。
18.L-草铵膦的制备方法，其特征在于，包括以D-氨基酸或外消旋氨基酸为底物，加入如权利要求14所述的D-氨基酸氧化酶、谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、过氧化氢酶、NAD+混合，搅拌，制得L-草铵膦；
所述底物的浓度包括0.2mol/L；所述搅拌时的温度包括40℃；所述搅拌时的pH包括8.0。
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| CN202311581696.7A CN117604004A (zh) | 2023-11-24 | 2023-11-24 | D-氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用 |
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Family Applications (1)
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| CN202311581696.7A Pending CN117604004A (zh) | 2023-11-24 | 2023-11-24 | D-氨基酸氧化酶突变体、核酸分子、重组菌株及其应用 |
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2023
- 2023-11-24 CN CN202311581696.7A patent/CN117604004A/zh active Pending
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