KR20220008755A - 이산화탄소와 개미산만으로 성장 가능한 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 유용물질을 제조하는 방법 - Google Patents

이산화탄소와 개미산만으로 성장 가능한 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 유용물질을 제조하는 방법 Download PDF

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안정호
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Abstract

본 발명은 이산화탄소와 개미산으로부터 피루브산을 합성하는 대사 경로를 도입하고 강화시켜 피루브산 합성 효율을 증진시키고, 추가적인 유전자 조작으로 이산화탄소와 개미산만으로 성장이 가능하도록 한 재조합 미생물 및 이를 이용한 유용물질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 C3 유기 화합물인 피루브산을 현저히 개선된 속도로 합성하고, 특히 포도당이 함유되지 않고 이산화탄소와 개미산만을 탄소원으로 함유한 배지에서도 성장이 현저히 개선된 재조합 미생물을 제공함으로써, 피루브산 및 이를 중간산물로 하는 다양한 고부가가치 화합물을 매우 경제적인 방법으로 합성할 수 있는 장점이 있다.

Description

이산화탄소와 개미산만으로 성장 가능한 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 유용물질을 제조하는 방법{A recombinant microorganism capable of growing solely on CO2 and formic acid and a method of producing useful materials using the same}
본 발명은 이산화탄소와 개미산만으로 성장 가능한 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 유용물질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 이산화탄소와 개미산으로부터 피루브산을 합성하는 대사 경로를 도입하고 강화시켜 피루브산 합성 효율을 증진시키고, 추가적인 유전자 조작으로 이산화탄소와 개미산만으로 성장이 가능하도록 한 재조합 미생물 및 이를 이용한 유용물질의 제조방법에 관한 것이다.
급변하는 기후변화의 원인인 온실가스 절감 방안 구축을 위해, 온실가스의 주성분인 이산화탄소 등의 탄소 하나로 구성된 기체 상태의 화합물을 더 높은 탄소수의 액체 혹은 고체상태의 유기물로 합성하는 연구가 현재 활발하게 진행되고 있다. 탄소 하나로 구성된 화합물(C1 화합물)의 전환 연구는 크게 화학적 방법 및 생물학적 방법으로 나눌 수 있고, 이 중 화학적 방법은 금속 및 비금속 촉매 기반 전기화학적 반응에 의해 진행된다. 상기 반응에 의해 이산화탄소는 메탄올, 개미산 등의 비기체상태의 탄소 화합물로 전환되고, 관련 연구의 예로 탄소나노튜브 촉매를 이용한 전환(Kumar et al., Nat. comm, 2819, 2013), 철 촉매를 이용한 전환(Christopher et al., Angew. Chem. Int. Ed. 49:50, 9777-9780, 2010), 합금 촉매를 이용한 전환 (Studt et al., Nat. chem, 6, 320-324, 2014) 등이 있다. 이들 화학적 방법을 이용한 전환은 비교적 빠른 속도로 진행된다는 장점이 있으나, C1 화합물 전환과정을 통해 생산된 결과물들이 여러 개의 탄소로 구성된 유용 화합물들이 아닌, 개미산, 메탄올 등의 단일 탄소 물질들이라는 한계점이 존재한다.
생물학적 전환 방법의 경우, 기체 상태의 C1 화합물을 비기체상태의 화합물로 전환, C1 화합물을 여러 개의 탄소로 구성된 유용 화합물로 전환하는 연구들이 진행되고 있으며, 전자의 경우 자연계에 존재하는 대사경로의 이용 및 개량 (PCT/US2008/083056), 새로운 대사경로 설계 (Schwander et al., Science, 354:6314. 900-904, 2016) 등의 연구가 진행되었고, 후자의 경우 메탄올 동화 미생물을 이용한 유용 화합물 생산 (US 2003/0124687 A1), 개미산으로부터 탄소 3개짜리 화합물 생산 (US 2013/0196359 A1) 등의 사례가 있다. 그러나 이들 연구는 낮은 효율로 인해 생물체 내부 조건에서 그 효과를 확인하기 어렵거나, 생물체 내부의 대사회로와 양립하여 기능할 수 있는지 여부가 검증되지 않았다는 한계가 있다.
따라서 위에서 서술한 생물학적 C1 화합물 전환공정의 한계점을 극복한 효율적인 C1 화합물 전환공정을 개발하기 위한 연구가 당업계에서 부상하고 있다. 특히 C1 화합물 중, 개미산의 경우 여타 C1 화합물에 비해 비교적 생물체에 미치는 독성이 적고, 반응 역학 측면에서 기체상태의 C1 화합물에 비해 동화반응 진행에 유리하며, 화학적 방법을 통해 이산화탄소로부터 쉽고 빠르게 합성할 수 있다는 장점이 있으나, 대표적인 개미산 동화 미생물인 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 속의 유전자 정보가 지난 2009년에서야 밝혀지는 등 응용연구를 위한 기초 연구들이 비교적 최근에서야 수행되었다. 현재는 C1 탄소원을 유용화학물질로 전환하는 이론을 검증하는 단계에 있다. 최근 연구에서 이산화탄소와 개미산만을 이용한 대장균 성장이 보고됐으나 (Gleizer, S. et al. Cell 179, 1255-1263, 2019, Kim, S. et al. Nat. Chem. Biol. 1-8, 2020) 이는 세포 성장 수준이 현저히 낮다는 한계점이 있다.
이에 본 발명자들은 선행연구에서 C1 화합물인 개미산을 여러 개의 탄소로 구성된 유용 화합물로 전환하기 위한 신규 대사경로를 설계 및 검증하였고 (10-2000755), 이를 이용하여 이산화탄소와 개미산만을 탄소원으로 사용하여 성장하는 미생물을 개발하기 위해 추가적인 연구를 진행한 결과, 대장균의 게놈상에서 포스포리보실글라이시나마이드 포밀트렌스퍼레이즈 (phosphoribosylglycinamide formyltransferase) 효소를 암호화하는 유전자 제거, 당신생과정(gluconeogenesis)의 대사흐름 강화, 캔디다(Candida) 속 미생물에서 유래한 개미산 탈수소화효소와 아라비돕시스(Arabidopsis) 속의 식물에서 유래한 개미산 탈수소화효소의 변이체 유전자를 도입하는 경우, 이산화탄소와 개미산만을 탄소원으로 사용하여 대장균 성장이 가능하다는 것을 확인하였다. 이에 더하여 재구성된 테트라하이드로포레이트 대사회로를 발현시키는 유전자, 캔디다 속 미생물에서 유래한 개미산 탈수소화효소 유전자 및 아라비돕시스 속 식물에서 유래한 개미산 탈수소화효소의 변이체를 발현시키는 유전자의 발현량을 조절하고, 배양온도 조건변화를 통해 미생물 내 에너지 공급에 요구되는 막단백질의 발현량을 효과적으로 조절하였으며, 미생물의 성장에 따라 에어레이션(aeration)을 증가시키는 배양공정을 개발하고, 배양액의 개미산 농도를 최적 수준으로 유지하는 배양공정을 개발하여 유용 화학물질 생산에 적용 가능한 수준의 높은 세포밀도까지 성장이 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
PCT/US2008/083056 US 2003/0124687 US 2013/0196359 KR 10-2000755
Kumar et al., Nat. comm, 2819, 2013 Christopher et al., Angew. Chem. Int. Ed. 49:50, 9777-9780, 2010 Studt et al., Nat. chem, 6, 320-324, 2014 Schwander et al., Science, 354:6314. 900-904, 2016 Gleizer, S. et al. Cell 179, 1255-1263, 2019 Kim, S. et al. Nat. Chem. Biol. 1-8, 2020
본 발명의 목적은 개미산과 이산화탄소로부터 C3 화합물을 비롯한 유용물질의 합성 효율이 향상된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 개미산과 이산화탄소로부터 C3 화합물을 비롯한 유용물질의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 중심탄소 동화회로를 가지고 있는 숙주 미생물에서,
글라이신 클리비지 시스템 전사 억제 효소 (glycine cleavage system transcriptional repressor); 파이루베이트 포메이트 라이에이즈 (pyruvate formate lyase); 및 포스포글라이서레이트 디하이드로지네이즈 (phosphoglycerate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고;
글라이신 클리비지 시스템 (glycine cleavage system) 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 강화되어 있으며,
상기 중심탄소 동화회로를 가지고 있는 숙주 미생물에 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈 (formate-tetrahydrofolate ligase); 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈 (methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase); 및 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈 (methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 재조합 미생물 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 C3 화합물의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 미생물을 개미산 및 이산화탄소만을 탄소원으로 배양하여 C3 화합물을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 C3 화합물을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 피루브산을 중간산물로 한 유용물질의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 미생물을 개미산 및 이산화탄소만을 탄소원으로 배양하여 피루브산을 중간산물로 한 유용물질을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 유용물질을 회수하는 단계.
본 발명은 자연계에 풍부하게 존재하는 이산화탄소와 독성이 적고 반응 역학적으로 동화반응에 적합하며 이산화탄소로부터 쉽고 빠르게 합성이 가능한 개미산을 이용하여 C3 유기 화합물인 피루브산을 종래 기술에 비해 현저히 개선된 속도로 합성할 수 있고, 특히 포도당이 함유되지 않고 이산화탄소와 개미산만을 탄소원으로 함유한 배지에서도 재조합 미생물의 성장이 현저히 개선된 재조합 미생물을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 미생물을 이용하면 피루브산 및 이를 중간산물로 하는 다양한 고부가가치 화합물을 매우 경제적인 방법으로 합성할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 재조합 미생물의 이산화탄소와 개미산을 동화하는 핵심 대사회로 및 그에 관여하는 유전자 및 효소, 대사산물을 도시한 것이다.
