KR102316549B1

KR102316549B1 - 신규 이소부탄올 내성 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102316549B1
Application number: KR1020190158537A
Authority: KR
Inventors: 김경헌; 신철수; 박용철; 양정우; 송영하; 장영서; 김태인
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2021-10-25
Also published as: KR20210068923A

Abstract

본 발명은 신규 이소부탄올 내성 유전자 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 이소부탄올 내성인자를 선별하고 이를 이용하여 이소부탄올의 생산능을 높임으로써 연료분야에 적용할 수 있는 효과가 있다.

Description

신규 이소부탄올 내성 유전자 및 그의 용도{Novel genes responsible for isobutanol tolerance and use thereof}

본 발명은 신규 이소부탄올 내성 유전자 및 그의 용도에 관한 것이다.

화석 연료의 오랜 사용과 국제적인 에너지 소비량 증가는 급격한 기후 변화와 같은 전 세계적인 문제를 야기하고 있으며, 이로 인해 미생물 발효에 의해 생산되는 에탄올과 같은 재생 가능한 연료의 필요성이 제기되었다. 그 중 이소부탄올은 에탄올에 비하여 가솔린에 근접하는 높은 에너지 밀도를 가지고 있으며, 친수성이 낮아 높은 비례의 혼합을 실현할 수 있으며, 기존 석유 파이프를 그대로 사용하여 운송할 수 있는 장점 등이 있다.

이소부탄올은 클로스트리디움(Clostridium) 균주에서 생산된다고 알려져 있으나 유전적 조작이 힘들다는 이유로 효모(Saccharomyces cerevisiae)와 대장균(Escherichia coli)과 같은 균주에서 5개의 필수유전자(alsS, ilvC, ilvD, kdc, adh 등)를 과발현하여 이소부탄올을 생산하는 추세이다. 그러나 여전히 조효소 불균형, 낮은 효소 발현량, 이소부탄올 독성에 의한 성장 저해 등 이소부탄올 생산을 저해하는 요인들이 존재한다. 특히, 이소부탄올의 독성은 세포 생장의 방해로 인해 미생물의 이소부탄올 생산량을 감소시키는 원인이 된다.

따라서, 본 발명자들은 이소부탄올에 내성을 가지는 미생물의 내성인자를 파악하여 이소부탄올 생산을 증진함으로써 본 발명을 완성하였다.

Carmen Felpeto-Santero et al. AMB Express (2015) 5:32

본 발명의 목적은 이소부탄올의 내성을 증진시키는 유전인자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 이소부탄올에 대한 내성이 증진됨으로써 이소부탄올의 생산을 증진시킬 수 있는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 이소부탄올의 생산을 증진하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 fadB 및 dppC로 이루어진 군에 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명을 또한 상기 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터를 포함하는 이소부탄올 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 형질전환체를 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는 이소부탄올의 생산 증진 방법을 제공한다.

본 발명은 이소부탄올 내성인자를 선별하고 이를 이용하여 이소부탄올의 생산능을 높임으로써 연료분야에 적용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 이소부탄올 내성 균주를 개발하기 위한 적정 이소부탄올 농도 설정 결과를 나타낸 것이다: (a) 다양한 이소부탄올 농도(0-1%, v/v)에서 E. coli BL21(DE3)의 생장 곡선 및 (b) E. coli MG1655(DE3)의 생장 곡선이다.
도 2는 이소부탄올 내성 균주 개발을 위한 연속배양과 그에 따른 세포생장 변화를 나타낸 것이다: (a) E. coli BL21(DE3) 및 (b) E. coli MG1655(DE3).
도 3은 이소부탄올 내성 돌연변이의 세포생장률 측정 결과이다. 연속배양 과정 중 다양한 이소부탄올 농도에 진화 적응된 균주들의 최대 세포생장을 나타낸 것이다(1.2% 이소부탄올 조건): (a) E. coli BL21(DE3) 및 (b) E. coli MG1655(DE3). 모균주 및 진화된 이소부탄올 내성 돌연변이 간의 생장률 비교 결과이다: (c) E. coli BL21(DE3)와 E. coli BL21(DE3)_TI133, (d) E. coli MG1655(DE3)와 E. coli MG1655(DE3)_TI136의 성장률 비교. P, 모균주; E, 진화공학을 이용하여 개발된 이소부탄올 내성 돌연변이 균주.
도 4는 진화공학을 거친 대장균의 유전적 안정성 테스트 결과를 나타낸 것이다: 이소부탄올 농도에 따른 (a) E. coli BL21(DE3)_TI133의 생장률 및 (b) E. coli MG1655(DE3)_TI136의 생장률.
도 5는 이소부탄올 내성 돌연변이 균주들의 전사체 분석 결과를 나타낸 것이다: 이소부탄올 스트레스 조건에서, E. coli BL21(DE3)_TI133와 E. coli MG1655(DE3)_TI136에서 공통적으로 상향조절된 유전자(a) 및 하향조절된 유전자(b)의 기능별 정리.
도 6은 전사체 분석으로부터 선별된 내성 유전인자의 이소부탄올 내성검증 결과를 나타낸 것이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001
도 7은 내성 유전인자가 도입된 이소부탄올 생산 대장균 균주의 이소부탄올 발효 결과를 나타낸 것이다: (a) 빈 벡터가 도입된 이소부탄올 생산 균주(대조군), (b) fadB 및 (c) dppC가 도입된 이소부탄올 생산 균주의 발효 프로파일.

