BRPI0900748A2 - processo para fabricação de preparados enzimáticos obtidos de pena de aves, preparados enzimáticos assim fabricados, uso dos mesmos, ração animal e agente de transformação capilar - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA FABRICAçãO DE PREPARADOS ENZIMáTICOS OBTIDOS DE PENA DE AVES, PREPARADOS ENZIMáTICOS ASSIM FABRICADOS, USO DOS MESMOS, RAçãO ANIMAL E AGENTE DE TRANSFORMAçãO CAPILAR. A presente invenção refere-se ao processo para fabricação de preparados enzimáticos obtidos de pena de aves, aos preparados enzimáti- cos obteníveis pelo processo acima mencionado e, adicionalmente ou uso dos mesmos para adição ao pós-pellet de rações animais, para melhorar a digestibilidade de uma farinha de penas e para auxiliar na digestão de penas em digestores antes do seu aquecimento para obtenção de uma farinha de penas. A invenção ainda refere-se a uma ração animal e um agente de transformação capilar.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOPARA FABRICAÇÃO DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS OBTIDOS DEPENA DE AVES, PREPARADOS ENZIMÁTICOS ASSIM FABRICADOS,USO DOS MESMOS, RAÇÃO ANIMAL E AGENTE DE TRANSFORMAÇÃO CAPILAR".

Campo Da Invenção

A presente invenção se refere ao processo de fabricação depreparados enzimáticos contendo queratinases a partir de penas de aves epossui, dentre outras, aplicações em rações animais e em cabelos humanos.

Fundamentos da Invenção e Técnica Anterior Relacionada

O Brasil teve nos últimos anos um desenvolvimento significativona avicultura, sendo atualmente o maior exportador de frangos do mundo,responsável por 40% das exportações mundiais do produto e o terceiro mai-or produtor em escala crescente. Em virtude da expansão no setor da indús-tria avícola, observou-se um expressivo aumento na demanda de matériasprimas para a produção de ração e também na produção de resíduos agro-industriais, representados pelas penas descartadas (Moura,C.C. 2004. Fari-nha de penas e sangue em rações para suínos em crescimentos Soe. Brás.Zootecn. Viçosa.v 23:633-641, Scapim .M.R., Loures, EG., Rostango, H. Ce-con, P., Scapim, C.A. 2003 Avaliação nutricional de farinha de penas e desangue para frangos de corte submetida a diferentes tratamentos térmicosScientiarum animal Sciences,v25, p. 91-98). Foi estimado que, em 2008, osetor produziu de 700 a 800 mil toneladas de penas (5 a 7% do peso dasaves), contendo 90% de queratina.

O acúmulo de penas e sua deterioração lenta, que forma com-postos sulfurosos de odor extremamente desagradável, vem impulsionandoestudos relacionados a microrganismos queratinolíticos e a processos en-volvidos na biodegradação da queratina (Onifade, A A, ΑΙ-Sane, N A, Al-Musallam, AL- Zarban, S.1998. Review: Potentials for biotechnological appli-cations of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritionalimprovement of feathers and others keratins as Iivestock feed resources. Bio-resource. Tecnology, 66: 1-19; Friedrich, J. Gradisar, H., Chaumont,J.P. 1999. Screening fungi for synthesis of keratinolytic enzymes. Letters Ap-plied Microbiology 38:127-130, Suntornsuk, W. & Suntornsuk, L.2003. Fea-ther degrading by Baeillus FK 46 in submerged eultivation. Biosouree Tech-nology 86:239-243; Brandelli. A. 2008. Baeterial Keratinases: Useful Enzy-mes for Bioprocessing Agroindustrial Wastes and Beyond. Food BioprocessTeehnol 1:105-116). Inúmeros trabalhos sobre produção de queratinasesdemonstram que microrganismos como fungos e bactérias, por exemplo,Aspergillus fumigatus (Santos, R.M.D.B., Almeida, J. e Félix, C.R. 1995. De-gradação microbiana da queratina, Anais do ENZITEC 95, Organização, Ins-tituto de Química-UFRJ) e Chryseobacterium sp. (Riffel, A., Lucas, F.S., He-eb, P., Brandelli A. 2003. Characterization of a new keratinolytic bacteriumthat completely degrades native feather keratin. Archives of Microbiology179: 258-265.), entre outros, são capazes de degradar queratina "in natura"e têm um grande potencial para serem usados em processos biotecnológi-cos de degradação de penas (Revisto por Bon, Elba , Vermelho, A B , Edit.Said, Suraia & C. L. R. Pietro, Rosemeire .2004. Enzimas como Agentes Bio-tecnológicos. Capítulo Editora Legis Summa, Ltda., Vermelho A.B, Nogueirade Melo. Branquinha, M.H., Santos, A.L. d'Avila-Levy, C.M. Couri, S,Bon.P.S. 2008 Enzimas proteolíticas: Aplicações Biotecnológicas em Enzi-mas em Biotecnologia: Produção, Aplicações e Mercado 2008 Bon, E.P.S.Corvo Vermelho, A.B, Paiva, CL.A a Ferrara, M.A. CoeIho1R.R.. Alencas-tro,R.B. Editora INTERCIÊNCIA; Vermelho A.B, Termignoni1C., Macedo,A.J.,Brandelli, A. Elba P. S. Boné. P.S. 2008. Enzimas queratinolíticas:aplicaçõesBiotecnológicas em Enzimas em Biotecnologia: Produção, Aplicações eMercado 2008 b. Bon, E.P.S. Corvo., Vermelho, A.B, Paiva , CL.A a Ferrara,M.A. Coelho,R.R.. Alencastro,R.B. Editora INTERCIÊNCIA.).