도 2는 이산화탄소와 개미산 동화에 관여하는 유전자와 캔디다 (Candida) 속 유래 개미산 탈수소화효소가 삽입된 플라스미드와 아라비돕시스 (Arabidopsis) 속 유래 개미산 탈수소화효소의 변이체 (formate dehydrogenase)를 삽입하여 제작한 플라스미드 맵을 도시한 것이다.
도 3은 DH5α FC1부터 DH5α FC5까지 제작 균주에 따라 이산화탄소와 개미산만으로 배양 시 세포 성장을 측정한 그래프이다.
도 4는 DH5α FC5 균주의 시간에 따른 CFU 변화량을 측정한 그래프이다.
도 5는 배양 조건 최적화에 따른 세포 성장을 비교한 그래프이다.
도 6은 서로 다른 플라스미드 카피 넘버 (Copy number)를 갖도록 제작된 플라스미드 맵과 플라스미드 종류에 따른 유전자 발현량 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 DH5α FC5, FC7, FC8 균주를 이산화탄소와 개미산만을 첨가하여 배양했을 때 각 균주의 세포 성장을 측정한 그래프이다.
도 8는 DH5α FC8 균주의 이산화탄소와 개미산만을 이용한 플라스크 배양에 따른 세포 성장 그래프이다.
도 9은 DH5α FC8 균주의 37
Figure pat00001
대비 32
Figure pat00002
배양시 cyoA, cyoB, cydA, cydB의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 DH5α FC8 균주의 이산화탄소와 개미산만을 이용한 발효기 배양에 따른 세포 성장 그래프이다.
도 11은 DH5α FC8 균주의 이산화탄소와 개미산만을 이용한 발효기 배양에 따른 세포 성장 그래프이다.
도 12은 DH5α FC9 균주의 이산화탄소와 개미산만을 이용한 발효기 배양에 따른 세포 성장 그래프이다.
도 13은 개미산 동화 대사회로를 도입한 맨하이미아 균주 (LPK7_FTF)와 야생형 맨하이미아 균주 (LPK7)의 세린에서 개미산으로부터 유래한 13C 탄소를 검출한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 종래 본 발명자들에 의해 발명된 개미산과 이산화탄소로부터 C3 화합물을 합성할 수 있는 신규한 순환형 대사 경로를 갖는 재조합 미생물 (KR 10-2000755)을 대사공학적으로 추가로 개량하여, 이산화탄소와 개미산을 피루브산으로 전환하는 속도를 현저히 향상시키고, 특히 재조합 미생물을 성장시키기 위하여 공급되던 포도당을 추가로 공급하지 않고도 이산화탄소와 개미산만을 이용하여 재조합 미생물이 성장할 수 있도록 하였으며, 상기 재조합 미생물이 피루브산을 합성할 수 있는 발효공정도 함께 개량함으로써 종래 기술에 비해 C3 화합물 합성 효율이 현저히 개선될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 중심탄소 동화회로를 가지고 있는 숙주 미생물에서, 글라이신 클리비지 시스템 전사 억제 효소 (glycine cleavage system transcriptional repressor); 파이루베이트 포메이트 라이에이즈 (pyruvate formate lyase); 및 포스포글라이서레이트 디하이드로지네이즈 (phosphoglycerate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고;
글라이신 클리비지 시스템 (glycine cleavage system) 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 강화되어 있으며,
상기 중심탄소 동화회로를 가지고 있는 숙주 미생물에 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈 (formate-tetrahydrofolate ligase); 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈 (methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase); 및 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈 (methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 개미산 동화회로는 미생물에서 이산화탄소와 개미산을 탄소 3개로 구성된 피루브산으로 동화하는 순환형 회로로 도 1에는 대장균의 개미산 동화 회로에 관여하는 유전자, 조효소 및 에너지 전달 물질을 도시하였다.
본 발명에서 상기 개미산 동화회로는 중심탄소 동화 회로와 결합하여 탄소 3개 이상으로 구성된 탄소 화합물을 합성할 수 있는데, 상기 숙주 미생물은 i) 중심탄소 동화 회로가 내재되어 있거나; ii) 중심탄소 동화 회로가 외부에서 도입됨으로써, 중심탄소 동화 회로를 가지게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 미생물은 에스처리키아 (Escherichia) 속, 맨하이미하 (Mannheimia) 속, 로도박터 (Rhodobacter) 속 및 메틸로박테리엄 (Methylobacterium) 속으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 글라이신 클리비지 시스템 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현은 내재적 프로모터를 강한 프로모터로 치환하여 강화시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 강한 프로모터는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈 (formate-tetrahydrofolate ligase), 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈 (methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈 (methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)는 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 (Methylobacterium extorquens) 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈 (formate-tetrahydrofolate ligase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되고, 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈 (methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되며, 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈 (methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은, 포스포에놀파이루베이트 합성효소 억제 단백질 (posphoenolpyruvate synthetase regulatory protein); 포스포리보실글라시나마이드 포밀트렌스퍼레이즈 (phosphoribosylglycinamide formyltransferase)를 코딩하는 유전자가 추가로 약화 또는 결실되어 있고,
포스포에놀파이루베이트 신테이즈 (phosphoenolpyruvate synthase); H+ 트랜스로케이팅 NAD(P) 트랜스하이드로지네이즈 (H+ translocating NAD(P) transhydrogenase)를 코딩하는 유전자의 발현이 추가로 강화되어 있으며,
상기 재조합 미생물에 개미산 탈수소화효소 (formate dehydrogenase) 및/또는 이의 변이체를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포스포에놀파이루베이트 신테이즈 (phosphoenolpyruvate synthase, ppsA) 및 H+ 트랜스로케이팅 NAD(P) 트랜스하이드로지네이즈 (H+ translocating NAD(P) transhydrogenase, pntAB)를 코딩하는 유전자의 발현은 내재적 프로모터를 강한 프로모터로 치환하여 강화시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 강한 프로모터는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈(formate-tetrahydrofolate ligase), 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈(methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈(methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase), 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 및 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자는 카피 넘버 1~12를 갖는 복제원점을 포함하는 벡터에 클로닝되어 도입되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 카피 넘버 1~5를 갖는 복제원점을 포함하는 벡터에 클로닝되어 도입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase)는 칸디다 보이디니 (Candida boidinii) 유래일 수 있고, 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)를 코딩하는 유전자는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 유래일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 염기서열로 표시되고, 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)를 코딩하는 유전자는 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서는, 상기 재조합 미생물에서는 글라이신 클리비지 시스템 (glycine cleavage system) 반응에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자를 강화하기 위해 기존 프로모터에서 강한 프로모터로 교체를 진행하였고, 글라이신 클리비지 시스템을 억제하기 위하여, 글라이신 클리비지 시스템 전사 억제 효소를 암호화하는 유전자를 결실시켰다. 추가적으로 피루브산의 개미산으로의 불필요한 전환을 막고 피루브산 형성 흐름을 향상시키고자 파이루베이트 포메이트 리에이즈(pyruvate formate lyase)를 암호화하는 유전자를 결실시켰다. 또한, D-3-포스포글라이서레이트 디하이드로지네이즈(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자는 포도당을 포함하는 M9 최소 배지에서 성장에 필수적으로 요구되는 유전자로 이 유전자를 결실시킬 시 퓨린이나 메싸이오닌과 같은 대사산물을 생합성하는데 필요한 5, 10-CH2-THF를 C1 화합물 동화회로를 통해서만 생성해낼 수 있기 때문에 C1 화합물 동화회로의 대사흐름이 강화될수록 균주의 성장 또한 증가하기 때문에 D-3-포스포글라이서레이트 디하이드로지네이즈(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자를 결실시켰다.
본 발명에 따른 재조합 미생물은 개미산 및 이산화탄소만을 탄소원으로 이용하여 C3 화합물 생성이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 미생물은 또한, 개미산 및 이산화탄소만을 탄소원으로 성장이 가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 유전자는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
따라서, 본 발명은 상기 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열의 상동성과는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 단편 또한 단편의 길이와는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다.
또한, 본 발명의 유전자의 발현산물인 단백질의 아미노산 서열이 해당 효소의 역가 및 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 미생물 등 생물자원들로부터 확보될 수 있으며, 그러한 다른 생물자원으로부터 확보한 단백질 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
따라서, 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 아미노산 서열의 상동성과는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 폴리펩티드의 단편 또한 단편의 길이와는 무관하게, 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 단백질을 의미한다.
본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법 (electroporation) (Neumann, et al, EMBO J, 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.
본 발명에서 유전자가 약화된다는 의미는 야생형에 비해 유전자의 발현이 상대적으로 적어지거나 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 기능이나 활성이 야생형에 비해 감소함을 의미한다.
본 발명에 따른 유전자의 강화 또는 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.