본 발명자들은 모균주인 E. coli BL21(DE3)과 E. coli MG1655(DE3)를 이소부탄올 스트레스 조건에서 연속 배양한 뒤 이소부탄올에 내성을 지니는 균주를 분리하였으며, 돌연변이 균주들의 전사체 분석을 통하여 공통적으로 상향조절된 30개 유전자와 하향조절된 74개의 유전자를 분리할 수 있었다. 이중 상향조절된 17개의 유전자를 내성 후보유전자로 선정 후, 대장균에 각 후보유전자를 과발현하여 이소부탄올 1%(v/v)에서 내성 실험을 진행하였으며, 그 후 최종적으로 acs, fadB, csiD, fadH, argT, dppC의 6개 내성인자를 선별하였다. 끝으로, 이소부탄올 생산이 가능한 재조합 대장균에 4개의 내성인자(acs, csiD, dppC, fadB)를 각각 도입한 후 이소부탄올 발효를 진행한 결과 dppC와 fadB가 각각 도입된 이소부탄올 생산이 가능한 재조합 대장균에서 이소부탄올의 생산량이 증가하여 dppC와 fadB이 생산량을 높이는 유전인자임을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 fadB 및 dppC로 이루어진 군에 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터를 제공한다.

상기 fadB 및 dppC는 이소부탄올 스트레스 조건에서 이소부탄올 내성 균주에서 발현이 상향조절되고, 이소부탄올 생산 균주에 도입 시 이소부탄올의 생산을 증가시키는 특징이 있다.

상기 유전자는 대장균(E. coli)등을 포함하는 원핵생물 및 효모(Saccharomyces cerevisiae)등을 포함하는 진핵생물에서 유래된 것일 수 있고, 구체적으로 대장균(E. coli), 보다 구체적으로 이소부탄올 내성 대장균으로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 fadB는 Fatty acid oxidation complex subunit alpha의 약어로, SEQ ID NO: 1의 염기서열로 표시될 수 있다.

상기 dppC는 Dipeptide transport system permease protein DppC의 약어로, SEQ ID NO: 2의 염기서열로 표시될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 SEQ ID NO: 1의 염기서열을 갖는 fadB 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열을 갖는 dppC이 삽입되어 이소부탄올의 내성을 증진시킬 수 있다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro)에서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물(construct)을 말한다. 본 명세서에 있어서, 용어 "플라스미드", "벡터" 또는 "발현 벡터"는 상호 교환적으로 사용된다. 유전자 작제물은 숙주세포에 fadB및/또는 dppC의 핵산 분자를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 이들 유전자 작제물에서 fadB및/또는 dppC의 핵산 분자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결(operably linked)되며, 숙주세포로 삽입되면, 벡터는 숙주 게놈과는 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나 또는 일부 경우에 숙주 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

상기 "작동가능하게 연결된"은 적절한 핵산 분자가 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "핵산 분자"는 cDNA, genomic DNA, 합성 DNA 또는 RNA, PNAS 또는 LNA 기원의 임의의 단일 또는 이중 나선 핵산 분자, 또는 이들의 혼합물을 의미한다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터에 상술한 유전자를 삽입함으로써 제조될 수 있다. 상기 대장균 균주 발현용 벡터는 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균 발현용 벡터가 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로 fadB 및/또는 dppC의 핵산 분자가 삽입된 재조합 벡터, 더 구체적으로, SEQ ID NO: 1의 염기서열을 갖는 fadB 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열을 갖는 dppC가 삽입된 재조합 벡터를 포함하며, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 형질전환시킴으로써 미생물의 이소부탄올에 대한 내성을 증진시킬 수 있다.

상기 미생물은 이소부탄올을 생산하는 미생물일 수 있고, 예컨대, 클로스트리디움(Clostridium) 균주, 이소부탄올을 생산하는 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 대장균(Escherichia coli) 등일 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터를 이소부탄올 생산 균주에 도입하여 이소부탄올의 내성을 증진시켜 이소부탄올 독성에 의한 성장 저해를 억제시킴으로써 이소부탄올의 생산을 증진시킬 수 있는 특징이 있다.

상기 이소부탄올 생산 균주는 클로스트리디움(Clostridium) 균주 또는 이소부탄올을 생산하는 재조합 균주일 수 있다.

상기 이소부탄올을 생산하는 재조합 균주는 alsS, ilvD, ilvC, kivD 및 adhP를 포함하는 유전자군을 발현하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 대장균(Escherichia coli)을 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 이소부탄올을 생산하는 재조합 균주는

SEQ ID NO: 3의 염기서열로 표시되는 alsS;

SEQ ID NO: 4의 염기서열로 표시되는 ilvD;

SEQ ID NO: 5의 염기서열로 표시되는 ilvC;

SEQ ID NO: 6의 염기서열로 표시되는 kivD; 및

SEQ ID NO: 7의 염기서열로 표시되는 adhP를 포함하는 유전자군을 발현하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.

상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

또한, 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

숙주세포로는 대장균(Escherichiacoli), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵생물이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichiapastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurosporacrassa))등의 진핵생물이 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 이소부탄올에 대한 내성이 증진되어 이소부탄올 독성에 의한 성장 저해를 억제함으로써 이소부탄올 생산 균주로부터 이소부탄올의 생산량을 증진시킬 수 있다.

형질전환체의 (대량) 배양을 위해, 다양한 배양 방법이 적용될 수 있는데, 예컨대 재조합 미생물로부터 발현 또는 과발현된 유전자 산물의 대규모 제조는 회분(batch) 또는 연속 배양 방법에 의해 달성될 수 있다. 회분 및 유가식(fed-batch) 배양 방법은 통상적인 것으로서 당분야에 공지되어 있다. 연속 배양 공정을 위한 영양분 및 성장 인자의 조절 방법, 뿐만 아니라 생성물 형성율을 최대로 하기 위한 기법은 미생물 산업 분야에 공지되어 있다. 또한, 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 당분야에 공지된 바에 따라 조성 구성할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 진화공학을 위한 적정 이소부탄올 농도의 결정

진화공학을 이용하여 이소부탄올 내성을 지니는 대장균 균주를 제작하기 위하여 세포 생장을 완전히 저해되지는 않으면서, 최소한의 세포 생장이 일어날 수 있는 이소부탄올 농도를 찾아야 했다. 이를 위해, E. coli BL21(DE3)와 E. coli MG1655(DE3)를 0-1%(v/v)의 이소부탄올을 첨가한 LB(Luria-Bertani)배지에 세포농도 OD₆₀₀=0.01이 되도록 접종하여 37℃에서 200rpm으로 12시간 동안 배양하였다. 그 뒤, 2시간 간격으로 600nm 파장에서의 흡광도를 통해 세포 생장을 측정하였다.