No Brasil, grande parte das penas descartadas é transformadaem farinha de penas. Os métodos convencionais utilizados para pré-tratamento de penas visando aproveitar este resíduo em ração animal diges-tível baseiam-se em métodos físicos de moagem e cocção, a temperaturaselevadas e, assim sendo, apresentam alto consumo de energia e levam àdestruição de aminoácidos, diminuindo o valor biológico da proteína.Segundo Naber et al.,1961 (Effect of processing methods andaminoacid supplementation on dietary utilization of feather meai and proteinby chiks. Poult. Sei.Savoy ,40: 1234-1245). e Papadoulos, MC. 1985.(Effectof different processing conditions on aminoacid digestibility of feather meaideterminated by chicken assay.Agricultura.64: 1729-1741), o tratamentotérmico altera a estrutura das proteínas e favorece diferentes tipos de liga-ções entre proteínas e substâncias como gorduras e carboidratos presentesna farinha. Essas novas ligações químicas podem comprometer a disponibi-lidade dos aminoácidos. Em relação à disponibilidade dos aminoácidos dafarinha de penas processadas sob pressão, Naber et ai, 1961 (Effect of pro-cessing methods and aminoacid supplementation on dietary utilization of fea-ther meai and protein by chiks. Poult. Sei.Savoy ,40: 1234-1245) afirmaramque os métodos de processamento causaram variações significativas no va-lor nutritivo das farinhas de penas. O cozimento, embora aumente a disponi-bilidade de alguns aminoácidos, destrói outros, particularmente os instáveis,sob o efeito do calor.

A farinha de penas contém alto teor de proteína bruta. Mais de85% a 90% dessa proteína é a queratina, que, em virtude da sua estrutura eda grande quantidade de aminoácidos sulfurosos, possui baixa solubilidadee alta resistência à ação de enzimas, e deve ser hidrolisada a fim de ser me-tabolizada por animais (Santos, A. L. S., Gomes, Α. V. C., Pessoa, M. F.Mostafá, S. & Curvello, F. A. 2006 Níveis de inclusão de farinha de penas nadieta sobre o desempenho e características de carcaça de codornas paracorte. Acta Scientiarum. Animal Sciences, 28 (1), 27-30). Neste contexto, ahidrólise da queratina por queratinases microbianas é uma opção vantajosapara a digestão da queratina e, como é um método natural, não térmico esem aditivos químicos representa um ganho econômico para a indústria, a-lém de usar tecnologia limpa.

Os processos biocatalisados por enzimas são menos poluentes.As características destes processos industriais e a biodegradabilidade apre-sentada pelos seus efluentes atendem às exigências das normas ISO 9000e ISO 14001, que estabelecem padrões para a qualidade de produtos e nor-teiam as características dos processos de produção, dando ênfase ao menorconsumo energético, ao baixo impacto ambiental e à maior qualidade dosprodutos. Neste contexto é importante ressaltar que o processamento enzi-mático de matérias primas resulta em produtos de maior valor agregado.

O processamento biotecnológico de penas para a produção deração animal, em contraposição ao seu processamento químico, oferecevantagens relacionadas à não destruição de aminoácidos essenciais taiscomo metionina, Iisina e histidina, cujas penas já apresentam níveis sub-ótimos. A queratina é rica em aminoácidos sulfurados como cisteína e cistina(cisteína-cistina), além de metionina. Estudos demonstram que a presençadestes compostos na ração para aves é importante no período pós-muda(muda natural de penas) e também para aumento da postura de ovos, juntocom o teor de proteína da dieta (Filho JJ; J Vilar da Silva JH; Silva, EL; Ri-beiro, MLG ; Domiciano1T., Martins D; Rabello, CBV,2006 Exigências nutri-cionais de metionina+cistina para poedeiras semipesadas do início de pro-dução até o pico de postura, R. Brás Zootec. vol.35 no.3 suppl.0 ViçosaMay/June 2006). Outra vantagem do método biotecnológico é não formaraminoácidos derivados não assimiláveis (Bon, Elba, Vermelho, A B , Edit.Said, Suraia & C. L. R. Pietro, Rosemeire .2004. Enzimas como Agentes Bio-tecnológicos. Capítulo Editora Legis Summa, Ltda., Vermelho A.B, Nogueirade Melo. Branquinha, M.H., ., Santos, A.L.. d'Avila-Levy, C.M. Couri, S.,Bon.P.S. 2008 a . Enzimas proteolíticas: Aplicações Biotecnológicas. EmEnzimas em Biotecnologia: Produção, Aplicações E Mercado 2008 Bon,E.P.S. Corvo Vermelho, A.B, Paiva , CL.A a Ferrara, M.A. Coelho,R.R.. A-Iencastro1R.B. Editora INTERCIÊNCIA.; Vermelho A.B, Termignoni1C., Ma-cedo,A. J., Brandelli, A. Elba P. S. Boné.P.S. 2008. Enzimas queratinolíti-cas:aplicações Biotecnológicas. Em Enzimas em Biotecnologia: Produção,Aplicações e Mercado 2008 b. Bon, E.P.S. Corvo., Vermelho, A.B, Paiva ,CL.A a Ferrara, M.A. Coelho,R.R.. AIencastro1R.B. Editora INTERCIÊNCIA.).

O Brasil é dependente do mercado externo de enzimas que são usadas co-mo aditivos de rações animais. A listagem e tabela 1 abaixo citam as princi-pais indústrias internacionais fornecedoras destas enzimas e também algu-mas das principais proteases comercializadas para a indústria de alimentos.

AB Enzymes- Alemanha

Novozyme- Dinamarca

Danisco - Dinamarca

BioResource International, Inc.- E.U.A

Biocatalysts- Inglaterra

Adisseo- França

Bioresource - E.U.A

Toyobo - Japão

Amano Enzyme Inc- Japão

-Nagase Biochemicals, Japão

Enzyme Development - EUA

Gist-Brocades - Países Baixos

Alltech - E.U.A

<table>table see original document page 6</column></row><table><table>table see original document page 7</column></row><table>

Tabela 1: Algumas enzimas e/ou preparações enzimáticas contendo protea-ses e queratinases comercializadas

Nas rações, estas enzimas têm importantes funções como re-moção de fatores anti-nutricionais, aumento da disponibilidade de nutrientes,aumento na digestibilidade de polissacarídeos não amídicos e suplementa-ção na produção de enzimas endógenas em animais adultos e em aves esuínos jovens.