염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
아울러, 본 발명에서 도입된 유전자는 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
한편, 본 발명에서는 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계에서 IPTG의 투여량, 배양 온도, 에어레이션, 및 개미산 농도와 pH 조건 등을 조절하여, 재조합 미생물의 성장을 7-11배까지 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 C3 화합물의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 상기 재조합 미생물을 개미산 및 이산화탄소만을 탄소원으로 배양하여 C3 화합물을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 C3 화합물을 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계에서 0.02 - 0.08 mM의 IPTG를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.04 - 0.06 mM, 가장 바람직하게는 0.05 mM의 IPTG를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 종래 유전자 발현을 유도하는 IPTG를 1 mM 첨가하는 것에 비하여 상당히 감소된 용량의 IPTG를 이용하여 유전자 발현을 유도하는 것인데, 이와 같은 방법으로 이산화탄소와 개미산을 이용한 피루브산 합성 대사경로를 미세하게 조절하며 재조합 미생물의 성장을 강화시키게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 31 - 33
Figure pat00003
에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 32
Figure pat00004
에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기와 같은 온도 조건에서 사이토크롬 bo3 유비퀴놀 옥시데이즈 (cytochrome bo3 ubiquinol oxidase, Cyo)와 사이토크롬 bd-I 유비퀴놀 옥시데이즈 (cytochrome bd-I ubiquinol oxidase, Cyd)가 가장 효율적으로 환원력을 세포 에너지인 ATP로 전환하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 단계 중 개미산은 2 - 3 g/l의 농도로 유지하고, 배양 단계에서의 pH는 6.6 - 7.0으로 유지하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 초기 교반 속도 450 - 550 rpm으로 배양을 시작하여 최종 700 - 800 rpm까지 증가시키며 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이와 같은 개미산 농도와 pH, 에어레이션을 공급함으로써 본 발명에 따른 재조합 미생물의 성장률은 현저히 향상된다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 피루브산을 중간산물로 한 유용물질의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 상기 재조합 미생물을 개미산 및 이산화탄소만을 탄소원으로 배양하여 피루브산을 중간산물로 한 유용물질을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 유용물질을 회수하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 유용물질은 부탄올, 이소부탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, tert-부탄올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올이소부탄올, 퓨트레신, L-오르니틴, 아르기닌, 다핵방향족 탄화수소(PHA), 폴리락테이트, 폴리락테이트-co-글라이콜레이트, 폴리아이소발러레이트, 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 4-하이드록시부티레이트, 바이오디젤, 가솔린, 올레핀, 5-아미노발러릭산, 감마이미노부티릭산, 3-하이드록스피로피오닉산, 3-아미노프로피오닉산, 아크릴산, 1,3-디아미노프로판, 카프로락탐, 쓰레오닌, 발린, 이소류신, 푸마르산, 말릭산, 숙신산, 세라마이드, 아스타잔틴, 실리빈, 라이코펜, 루테인 및 레티놀로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 재조합 미생물과 이를 이용한 C3 화합물 제조방법은 다음과 같은 특징을 갖는다.
우선, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 대사공학적 균주 개량을 통해 이산화탄소와 개미산을 피루브산으로 전환하는 속도를 향상시켰다. 예를 들어, 이산화탄소 및 개미산을 이용하여 피루브산을 합성하는 본 발명자들의 최초 재조합 미생물에서 pflB 유전자와 serA 유전자를 추가로 결실시켜 이산화탄소와 개미산으로부터 피루브산을 합성하는 속도가 향상된 균주를 개발하였다 (DH5α RG5). 이 균주는 포도당에서 피루브산을 합성하는 속도의 12.9% 에 해당하는 속도로 이산화탄소와 개미산으로부터 피루브산을 합성하며, 이는 본 발명자들이 이산화탄소와 개미산으로부터 피루브산을 합성하도록 개발한 종래 재조합 미생물에 비해서도 70% 향상된 속도이다.
본 발명에 따른 재조합 미생물은 이산화탄소 및 개미산만을 이용하여 성장이 가능하다. 본 발명자들이 종래 개발한 재조합 미생물은 이산화탄소와 개미산으로 피루브산 생산이 가능하였으나, 재조합 미생물의 성장을 위하여서는 포도당을 별도로 공급하여야 하였다. 그러나 본 발명에 따른 재조합 미생물은 상기 이산화탄소와 개미산으로부터 피루브산을 합성하는 속도가 향상된 재조합 미생물 (DH5α RG5)의 게놈에서 ppsR 유전자와 purT 유전자를 결실시키고, ppsA 유전자의 native 프로모터를 강한 세기의 trc 프로모터로 교체하고, Candida boidinii 유래 개미산 탈수소화효소 유전자와 Arabidopsis thaliana 유래 개미산 탈수소화효소의 돌연변이체 유전자를 플라스미드를 통해 추가로 도입함으로써 포도당 공급 없이 이산화탄소와 개미산만을 이용하여 성장이 가능하도록 하였다.
본 발명에서는 상기 재조합 미생물 (DH5α FC5)의 성장 속도를 추가로 향상시키기 위하여 도입되는 플라스미드의 카피수가 추가로 조절된 재조합 미생물 (DH5α FC8)을 개발하였다. 이로써 재조합 미생물 DH5α FC5에 비해 재조합 미생물 DH5α FC8의 성장 속도는 추가로 1.14 배 증가하였다.
본 발명에서는 상기 재조합 미생물 (DH5α FC8)의 성장 속도를 추가로 향상시키기 위하여 pntAB 유전자의 native 프로모터를 강한 세기의 trc 프로모터로 교체한 재조합 미생물 (DH5α FC9)을 개발하였다. 이로써 재조합 미생물 DH5α FC8에 비해 재조합 미생물 DH5α FC9의 성장 속도는 추가로 2 배 증가하였다.
본 발명에서는 상기 재조합 미생물의 성장을 최대화 할 수 있는 배양 및 발효 조건을 개발하였다. 이는 기존에 보고된 (Kim, S. et al. Nat. Chem. Biol. 1-8, 2020) 이산화탄소와 개미산만을 이용하여 성장하는 대장균의 최대 성장 한계치 OD600 (약 1)에 비해 7-11배 이상 높은 최대 성장 한계치 OD600 =7.38-11.1를 나타내는 것으로, 이는 유전자 발현을 위한 IPTG의 투여량 감소, 배양 온도 감소, 에어레이션 향상, 및 개미산 농도와 pH 조절 등을 통해 달성되었다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 이산화탄소와 개미산 동화 회로 구축 및 대사 공학적 전략을 통한 이산화탄소와 개미산으로부터 피루브산 형성 대사흐름 향상
이산화탄소 및 개미산 동화 대사회로의 탄소 동화 대사흐름을 향상시키기 위하여 대장균의 gcvR, pflB, serA 유전자를 결실시키고 gcvT 프로모터를 강한 trc 프로모터로 교체한 재조합 대장균 균주에 이산화탄소와 개미산 동화회로에 관여하는 유전자 ftl, fch, mtd를 포함하는 플라스미드를 도입하여 전체 피루브산 중 12.9%를 이산화탄소와 개미산으로부터 합성하는 재조합 균주를 개발하였다.
구체적으로, 플라스미드 제작에 필요한 외래 유전자 단편들은 해당 유전자를 가지고 있는 미생물의 유전체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, 해당 유전자 증폭을 위해 설계한 프라이머를 이용하여 PCR 수행 후, 증폭된 유전자 단편을 회수 및 정제하여 준비하였으며, 해당 유전자와 프라이머 서열은 하기에 나타내었다.
대상 유전자 NCBI 정보 유래 미생물
ftfL 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈 (formate-tetrahydrofolate ligase)CP001298 REGION: 434499-436172[서열번호 01] Methylobacterium extorquens CM4
fch 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈(methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase)CP001298 REGION: 2231946-2232572
[서열번호 02]
Methylobacterium extorquens CM4
mtdA 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈(methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)CP001298 REGION: 2230986-2231852[서열번호 03] Methylobacterium extorquens CM4
대상
유전자
프라이머 서열
ftfL[서열번호01] [서열번호 04]: 5'-CCCGCTCGCCAAGGCTTGA AGGAGGAATTCATGCCCTCAGATATCGAGATC-3'
[서열번호 05]: 5'-CTAGAACAGCCCGTCGATC-3'
fch[서열번호02] [서열번호 06]: 5'-GATCGACGGGCTGTTCTAG AGGAGGAATTCATGGCCGGCAACGAGACGATC-3'[서열번호 07]: 5'-TCAGTTTACCTTGGACTTCAC-3'
mtdA[서열번호03] [서열번호 08]: 5'-GTGAAGTCCAAGGTAAACTGA AGGAGGAATTCATGTCCAAGAAGCTGCTCTTC-3'
[서열번호 09]: 5'-TCATCCGCCAAAACAGCCAAGTCA GGCCATTTCCTTGGCC-3'
이산화탄소와 개미산 동화 회로 구축을 위하여 상기 효소들을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작하였다.
플라스미드 특징
p100THF pBR322 복제원점, 앰피실린(Ampicillin) 내성유전자, BBa_23100 합성 프로모터 서열번호01 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈(formate-tetrahydrofolate ligase), 서열번호02 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈(methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), 및 서열번호 03 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈(methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)를 포함
플라스미드 골격(Backbone) 유전자 단편과 증폭된 유전자 단편들은 유전자 단편의 조립을 위해 통상적으로 사용되는 깁슨 어셈블리(Gibson assembly) 방법(Gibson et al., Nat. methods, 6:5, 343-345, 2009)을 이용하여 플라스미드를 제작하였으며, 각 플라스미드에는 상기 표에 기재된 외래 유전자들 중 하나 또는 그 이상을 포함하도록 제작되었다.
상기 방법에 의해 제작된 재조합 플라스미드를 대장균에 형질전환시켜 재조합 대장균을 제작하였다. 본 발명에서 사용된 대장균은 E. coli DH5α(Invitrogen, USA)이고, 대장균에의 형질전환은 당업계에서 일반적으로 사용되는 화학적 형질전환 방법을 이용하였다.