다양한 농도의 이소부탄올에서 대장균 E. coli BL21(DE3) 및 E. coli MG1655(DE3)를 배양한 결과, 전반적으로 이소부탄올 농도가 높아질수록 대장균의 생장이 둔화되는 것을 확인할 수 있었다. 1%(v/v)의 이소부탄올 농도에서는 균의 생장이 완전히 저해(lethal)되는 반면, 0.75%(v/v) 이소부탄올 농도에서는 미약한 균의 성장(sub-lethal)을 관찰할 수 있었다. 따라서 0.75%(v/v)를 이소부탄올 내성 균주를 개발하기 위한 적정 이소부탄올 농도로 설정하였다(도 1).

<실시예 2> 진화공학을 이용한 이소부탄올 내성 균주 제작

상기 실시예 1에서 정해진 이소부탄올 0.75%(v/v)에서 E. coli BL21(DE3)와 E. coli MG1655(DE3) 균주를 12시간마다 연속 배양하여 대장균 최대성장 OD₆₀₀=1.5가 되는 시점에서 이소부탄올 농도를 0.75에서 1.2%(v/v)까지 서서히 높여가며 연속배양을 실시하였다. 이를 위해, 0.75%(v/v)의 이소부탄올을 첨가한 LB(Luria-Bertani)배지에 세포농도 OD₆₀₀=0.01이 되도록 접종하여 37℃에서 200rpm으로 12시간 동안 배양하였고, 12시간뒤 배양액으로부터 초기 세포농도를 OD₆₀₀=0.01이 되도록 새로운 LB배지에 접종하여 다시 37℃, 200rpm에서 배양하였다. 이를 계속 반복하며 이소부탄올 농도를 1.2%까지 증가시켰으며, 50mL 튜브에 10mL working volume으로 실험을 진행하였다.

또한, 12시간 연속배양을 하는 동안, 새로운 배지에 transfer를 하기 위한 세포배양액의 일부(aliquot)을 취하여 셀 스톡(cell stock)을 제작하였다. Transfer별 세포를 다시 키운 뒤, 1.2%(v/v)의 이소부탄올을 첨가한 LB 배지에 세포 농도 OD₆₀₀=0.01이 되도록 접종하여 37℃에서 200rpm으로 12시간 동안 배양하였고, 2시간 간격으로 600nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 생장을 분석하였다.

도 2 및 3에 나타난 바와 같이, 최대 1.2%(v/v) 이소부탄올 농도에서 내성을 지니는 돌연변이 균주 E. coli BL21(DE3)_TI133와 E. coli MG1655_TI136를 획득하였다(도 2, 도 3a, 3b).

또한, 획득된 이소부탄올 내성 돌연변이 E. coli BL21(DE3)_TI133와 E. coli MG1655_TI136는 다양한 이소부탄올 조건에서도 잘 생장하는 균주임을 확인할 수 있었다(도 3c, d).

<실시예 3> 최종 선별된 이소부탄올 내성 균주의 유전적 안정성 평가

진화공학을 통하여 제작된 내성 돌연변이 균주는 일시적인 표현형(phenotype)에 의한 이소부탄올 내성이 아니라 진화에 의한 유전적 변이의 결과로써 내성을 가짐을 증명하기 위하여 균주의 안정성 평가를 실시하였다. 이를 위해, 이소부탄올이 없는 10mL LB 배지에서 28회 transfer(약 100세대)하여 키운 후, 진화 균주를 1.0, 1.1 및 1.2%(v/v) 이소부탄올 농도에서 37℃, 200rpm 조건으로 16시간 배양하여 생장률을 계산하였다.

그 결과, 생장률이 0.4 - 0.5 h^-1 사이로 측정되었다(도 4). 그리하여, 돌연변이 균주는 유전적 변이에 의한 이소부탄올 내성임을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 진화공학으로 내성 증가된 돌연변이의 전사체 분석

이소부탄올이 있는 조건에서 모균주와 돌연변이 균주를 4시간 동안 키운 후 총 RNA를 분리하여 DNALink(http://www.dnalink.com)에 전사체 분석을 의뢰하였다. DEGs(Differentially expressed genes) 데이터를 분석하여 돌연변이 균주인 E. coli BL21(DE3)_TI133와 E. coli MG1655_TI136에서 모균주보다 발현량이 공통적으로 2배 이상 차이가 나는 상향조절된 유전자 30개와 하향조절된 유전자 74개를 선별하였다(표 1 및 표 2). 이 중, 유전자 기능을 고려하여 최종적으로 이소부탄올 내성에 밀접한 연관이 있을 거라고 예상되는 17개의 상향조절된 유전자를 선별하였다(도 5).

<실시예 5> 발굴된 유전인자의 이소부탄올 내성 검증

상기 실시예 4에서 선별한 상향조절된 유전자들을 pET21(a) 벡터에서 과발현 되도록 삽입하여 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하고, 형질전환된 17개의 균주를 pET21(a) 공벡터가 삽입된 대조군 균주와 함께 1%(v/v)의 이소부탄올이 들어가 있는 LB 배지에서 배양하여 세포 생장을 관찰하였다.