Os documentos mais relevantes do estado da técnica são cita-dos abaixo.

O pedido de patente PI0313288-9 revela um método para criaraves domésticas para abate, métodos de melhorar o desempenho de cres-cimento, melhorar a eficiência de utilização da ração, aumentar a capacida-de de digestão da ração, e diminuir a mortalidade de animais imaturos e emdesenvolvimento que recebem a ração animal. Métodos de produzir um ex-trato da enzima queratinase bruta e suplementos de ração animal para obtero mesmo também são fornecidos. O método em questão inclui o uso de que-ratinase, entretanto, utiliza um sobrenadante concentrado e filtrado, que a-presenta queratinase purificada a partir deste sobrenandante.

De forma completamente diferente, a presente invenção usa osobrenadante bruto centrifugado e liofilizado. Além disso, o método de ob-tenção das enzimas revelado no pedido de patente PI0313288-9 difere dapresente invenção por usar um meio com soja e outros componentes. A pre-sente invenção utiliza somente penas de frango com tampão. Finalmente, oproduto final obtido pelo processo do pedido PI0313288-9 é uma queratina-se, enquanto que o produto obtido pelo processo da presente invenção éuma mistura de celulases, amilases, outras proteases, além da queratinase.

A patente européia EP 0 670 681 revela um método de manterum animal em uma dieta contendo queratina e um alimento para animaiscompreendendo uma fonte de hidrato de carbono e uma fonte de proteínascompreendendo queratina, além de uma queratinase capaz de hidrolisar aqueratina em uma quantidade eficaz para melhorar a digestão da queratina.A fonte de proteínas contendo queratina pode também conter uma enzimado Bacillus Iicheniformis PWD-1 para melhorar a digestão da queratina.

De forma diferente da presente invenção, o Iisado de penas con-tém as próprias bactérias, ou seja, neste caso a enzima queratinase estájunto com o microrganismos no biodigestor, hidrolisando as penas e, emuma etapa posterior, as bactéria são incorporadas à ração. A presente in-venção faz uso de um hidrolisado com enzimas, e todas as bactérias sãoremovidas da mistura. Além disso, a presente invenção usa Bacillus subtiliscepa AMR no lugar do BaciHus Iieheniformis PWD-1 e o preparado enzimáti-co contém, além de queratinases, amilases, celulases e outras proteases.Logo, conclui-se que o presente método é superior pois não precisa incorpo-rar as baterias à ração e o preparado enzimático é mais rico por ter diferen- .tes classes de enzimas. Esta é, inclusive, uma importante diferença de resul-tado obtido a partir da escolha da cepa. Cada cepa tem diferentes quantida-des e tipos de enzimas.

A patente US 4.908.220, por sua vez, revela um suplemento dealimento animal a partir de penas parcialmente hidrolisadas, proteínas e pep-tídeos clivados a partir dessas penas parcialmente hidrolisadas e células deBacillus Iicheniformis PWD-1; e um alimento animal compreendendo umafonte de carboidrato e uma fonte de proteínas consistindo essencialmenteem penas parcialmente hidrolisadas, proteínas e peptídeos clivados a partirdessas penas parcialmente hidrolisadas e células de Bacillus IicheniformisPWD-1.

De forma superior, o preparado da presente invenção não apre-senta restos de penas, apenas aminoácidos e peptídeos solúveis.. De formasemelhante ao acima exposto, estes Iisados de penas não existem na mistu-ra da presente invenção, em que as penas são 100% solubilizadas. Os res-tos de penas são prejudiciais à ração por não serem digeríveis. Além disso,a presente invenção usa Bacillus subtilis cepa AMR no lugar do Bacillus Ii-eheniformis PWD-1.

A patente US 4.959.311 revela um método de degradação dematerial de queratina, compreendendo as etapas de combinar o material dequeratina com o BaciHus Iieheniformis PWD-1 para formar um meio de fer-mentação e fermentar o meio por um tempo suficiente para degradar o mate-rial. Nesta patente, a enzima queratinase é purificada e tem suas caracterís-ticas descritas.

De forma diferente desta patente US, a presente invenção nãousa a enzima purificada, e sim uma mistura contendo queratinases, outrasproteases, amilases e celulases. No preparado da presente invenção sãoincluídos os peptídeos e os aminoácidos obtidos com a hidrólise das penas.A comercialização de enzimas purificadas é difícil para a incorporação emtoneladas de rações animais. Além disso, a invenção usa Bacillus subtiliscepa AMR no lugar do Bacillus Iieheniformis PWD-1.

Portanto, de forma inventiva e inesperada, a presente invençãoresolve os problemas técnicos acima apontados.

Com o aumento dos preços dos componentes para rações, asenzimas representam uma alternativa para conter a alta do custo de produ-ção. Os complexos enzimáticos passaram a ser muito usados no Brasil em2008. A inclusão de aditivos pode levar a uma economia de até 3% nos cus-tos com ração, além de diminuir o tempo de engorda de aves. Se antes asaves levavam, em média, 40 dias para pesar 1,7 Kg, hoje, graças ao uso deaditivos, esse peso já pode ser alcançado no 34° dia. O tempo de alojamen-to é mais um dos elementos de redução do custo de produção.

As queratinases e outras peptidases têm adquirido grande im-portância biotecnológica devido a suas aplicações industriais crescentes.

Atualmente são utilizadas pela indústria farmacêutica, em medicamentos ecosméticos, pela indústria de detergentes, de alimentos e indústria coureiracomo depilantes. Também são utilizadas para tratamento de tecidos na in-dústria têxtil e em processo de biorremediacão e compostagem.

