CN104911160B - 一种中性植酸酶突变体及其应用 - Google Patents

一种中性植酸酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

一种中性植酸酶突变体及其应用，本发明提供了一种新型中性植酸酶，通过随机突变的方法对植酸酶PHYA进行改造，获得一种突变体蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。本发明筛选到的植酸酶突变体PHYAT3最适反应pH为6.5，在pH6.5‑7.0范围内，能保持80％以上的酶活，当pH为8.0时，仍能保持20％的酶活，取得了意料不到的技术效果。与野生型相比，植酸酶突变体PHYAT3在中性范围内的酶活水平得到显著提高，最适反应温度未发生明显变化。所述植酸酶突变体可广泛应用于水产饲料中，从而有利于减少饲料中无机磷酸盐的添加，降低养殖成本，同时还能有效减少水产动物粪磷对环境的污染。

Description

一种中性植酸酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一种中性植酸酶突变体及其在水产饲料中的应用。
技术背景
磷是鱼类所必需的重要矿物元素之一，鱼体对磷的需要量高于其他矿物元素但饲料中过量的磷被认为是造成水体富营养化的重要因素之一。因此，通过提高鱼类对原料中磷的利用率，适当调整饲料中磷的含量，使其更接近鱼的需要量，来降低养殖鱼类磷的排放量，是减少水环境污染的重要途径。
植酸酶作为一种由微生物发酵生产的酶制剂，可分解植酸和植酸盐，促进饲料中植酸和植酸盐的分解，使磷、磷酸根结合的内源性酶和其它营养素得以释放和利用，减少粪磷对环境的污染，节省无机磷酸盐的添加。多项研究证明，在水产养殖中植酸酶替代部分磷酸二氢钙表现出了较好的养殖效果和环境效益。罗琳等(2007)在基本花鲈试验研究表明用中性植酸酶部分替代磷酸二氢钙是完全可行的，并得出中性植酸酶1000U/kg替代80％左右的磷酸二氢钙综合生长效果最佳，也证明中性植酸酶存在一定的广谱应用性。近期研究还表明中性植酸酶在有胃和无胃水产动物均表现较好性能，可以在水产动物胃肠道中释放大量的有效磷。
但当前市场上的植酸酶以酸性植酸酶为主，在pH 2.5和5.5条件下活性最高，而在无胃水产动物消化道中，由于没有胃酸的分泌，消化道中pH约呈中性，不利于酸性植酸酶发挥作用。因此目前急需开发一种在中性pH范围内具有较高酶活的植酸酶。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种中性植酸酶突变体及其应用。本发明通过随机突变的方法对植酸酶PHYA进行改造，获得一种突变体蛋白，其pH适用范围更偏向中性条件，有利于其在水产饲料中的广泛应用。
本发明一方面提供了一种植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
所述植酸酶的一种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
本发明另一方面提供了一种植酸酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的植酸酶的第87位氨基酸由Ser变为Arg，第159位氨基酸由Gly变为Lys，第198位氨基酸由Ser变为Asp。
上述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码核苷酸序列为SEQID NO：4。
本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO：3的植酸酶突变体基因的质粒。
本发明再一方面提供了一种重组黑曲霉，是将上述质粒转入黑曲霉中构建得到的。
本发明还提供了上述植酸酶突变体在水产饲料中应用。
本发明筛选到的植酸酶突变体PHYAT3最适反应pH为6.5，在pH6.5-7.0范围内，能保持80％以上的酶活，当pH为8.0时，仍能保持20％的酶活，取得了意料不到的技术效果。与野生型相比，植酸酶突变体PHYAT3在中性范围内的酶活水平得到显著提高，最适反应温度未发生明显变化。所述植酸酶突变体可广泛应用于水产饲料中，从而有利于减少饲料中无机磷酸盐的添加，降低养殖成本，同时还能有效减少水产动物粪磷对环境的污染。
附图说明
图1为植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的pH-相对酶活曲线图；
图2为植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的温度-相对酶活曲线图。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1 植酸酶基因的获得
根据公共基因数据库中的基因序列，优化了合成基因的密码子并人工合成来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的植酸酶基因PHYA(序列为SEQ ID NO：2)，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
PCR引物和反应条件如下：
引物1(F)：GCGCGAATTCATGAGCTTCCGGTCCCTG
引物2(R)：TAAAGCGGCCGCTTAGGCGAAGCACTCGGC
反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1.5min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，PHYA基因大小为1395bp。
实施例2 植酸酶突变体的构建及筛选
为了提高植酸酶PHYA的在中性条件下的酶活水平，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
以PHYA基因为模板，以实施例1所述引物1、2用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用pH 5.0的缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有植酸酶突变子的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出40μl裂解液至两块新的96孔板，其中一块稀释到pH 5.0的缓冲液中，另一块稀释到pH 7.0的缓冲液中，分别加入相同pH值的20μl底物，于37℃反应30min后，加入40ul终止液混匀以终止反应，室温放置10min显色，分光光度计415nm处测定吸光值。实验结果显示：大部分植酸酶突变体在pH 5.0条件下的酶活高于在pH 7.0条件下的酶活，只有少数突变体在pH 7.0条件下酶活高于在pH 5.0条件下的酶活，还有一些突变体在pH 5.0和pH7.0条件下的酶活水平比突变前均大幅下降。申请人通过对在pH 7.0条件下的酶活水平显著高于在pH 5.0条件下酶活的突变体进行DNA测序，最终获得了能提高植酸酶PHYA在中性pH范围内酶活水平的突变组合：S87R、G159K、S198D三点突变体和A66P、N102R、S189R、S190P、T270K五点突变体。
将S87R、G159K、S198D三点突变体命名为PHYAT3，其氨基酸序列为SEQID NO：3，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
将A66P、N102R、S189R、S190P、T270K五点突变体命名为PHYAT5，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
实施例3 重组表达载体的构建
利用PCR分别扩增植酸酶突变体PHYAT3和PHYAT5的基因片段，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：
引物3(F)：GCTCTAGAATGAGCTTCCGGTCCCTG