구체적으로, 상향조절된 17개의 후보유전자를 획득하기 위하여 특정 프라이머를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 진행하였다(표 3). PCR 산물과 pET21(a) 벡터는 제한효소 절단 후 T4 리가아제를 이용해 후보유전자들을 pET21(a)에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다. 그 뒤, 각각의 재조합 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시켜 각각의 유전자를 과발현할 수 있는 균주들을 제작하였다. 이소부탄올 스트레스에 대한 내성 테스트를 위하여, 각각의 형질전환된 균주들을 100mL의 LB 배지에 배양하였고 세포농도가 OD₆₀₀=0.5에 도달하면 이소부탄올 농도가 1%(v/v)가 되도록 넣어 주었고, 동시에 유전자 과발현을 위하여 0.1mM IPTG를 넣어준 뒤 37℃, 200rpm 조건으로 12시간 배양하였다. 끝으로, 세포생장의 측정을 위하여 2시간 간격으로 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하였다.

본 발명에서 사용한 균주, 플라스미드 및 프라이머 목록

*E. coli* 균주	설명	참고문헌
K12	Wild type, source of targeted genes	Blattner et al., 1997
DH5α	A Hoffman-Berling 1100 strain derivative (Meselson68)	Invitrogen
BL21(DE3)	E. coli B strain with DE3, a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacI^q	RBC Bioscience
MG1655(DE3)	Wild type K-12 strain with DE3, a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacI^q	Addgene
JK209	E. coli BL21(DE3) harboring pJK01 and pJK02	본 발명
플라스미드
pET21a(+)	T7 lac promoter, T7 terminator, bacterial origin (ori) and Amp^R	Novagen
pJK01	pCDFDuet-1carrying alsS and ilvD genes; Sm^R	본 발명
pJK02	pET28a carrying ilvC, kivD, and adhP genes; Kan^R	본 발명
삽입된 유전자 및 서열	fadB, dppC: 각각 SEQ ID NOS: 1 및 2에 기재된 염기서열alsS, ilvD, ilvC, kivD, adhP: 각각 SEQ ID NOS: 3 내지 7에 기재된 염기서열
프라이머	염기서열(5'-3')
uidA_F uidA_R putA_F putA_R acs_F acs_R gltI_F gltI_R fadB_F fadB_R argT_F argT_R csiD_F csiD_R dppC_F dppC_R fadD_F fadD_R fadH_F fadH_R ylaC_F ylaC_R cpxP_F cpxP_R gabD_F gabD_R dppB_F dppB_R yeaR_F yeaR_R spy_F spy_R fadA_F fadA_R puuA_F puuA_R gabT_F gabT_R	GACAAGCTTATGTTACGTCCTGTAGAAACCCC TGACTCGAGTCATTGTTTGCCTCCCTG GACAAGCTTATGGGAACCACCACCATG TGACTCGAGTTAACCTATAGTCATTAAGCTGGCG TGAGGATCCATGAGCCAAATTCACAAACACA GACAAGCTTTTACGATGGCATCGCGATA TACGGATCCATGCAATTACGTAAACCTGCC TCAAAGCTTTTAGTTCAGTGCCTTGTCATTCG TATGGATCCATGCTTTACAAAGGCGACACC GATAAGCTTTTAAGCCGTTTTCAGGTCG CACGGATCCATGAAGAAGTCGATTCTCGCTC GATCTCGAGTCAGTCACCGTAGACATTAAAGTCG CTAGGATCCATGAATGCACTGACCGCC CGTAAGCTTTTACTGATGCGTCTGGTAGTGG CGTGGATCCATGTCACAGGTTACTGAAAATAAAGTG GATAAGCTTTTACTGCTTCAGTTTGGGATCG CTAGGATCCTTGAAGAAGGTTTGGCTTAACC CGTAAGCTTTCAGGCTTTATTGTCCACTTTG CGTAAGCTTATGAGCTACCCGTCGCTG GAACTCGAGTTAAATCTCCAGCGCCAGC CTAGGATCCATGACCGAAATACAACGCCT CGTAAGCTTTTAAGATGTTGATTCGGCGC CTAGGATCCATGCGCATAGTTACCGCTG CGTAAGCTTCTACTGGGAACGTGAGTTGCTAC CTAGGATCCATGAAACTTAACGACAGTAACTTATTC GAACTCGAGTTAAAGACCGATGCACATATATT CTAGGATCCATGTTGCAGTTTATTCTCCGAC CGTAAGCTTTTACTTCTTATGACGAATACGCG CTAGGATCCATGCTTCAAATCCCACAGAATT CGTAAGCTTTCATTTCCCGTTATGAATGACTT CTAGGATCCATGCGTAAATTAACTGCACTGTTT CGTAAGCTTTTATTCAGCAGTTGCAGGCA CTAGGATCCATGGAACAGGTTGTCATTGTCG CGTAAGCTTTTAAACCCGCTCAAACACC CTAGGATCCATGGAAACCAATATCGTTGAAGTAG CGTAAGCTTTTACGCGTTTTTCAACATCC CTAGGATCCATGAACAGCAATAAAGAGTTAATGCA CGTAAGCTTCTACTGCTTCGCCTCATCAAA	본 발명
Underlines indicate restriction sites of HindIII, AAGCTT; XhoI, CTCGAG; and BamHI, GGATCC

그 결과, acs, fadB, csiD, fadH, argT, dppC 6개의 유전자가 이소부탄올 내성인자임을 확인할 수 있었다(도 6).

<실시예 6> 내성인자 이용한 이소부탄올의 생산증대

상기 실시예 5에서 선별한 6개의 유전자 중 이소부탄올 내성에 가장 효과가 큰 4개의 유전자(acs, fadB, csiD, dppC)를 이소부탄올 생산균주인 E. coli JK209에 적용하여 이소부탄올 발효를 실시하였다 (표 3). 구체적으로, 실시예 5의 이소부탄올 내성실험에 사용된 내성인자(acs, fadB, csiD, dppC)가 삽입된 재조합 플라스미드를 이소부탄올 생산균주인 E. coli JK209(표 3 참조)에 각각 형질전환하여 이소부탄올 발효실험을 하였다. 이를 위해 사용된 배지는 Glucose(20 g/L), MgSO₄·7H₂O(2 g/L), Yeast extract(20 g/L), Casein peptone(3 g/L), (NH₄)₂SO₄(10 g/L), Na₂HPO₄·12H₂O(3 g/L), KH₂PO₄(3 g/L), NaCl(0.5 g/L)의 조성으로 제작되었다. 각각의 형질전환된 균주들을 위 배지에 배양하였고 세포농도가 OD₆₀₀=0.5에 도달하면 유전자들의 과발현을 위하여 0.1mM IPTG를 넣어준 뒤 37℃, 200rpm 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 끝으로, 이소부탄올, 글루코스, 에탄올, 아세테이트, 락테이트 농도는 HPLC를 이용하여 분석 및 정량하였으며, 세포생장은 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하여 분석하였다.

