CN107663518A - 蛋白酶抗性改良的植酸酶的突变体k226h及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶工程研究领域，具体涉及植酸酶YeAPPA的突变体K226H及其编码基因和应用。通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第226位的赖氨酸突变为组氨酸。本发明所述突变酶的胰蛋白酶抗性和胃蛋白酶抗性明显改良，在饲料酶工业具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程领域，具体涉及植酸酶的突变体E226H及其编码基因和应用。
背景技术
植酸是植物中磷酸的储存库，由于常和矿物质结合产生不溶性化合物，使矿物质的有效性降低，因此植物源食品中的植酸是影响矿质元素吸收的主要抗营养成分。通过植酸酶催化水解植酸能释放可利用的磷酸集团。单胃动物缺乏内源植酸酶，工业上需要向单胃动物饲料中添加外源植酸酶，可以提高饲料的营养利用率，减少植酸向环境中排放，具有良好的经济和生态效益。
胰蛋白酶和胃蛋白酶作为动物体内常见的消化酶，能选择性降解植酸酶中特定的氨基酸位点，造成植酸酶活性降低，从而限制一些植酸酶功能的充分发挥。胃蛋白酶则选择性切割苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)和谷氨酸(E)等一些氨基酸。植酸酶因含有蛋白酶偏爱氨基酸而易被蛋白酶降解。通过干扰蛋白酶对偏爱氨基酸的选择可以有效提高蛋白酶抗性，延长植酸酶发挥功能的时间，节约饲料资源，是健康养殖饲料酶分子改良的重要策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体。
本发明另一目的是提供编码上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体的应用。
本发明对小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)来源植酸酶YeAPPA基因进行定点突变，该植酸酶YeAPPA的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的。
SEQ ID NO.1
MSVAKRNLHLSALTLIMGCFTAGAAPIATPPASYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPLWPVKAGYLTPRRAELVTLMGGFYGDYFRSQGLLSAGCPVDGSVYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKVDPLFHTVEAGVCKLDSAKTHQAVEERLGGPLSDLSQRYAKPFAQMGEVLNFAASPYCKSLQKNGKTCDFATFTANEIKVNEEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQDSQAMPDVAWHRLSGEENWVSLLSLRNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMDQLRNAEKLDMKNNPAKIVPITIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
SEQ ID NO.2
Atgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacaccgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaatgatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggggggattttatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgttgaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgatttgaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaactggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatcgccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattaaggtaaacgaagaaggtactaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgtggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccccgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaattggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagcgctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaattagatatgaaaaacaacccagctaaaattgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa
根据本发明的胃蛋白酶抗性和耐酸性提高的植酸酶YeAPPA的突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第226位的赖氨酸突变为组氨酸。
根据本发明的具体实施方式，采用定点突变的方法，获得了1个胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的植酸酶YeAPPA的突变体，命名为K226H，即：K226H为第226位赖氨酸突变为组氨酸。
因此根据本发明的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良的植酸酶YeAPPA的突变体K226H，其中第226位赖氨酸突变为组氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示
SEQ ID NO.3
MSVAKRNLHLSALTLIMGCFTAGAAPIATPPASYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPLWPVKAGYLTPRRAELVTLMGGFYGDYFRSQGLLSAGCPVDGSVYAQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKVDPLFHTVEAGVCKLDSAKTHQAVEERLGGPLSDLSQRYAKPFAQMGEVLNFAASPYCKSLQKNGKTCDFATFTANEIHVNEEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQDSQAMPDVAWHRLSGEENWVSLLSLRNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMDQLRNAEKLDMKNNPAKIVPITIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
本发明还提供了编码上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良的植酸酶YeAPPA的突变体K226H的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4
atgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacaccgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaatgatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggggggattttatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgttgaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgatttgaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaactggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatcgccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattcatgtaaacgaagaaggtactaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgtggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccccgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaattggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagcgctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaattagatatgaaaaacaacccagctaaaattgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa
将上述编码胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良的植酸酶YeAPPA的突变体的cDNA分子以合适的取向和正确的读码框插入到所述载体的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明优选的载体为pPIC9γ，使改造的植酸酶基因插入到质粒pPIC9γ上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，位于AOX1启动子的下游并受其调控。本发明优选的宿主菌为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。重组酵母表达质粒经BglII线性化后用电击转化法在毕赤酵母GS115中大量表达。
相比于野生型，本发明的植酸酶YeAPPA的突变体K226H的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性明显提高，在动物生产中具有很大应用潜力。
附图说明
图1为改造前、后的植酸酶对不同浓度胰蛋白酶和胃蛋白酶处理的耐受性曲线图；
图2为改造前、后的植酸酶在不同pH下的酶活曲线图；
图3为改造前、后的植酸酶在60℃下处理不同时间后酶活曲线图。
具体实施方式
实验材料
表达宿主菌毕赤酵母GS115和酵母表达载体pPIC9γ购自Invitrogen公司。质粒扩增宿主菌是大肠杆菌Trans1-T1细胞，购自天根。DNA纯化试剂盒购自TaKaRa。Pfu DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自天根。植酸钠、胃蛋白酶(P0685)和胰蛋白酶(T0458)购自Sigma。由上海英俊生物技术有限公司合成核苷酸引物。
实施例1：突变基因的获得
通过Overlap PCR方法引入突变，产生突变基因。以小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)来源植酸酶YeAPPA的基因序列(SEQ IDNO.2)为模板，通过两轮PCR反应引入突变，所需的突变基因连接到pEASY-T3载体上并经DNA测序证实。
突变使用四条引物：Ye-F、Ye-R、K226H-F和K226H-R。
引物序列如下：
Ye-F：5’-cgcgaattcgccccgattgctacaccgcc-3’
Ye-R：5’-gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcga-3’
K226H-F：5’-caaatgaaattcatgtaaacgaagaaggta-3’
K226H-R：5’-taccttcttcgtttacatgaatttcatttg-3’
引物中斜体代表限制性酶切位点EcoR I和Not I，下划线标记的核苷酸序列为突变位点。
实施例2：改造前后的植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化
植酸酶突变体K226H和野生型植酸酶的成熟蛋白序列克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9γ中。重组质粒经BglII线性化后，电击转化入毕赤酵母GS115中，在30℃下利用甲醇诱导重组酵母菌大量表达目的蛋白。粗酶液经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱和二乙基氨基乙基(DEAE)柱进行层析纯化。经10％SDS-PAGE电泳分析，改造前后的植酸酶的表面分子量均为46kDa，与其理论分子量一致。
实施例3：突变植酸酶的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性
突变植酸酶的胰蛋白酶抗性根据不同浓度胰蛋白酶处理2h后剩余的植酸酶酶活与植酸酶蛋白进行确定。用胰蛋白酶与植酸酶的酶活与质量比为3、6、14、28、71和141U/mg的胰蛋白酶处理突变植酸酶。
突变植酸酶的胃蛋白酶抗性根据不同浓度胃蛋白酶处理2h后剩余的植酸酶酶活与植酸酶蛋白进行确定。用胃蛋白酶与植酸酶的酶活与质量比为3、6、14、28、71和141U/mg的胃蛋白酶处理突变植酸酶。
使用硫酸亚铁钼蓝法测定胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后剩余的植酸酶酶活。将50μL适当浓度酶液与950μL 1.5mmol/L植酸钠底物(用pH 4.5和0.25M的NaAc-HAc缓冲液配制)混匀，在37℃水浴锅中反应30min，用1mL 10％三氯乙酸终止反应，再用2mL显色液(1％四水合钼酸铵，3.2％浓硫酸，7.32硫酸亚铁)进行显色。根据700nm处的吸光值确定释放的无机磷酸盐的量。一个植酸酶活性单位定义为在测定条件下每分钟释放1微摩尔磷酸盐所需的酶量。结果(图1)显示，用3至141U/mg的胰蛋白酶处理2h，野生型YeAPPA丧失了接近一半的酶活，而突变酶K226H可保持89％以上酶活；用3U/mg的胃蛋白酶处理2h时，野生酶YeAPPA完全失去活性，突变植酸酶K226H可保持65％的酶活，当胃蛋白酶浓度增加至141U/mg时，突变植酸酶K226H仍可保持26％的酶活。因此突变植酸酶K226H较野生酶显示了较高的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性。
用28U/mg胰蛋白酶或胃蛋白酶处理植酸酶不同时间后的剩余蛋白经PAGE分离，并用Image J软件评价其蛋白条带的灰度值。根据突变植酸酶的剩余蛋白计算植酸酶在胰蛋白酶和胃蛋白酶处理下的半衰期。结果(表1)显示突变植酸酶具有较强的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性，在胰蛋白酶或胃蛋白酶处理下，突变植酸酶K226H较野生酶的半衰期更大。
表1改造前后的植酸酶在胰蛋白酶和胃蛋白处理下的半衰期
实施例4：突变植酸酶的耐热性