여기에, 글라이신 클리비지 시스템 (glycine cleavage system) 반응에 관여하는 효소를 암호화하는 gcvTHP 유전자 (gcvT, NCBI GeneID: 947390; gcvH, NCBI GeneID: 947393; gcvP, NCBI GeneID: 947394) 강화를 위해 기존 프로모터에서 강한 trc 프로모터로 교체를 진행하였고, 글라이신 클리비지 시스템을 억제하는 유전자 gcvR을 결실시켰다. 추가적으로 피루브산의 개미산으로의 불필요한 전환을 막고 피루브산 형성 흐름을 향상시키고자 파이루베이트 포메이트 리에이즈(pyruvate formate lyase)를 암호화하는 pflB 유전자를 결실시켰다. 또한, D-3-포스포글라이서레이트 디하이드로지네이즈(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 serA는 포도당을 포함하는 M9 최소 배지에서 성장에 필수적으로 요구되는 유전자로 이 유전자를 결실시킬 시 퓨린이나 메싸이오닌과 같은 대사산물을 생합성하는데 필요한 5, 10-CH2-THF를 C1 화합물 동화회로를 통해서만 생성해낼 수 있기 때문에 C1 화합물 동화회로의 대사흐름이 강화될수록 균주의 성장 또한 증가하기 때문에 serA 유전자를 결실시켰다. 강화 및 결실된 유전자들은 하기와 같다.
대상 유전자 NCBI 정보 유래 미생물
gcvT 아미노메틸트랜스퍼레이즈(aminomethyltransferase)
NCBI GeneID:947390
[서열번호 10]
Escherichia coli.
gcvH 글리신 클리비즈 시스템 에이치 프로틴(glycine cleavage system H protein)
NCBI GeneID:947393
[서열번호 11]
Escherichia coli.
gcvP 글리신 디카복실레이즈(glycine decarboxylase)
NCBI GeneID:947394
[서열번호 12]
Escherichia coli.
pflB 파이루베이트 포메이트 라이에이즈(pyruvate formate lyase)
NCBI GeneID:945514
[서열번호 13]
Escherichia coli.
serA 포스포글라이서레이트 디하이드로지네이즈(phosphoglycerate dehydrogenase)NCBI GeneID:945258
[서열번호 14]
Escherichia coli.
gcvR 글라이신 클리비지 시스템 전사 억제 효소(glycine cleavage system transcriptional repressor)Gene ID: 946950[서열번호 15] Escherichia coli.
균주명 유전자형
DH5α GTPS DH5α strain where gcvR, pflB and serA genes were deleted and native promoter of gcvT was changed to trc promoter
상기 제작된 균주에 p100THF 플라스미드를 도입하여 아래와 같은 균주를 제작하였다.
DH5α RG5 DH5α_GTPS harboring p100THF
제작된 재조합 대장균 (DH5α RG5)의 이산화탄소 및 개미산 동화 대사흐름 향상을 확인하기 위하여, 상기 재조합 대장균(DH5α RG5)을 실험군, 야생형 대장균(DH5α WT)을 대조군으로 탄소 동위원소 분석을 진행하였다.
성분 함량 (g/l)
Na2HPO4 3.6
KH2PO4 3
NaCl 0.5
NH4Cl 1
MgSO4 0.24
CaCl2 0.011
Glucose 5
Sodium formate 13C 2.76
Folate 0.01
Sodium bicarbonate 13C 3.4
FeSO4 0.00455
NiSO4 0.00464
Sodium molybdate 0.00618
Thiamine 0.01
상기 대조군 및 실험군 대장균을 질량수 13인 탄소 동위원소가 표지된 개미산 및 바이카보네이트 이온을 포함한 M9 배지에서 배양한 후 (상기 표 7 조성물 참조), 대장균 세포 시료를 분석하였다. 대장균 세포 시료를 이용한 대장균 구성 아미노산 질량수 분석은 대장균을 구성하는 모든 단백질을 강한 산과 고온 조건에서 가수분해 처리 후, 가스-크로마토그래피/매스-스펙트로스코피 분석법을 이용하여 진행하였다(Zamboni et al., Nat. protocols, 4:6, 878-892, 2009).
동위원소 분석 결과 상기한 DH5α RG5 균주는 전체 피루브산 형성 흐름 중 이산화탄소와 개미산 동화를 통한 피루브산 형성 흐름이 12.9%까지 향상된 것을 확인하였다.
실시예 2: 대사공학적 균주 개량을 통한 이산화탄소와 개미산만을 사용하여 성장하는 재조합 미생물 개발
실시예 1에서 제작한 재조합 대장균 균주의 게놈상에서 ppsR, purT 유전자를 결실시키고 ppsA 유전자의 프로모터를 강한 trc 프로모터로 교체하여 재조합 대장균 균주 (DH5α AKO1)를 제작하였고 여기에 실시예 1에서 제작한 플라스미드에 추가적으로 fdh 유전자와 fdhmut 유전자를 추가한 플라스미드(p100FA2)를 도입하여 이산화탄소와 개미산만으로 성장하는 대장균 (DH5α FC5)을 제작하였다.
대상 유전자 NCBI 정보 유래 미생물
ppsR 포스포에놀파이루베이트 합성효소 억제 단백질(posphoenolpyruvate synthetase regulatory protein)NCBI GeneID:946207
[서열번호 16]
Escherichia coli.
purT 포스포기보실글라시나마이드 포밀트렌스퍼레이즈(phosphoribosylglycinamide formyltransferase)NCBI GeneID:946368[서열번호 17] Escherichia coli.
플라스미드 특징
p100FA2 pBR322 복제원점, 앰피실린(Ampicillin) 내성유전자, BBa_23100 합성 프로모터 서열번호 01 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈(formate-tetrahydrofolate ligase), 서열번호 02 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈(methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), 서열번호 03 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈(methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase), 서열번호 18 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 서열번호 21 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)를 포함
세포가 포도당 없이 이산화탄소와 개미산만으로 성장하기 위해서는 에너지와 환원력 (redox)의 원활한 공급이 필수적이다. 이를 위해 개미산을 이산화탄소로 전환하면서 NADH와 NADPH를 생성하는 대사 흐름이 요구되었다. 따라서 NAD+를 이용하는 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase)를 암호화하는 Candida boidinii 유래 fdh 유전자와 NADP+를 이용하는 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase)를 암호화하는 Arabidopsis thaliana 유래 fdh 유전자의 돌연변이체 fdh mut 를 기존 p100THF 플라스미드에 도입하여 p100FA2 플라스미드를 제작하였다.
플라스미드 특징
p100FA2 pBR322 복제원점, 앰피실린(Ampicillin) 내성유전자, BBa_23100 합성 프로모터 서열번호 01 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈(formate-tetrahydrofolate ligase), 서열번호 02 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈(methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), 서열번호 03 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈(methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase), 서열번호 18 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 서열번호 21 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)를 포함
대상 유전자 NCBI 정보 유래 미생물
fdh 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase)EC:1.17.1.9
[서열번호 18]
Candida boidinii
대상
유전자
프라이머 서열
fdh[서열번호18] [서열번호 19]: 5'- attgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatgaagatcgttttagtcttata -3'
[서열번호 20]: 5'- gtaccgagctcgaattccatttatttcttatcgtgtttac -3'
대상 유전자 NCBI 정보 유래 미생물
fdhmut 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)NCBI_GeneID:831330
[서열번호 21]
L229H mutant
Arabidopsis thaliana
대상 유전자 프라이머 서열
fdhmut[서열번호21] [서열번호 22]: 5'-gtaaacacgataagaaataaaggaggaattcatggcgatgagacaagccgc-3'
[서열번호 23]: 5'- tcatccgccaaaacagccaagttaccggtactgaggagcaag -3'
DH5α AKO1 균주에 p100FA2 플라스미드를 도입한 DH5α FC5 균주의 경우 M9 최소배지에 이산화탄소와 개미산만을 첨가해 주었을 때 (표 15) 초기 광학 밀도 0.051에서 150시간 배양 동안 0.285까지 성장하였다. 반면 음성대조군 (DH5a FC1, FC2, FC3)들은 균주 성장이 전혀 관찰되지 않았다.
성분 함량 (g/l)
Na2HPO4 6.8
KH2PO4 3
NaCl 0.5
NH4Cl 2
MgSO4 0.8
NaHCO3 4.2
IPTG 0.24
EDTA 0.05
Thiamine 0.002
Trace metal solution 5ml
Sodium formate 4.43
균주명 유전자형
DH5α AKO ppsR gene was knocked out and native promoter of ppsA gene was changed to trc promoter in the DH5α_GTPS strain
DH5α AKO1 purT gene was knocked out from the AKO strain
DH5α FC1 DH5α_GTPS harboring p100FA1
DH5α FC2 AKO harboring p100FA1
DH5α FC3 AKO1 harboring p100FA1
DH5α FC5 AKO1 harboring p100FA2
추가적으로 세포분열에 의한 세포 수 증가를 측정하기 위해 집락 형성 단위(colony forming unit, CFU)를 측정한 결과 초기 CFU 4.8 x 107 CFUs/ml (OD600 0.051)에서 50시간 이후 14.1 x 107 CFUs/ml (OD600 0.2)까지 증가하였으며, 이후 CFU가 점점 감소하여 150시간 이후에는 5.2 x 107 CFUs/ml (OD600 0.285)까지 감소하였다. (도 3, 4)
실시예 3: 배양 환경 및 유전자 발현량 최적화를 통한 성장률 향상
실시예 2에서 제작한 DH5α FC5 균주의 배양 조건을 최적화하고, 기존 플라스미드의 카피 넘버(copy number)를 감소시킨 플라스미드를 제작하여 이산화탄소와 개미산만을 첨가한 조건에서 성장이 향상된 DH5α FC8 균주를 제작하였다. 또한 기존 37
Figure pat00005
배양 온도를 32
Figure pat00006
로 감소시켜 cyo 발현량을 높이고 cyd 발현량을 낮추어 DH5α FC8 균주가 이산화탄소와 개미산만을 이용하여 광학 밀도 0.018에서 3.59까지 성장하는 것을 확인하였다.