그 결과, 공벡터가 들어간 대조군 균주의 이소부탄올 최대 생산량은 0.752 g/L였으며, fadB 및 dppC가 각각 삽입된 균주의 이소부탄올 최대 생산량 1.099 g/L 및 1.035 g/L으로, 1.5배 및 1.4배가 증가됨을 확인하였다(도 7). 그러나, acs 및 csiD가 삽입된 균주의 이소부탄올 최대생산량은 평균 0.77 g/L로 대조군 균주와 큰 차이가 없었다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Novel genes responsible for isobutanol tolerance and use thereof <130> P19U13C0836 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2190 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fadB gene <400> 1 atgctttaca aaggcgacac cctgtacctt gactggctgg aagatggcat tgccgaactg 60 gtatttgatg ccccaggttc agttaataaa ctcgacactg cgaccgtcgc cagcctcggc 120 gaggccatcg gcgtgctgga acagcaatca gatctaaaag ggctgctgct gcgttcgaac 180 aaagcagcct ttatcgtcgg tgctgatatc accgaatttt tgtccctgtt cctcgttcct 240 gaagaacagt taagtcagtg gctgcacttt gccaatagcg tgtttaatcg cctggaagat 300 ctgccggtgc cgaccattgc tgccgtcaat ggctatgcgc tgggcggtgg ctgcgaatgc 360 gtgctggcga ccgattatcg tctggcgacg ccggatctgc gcatcggtct gccggaaacc 420 aaactgggca tcatgcctgg ctttggcggt tctgtacgta tgccacgtat gctgggcgct 480 gacagtgcgc tggaaatcat tgccgccggt aaagatgtcg gcgcggatca ggcgctgaaa 540 atcggtctgg tggatggcgt agtcaaagca gaaaaactgg ttgaaggcgc aaaggcggtt 600 ttacgccagg ccattaacgg cgacctcgac tggaaagcaa aacgtcagcc gaagctggaa 660 ccactaaaac tgagcaagat tgaagccacc atgagcttca ccatcgctaa agggatggtc 720 gcacaaacag cggggaaaca ttatccggcc cccatcaccg cagtaaaaac cattgaagct 780 gcggcccgtt ttggtcgtga agaagcctta aacctggaaa acaaaagttt tgtcccgctg 840 gcgcatacca acgaagcccg cgcactggtc ggcattttcc ttaacgatca atatgtaaaa 900 ggcaaagcga agaaactcac caaagacgtt gaaaccccga aacaggccgc ggtgctgggt 960 gcaggcatta tgggcggcgg catcgcttac cagtctgcgt ggaaaggcgt gccggttgtc 1020 atgaaagata tcaacgacaa gtcgttaacc ctcggcatga ccgaagccgc gaaactgctg 1080 aacaagcagc ttgagcgcgg caagatcgat ggtctgaaac tggctggcgt gatctccaca 1140 atccacccaa cgctcgacta cgccggattt gaccgcgtgg atattgtggt agaagcggtt 1200 gttgaaaacc cgaaagtgaa aaaagccgta ctggcagaaa ccgaacaaaa agtacgccag 1260 gataccgtgc tggcgtctaa cacttcaacc attcctatca gcgaactggc caacgcgctg 1320 gaacgcccgg aaaacttctg cgggatgcac ttctttaacc cggtccaccg aatgccgttg 1380 gtagaaatta ttcgcggcga gaaaagctcc gacgaaacca tcgcgaaagt tgtcgcctgg 1440 gcgagcaaga tgggcaagac gccgattgtg gttaacgact gccccggctt ctttgttaac 1500 cgcgtgctgt tcccgtattt cgccggtttc agccagctgc tgcgcgacgg cgcggatttc 1560 cgcaagatcg acaaagtgat ggaaaaacag tttggctggc cgatgggccc ggcatatctg 1620 ctggacgttg tgggcattga taccgcgcat cacgctcagg ctgtcatggc agcaggcttc 1680 ccgcagcgga tgcagaaaga ttaccgcgat gccatcgacg cgctgtttga tgccaaccgc 1740 tttggtcaga agaacggcct cggtttctgg cgttataaag aagacagcaa aggtaagccg 1800 aagaaagaag aagacgccgc cgttgaagac ctgctggcag aagtgagcca gccgaagcgc 1860 gatttcagcg aagaagagat tatcgcccgc atgatgatcc cgatggtcaa cgaagtggtg 1920 cgctgtctgg aggaaggcat tatcgccact ccggcggaag cggatatggc gctggtctac 1980 ggcctgggct tccctccgtt ccacggcggc gcgttccgct ggctggacac cctcggtagc 2040 gcaaaatacc tcgatatggc acagcaatat cagcacctcg gcccgctgta tgaagtgccg 2100 gaaggtctgc gtaataaagc gcgtcataac gaaccgtact atcctccggt tgagccagcc 2160 cgtccggttg gcgacctgaa aacggcttaa 2190 <210> 2 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dppC gene <400> 2 atgtcacagg ttactgaaaa taaagtgatt agcgcaccgg tgccgatgac cccgttacag 60 gagttctggc actattttaa acgcaacaaa ggcgcggtcg tcgggctggt ttacgtcgtc 120 atcgtgctgt tcatcgcgat ctttgccaac tggattgcac cctataaccc ggcggaacag 180 ttccgcgatg cactgctcgc cccgccagcc tggcaggaag gcggcagcat ggcgcacttg 240 ctgggcaccg atgacgtagg ccgtgatgtg ctgtcgcgcc tgatgtacgg tgcgcgcctg 300 tcgctgctgg ttggctgtct ggtagttgtg ttatcgctga ttatgggcgt tattctcggc 360 ctgatcgccg gttactttgg cggcctggtc gataacatca ttatgcgcgt ggtcgatatc 420 atgctggcgc tgccaagtct gctgctggcg ctggtgctgg tggcaatttt cggcccgtcg 480 attggtaacg ccgcgctggc actgaccttc gttgccttgc cgcactatgt gcgcttaacc 540 cgcgccgccg tgctggtgga agttaaccgc gattacgtca ccgcgtctcg cgtggcgggt 600 gccggggcga tgcgtcagat gtttattaac atcttcccga actgccttgc gccgctgatt 660 gttcaggcgt cgctcggttt ctctaacgcc attctcgata tggctgctct tggtttcctc 720 ggcatggggg cacagccgcc aacgcctgag tggggcacca tgctctccga cgtgttgcag 780 ttcgcgcaaa gcgcctggtg ggtcgtgacc ttcccgggtc tggcgatcct gctgacggtg 840 ctggcattta acctgatggg tgacggtctg cgtgacgcgc tcgatcccaa actgaagcag 900 taa 903 <210> 3 <211> 1713 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alsS gene <400> 3 ttgacaaaag caacaaaaga acaaaaatcc cttgtgaaaa acagaggggc ggagcttgtt 60 gttgattgct tagtggagca aggtgtcaca catgtatttg gcattccagg tgcaaaaatt 120 gatgcggtat ttgacgcttt acaagataaa ggacctgaaa ttatcgttgc ccggcacgaa 180 caaaacgcag cattcatggc ccaagcagtc ggccgtttaa ctggaaaacc gggagtcgtg 