引物4(R)：GCTCTAGATTAGGCGAAGCACTCGGC
PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1.5min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，PHYAT3、PHYAT5基因为大小1395bp的片段。
将上述获得的植酸酶突变体PHYAT3和PHYAT5基因片段与表达载体pGAU分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：
37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ul ddH2O。用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：
22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到分别含有植酸酶突变体PHYAT3和PHYAT5基因的重组载体pGAU-PHYAT3和pGAU-PHYAT5。
采用上述同样方法构建得到含有植酸酶PHYA基因的重组载体pGAU-PHYA。
实施例4 植酸酶突变体的重组表达
原生质体制备：接种黑曲霉宿主于PDA+U平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种于100ml液体PDA+U培养基中，30℃培养24h生长菌丝体，用于转化。将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬，加入0.2g溶菌酶。30℃、100rpm培养2-3h。将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体。
转化：原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到108。200ul原生质体中加入10ul准备好的重组载体，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000室温放置5min，加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀。倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。
转化子筛选：培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养2d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基中发酵，32℃培养5d，每天加入适量氨水，控制pH在4.5左右。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行蛋白电泳检测，筛选出有明显蛋白条带表达的阳性转化子。申请人将筛选到的其中一个重组表达植酸酶PHYA的阳性转化子命名为黑曲霉Phya(Aspergillus niger Phya),一个重组表达植酸酶突变体PHYAT3的阳性转化子命名为黑曲霉Phyat3(Aspergillus niger Phyat3),一个重组表达植酸酶突变体PHYAT5的阳性转化子命名为黑曲霉Phyat5(Aspergillus niger Phyat5)。
将黑曲霉Phya、黑曲霉Phyat3和黑曲霉Phyat5的发酵上清液进行植酸酶酶活检测，同时以黑曲霉宿主菌发酵上清液做对照。结果表明：黑曲霉宿主菌的发酵上清液酶活仅为8.4U/ml，而黑曲霉Phya、黑曲霉Phyat3和黑曲霉Phyat5的发酵上清液酶活分别为168U/ml、136U/ml和110U/ml。从而进一步说明，本发明构建的重组菌黑曲霉Phya、黑曲霉Phyat3和黑曲霉Phyat5能分别重组表达植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5。
(1)植酸酶酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的植酸钠溶液中释放1μmol无机磷所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
(2)酶活测定方法
取4ml浓度为7.5mmol/L的植酸钠溶液(pH5.00.25mol/L乙酸缓冲液配制)，加入到比色管中，37℃平衡5min，再加入2ml经pH5.00.25mol/L乙酸缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的植酸酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入4ml终止液(2份硝酸溶液(硝酸：水＝1:2)、1份100g/L钼酸铵溶液、1份2.35g/L钒酸铵溶液)，混匀以终止反应。然后室温放置10min显色，分光光度计415nm处测定吸光值。
酶活计算公式：
U＝(A-A0-0.0016)×F/(0.0415×30)
式中：A为样品的吸光值；A0为空白样品的吸光值；F为实际样液反应前的总稀释倍数；30为酶解反应时间，min。
实施例6 酶学性质分析
1、最适作用pH分析
采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的缓冲液，分别将黑曲霉Phya、黑曲霉Phyat3和黑曲霉Phyat5发酵上清液进行稀释测定，植酸钠也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃下进行植酸酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。
结果如图1所示，野生型植酸酶PHYA的最适反应pH为5.5，当pH为6.5时植酸酶PHYA的相对酶活迅速降低至30％，而当pH高于7.0时，其酶活几乎降为0；而植酸酶突变体PHYAT3和PHYAT5的最适反应pH均为6.5，在pH6.5-7.0范围内，能保持80％以上的酶活，当pH为8.0时，PHYAT3和PHYAT5仍能分别保持20％和35％的酶活，取得了意料不到的技术效果。
2、最适作用温度分析
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.0条件下，测定黑曲霉Phya、黑曲霉Phyat3和黑曲霉Phyat5发酵上清液的植酸酶活力，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，野生型植酸酶PHYA的最适反应温度为55℃，而植酸酶突变体PHYAT3和PHYAT5的最适反应温度与野生型植酸酶PHYA一致。
综上，与野生型植酸酶相比，本发明筛选到的两个植酸酶突变体PHYAT3和PHYAT5在中性范围内的酶活水平得到显著提高，而最适反应温度没有发生明显变化。所述植酸酶突变体可广泛应用于水产饲料中，从而有利于减少饲料中无机磷酸盐的添加，降低养殖成本，同时还能有效减少水产动物粪磷对环境的污染。

Claims (6)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述的植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的植酸酶突变体。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
4.一种重组质粒，所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。
5.一种重组黑曲霉，其特征在于，所述的重组黑曲霉转化/转染有权利要求4所述的重组质粒。
6.权利要求1所述的植酸酶突变体在制备水产饲料中的应用。
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