실시예 3-1: 이산화탄소와 개미산만을 이용하여 성장하는 재조합 균주의 배양 조건 최적화
실시예 2에서 제작한 DH5α FC5 균주의 배양 조건 최적화를 진행하였다. 유전자 발현을 촉진하기 위해 사용하는 유도물질인 IPTG 농도를 기존 1mM에서 0.05mM로 줄이고 에어레이션을 강화하기 위해 기존 배양 조건 (100ml 베플 플라스크에 배양액 30ml 첨가)을 새로운 배양 조건 (300ml 베플 플라스크에 배양액 50ml)으로 변경하였고 배양 결과, 최종 세포 밀도가 기존 배양 조건 대비 2.16배 증가하였다 (도 5).
실시예 3-2: 유전자 발현량 최적화를 통한 이산화탄소와 개미산만을 이용하여 성장하는 재조합 균주의 성장 향상
이산화탄소와 개미산만을 이용하여 성장할 때 제한된 영양분 공급으로 인하여 세포가 실제로 요구하는 발현량보다 과도한 발현이 진행되면 세포 성장에 부정적 영향을 미치기 때문에 충분히 높은 세포 농도 달성을 위해 유전자 발현량 최적화가 진행되었다. 플라스미드 카피 넘버 10-12를 갖는 p15A 복제 원점과 카피 넘버 1-5를 갖는 pSC101 복제 원점을 각각 p100FA1 플라스미드에 치환하여 하기 플라스미드를 제작하였다. (도 6)
플라스미드 특징
p184FA p15A 복제원점, 클로로암페니콜(chloramphenicol) 내성유전자, BBa_23100 합성 서열번호 01 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈(formate-tetrahydrofolate ligase), 서열번호 02 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈(methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), 서열번호 03 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈(methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase), 서열번호 18 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 서열번호 21 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)를 포함
p518FA pSC101 복제원점, 클로로암페니콜(chloramphenicol) 내성유전자, BBa_23100 합성 서열번호 01 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈(formate-tetrahydrofolate ligase), 서열번호 02 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈(methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), 서열번호 03 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈(methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase), 서열번호 18 개미산 탈수소화효소 (formate dehydrogenase), 서열번호 21 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)를 포함
클로로람페니콜(chloroamphenicol) 내성 유전자와 p15A 복제 원점(Replication origin), 합성 프로모터 BBa_23100을 포함하는 pACYC184 플라스미드와 클로로람페니콜(chloroamphenicol) 내성 유전자와 pSC101 복제 원점(Replication origin), 합성 프로모터 BBa_23100을 포함하는 pJH518 플라스미드를 주형으로 각각 서열번호 24 부터 서열번호 27의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 유전자 단편을 회수 및 정제하여 재조합 플라스미드 제작시 플라스미드 골격(Backbone)으로 사용할 유전자 단편을 준비하였다.
[서열번호 24]: 5'-TGCTGAAAATAAGTCGTCCTGGATCCACTAGTTCTAGAGCGG-3'
[서열번호 25]: 5'-ACTATTTACGAAAGTCTCGGGCTTATCGATACCGTCGACCTCG-3'
[서열번호 26]: 5'-TGCTGAAAATAAGTCGTCCTGCACCTCGCTAACGGATTCACCAC-3'
[서열번호 27]: 5'-ACTATTTACGAAAGTCTCGGGAATTACAACTTATATCGTATGGGGC-3'
DH5α AKO1 균주에 상기 플라스미드 p184FA를 도입하여 DH5α FC7 균주를 제작하였고, 플라스미드 p518FA를 도입하여 DH5α FC8 균주를 제작하였다. 실시예 3-1에서 개발한 최적 배양 조건에서 두 균주를 배양하였을 때 DH5α FC8 균주는 초기 광학 밀도 0.06에서 0.607까지 200시간 동안 성장하며 DH5α FC5보다 1.14배 높아진 성장을 보였고 성장률 또한 가장 높았다. (도 7)
균주명 유전자형
DH5α FC7 AKO1 harboring p184FA
DH5α FC8 AKO1 harboring p518FA
실시예 3-3: 사이토크롬 bo3 유비퀴놀 옥시데이즈 (cytochrome bo3 ubiquinol oxidase, Cyo) 효소와 사이토크롬 bd-I 유비퀴놀 옥시데이즈 (cytochrome bd-I ubiquinol oxidase, Cyd) 효소의 발현량 최적화를 통한 이산화탄소와 개미산만을 이용하여 성장하는 재조합 균주의 성장 향상
사이토크롬 bo3 유비퀴놀 옥시데이즈 (cytochrome bo3 ubiquinol oxidase, Cyo) 효소(NCBI GeneID: 945080, 945615, 946897, 944918)와 사이토크롬 bd-I 유비퀴놀 옥시데이즈 (cytochrome bd-I ubiquinol oxidase, Cyd) 효소(NCBI GeneID: 945341, 945347)는 대장균의 내막에 위치한 효소들로 환원력을 세포 에너지인 ATP로 변환한다. 보고된 바에 따르면(Gadgil, M., Kapur, V. & Hu, W. S. Biotechnol. Prog. 21, 689-699, 2005) 37
Figure pat00007
보다 더 낮은 온도에서 대장균을 배양하였을 때 Cyo의 발현량은 올라가고 Cyd의 발현량은 내려간다고 알려져 있다. 두 효소 중 Cyo가 Cyd보다 더 효율적으로 환원력을 ATP로 전환하므로 Cyo의 발현량을 높이고 Cyd의 발현량을 낮추기 위해 30, 32, 33
Figure pat00008
에서 상기 FC8 균주를 배양하였다. 32
Figure pat00009
에서 배양 결과, 광학밀도 0.018에서 시작하여 791.5 시간동안 3.59까지 성장하였으며 (도 8), Cyo의 발현량이 증가하고 Cyd의 발현량이 감소하였다. (도 9) 상기 발현양 변화는 real-time quantification PCR을 통한 RNA 상대정량 방법을 통해 Cyo 발현에 사용되는 mRNA의 양과 Cyd 발현에 사용되는 mRNA의 양을 비교하여 확인하였다. 상기 mRNA 상대정량 방법에 사용된 프라이머는 하기 표 19에 나타내었다.
대상 유전자 프라이머 서열
rrsA [서열번호 28]: 5'- tgcataaaccgacactggcg -3'
[서열번호 29]: 5'- ttaacctgcttgccgtgctc -3'
cyoA [서열번호 30]: 5'- tggctgcgttcgaaaaactg -3'
[서열번호 31]: 5'- acatcggcaaacaagtctgg -3'
cyoB [서열번호 32]: 5'- ttgcgcacttccataacgtg -3'
[서열번호 33]: 5'- tgaaaccgaacgctttaggc -3'
cydA [서열번호 34]: 5'- ttacgcactgggcatcattg -3'
[서열번호 35]: 5'- atgcgttcttcatgctgcac -3'
cydB [서열번호 36]: 5'- aactccattgcaccacactg -3'
[서열번호 37]: 5'- aagaacaaagacgccagcac -3'
실시예 4: 이산화탄소와 개미산만을 이용하여 성장하는 재조합 균주에 최적화된 발효 공정 개발
이산화탄소와 개미산만을 이용하여 성장하는 재조합 균주 배양에 최적화된 발효 공정을 개발하여 상기 재조합 균주의 성장을 향상시켰다. 배양액의 개미산 농도와 pH를 일정 수준으로 유지하기 위해 pH stat mode를 이용하여 자동으로 30 % 개미산 용액을 공급하여 배양 시간 동안 배지 내 개미산 농도 (2~3g/l)와 pH (6.8)를 세포배양에 최적 수준으로 유지하였다. 또한 에어레이션 강화를 위하여 초기 교반 속도 500 rpm에서 광학 밀도가 1 성장할 때마다 교반속도를 50rpm씩 늘려 최종 750rpm까지 증가시켰다. 상기 최적화된 발효 공정에서 상기 DH5α FC8 균주는 초기 광학 밀도 1.02에서 450 시간 후 7.38까지 성장하였다 (도 10). 또한, 한 차례의 발효를 추가로 수행하였으며 상기 최적화된 발효 공정에서 상기 DH5α FC8 균주는 초기 광학 밀도 0.91에서 577 시간 후 11.1까지 성장하였다 (도 11).
실시예 5: 이산화탄소와 개미산만을 이용하여 성장하는 재조합 균주에 최적화된 발효 공정을 이용해 더 빠른 속도로 성장 가능한 재조합 균주 개발
실시예 4에서 개발된 최적화된 발효공정에서 상기 DH5α FC8 균주는 초기 광학 밀도 1.02에서 450시간 후 7.38 및 초기 광학 밀도 0.91에서 577시간 후 11.1까지 성장하였다 (도 10 및 도 11). 상기 DH5α FC8의 게놈상에서 pntAB 유전자의 프로모터를 강한 trc 프로모터로 교체하여 재조합 대장균 균주 (DH5α FC9)를 제작하였고 실시예 4에서 개발된 최적화된 발효 공정에서 DH5α FC9 균주는 초기 광학 밀도 1.01에서 206시간 후 10.2까지 성장하였다. 이는 동일한 시간 (206 시간)에 DH5α FC8 균주가 초기 광학 밀도 0.91에서 광학 밀도 5 정도의 세포 성장을 보이는 것과 비교하면 2배 가량 빠른 성장을 보인다는 것을 알 수 있다 (도 12).