240 ttagtcacat caggaccggg tgcctctaac ttggcaacag gcctgctgac agcgaacact 300 gaaggagacc ctgtcgttgc gcttgctgga aacgtgatcc gtgcagatcg tttaaaacgg 360 acacatcaat ctttggataa tgcggcgcta ttccagccga ttacaaaata cagtgtagaa 420 gttcaagatg taaaaaatat accggaagct gttacaaatg catttaggat agcgtcagca 480 gggcaggctg gggccgcttt tgtgagcttt ccgcaagatg ttgtgaatga agtcacaaat 540 acgaaaaacg tgcgtgctgt tgcagcgcca aaactcggtc ctgcagcaga tgatgcaatc 600 agtgcggcca tagcaaaaat ccaaacagca aaacttcctg tcgttttggt cggcatgaaa 660 ggcggaagac cggaagcaat taaagcggtt cgcaagcttt tgaaaaaggt tcagcttcca 720 tttgttgaaa catatcaagc tgccggtacc ctttctagag atttagagga tcaatatttt 780 ggccgtatcg gtttgttccg caaccagcct ggcgatttac tgctagagca ggcagatgtt 840 gttctgacga tcggctatga cccgattgaa tatgatccga aattctggaa tatcaatgga 900 gaccggacaa ttatccattt agacgagatt atcgctgaca ttgatcatgc ttaccagcct 960 gatcttgaat tgatcggtga cattccgtcc acgatcaatc atatcgaaca cgatgctgtg 1020 aaagtggaat ttgcagagcg tgagcagaaa atcctttctg atttaaaaca atatatgcat 1080 gaaggtgagc aggtgcctgc agattggaaa tcagacagag cgcaccctct tgaaatcgtt 1140 aaagagttgc gtaatgcagt cgatgatcat gttacagtaa cttgcgatat cggttcgcac 1200 gccatttgga tgtcacgtta tttccgcagc tacgagccgt taacattaat gatcagtaac 1260 ggtatgcaaa cactcggcgt tgcgcttcct tgggcaatcg gcgcttcatt ggtgaaaccg 1320 ggagaaaaag tggtttctgt ctctggtgac ggcggtttct tattctcagc aatggaatta 1380 gagacagcag ttcgactaaa agcaccaatt gtacacattg tatggaacga cagcacatat 1440 gacatggttg cattccagca attgaaaaaa tataaccgta catctgcggt cgatttcgga 1500 aatatcgata tcgtgaaata tgcggaaagc ttcggagcaa ctggcttgcg cgtagaatca 1560 ccagaccagc tggcagatgt tctgcgtcaa ggcatgaacg ctgaaggtcc tgtcatcatc 1620 gatgtcccgg ttgactacag tgataacatt aatttagcaa gtgacaagct tccgaaagaa 1680 ttcggggaac tcatgaaaac gaaagctctc tag 1713 <210> 4 <211> 1851 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvD gene <400> 4 atgcctaagt accgttccgc caccaccact catggtcgta atatggcggg tgctcgtgcg 60 ctgtggcgcg ccaccggaat gaccgacgcc gatttcggta agccgattat cgcggttgtg 120 aactcgttca cccaatttgt accgggtcac gtccatctgc gcgatctcgg taaactggtc 180 gccgaacaaa ttgaagcggc tggcggcgtt gccaaagagt tcaacaccat tgcggtggat 240 gatgggattg ccatgggcca cggggggatg ctttattcac tgccatctcg cgaactgatc 300 gctgattccg ttgagtatat ggtcaacgcc cactgcgccg acgccatggt ctgcatctct 360 aactgcgaca aaatcacccc ggggatgctg atggcttccc tgcgcctgaa tattccggtg 420 atctttgttt ccggcggccc gatggaggcc gggaaaacca aactttccga tcagatcatc 480 aagctcgatc tggttgatgc gatgatccag ggcgcagacc cgaaagtatc tgactcccag 540 agcgatcagg ttgaacgttc cgcgtgtccg acctgcggtt cctgctccgg gatgtttacc 600 gctaactcaa tgaactgcct gaccgaagcg ctgggcctgt cgcagccggg caacggctcg 660 ctgctggcaa cccacgccga ccgtaagcag ctgttcctta atgctggtaa acgcattgtt 720 gaattgacca aacgttatta cgagcaaaac gacgaaagtg cactgccgcg taatatcgcc 780 agtaaggcgg cgtttgaaaa cgccatgacg ctggatatcg cgatgggtgg atcgactaac 840 accgtacttc acctgctggc ggcggcgcag gaagcggaaa tcgacttcac catgagtgat 900 atcgataagc tttcccgcaa ggttccacag ctgtgtaaag ttgcgccgag cacccagaaa 960 taccatatgg aagatgttca ccgtgctggt ggtgttatcg gtattctcgg cgaactggat 1020 cgcgcggggt tactgaaccg tgatgtgaaa aacgtacttg gcctgacgtt gccgcaaacg 1080 ctggaacaat acgacgttat gctgacccag gatgacgcgg taaaaaatat gttccgcgca 1140 ggtcctgcag gcattcgtac cacacaggca ttctcgcaag attgccgttg ggatacgctg 1200 gacgacgatc gcgccaatgg ctgtatccgc tcgctggaac acgcctacag caaagacggc 1260 ggcctggcgg tgctctacgg taactttgcg gaaaacggct gcatcgtgaa aacggcaggc 1320 gtcgatgaca gcatcctcaa attcaccggc ccggcgaaag tgtacgaaag ccaggacgat 1380 gcggtagaag cgattctcgg cggtaaagtt gtcgccggag atgtggtagt aattcgctat 1440 gaaggcccga aaggcggtcc ggggatgcag gaaatgctct acccaaccag cttcctgaaa 1500 tcaatgggtc tcggcaaagc ctgtgcgctg atcaccgacg gtcgtttctc tggtggcacc 1560 tctggtcttt ccatcggcca cgtctcaccg gaagcggcaa gcggcggcag cattggcctg 1620 attgaagatg gtgacctgat cgctatcgac atcccgaacc gtggcattca gttacaggta 1680 agcgatgccg aactggcggc gcgtcgtgaa gcgcaggacg ctcgaggtga caaagcctgg 1740 acgccgaaaa atcgtgaacg tcaggtctcc tttgccctgc gtgcttatgc cagcctggca 1800 accagcgccg acaaaggcgc ggtgcgcgat aaatcgaaac tggggggtta a 1851 <210> 5 <211> 1476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvC gene <400> 5 atggctaact acttcaatac actgaatctg cgccagcagc tggcacagct gggcaaatgt 60 cgctttatgg gccgcgatga attcgccgat ggcgcgagct accttcaggg taaaaaagta 120 gtcatcgtcg gctgtggcgc acagggtctg aaccagggcc tgaacatgcg tgattctggt 180 ctcgatatct cctacgctct gcgtaaagaa gcgattgccg agaagcgcgc gtcctggcgt 240 aaagcgaccg aaaatggttt taaagtgggt acttacgaag aactgatccc acaggcggat 300 ctggtgatta acctgacgcc ggacaagcag cactctgatg tagtgcgcac cgtacagcca 360 ctgatgaaag acggcgcggc gctgggctac tcgcacggtt