O mercado mundial de enzimas é da ordem de quatro bilhões dedólares, sendo 2,2 bilhões de dólares o mercado de enzimas industriais (en-zimas técnicas, e para a indústria de alimentos e ração animal). Dados Ie-vantados pelo Ministério da Ciência e Tecnologia confirmam a defasagem doBrasil nesta área, prevalecendo no país o uso da catálise em detrimento dabiocatálise. Assim, avaliou-se o mercado externo brasileiro, no ano de 2005,em 147,2 milhões de dólares sendo que 86% correspondem a importações,indicando desvantagem tecnológica e estratégica em termos de produção euso destes catalisadores no país. As peptidases representam 60% das ven-das mundiais de enzimas, sendo 40% de origem microbiana.

A produção e complexos enzimáticos como aditivos em raçõescresce a cada ano como conseqüência do aumento da produção animal. Nomercado internacional existem Versazyme™ e Valkerase™, produzidos pelaBioResource International Inc., na Carolina do Norte, E.U.A. Estes produtostecnológicos são concentrados de queratinases de Bacillus IicheniformisPWD-1, que são usados para serem incorporados no pós pellet das raçõesdas aves para auxiliar na digestão da queratina presente na ração. Estesprodutos têm grande aplicação nas indústrias que incorporam a farinha depenas na sua ração.

Outra área de aplicação é em cosmética em "peelings" faciais,depilação do couro, na indústria farmacêutica, têxtil e na produção de deter-gentes, onde estas queratinases podem ter grande aplicação. Um exemplo éo Arazyme® produzido pela Insect Biotech Co., Ltd1 na Coréia.

O outro resíduo produzido no processo são células da bactéria euma pequena quantidade de penas não digeridas (5%) que podem ser usa-das em compostagem como bioativos.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se ao processo para fabricação depreparados enzimáticos obtidos de pena de aves, compreendendo o preparodas penas de frango através de lavagem com detergente ou água, secageme delipidação; o cultivo de microrganismos Bacillus subtilis cepa AMR emmeio extrato de levedura; a fermentação das penas pelos microrganismos,produzindo peptídeos e uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupoque consiste em proteases, queratinases, amilases e celulases.

Uma etapa opcional consiste na liofilização do produto obtidoapós remoção dos microrganismos por centrifugação produzindo um prepa-rado enzimático em pó.

A delipidação pode ser realizada com qualquer solução de deli-pidação, por exemplo, solução de clorofórmio: metanol (1:1 v/v) por 1h sobagitação de 300 rpm à temperatura ambiente e após esta etapa, as penassão opcionalmente secas "overnight" a 60°C.

O meio extrato de levedura pode compreender extrato de leve-dura 0,5%, peptona 0,5%, KCI 2,0% e sacarose 2,0%.

O cultivo pode ser realizado por 2-3 dias a 28°C sob agitaçãoconstante (300 rpm) e a lavagem pode ser realizada com salina (2x3000rpm/20min).

A fermentação das penas pode compreender a transferência dosmicrorganismos para meio PBS pH 7,0-8,0 (NaH2PO4 0,06M e K2HPO40,04M) com 1% de penas de frango, sendo cultivados durante 5-7 dias a28°C sob agitação de 300 rpm.

A presente invenção refere-se também aos preparados enzimá-ticos obteníveis pelo processo acima mencionado e, adicionalmente, ao usodos mesmos para adição ao pós-pellet de rações animais, para melhorar adigestibilidade de uma farinha de penas e para auxiliar na digestão de penasem digestores antes do seu aquecimento para obtenção de uma farinha depenas.

Ainda, os preparados enzimáticos da presente invenção têm usocomo agente de transformação capilar.

A presente invenção também provê uma ração animal e um a-gente de transformação capilar.

Descrição Detalhada da Invenção

Os preparados enzimáticos da presente invenção contêm enzi-mas como queratinases e outras proteases, além de celulases e amilases.

Os preparados contêm também peptídeos obtidos da queratina de pena defrango.

A presente invenção refere-se a duas principais modalidades:ração animal e transformação capilar.

Modalidade 1 - Ração Animal

Os preparados enzimáticos podem ser adicionados no pós-pelletde rações animais ou ser usados para melhorar a digestibilidade de penas ede farinha de penas ou auxiliar na digestão das penas em digestores antesdo seu aquecimento para obtenção da farinha de penas. Os preparados po-dem ser usados também no pós-pellet de rações em geral, devido à varie-dade de enzimas.

Os preparados enzimáticos são obtidos pelo cultivo de micror-ganismos com cepas isoladas das indústrias avícolas brasileiras. Estas ce-pas e espécie de bacilos foram isoladas de avícolas e aviários brasileiros eforam depositadas em coleções de cultura da Fundação Oswaldo Cruz -Brasil. É a primeira vez que se trabalha com estas cepas.

As penas são fermentadas pelos bacilos em condições ótimasde pH, temperatura e sais, produzindo peptídeos altamente digestíveis e en-zimas como proteases, queratinases, amilases e celulases. O produto é Iiofi-Iizado após remoção dos microrganismos por centrifugação produzindo umpreparado enzimático em pó.

O método enzimático preserva todos os aminoácidos da pena.Além do mais, utiliza penas originadas da indústria avícola brasileira comoresíduo agroindustrial, favorecendo uma reciclagem deste material que poluio ambiente por ser de difícil e lenta decomposição.

A presente invenção demonstrou, através de testes com tripsinae pancreatina, que estas enzimas aumentam a digestiblidade da farinha depenas e das penas "in natura". Desta forma, com o uso do preparado enzi-mático, a farinha de penas fica mais digerível e pode ser usada em raçãopara qualquer animal de criação.