Figure pat00010
실시예 6: 맨하이미아 속 미생물에 개미산 동화 대사회로 도입 및 개미산 동화능 검증
본 발명에서 개발한 개미산 동화 대사회로에 의해 대장균 이외의 중심탄소 대사회로를 가지고 있는 숙주 미생물에서도 개미산 동화가 진행됨을 확인하였다. 본 실시예에서는 맨하이미아 속 미생물에 개미산 동화 대사회로를 도입하여, 개미산 동화 진행 여부를 탄소 동위원소 분석법을 통해 확인하였다.
우선 맨하이미아 속 미생물에 개미산 동화회로에 관여하는 유전자 ftl, fch, mtd를 포함하는 플라스미드를 도입하여 개미산 동화회로를 포함한 재조합 미생물을 제작하였다. 구체적으로, 플라스미드 제작에 필요한 외래 유전자 단편들은 해당 유전자를 가지고 있는 실시예 1에서 제작한 p100THF 플라스미드를 주형으로 하고, 해당 유전자 증폭을 위해 설계한 프라이머를 이용하여 PCR 수행 후, 증폭된 유전자 단편을 회수 및 정제하여 준비하였다. 프라이머 서열은 하기 표 21 에 나타내었다.
대상 유전자 프라이머 서열
ftfL-fch-mtd [서열번호 38]: 5'- ttatcaactctactggggaggaattcatgccctcagatatcgagatc -3'
[서열번호 39]: 5'- tctagaggatccccgggtacctcaggccatttccttggcc -3'
개미산 동화 회로 구축을 위하여 상기 효소들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 플라스미드를 제작하였다.
플라스미드 특징
pMS3-THF pMB1 복제원점, 맨하이미아 복제원점, 앰피실린(Ampicillin) 내성유전자, frdA 프로모터 서열번호01 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈(formate-tetrahydrofolate ligase), 서열번호02 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈(methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), 및 서열번호 03 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈(methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)를 포함
플라스미드 골격(Backbone) 유전자 단편과 증폭된 유전자 단편들은 유전자 단편의 조립을 위해 통상적으로 사용되는 깁슨 어셈블리(Gibson assembly) 방법(Gibson et al., Nat. methods, 6:5, 343-345, 2009)을 이용하여 플라스미드를 제작하였으며, 각 플라스미드에는 상기 표에 기재된 외래 유전자들 중 하나 또는 그 이상을 포함하도록 제작되었다.
상기 방법에 의해 제작된 재조합 플라스미드를 맨하이미아균에 형질전환시켜 재조합 맨하이미아균을 제작하였다. 본 발명에서 사용된 맨하이미아균은 Mannheimia succiniciproducens LPK7 이고, 맨하이미아균의 형질전환은 당업계에서 일반적으로 사용되는 전기천공법을 이용하였다.
개미산 동화능 분석을 위해 개미산 동화 대사회로가 도입된 재조합 맨하이미아 균주 (LPK7_FTF) 와 공벡터를 도입한 음성대조군 균주 (LPK7)를 Brain Heart Infusion (BHI) 배지에 2 g/l 글리신과 13C로 표지된 개미산염 4.43 g/l를 첨가하여 배양 후 바이오매스에 포함된 세린에 포함된 탄소 동위원소의 비율을 측정하였다. 개미산 동화 대사회로에 의해 개미산 동화가 진행될 경우 도 1에 표시된 개미산 동화 대사회로에 의해 개미산 유래 탄소는 세린의 1번 탄소에 위치하게 된다. 측정 결과 개미산 동화 대사회로를 도입한 LPK7_FTF 균주에서는 바이오매스에 포함된 전체 세린 중 약 19.5 %에서 개미산으로부터 유래한 13C 탄소가 검출되었으나, 음성대조균 균주의 경우 세린에서 13C 탄소가 전혀 검출되지 않았다 (도 13).
본 실시예에서 사용된 유전자 서열
유전자 이름 유전자 서열 (5 - 3)
ftfL
[서열번호 1]
atgccctcagatatcgagatcgcccgcgcggcgaccctgaagccgatcgcccaggtcgccgaaaagctcggcatcccggacgaggcgcttcacaattacggcaagcacatcgccaagatcgaccacgacttcatcgcctcgctcgagggtaagcccgagggcaagctggtgctcgtcaccgcgatctcgccgacgcctgcgggcgagggcaagaccaccacgactgtggggctcggcgacgcgctcaaccgcatcggcaagcgggcggtgatgtgcctgcgcgagccctcgctcggcccctgcttcggcatgaagggcggcgcggccggtggcggcaaggcgcaggtcgtgccgatggagcagatcaacctgcacttcaccggcgacttccacgccatcacctcggcgcactcgctcgccgccgctctgatcgacaaccacatctactgggccaacgagctcaacatcgacgtgcgccgcatccactggcgccgcgtggtcgacatgaacgaccgagcgctgcgcgcgatcaaccagtcgctcggcggcgtcgccaacggctttccgcgtgaggacggcttcgacatcaccgtcgcctccgaggtgatggcggtgttctgcctcgccaagaatctggctgacctcgaagagcggctcggccgcatcgtcatcgccgagacccgcgaccgcaagccggtgacgctggccgacgtgaaggcgaccggtgcgatgaccgttctcctcaaggacgcgcttcagccgaacctcgtgcagacgctggagggcaacccggccctgatccatggcggcccgttcgccaacatcgcccacggctgcaactcggtgatcgccacccgcaccggcctgcggctggccgactacaccgtcaccgaggccggcttcggcgcggatctcggcgcggagaagttcatcgacatcaagtgccgccagaccggcctcaagccctcgtcggtggtgatcgtcgccacgatccgcgccctcaagatgcatggcggcgtcaacaagaaggatctccaggctgagaacctcgacgcgctggagaagggcttcgccaacctcgagcgccacgtgaataacgtccggagcttcggcctgccggtggtggtgggtgtgaaccacttcttccaggacaccgacgccgagcatgcccggttgaaggagctgtgccgcgaccggctccaggtcgaggcgatcacctgcaagcactgggcggagggcggcgcgggcgccgaggcgctggcgcaggccgtggtgaagctcgccgagggcgagcagaagccgctgaccttcgcctacgagaccgagacgaagatcaccgacaagatcaaggcgatcgcgaccaagctctacggcgcggccgacatccagatcgagtcgaaggccgccaccaagctcgccggcttcgagaaagacggctacggcaaattgccggtctgcatggccaagacgcagtactcgttctcgaccgacccgaccctgatgggcgcgccctcgggccacctcgtctcggtgcgcgacgtgcgcctctcggcgggcgccggcttcgtcgtggtgatctgcggtgagatcatgaccatgccgggtctgccaaaagtgccggcggcggacaccatccgcctggacgccaacggtcagatcgacgggctgttctag
fch
[서열번호 2]
atggccggcaacgagacgatcgaaacattcctcgacggcctggcgagctcggccccgacccccggcggcggcggtgccgccgcgatctccggcgccatgggcgcggcgctggtgtcgatggtgtgcaacctcaccatcggcaagaagaagtatgtcgaggtcgaggccgacctgaagcaggtgctggagaagtcggaaggcctgcgccgcacgctcaccggcatgatcgccgacgacgtcgaggctttcgacgcggtgatgggcgcctacgggctgccgaagaacaccgacgaagagaaggccgcccgcgccgccaagattcaagaggcgctcaaaaccgcgaccgacgtgccgctcgcctgctgccgcgtctgccgcgaggtgatcgacctggccgagatcgtcgccgagaagggcaatctcaacgtcatctcggatgccggcgtcgccgtgctctcggcctatgccggcctgcgctcggcggcccttaacgtctacgtcaacgccaagggcctcgacgaccgcgccttcgccgaggagcggctgaaggagctggagggcctactggccgaggcgggcgcgctcaacgagcggatctacgagaccgtgaagtccaaggtaaactga
mtdA
[서열번호 3]
atgtccaagaagctgctcttccagttcgacaccgatgccacgccgagcgtcttcgacgtcgtcgtcggctacgacggcggtgccgaccacatcaccggctacggcaacgtcacgcccgacaacgtcggcgcctatgtcgacggcacgatctacacccgcggcggcaaggagaagcagtcgacggcgatcttcgtcggcggcggcgacatggcggccggcgagcgggtgttcgaggcggtgaagaagcgcttcttcggcccgttccgcgtgtcctgcatgctggattcgaacggctccaacacgaccgctgcggcgggcgtggcgctcgtcgtcaaggcggcgggcggctcggtcaagggcaagaaggccgtcgtgctcgcgggcaccggcccggtcggcatgcgctcggcggcgctgcttgccggcgagggcgccgaggtcgtgctgtgcgggcgcaagctcgacaaggcgcaggccgcggccgattccgtgaacaagcgcttcaaggtgaacgtcaccgcggccgagaccgcggacgacgcttcgcgtgccgaggccgtgaagggcgcccatttcgtcttcaccgccggtgcgatcggccttgaactgctgccgcaggcagcctggcagaacgagagttcgatcgagatcgtggccgactacaacgcccagccgccgctcggcatcggcgggatcgatgcgaccgacaaaggcaaggaatacggcggaaagcgcgccttcggtgcgctcggcatcggcggcttgaagctcaagctgcaccgcgcctgcatcgccaagctgttcgagtcgagcgaaggcgtcttcgacgccgaggagatctacaagctggccaaggaaatggcctga
gcvT
[서열번호 10]
atggcacaacagactcctttgtacgaacaacacacgctttgcggcgctcgcatggtggatttccacggctggatgatgccgctgcattacggttcgcaaatcgacgaacatcatgcggtacgtaccgatgccggaatgtttgatgtgtcacatatgaccatcgtcgatcttcgcggcagccgcacccgggagtttctgcgttatctgctggcgaacgatgtggcgaagctcaccaaaagcggcaaagccctttactcggggatgttgaatgcctctggcggtgtgatagatgacctcatcgtctactactttactgaagatttcttccgcctcgttgttaactccgccacccgcgaaaaagacctctcctggattacccaacacgctgaacctttcggcatcgaaattaccgttcgtgatgacctttccatgattgccgtgcaagggccgaatgcgcaggcaaaagctgccacactgtttaatgacgcccagcgtcaggcggtggaagggatgaaaccgttctttggcgtgcaggcgggcgatctgtttattgccaccactggttataccggtgaagcgggctatgaaattgcgctgcccaatgaaaaagcggccgatttctggcgtgcgctggtggaagcgggtgttaagccatgtggcttgggcgcgcgtgacacgctgcgtctggaagcgggcatgaatctttatggtcaggagatggacgaaaccatctctcctttagccgccaacatgggctggaccatcgcctgggaaccggcagatcgtgactttatcggtcgtgaagccctggaagtgcagcgtgagcatggtacagaaaaactggttggtctggtgatgaccgaaaaaggcgtgctgcgtaatgaactgccggtacgctttaccgatgcgcagggcaaccagcatgaaggcattatcaccagcggtactttctccccgacgctgggttacagcattgcgctggcgcgcgtgccggaaggtattggcgaaacggcgattgtgcaaattcgcaaccgtgaaatgccggttaaagtgacaaaacctgtttttgtgcgtaacggcaaagccgtcgcgtga
gcvH
[서열번호 11]