tcaacatcgt cgaagtgggc 420 gagcagatcc gtaaagatat caccgtagtg atggttgcgc cgaaatgccc aggcaccgaa 480 gtgcgtgaag agtacaaacg tgggttcggc gtaccgacgc tgattgccgt tcacccggaa 540 aacgatccga aaggcgaagg catggcgatt gccaaagcct gggcggctgc aaccggtggt 600 caccgtgcgg gtgtgctgga atcgtccttc gttgcggaag tgaaatctga cctgatgggc 660 gagcaaacca tcctgtgcgg tatgttgcag gctggctctc tgctgtgctt cgacaagctg 720 gtggaagaag gtaccgatcc agcatacgca gaaaaactga ttcagttcgg ttgggaaacc 780 atcaccgaag cactgaaaca gggcggcatc accctgatga tggaccgtct ctctaacccg 840 gcgaaactgc gtgcttatgc gctttctgaa cagctgaaag agatcatggc acccctgttc 900 cagaaacata tggacgacat catctccggc gaattctctt ccggtatgat ggcggactgg 960 gccaacgatg ataagaaact gctgacctgg cgtgaagaga ccggcaaaac cgcgtttgaa 1020 accgcgccgc agtatgaagg caaaatcggc gagcaggagt acttcgataa aggcgtactg 1080 atgattgcga tggtgaaagc gggcgttgaa ctggcgttcg aaaccatggt cgattccggc 1140 atcattgaag agtctgcata ttatgaatca ctgcacgagc tgccgctgat tgccaacacc 1200 atcgcccgta agcgtctgta cgaaatgaac gtggttatct ctgataccgc tgagtacggt 1260 aactatctgt tctcttacgc ttgtgtgccg ttgctgaaac cgtttatggc agagctgcaa 1320 ccgggcgacc tgggtaaagc tattccggaa ggcgcggtag ataacgggca actgcgtgat 1380 gtgaacgaag cgattcgcag ccatgcgatt gagcaggtag gtaagaaact gcgcggctat 1440 atgacagata tgaaacgtat tgctgttgcg ggttaa 1476 <210> 6 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kivD gene <400> 6 atgtatacag taggagatta cctattagac cgattacacg agttaggaat tgaagaaatt 60 tttggagtcc ctggagacta taacttacaa tttttagatc aaattatttc ccgcaaggat 120 atgaaatggg tcggaaatgc taatgaatta aatgcttctt atatggctga tggctatgct 180 cgtactaaaa aagctgccgc atttcttaca acctttggag taggtgaatt gagtgcagtt 240 aatggattag caggaagtta cgccgaaaat ttaccagtag tagaaatagt gggatcacct 300 acatcaaaag tccaaaatga aggaaaattt gttcatcata cgctggctga cggtgatttt 360 aaacacttta tgaaaatgca cgaacctgtt acagcagctc gaactttact gacagcagaa 420 aatgcaaccg ttgaaattga ccgagtactt tctgcactac taaaagaaag aaaacctgtc 480 tatatcaact taccagttga tgttgctgct gcaaaagcag agaaaccctc actccctttg 540 aaaaaagaaa atccaacttc aaatacaagt gaccaagaga ttttgaataa aattcaagaa 600 agcttgaaaa atgccaaaaa accaatcgtg attacaggac atgaaataat tagctttggc 660 ttagaaaata cagtcactca atttatttca aagacaaaac tccctattac gacattaaac 720 tttggaaaaa gttcagttga tgaaactctc ccttcatttt taggaatcta taatggtaaa 780 ctctcagagc ctaatcttaa agaattcgtg gaatcagccg acttcatcct gatgcttgga 840 gttaaactca cagactcttc aacaggagca tttacccatc atttaaatga aaataaaatg 900 atttcactga acatagacga aggaaaaata tttaacgaaa gcatccaaaa ttttgatttt 960 gaatccctca tctcctctct cttagaccta agcggaatag aatacaaagg aaaatatatc 1020 gataaaaagc aagaagactt tgttccatca aatgcgcttt tatcacaaga ccgcctatgg 1080 caagcagttg aaaacctaac tcaaagcaat gaaacaatcg ttgctgaaca agggacatca 1140 ttctttggcg cttcatcaat tttcttaaaa ccaaagagtc attttattgg tcaaccctta 1200 tggggatcaa ttggatatac attcccagca gcattaggaa gccaaattgc agataaagaa 1260 agcagacacc ttttatttat tggtgatggt tcacttcaac ttacagtgca agaattagga 1320 ttagcaatca gagaaaaaat taatccaatt tgctttatta tcaataatga tggttataca 1380 gtcgaaagag aaattcatgg accaaatcaa agctacaatg atattccaat gtggaattac 1440 tcaaaattac cagaatcatt tggagcaaca gaagaacgag tagtctcgaa aatcgttaga 1500 actgaaaatg aatttgtgtc tgtcatgaaa gaagctcaag cagatccaaa tagaatgtac 1560 tggattgagt tagttttggc aaaagaagat gcaccaaaag tactgaaaaa aatgggtaaa 1620 ctatttgctg aacaaaataa atcataa 1647 <210> 7 <211> 1011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhP gene <400> 7 atgaaggctg cagttgttac gaaggatcat catgttgacg ttacgtataa aacactgcgc 60 tcactgaaac atggcgaagc cctgctgaaa atggagtgtt gtggtgtatg tcataccgat 120 cttcatgtta agaatggcga ttttggtgac aaaaccggcg taattctggg ccatgaaggc 180 atcggtgtgg tggcagaagt gggtccaggt gtcacctcat taaaaccagg cgatcgtgcc 240 agcgtggcgt ggttctacga aggatgcggt cattgcgaat actgtaacag tggtaacgaa 300 acgctctgcc gttcagttaa aaatgccgga tacagcgttg atggcgggat ggcggaagag 360 tgcatcgtgg tcgccgatta cgcggtaaaa gtgccagatg gtctggactc ggcggcggcc 420 agcagcatta cctgtgcggg agtcaccacc tacaaagccg ttaagctgtc aaaaattcgt 480 ccagggcagt ggattgctat ctacggtctt ggcggtctgg gtaacctcgc cctgcaatac 540 gcgaagaatg tctttaacgc caaagtgatc gccattgatg tcaatgatga gcagttaaaa 600 ctggcaaccg aaatgggcgc agatttagcg attaactcac acaccgaaga cgccgccaaa 660 attgtgcagg agaaaactgg tggcgctcac gctgcggtgg taacagcggt agctaaagct 720 gcgtttaact cggcagttga tgctgtccgt gcaggcggtc gtgttgtggc tgtcggtcta 780 ccgccggagt ctatgagcct ggatatccca cgtcttgtgc tggatggtat tgaagtggtc 840 ggttcgctgg tcggcacgcg ccaggattta actgaagcct tccagtttgc cgccgaaggt 900 aaagtggtgc cgaaagtcgc cctgcgtccg ttagcggaca tcaacaccat ctttactgag 960 atggaagaag gcaaaatccg tggccgcatg gtgattgatt tccgtcacta a 1011