Ainda, a presente invenção transforma a farinha de penas emum produto com maior digestibilidade. Muitas indústrias avícolas preferemvendê-la para fábricas de rações e não adicioná-las em suas próprias raçõespara aves. Trata-se de um método para reciclar a pena descartada de frango.

Os microrganismos utilizados são altamente queratinolíticos eproteolíticos, capazes de hidrolisar as penas produzindo peptídeos e amino-ácidos. A presente invenção usou cepas de Bacillus sp, que são usados emprocessos industriais desde 1960 e são GRAS ("Generally Regarded As Sa-fe"). O método gera, basicamente, além das proteases, queratinases e ou-tras enzimas, os hidrolisados de queratina que enriquecem o produto comaminoácidos e peptídeos.

Portanto, de forma totalmente inovadora, a presente invençãousa cepas nativas brasileiras altamente produtoras de complexos enzimáti-cos que diferem qualitativa e/ ou quantitativamente do estado da técnica. Apreparação é enriquecida com hidrolisados de queratina que não são sepa-rados da mistura final e o preparado pode ser usado para aumentar a diges-tibilidade tanto das penas in natura em fermentadores quanto da farinha depenas em biofermentadores.

Além disso, a metodologia em questão tem um mistura de enzi-mas que ajuda na degradação da queratina, proteína, amido e celulose. Asenzimas podem ser comercializadas isoladas ou em complexos enzimáticos,e a mistura possui as principais classes de enzimas com grande quantidadede proteases e queratinases.A presente invenção usa microrganismos como produtores dire-tos do biocatalisador (enzima) no sistema de produção das enzimas e doshidrolisados de queratina. O uso de microrganismos nos sistemas de produ-ção de enzimas é vantajoso porque o tempo de produção fica mais curto,podendo-se facilmente obter grandes populações de microrganismos e con-seqüentemente, enzima, e também obter-se um controle da produção emtodas as fases. Outras vantagens são que os microrganismos podem sergeneticamente melhorados, aumentando a quantidade e/ou qualidade dobiocatalisador produzido, permitindo também sempre selecionar cepas dealta atividade.

O meio de crescimento da presente invenção é de baixo custodevido à abundância de matéria-prima no Brasil (resíduos agroindustriais daindústria avícola). Portanto é um método que ainda tem a vantagem de po-tencialmente poder aproveitar um dos principais resíduos gerados pelas ati-vidades industriais brasileiras.

Metodologia

1. Preparo das penas de frango

As penas utilizadas no meio de cultura foram penas de frangobrancas lavadas com detergente em água corrente, secas a 60°C e delipida-das com clorofórmio: metanol (1:1 v/v) por 1h sob agitação de 300 rpm atemperatura ambiente. A delipidação foi feita em béquer de 4 litros com 1/3do volume do mesmo em penas com 1L da solução de clorofórmio: metanol1;1 (v/v). Em seguida as penas foram removidas e secas "overnight" a 60°C.As penas foram adicionadas inteiras no meio de cultura como principal fontede carbono e nitrogênio.

2. Microrganismo e condições de cultura

Para obtenção dos hidrolisados de queratina utilizou-se o Bacil-Ius subtilis cepa AMR, isolado pelo laboratório de resíduos agro-industriaisda indústria avícola RICA e atualmente depositado na coleção de cultura daFundação Oswaldo Cruz - Brasil com o numero de registro 1266. Este mi-crorganismo foi escolhido devido à sua intensa atividade queratinolítica parapenas de frango.O bacilo foi cultivado em meio extrato de levedura (figura 1) (ex-trato de levedura 0,5%, peptona 0,5%, KCI 2,0% e sacarose 2,0%;) por 2dias a 28°C sob agitação constante (300 rpm) para obter massa celular elavados com salina (2x 3000rpm/20min) para remoção dos componentes domeio antes de serem inoculados no meio contendo penas a 1%. Em seguidaas células foram transferidas para meio PBS pH 8,0 (NaHaPO4 0,06M eK2HPO4 0,04M) com 1% de penas de frango (preparadas segundo o proce-dimento descrito no item anterior) e suplementado com 0,01% de extrato delevedura. A amostra foi cultivada neste meio durante 5-6 dias a 28°C sobagitação de 300 rpm (figura 2). Ao término da fermentação do bacilo no meiocontendo penas como principal fonte de carbono e nitrogênio, o sobrenadan-te foi recolhido por centrifugação a 4.000 rpm por 20 minutos.

3. Análise dos peptídeos presentes no meio de cultura por MALDI-TOFForam feitas análises em MALDI-TOF (Matrix assisted laser de-sorption/ionisation - Time of flight) para detecção de peptídeos no sobrena-dante de cultura (obtido segundo o item anterior) gerados pela hidrólise depenas pelas peptidases do B.subtiíis AMR. O sobrenadante contendo 4,99mg/ml de proteínas dosadas pelo método de Lowry (Lowry et al. 1951), foiparcialmente purificado em ZipTip C18 O ZipTip C18 foi equilibrado comuma solução de acetonitrila (ACN) 100% seguida pela lavagem com ácidotrifloroacético (TFA) 0,1%. Após este processo, os peptídeos foram fixadosna resina do ZipTip C18, lavados com TFA 0,1% para remoção de sais, fos-fatos e/ou DMSO que causam ruído na leitura. A eluição foi feita com 0,1%de TFA em ACN 50%. As amostras purificadas foram incorporadas as matri-zes de ácido a-ciano-4- hidroxicinâmico (5pg/mL em TFA 0,1% em ACN50%) 1:1. A mistura foi então aplicada na placa para análise por MALDI-TOF. Análise em MALDITOF revelou fragmentos com massa molecular de800-1100 Dalton no sobrenadante bruto das culturas (Figura 3)