atgagcaacgtaccagcagaactgaaatacagcaaagaacacgaatggctgcgtaaagaagccgacggcacttacaccgttggtattaccgaacatgctcaggagctgttaggcgatatggtgtttgttgacctgccggaagtgggcgcaacggttagcgcgggcgatgactgcgcggttgccgaatcggtaaaagcggcgtcagacatttatgcgccagtaagcggtgaaatcgtggcggtaaacgacgcactgagcgattccccggaactggtgaacagcgaaccgtatgcaggcggctggatctttaaaatcaaagccagcgatgaaagcgaactggaatcactgctggatgcgaccgcatacgaagcattgttagaagacgagtaa
gcvP
[서열번호 12]
atgacacagacgttaagccagcttgaaaacagcggcgcttttattgaacgccatatcggaccggacgccgcgcaacagcaagaaatgctgaatgccgttggtgcacaatcgttaaacgcgctgaccggccagattgtgccgaaagatattcaacttgcgacaccaccgcaggttggcgcaccggcgaccgaatacgccgcactggcagaactcaaggctattgccagtcgcaataaacgcttcacgtcttacatcggcatgggttacaccgccgtgcagctaccgccggttatcctgcgtaacatgctggaaaatccgggctggtataccgcgtacactccgtatcaacctgaagtctcccagggccgccttgaagcactgctcaacttccagcaggtaacgctggatttgactggactggatatggcctctgcttctcttctggacgaggccaccgctgccgccgaagcaatggcgatggcgaaacgcgtcagcaaactgaaaaatgccaaccgcttcttcgtggcttccgatgtgcatccgcaaacgctggatgtggtccgtactcgtgccgaaacctttggttttgaagtgattgtcgatgacgcgcaaaaagtgctcgaccatcaggacgtcttcggcgtgctgttacagcaggtaggcactaccggtgaaattcacgactacactgcgcttattagcgaactgaaatcacgcaaaattgtggtcagcgttgccgccgatattatggcgctggtgctgttaactgcgccgggtaaacagggcgcggatattgtttttggttcggcgcaacgcttcggcgtgccgatgggctacggtggcccacacgcggcattctttgcggcgaaagatgaatacaaacgctcaatgccgggccgtattatcggtgtatcgaaagatgcagctggcaataccgcgctgcgcatggcgatgcagactcgcgagcaacatatccgccgtgagaaagcgaactccaacatttgtacttcccaggtactgctggcaaacatcgccagcctgtatgccgtttatcacggcccggttggcctgaaacgtatcgctaaccgcattcaccgtctgaccgatatcctggcggcgggcctgcaacaaaaaggtctgaaactgcgccatgcgcactatttcgacaccttgtgtgtggaagtggccgacaaagcgggcgtactgacgcgtgccgaagcggctgaaatcaacctgcgtagcgatattctgaacgcggttgggatcacccttgatgaaacaaccacgcgtgaaaacgtaatgcagcttttcaacgtgctgctgggcgataaccacggcctggacatcgacacgctggacaaagacgtggctcacgacagccgctctatccagcctgcgatgctgcgcgacgacgaaatcctcacccatccggtgtttaatcgctaccacagcgaaaccgaaatgatgcgctatatgcactcgctggagcgtaaagatctggcgctgaatcaggcgatgatcccgctgggttcctgcaccatgaaactgaacgccgccgccgagatgatcccaatcacctggccggaatttgccgaactgcacccgttctgcccgccggagcaggccgaaggttatcagcagatgattgcgcagctggctgactggctggtgaaactgaccggttacgacgccgtttgtatgcagccgaactctggcgcacagggcgaatacgcgggcctgctggcgattcgtcattatcatgaaagccgcaacgaagggcatcgcgatatctgcctgatcccggcttctgcgcacggaactaaccccgcttctgcacatatggcaggaatgcaggtggtggttgtggcgtgtgataaaaacggcaacatcgatctgactgatctgcgcgcgaaagcggaacaggcgggcgataacctctcctgtatcatggtgacttatccttctacccacggcgtgtatgaagaaacgatccgtgaagtgtgtgaagtcgtgcatcagttcggcggtcaggtttaccttgatggcgcgaacatgaacgcccaggttggcatcacctcgccgggctttattggtgcggacgtttcacaccttaacctacataaaactttctgcattccgcacggcggtggtggtccgggtatgggaccgatcggcgtgaaagcgcatttggcaccgtttgtaccgggtcatagcgtggtgcaaatcgaaggcatgttaacccgtcagggcgcggtttctgcggcaccgttcggtagcgcctctatcctgccaatcagctggatgtacatccgcatgatgggcgcagaagggctgaaaaaagcaagccaggtggcaatcctcaacgccaactatattgccagccgcctgcaggatgccttcccggtgctgtataccggtcgcgacggtcgcgtggcgcacgaatgtattctcgatattcgcccgctgaaagaagaaaccggcatcagcgagctggatattgccaagcgcctgatcgactacggtttccacgcgccgacgatgtcgttcccggtggcgggtacgctgatggttgaaccgactgaatctgaaagcaaagtggaactggatcgctttatcgacgcgatgctggctatccgcgcagaaattgaccaggtgaaagccggtgtctggccgctggaagataacccgctggtgaacgcgccgcacattcagagcgaactggtcgccgagtgggcgcatccgtacagccgtgaagttgcggtattcccggcaggtgtggcagacaaatactggccgacagtgaaacgtctggatgatgtttacggcgaccgtaacctgttctgctcctgcgtaccgattagcgaataccagtaa
pflB
[서열번호 13]
atgtccgagcttaatgaaaagttagccacagcctgggaaggttttaccaaaggtgactggcagaatgaagtaaacgtccgtgacttcattcagaaaaactacactccgtacgagggtgacgagtccttcctggctggcgctactgaagcgaccaccaccctgtgggacaaagtaatggaaggcgttaaactggaaaaccgcactcacgcgccagttgactttgacaccgctgttgcttccaccatcacctctcacgacgctggctacatcaacaagcagcttgagaaaatcgttggtctgcagactgaagctccgctgaaacgtgctcttatcccgttcggtggtatcaaaatgatcgaaggttcctgcaaagcgtacaaccgcgaactggatccgatgatcaaaaaaatcttcactgaataccgtaaaactcacaaccagggcgtgttcgacgtttacactccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgtatcatcggtgactaccgtcgcgttgcgctgtacggtatcgactacctgatgaaagacaaactggcacagttcacttctctgcaggctgatctggaaaacggcgtaaacctggaacagactatccgtctgcgcgaagaaatcgctgaacagcaccgcgctctgggtcagatgaaagaaatggctgcgaaatacggctacgacatctctggtccggctaccaacgctcaggaagctatccagtggacttacttcggctacctggctgctgttaagtctcagaacggtgctgcaatgtccttcggtcgtacctccaccttcctggatgtgtacatcgaacgtgacctgaaagctggcaagatcaccgaacaagaagcgcaggaaatggttgaccacctggtcatgaaactgcgtatggttcgcttcctgcgtactccggaatacgatgaactgttctctggcgacccgatctgggcaaccgaatctatcggtggtatgggcctcgacggtcgtaccctggttaccaaaaacagcttccgtttcctgaacaccctgtacaccatgggtccgtctccggaaccgaacatgaccattctgtggtctgaaaaactgccgctgaacttcaagaaattcgccgctaaagtgtccatcgacacctcttctctgcagtatgagaacgatgacctgatgcgtccggacttcaacaacgatgactacgctattgcttgctgcgtaagcccgatgatcgttggtaaacaaatgcagttcttcggtgcgcgtgcaaacctggcgaaaaccatgctgtacgcaatcaacggcggcgttgacgaaaaactgaaaatgcaggttggtccgaagtctgaaccgatcaaaggcgatgtcctgaactatgatgaagtgatggagcgcatggatcacttcatggactggctggctaaacagtacatcactgcactgaacatcatccactacatgcacgacaagtacagctacgaagcctctctgatggcgctgcacgaccgtgacgttatccgcaccatggcgtgtggtatcgctggtctgtccgttgctgctgactccctgtctgcaatcaaatatgcgaaagttaaaccgattcgtgacgaagacggtctggctatcgacttcgaaatcgaaggcgaatacccgcagtttggtaacaatgatccgcgtgtagatgacctggctgttgacctggtagaacgtttcatgaagaaaattcagaaactgcacacctaccgtgacgctatcccgactcagtctgttctgaccatcacttctaacgttgtgtatggtaagaaaacgggtaacaccccagacggtcgtcgtgctggcgcgccgttcggaccgggtgctaacccgatgcacggtcgtgaccagaaaggtgcagtagcctctctgacttccgttgctaaactgccgtttgcttacgctaaagatggtatctcctacaccttctctatcgttccgaacgcactgggtaaagacgacgaagttcgtaagaccaacctggctggtctgatggatggttacttccaccacgaagcatccatcgaaggtggtcagcacctgaacgttaacgtgatgaaccgtgaaatgctgctcgacgcgatggaaaacccggaaaaatatccgcagctgaccatccgtgtatctggctacgcagtacgtttcaactcgctgactaaagaacagcagcaggacgttattactcgtaccttcactcaatctatgtaa
serA
[서열번호 14]
atggcaaaggtatcgctggagaaagacaagattaagtttctgctggtagaaggcgtgcaccaaaaggcgctggaaagccttcgtgcagctggttacaccaacatcgaatttcacaaaggcgcgctggatgatgaacaattaaaagaatccatccgcgatgcccacttcatcggcctgcgatcccgtacccatctgactgaagacgtgatcaacgccgcagaaaaactggtcgctattggctgtttctgtatcggaacaaaccaggttgatctggatgcggcggcaaagcgcgggatcccggtatttaacgcaccgttctcaaatacgcgctctgttgcggagctggtgattggcgaactgctgctgctattgcgcggcgtgccggaagccaatgctaaagcgcaccgtggcgtgtggaacaaactggcggcgggttcttttgaagcgcgcggcaaaaagctgggtatcatcggctacggtcatattggtacgcaattgggcattctggctgaatcgctgggaatgtatgtttacttttatgatattgaaaataaactgccgctgggcaacgccactcaggtacagcatctttctgacctgctgaatatgagcgatgtggtgagtctgcatgtaccagagaatccgtccaccaaaaatatgatgggcgcgaaagaaatttcactaatgaagcccggctcgctgctgattaatgcttcgcgcggtactgtggtggatattccggcgctgtgtgatgcgctggcgagcaaacatctggcgggggcggcaatcgacgtattcccgacggaaccggcgaccaatagcgatccatttacctctccgctgtgtgaattcgacaacgtccttctgacgccacacattggcggttcgactcaggaagcgcaggagaatatcggcctggaagttgcgggtaaattgatcaagtattctgacaatggctcaacgctctctgcggtgaacttcccggaagtctcgctgccactgcacggtgggcgtcgtctgatgcacatccacgaaaaccgtccgggcgtgctaactgcgctgaacaaaatcttcgccgagcagggcgtcaacatcgccgcgcaatatctgcaaacttccgcccagatgggttatgtggttattgatattgaagccgacgaagacgttgccgaaaaagcgctgcaggcaatgaaagctattccgggtaccattcgcgcccgtctgctgtactaa