Claims

fadB 유전자를 포함하는 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
fadB는 SEQ ID NO: 1의 염기서열로 표시되는, 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터.
삭제
제1항의 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터를 포함하는 이소부탄올 내성 증진용 조성물.
제1항의 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제5항에 있어서,
형질전환체는 상기 이소부탄올 내성 증진용 재조합 벡터를 클로스트리디움(Clostridium) 균주 또는 이소부탄올을 생산하는 재조합 균주에 형질전환시켜 제조되는 것인, 형질전환체.
제6항에 있어서,
이소부탄올을 생산하는 재조합 균주는 alsS, ilvD, ilvC, kivD 및 adhP를 포함하는 유전자군을 발현하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 대장균(Escherichia coli)을 포함하는, 형질전환체.
제7항에 있어서, 이소부탄올을 생산하는 재조합 균주는
SEQ ID NO: 3의 염기서열로 표시되는 alsS;
SEQ ID NO: 4의 염기서열로 표시되는 ilvD;
SEQ ID NO: 5의 염기서열로 표시되는 ilvC;
SEQ ID NO: 6의 염기서열로 표시되는 kivD; 및
SEQ ID NO: 7의 염기서열로 표시되는 adhP를 포함하는 유전자군을 발현하는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 대장균(Escherichia coli)을 포함하는, 형질전환체.
제5항의 형질전환체를 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는 이소부탄올의 생산 증진 방법.