4. Zimografia com substrato gelatina e queratinaAos sobrenadantes concentrados foi adicionado o tampão daamostra para peptidase [tampão Tris-HCI 0,32M, pH 6,8; glicerol 48% (v/v);dodecil sulfato de sódio 8% (p/v) e azul de bromofenol 0,06% (p/v)] na pro-porção 6:4 (60 μΙ_ de amostra para 40 μΙ_ de tampão da amostra para pepti-dase). As amostras foram aplicadas (20-30 pL) no gel de poliacrilamida (La-emmli, 1970) a 12,5% contendo 1% (p/v) de gelatina ou queratina co-polimarizada (Heussen & Dowdle, 1980). A corrida foi realizada a 170V por2,5 horas a 4°C. Após a corrida, os géis foram lavados com Triton X-100 2,5% (v/v) duas vezes por 15 minutos sob agitação (70 rpm/ mim) para a remo-ção do SDS. Em seguida, os géis foram incubados por 48 horas a 37°C emtampão ácido cítrico pH 5,0 (48,5 mL de ácido cítrico 0,1 M e 51,5 mL deNa2HP04 0,2M). Para detecção da atividade proteolítica, os géis foram co-rados com coomassie blue [5 mL de solução estoque (coomassie blue 2%p/v); 4 mL de ácido acético; 20 mL de metanol e 11mL de água destilada]"overnight" e descorados com a solução metanol: ácido acético: água(50:10:40 v/v/v), sob agitação, até o aparecimento de bandas de degrada-ção, (fig. 4)

5. Presença de outras enzimas

O preparado enzimático foi também analisado para a presençade outras enzimas. Amilases e celulases foram detectadas. O método usoua incorporação dos substratos em placas de petri contendo mei simbels semoutras fontes de proteína e amido. As proteases analisadas além das quera-tinases também mostraram especificidade para caseína e gelatina (figura 5).

6. Degradação enzimática da farinha de penas pelo preparado enzimático

O microrganismo B. subtilis cepa AMR, foi cultivado em meio ex-trato de levedura por 48 horas sob agitação (300rpm) à temperatura ambien-te para obter massa celular. Após esse período, as células foram lavadasduas vezes com salina estéril (3000 rpm/ 20 min) e inoculadas nos meiosotimizados para penas (1,5% de penas, pH 8,0, MgS04, MnCI2 e CaCI2,nas concentrações de 0,5 e 1mM ) ou farinha de penas (2,0%farinha de pe-nas pH 7,0) por 6 dias nas melhores condições (agitação constante, 300rpm, à temperatura ambiente)

Ao final da incubação, o meio de fermentação foi centrifugado(3000 rpm/ 20min) e o sobrenadante de cultura (preparado enzimático bruto)foi clarificado em membrana com poro de 0,45 μιτι, seguida de filtração emmembrana com poro de 0,22 μηι. O extrato enzimático bruto foi acrescido deazida sódica (0,05%) e distribuído em erlenmeyers contendo 2, 4, 6, 8 e 10%de penas ou farinha de penas (proporcional ao volume de extrato enzimáticousado) autoclavadas. Os frascos foram mantidos à temperatura ambientesob agitação constante (300rpm) por 24, 48, 42 e 96 horas. Ao final da hidró-Iise enzimática, as penas ou farinha de penas restantes foram desidratadas(60°C/ 72 h) e pesadas para avaliação de perda de massa, além de teremsido submetidas ao ensaio da digestibilidade in vitro. O sobrenadante damistura de reação, coletado diariamente, foi avaliado quanto à concentraçãode proteínas solúveis.

No que tange às penas previamente autoclavadas, foram utiliza-das como substrato da degradação enzimática. Observou-se o máximo deconcentração de proteínas após o quarto dia, quando penas foram utilizadasa 4% (8,416 mg/ml), como mostra a figura 6. Na mistura de reação com pe-nas a 5%, a concentração de proteínas após 24 horas foi de 7,178 mg/ml,um valor duas vezes maior que a concentração de proteínas do extrato en-zimático (3,55mg/ml).

O mesmo experimento foi conduzido para avaliar a degradaçãoenzimática de farinha de penas, utilizando como extrato enzimático o sobre-nadante de B. subtilis AMR cultivado na presença deste substrato.

A dosagem de proteínas do sobrenadante da mistura de reaçãomostrou que, ao longo dos dias, a concentração de proteínas aumentou (fi-gura 7), com máximo de 16,665 mg/ml no terceiro dia na mistura de reaçãocontendo 5% de farinha de penas e mantendo-se constante, o que poderiaindicar a inibição das enzimas (ou parte delas), pelo produto. Nesta concen-tração de farinha de penas (5%), a concentração inicial de proteínas foi de3,153mg/ml e logo após 24 horas de degradação, a concentração subiu para11,232mg/ml. Altas concentrações de proteínas também foram alcançadasapós 4 dias de reação, quando foram utilizadas farinha de penas a 3 e 4%(15,735 ± 0,444 e 15,575 ±0,151 mg/ml, respectivamente). Com 1 e 2% defarinha de penas como substrato da reação, o aumento da concentração deproteínas não foi tão evidente (figura 7).À medida que a concentração de farinha penas aumentou namistura de reação, a perda de peso da farinha no final do processo foi me-nor. Na mistura de reação contendo 1% de farinha de penas, a perda de pe-so (rendimento da degradação) foi de 42%, um valor bem alto, considerandoque a degradação microbiana fica em torno de 70% (figura 8). Já com pe-nas, a pesagem após 4 dias de incubação mostrou que houve perda de pesode até 13,25±0,58 % e 11,96 ± 2,39% (na mistura contendo 4% e 1% de pe-nas, respectivamente). Em todas as concentrações de penas utilizadas namistura de reação, a perda de peso foi próxima a 11% (figura 8).