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[서열번호 16]
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[서열번호 17]
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[서열번호 18]
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[서열번호 21]
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이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> A recombinant microorganism capable of growing solely on CO2 and formic acid and a method of producing useful materials using the same <130> PP-B2585 <150> KR 10-2020-0086811 <151> 2020-07-14 <160> 41 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1674 <212> DNA <213> Methylobacterium extorquens <400> 1 atgccctcag atatcgagat cgcccgcgcg gcgaccctga agccgatcgc ccaggtcgcc 60 gaaaagctcg gcatcccgga cgaggcgctt cacaattacg gcaagcacat cgccaagatc 120 gaccacgact tcatcgcctc gctcgagggt aagcccgagg gcaagctggt gctcgtcacc 180 gcgatctcgc cgacgcctgc gggcgagggc aagaccacca cgactgtggg gctcggcgac 240 gcgctcaacc gcatcggcaa gcgggcggtg atgtgcctgc gcgagccctc gctcggcccc 300 tgcttcggca tgaagggcgg cgcggccggt ggcggcaagg cgcaggtcgt gccgatggag 360 cagatcaacc tgcacttcac cggcgacttc cacgccatca cctcggcgca ctcgctcgcc 420 gccgctctga tcgacaacca catctactgg gccaacgagc tcaacatcga cgtgcgccgc 480 atccactggc gccgcgtggt cgacatgaac gaccgagcgc tgcgcgcgat caaccagtcg 540 ctcggcggcg 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Claims (20)

  1. 중심탄소 동화회로를 가지고 있는 숙주 미생물에서,
    글라이신 클리비지 시스템 전사 억제 효소 (glycine cleavage system transcriptional repressor); 파이루베이트 포메이트 라이에이즈 (pyruvate formate lyase); 및 포스포글라이서레이트 디하이드로지네이즈 (phosphoglycerate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고;
    글라이신 클리비지 시스템 (glycine cleavage system) 반응에 관여하는 효소를 코당하는 유전자의 발현이 강화되어 있으며,
    상기 중심탄소 동화회로를 가지고 있는 숙주 미생물에 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈 (formate-tetrahydrofolate ligase); 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈 (methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase); 및 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈 (methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 에스처리키아(Escherichia) 속, 맨하이미아(Mannheimia) 속, 로도박터(Rhodobacter) 속 및 메틸로박테리엄(Methylobacterium) 속으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 글라이신 클리비지 시스템 반응에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현은 내재적 프로모터를 강한 프로모터로 치환하여 강화시키는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 강한 프로모터는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈 (formate-tetrahydrofolate ligase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되고, 상기 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈 (methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되며, 상기 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈 (methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 미생물에서 포스포에놀파이루베이트 합성효소 억제 단백질 (phosphoenolpyruvate synthetase regulatory protein); 또는 포스포리보실글라시나마이드 포밀트렌스퍼레이즈 (phosphoribosylglycinamide formyltransferase)를 코딩하는 유전자가 추가로 약화 또는 결실되어 있고,
    포스포에놀파이루베이트 합성효소 (phosphoenolpyruvate synthase); 또는 H+ 트랜스로케이팅 NAD(P) 트랜스하이드로지네이즈 (H+-translocating NAD(P) transhydrogenase) 를 코딩하는 유전자의 발현이 추가로 강화되어 있으며,
    상기 재조합 미생물에 개미산 탈수소화효소 (formate dehydrogenase) 및/또는 이의 변이체를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는, 재조합 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 포스포에놀파이루베이트 합성효소 (phosphoenolpyruvate synthase); 및 H+ 트랜스로케이팅 NAD(P) 트랜스하이드로지네이즈 (H+-translocating NAD(P) transhydrogenase)를 코딩하는 유전자의 발현은 내재적 프로모터를 강한 프로모터로 치환하여 강화시키는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 강한 프로모터는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 포메이트-테트라하이드로포레이트 라이게이즈(formate-tetrahydrofolate ligase), 메테닐테트라하이드로포레이트 싸이클로하이드롤레이즈(methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase), 메틸렌-테트라하이드로포레이트 디하이드로지네이즈(methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase), 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 및 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자는 카피 넘버 1~12를 갖는 복제원점을 포함하는 벡터에 클로닝되어 도입되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 벡터는 카피 넘버 1~5를 갖는 복제원점을 포함하는 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 개미산 탈수소화효소(formate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 염기서열로 표시되고, 개미산 탈수소화효소 변이체(formate dehydrogenase mutant)를 코딩하는 유전자는 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 개미산 및 이산화탄소만을 탄소원으로 이용하여 C3 화합물 생성이 가능한 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 C3 화합물은 피루브산인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  14. 다음 단계를 포함하는 C3 화합물의 제조방법:
    (a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 개미산 및 이산화탄소만을 탄소원으로 배양하여 C3 화합물을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 C3 화합물을 회수하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계에서 0.02 - 0.08 mM의 IPTG를 첨가하는 것을 특징으로 하는 C3 화합물의 제조방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 31 - 33
    Figure pat00011
    에서 배양하는 것을 특징으로 하는 C3 화합물의 제조방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 개미산은 2 - 3 g/l의 농도로 유지하고, 배양 단계에서의 pH는 6.6 - 7.0으로 유지하여 배양하는 것을 특징으로 하는 C3 화합물의 제조방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 초기 교반 속도 450 - 550 rpm으로 배양을 시작하여 최종 700 - 800 rpm까지 증가시키며 배양하는 것을 특징으로 하는 C3 화합물의 제조방법.
  19. 다음 단계를 포함하는 피루브산을 중간산물로 한 유용물질의 제조방법:
    (a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 개미산 및 이산화탄소만을 탄소원으로 배양하여 피루브산을 중간산물로 한 유용물질을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 유용물질을 회수하는 단계.
  20. 제19항에 있어서, 상기 유용물질은 부탄올, 이소부탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, tert-부탄올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올이소부탄올, 퓨트레신, L-오르니틴, 아르기닌, 다핵방향족 탄화수소(PHA), 폴리락테이트, 폴리락테이트-co-글라이콜레이트, 폴리아이소발러레이트, 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 4-하이드록시부티레이트, 바이오디젤, 가솔린, 올레핀, 5-아미노발러릭산, 감마이미노부티릭산, 3-하이드록스피로피오닉산, 3-아미노프로피오닉산, 아크릴산, 1,3-디아미노프로판, 카프로락탐, 쓰레오닌, 발린, 이소류신, 푸마르산, 말릭산, 숙신산, 세라마이드, 아스타잔틴, 실리빈, 라이코펜, 루테인 및 레티놀로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유용물질의 제조방법.
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