7. Determinação da digestibilidade in vitro

A pena ou farinha de penas (0,02g), antes e após a fermentaçãomicrobiana, foi colocada em tubos contendo 1,5 ml_ de HCI 0,1 M contendo0,15 mg de pepsina, seguida da incubação a 37°C por 3h. A suspensão foineutralizada com NaOH 0,5M e tratada com 0,4mg de pancreatina em 0,75mL de tampão fosfato contendo 0,005M de azida sódica, e a mistura incuba-da por 24h a 37°C. Após a incubação, as amostras foram tratadas com 1 mLde TCA 10% e centrifugadas a 9000 rpm por 5 minutos. A proteína do so-brenadante foi mensurada pelo método de Lowry et al., (1951) e a digestibi-lidade foi calculada pela razão da proteína no sobrenadante e proteína naamostra. A digestibilidade (degradação com pepsina e pancreatina) das pe-nas aumentou quando 1% de penas foi utilizada como substrato de reação(0,0421) em relação às penas controle, sem tratamento (controle - 0,0314)(figura 9). Observou-se que a digestibilidade desta farinha de penas diminuiuligeiramente (figura 9), não havendo diferenças significativas entre os valo-res observados para as diferentes concentrações de farinha de penas utili-zadas (figura 7).

A degradação enzimática das penas poderia ser realizada para aobtenção de hidrolisados de queratina, mas como o rendimento da degrada-ção das penas é baixo (Figura 8) e as penas restantes não se tornaram maisdigeríveis, concluiu-se que as queratinases e demais peptidases produzidaspelo B. subtilis não são eficientes na degradação de penas e que a presençado microrganismo é necessária para a degradação deste substrato. Entre-tanto, a digestão enzimática da farinha de penas se mostra promissora paraa obtenção de proteínas, A otimização de parâmetros como pH e temperatu-ra, assim como adição de agentes redutores pode aumentar a degradaçãoda farinha.

8. Aminoácidos da farinha de penas após a fermentação in vivo pelos mi-crorganismos

A farinha de penas fermentada pelo microrganismo in vivo tevesua composição de aminoácidos analisada e foi demonstrado que os amino-ácidos são liberados devido à ação enzimática.

Tabela 2

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Tabela 2: aminoácidos liberados pela enzima da farinha de penas após fer-mentação

Modalidade 2 - Transformação capilar

Outra vantagem oferecida pela presente invenção é o fato deque a indústria cosmética pode fazer um importante link com a indústria aví-cola para aproveitamento destes resíduos, evitando que os mesmos sejamincorporados em rações animais ou poluindo o ambiente.

Portanto, outro uso para o preparado enzimático da presente in-venção é como agente de transformação capilar. As enzimas são capazesde clivar pontes dissulfeto quando usadas com outros agentes de transfor-mação como o tioglicolato, que potencializam seu uso. O resultado é a dimi-nuição da ondulação dos cabelos, inclusive comparando-se ao efeito de es-cova progressiva.Os tipos mais comuns de alisamentos são os temporários (bru-shing), os progressivos (escovas progressivas e relaxamento com duraçãode um a três meses) e os definitivos (escova definitiva - com duração de atéum ano). Todos com agentes próprios para cada necessidade. Estes agen-tes usados para transformação capilar são químicos.

Os cabelos podem ser transformados basicamente através dedois processos: relaxamento e permanente. Ambos usam soluções com a-gentes químicos que reduzem as pontes dissulfeto das cistinas da queratinado cabelo, precisamente no córtex do cabelo.

Após lavagem, os cabelos são tratados com outros agentesquímicos para oxidar novamente as cisteínas em cistinas na nova forma docabelo (liso: relaxamento ou em cachos: permanente). As substâncias maisconhecidas e utilizadas nos salões de beleza são o hidróxido de sódio, hi-dróxido de cálcio, lítio, guanidina e a amônia. Há outros componentes comoa etalonamina, derivada do tioglicolato de amônia, componente mais comumnos alisantes, que tem um poder de alisamento maior.

No Brasil existem escovas progressivas que possuem, em suafórmula, o tão discutido formol, porém em percentagem autorizada pela AN-VISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Os vapores do formol sãoaltamente agressivos às mucosas, olhos e aparelhos respiratórios, além deserem potencialmente alergênicos e cancerígenos. Seu uso excessivo podecausar irritações na pele. Neste caso, embora não existam estudos científi-cos sobre os mecanismos do alisamento, sabe-se que são utilizados amino-ácidos e peptídeos de queratina, além do formol e calor, formando um filmeque recobre o cabelo. Uma pesquisa realizada pelo Instituto Adolfo Lutz re-velou que 52% das amostras avaliadas disponíveis no mercado brasileirotinham concentração 10 vezes maior que o limite de 0,2g de formol, permiti-do pela legislação sanitária.

O método enzimático proposto no presente pedido de patente épioneiro, considerando que não existe ainda no mercado mundial nenhummétodo que empregue enzimas em processos de alisamentos capilares. Aenzima queratinase cliva as pontes dissulfeto do cabelo permitindo que ocabelo possa ser moldado na forma lisa com o auxílio do calor. No prepara-do em questão, além da enzima queratinase, existem outras proteases, asaber, todas da classe das serinas e peptidases, que auxiliam na penetraçãodo produto, aminoácidos e peptídeos de queratina de penas de frango, queauxiliam no processo recompondo as perdas protéicas. Os hidrolisados depena usados nesta escova progressiva ajudam a recompor a cutícula melho-rando a maciez e brilho da fibra capilar.

Meios de cultura e cultivo

Os substratos utilizados foram penas de frango inteiras como Cí-nica ou principal fonte de carbono e nitrogênio. As penas foram previamentelavadas com detergente, enxaguadas exaustivamente com água corrente eos lipídeos removidos com uma solução de clorofórmio: metanol (1:1 v/v)sob agitação (300rpm/1h). O microrganismo usado, uma cepa de Bacillussubtilis, foi cultivado no meio extrato de levedura (extrato de levedura 0,5%,peptona 0,5%, KCI 2,0% e sacarose 2,0%) por 72 horas com agitação(300rpm) para obter massa celular e lavado com salina (2x 3000rpm/20min)para remoção dos componentes do meio antes de serem inoculados nosmeio de penas a 1%. (Meio PBS-penas de frango: contém tampão fosfato(NaH2PO4 0,06M e K2HPO4 0,04M) pH 7,2 com 1% de penas).Neste meio foicultivado por 7 dias à temperatura ambiente. No final deste tempo, o meio decultura foi centrifugado (3000rpm/20min) para remoção das células e o so-brenadante foi liofilizado.

Este liofilizado contém as enzimas e os peptídeos e aminoácidosda queratina que foram usados neste estudo da escova progressiva. Previ-amente alguns testes foram realizados com o liofilizado como zimografiaspara verificar a presenças das enzimas e MALDI TOF para verificar a pre-sença dos peptídeos, como mostram respectivamente, as figuras 10 e 11. e 12.

Aplicação do produto

O liofilizado foi dissolvido em tampão fosfato (NaH2PO4 0,06M eK2HPO4 0,04M) pH 7,2, o mesmo tampão usado no meio de cultura. A solu-ção foi então aplicada em mechas de cabelo humano comerciais e o produtoagiu por 20 minutos. Após lavagem, a mecha foi submetida a placa térmicaestabelecendo o formato liso da fibra capilar. O experimento foi repetido 3vezes para cada lote diferente do liofilizado.Avaliação

Os resultados foram avaliados por análises sensoriais e medidasda hidratação, mostrando resultados surpreendentes e altamente positivos.

Não existe nada parecido com o uso de enzimas como agentede transformação capilar descrito na técnica. Até o presente momento todosos métodos para alisamento ou diminuição das ondas são químicos, semexceção.

Descrição Detalhada das Figuras

Figura 1: Microscopia eletrônica de Bacillus subtilis AMR em meio conten-do penas de frango.

Figura 2: Meio de cultivo de B subtilis AMR, mostrando a quase completadegradação das penas (90-95%) após cinco dias de cultivo.

Figura 3: MALDI-TOF do sobrenadante de cultura do B. subtilis, AMR emmeio de penas após 120h de cultivo, mostrando os peptídeosderivados da queratina da pena.

Figura 4: Zimografia com gelatina e queratina do sobrenadante de Bacillussubtillis em penas demonstrando a presença de enzimas proteo-líticas e queratinolíticas.

Fig 5: Presença de gelatinases, caseinases, celulases e amilases emdiferentes cepas de Bacillus SP.

Figura 6: Concentração de proteínas da mistura de reação da degradaçãoenzimática de penas (estéreis).

Figura 7: Concentração de proteínas da mistura de reação da degradaçãoenzimática de farinha de penas.

Figura 8: Rendimento da degradação de penas e farinha de penas subme-tidas à degradação enzimática.

Figura 9: Digestibilidade in vitro das penas (estéreis) e farinha de penassubmetidas á degradação enzimática.

Figura 10: Pontes dissulfeto da cistina da queratina.Figura 11: Zimografia das enzimas queratinolíticas (A) e das proteases (B)presentes no extrato enzimático (liofilizado).

Figura 12 A: MALDI TOF mostrando a presença de peptídeos obtidos dasqueratina de penas do meio que foi hidrolisada pelas enzimasqueratinolíticas e pelas proteases do microrganismo.

Figura 12 B: Queratina de penas (padrão), não hidrolisada mostrando o picode 9.000 e 10.000 m/z que corresponde a queratina intacta.

Claims (14)

1. Processo para fabricação de preparados enzimáticos obtidosde pena de aves, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) preparo das penas de frango através de lavagem, secagem e delipida-ção;(b) cultivo de microrganismos Bacillus subtilis cepa AMR em meio extratode levedura;(c) fermentação das penas preparadas a partir da etapa (a) pelos micror-ganismos cultivados a partir da etapa (b), produzindo peptídeos e umaou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em pro-teases, queratinases, amilases e celulases.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende adicionalmente a etapa de liofilização do produtoobtido da etapa (c) após remoção dos microrganismos por centrifugaçãoproduzindo um preparado enzimático em pó.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a delipidação da etapa (a) é realizada com solução de cloro-fórmio: metanol (1:1 v/v) por 1h sob agitação de 300 rpm a temperatura am-biente.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que após a etapa de delipidação da etapa (a),as penas são secas "overnight" a 60°C.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o meio extrato de levedura da etapa (b)compreende extrato de levedura 0,5%, peptona 0,5%, KCI 2,0% e sacarose 2,0%.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o cultivo da etapa (b) é realizado por 2-3dias a 28°C sob agitação constante (300 rpm) e lavados com salina (2x 3000rpm/20min)

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende a transferência dosmicrorganismos para meio PBS pH 7,0-8,0 (NaH2PO4 0.06M e K2HPO4-0,04M) com 1% de penas de frango, sendo cultivados durante 5-7 dias a-28°C sob agitação de 300 rpm.

8. Preparados enzimáticos, caracterizados pelo fato de seremobteníveis pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações-1 a 7.

9. Uso de preparados enzimáticos como definidos na reivindica-ção 8, caracterizado pelo fato de ser para adição ao pós-pellet de raçõesanimais.

10. Uso de preparados enzimáticos como definidos na reivindi-cação 8, caracterizado pelo fato de ser para melhorar a digestibilidade deuma farinha de penas.

11. Uso de preparados enzimáticos como definidos na reivindi-cação 8, caracterizado pelo fato de ser para auxiliar na digestão de penasem digestores antes do seu aquecimento para obtenção de uma farinha depenas.

12. Uso de preparados enzimáticos como definidos na reivindi-cação 8, caracterizado pelo fato de ser como agente de transformação capilar.

13. Ração animal, caracterizada pelo fato de conter preparadosenzimáticos como definidos na reivindicação 8.

14. Agente de transformação capilar, caracterizado pelo fato deconter preparados enzimáticos como definidos na reivindicação 8.