改造前后的植酸酶在不同pH(1-12)和37℃下进行酶促反应30min，测定最适pH。酶液在pH 1-9和37℃下处理1h或pH1-4下37℃处理2h，研究不同pH下酶的活性模式。所用的缓冲液为：0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，pH1-3；0.1mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液，pH3-6；0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液，pH7-8；0.1mol/L Bis-Tris-盐酸缓冲液，pH6-7.3；0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8-12。突变酶的最适pH比野生型小0.5，为pH 4.5(表2)。突变酶K226H较野生型具有更好的酸稳定性，在pH 2下处理1h可保持77％的酶活，而野生酶仅保持12％的酶活(图2)。
表2改造前后的植酸酶的最适pH、最适温度及热失活半衰期
突变酶与野生酶在最适pH和不同温度(30-80℃)下处理30min，确定最适温度。热稳定性测定是60℃下将酶液分别处理不同时间后进行测定。突变植酸酶K226H的最适温度与突变酶一致，为45℃(表2)。突变酶K226H在60℃下处理30min较野生酶有更好的热稳定性，可保持22％酶活，而野生酶则失去活性(图3)。以植酸酶在60℃下保持一半酶活力的时间为植酸酶的半衰期来表示酶的热稳定性。结果(表2)显示突变植酸酶具有较强的耐热性，在60℃下，突变植酸酶K226H的半衰期达4.9min，而野生酶的半衰期仅为1.1min。
因此，植酸酶YeAPPA的第226位的赖氨酸突变为组氨酸不但提高了植酸酶的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性，也提高了植酸酶的热稳定性。
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 蛋白酶抗性改良的植酸酶的突变体K226H及其编码基因和应用
<160>4
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 克氏耶尔森氏菌
<400> 1
MSVAKRNLHL SALTLIMGCF TAGAAPIATP PASYTLERVV ILSRHGVRSP TKQTQLMNDV 60
TPDKWPLWPV KAGYLTPRRA ELVTLMGGFY GDYFRSQGLL SAGCPVDGSV YAQADVDQRT 120
RLTGQAFLDG IAPDCGLKVH YQADLKKVDP LFHTVEAGVC KLDSAKTHQA VEERLGGPLS 180
DLSQRYAKPF AQMGEVLNFA ASPYCKSLQK NGKTCDFATF TANEIKVNEE GTKVSLSGPL 240
ALSSTLGEIF LLQDSQAMPD VAWHRLSGEE NWVSLLSLRN AQFDLMAKTP YIARHKGTPL 300
LQQIDTALVL QRDAQGQTLP LSPQTKLLFL GGHDTNIANI AGMLGANWQL PQQPDNTPPG 360
GGLVFELWQN PDNHQRYVAV KMFYQTMDQL RNAEKLDMKN NPAKIVPITI EGCENEGDNK 420
LCQLETFQKK VAQVIEPACH I 441
<210> 2
<211> 1326
<212> DNA
<213> 克氏耶尔森氏菌
<400> 2
atgtcagttg caaagagaaa tctgcactta tccgcactca ctttgataat gggctgtttt 60
accgcaggtg ctgccccgat tgctacaccg ccggccagct acacattaga gcgtgtggtt 120
attttgagtc gacatggtgt tcgctccccg acaaaacaaa cccagctaat gaatgatgtc 180
acacctgata aatggcccct gtggccagta aaagcgggct atttaacacc gcgaagggct 240
gagttagtga ctttgatggg gggattttat ggtgattatt tccgcagcca agggttgttg 300
tctgcggggt gtccggtaga tggctccgtt tatgcacagg cagatgttga ccaacgaacc 360
cgcttaaccg gacaggcatt cttggatggg atcgcaccgg attgtggtct gaaagtacat 420
tatcaggctg atttgaagaa agttgacccg ctatttcata ccgtcgaagc gggggtctgt 480
aaactggact cagcgaaaac tcatcaggct gttgaggagc gattgggcgg gccattgagt 540
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gcatcgcctt attgcaagtc attgcaaaaa aatggaaaaa cctgtgattt tgcaactttt 660
acggcaaatg aaattaaggt aaacgaagaa ggtactaaag tttctctgag tgggccattg 720
gcactatcgt cgacattggg tgaaattttc ctgttacaag actcacaagc tatgccggat 780
gtggcctggc atcggctcag cggtgaagag aactgggttt cgctattgtc gttgcgcaat 840
gcgcaatttg atttgatggc caaaaccccg tatatcgctc gccataaagg gaccccgctg 900
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ggcggattag tctttgagct atggcagaac ccagataatc atcagcgcta tgtcgccgtg 1140
aaaatgttct atcaaacgat ggatcagctg cgaaatgccg agaaattaga tatgaaaaac 1200
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<212> PRT
<213> 人工序列
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atttaa 1326
Claims (7)
1.一种植酸酶突变体，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第226位的赖氨酸突变为组氨酸得到所述植酸酶突变体。
2.一种植酸酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的植酸酶突变体。
3.根据权利要求2所述的植酸酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.包含权利要求2所述的植酸酶突变体基因的重组载体。
5.包含权利要求2所述的植酸酶突变基因的重组菌株。
6.一种制备稳定性改良的植酸酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组的植酸酶突变体表达；以及
3)回收并纯化所表达的植酸酶突变体。
7.权利要求1所述的植酸酶突变体的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710703082.XA CN107663518A (zh) | 2017-08-16 | 2017-08-16 | 蛋白酶抗性改良的植酸酶的突变体k226h及其编码基因和应用 |
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| CN106591256A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-04-26 | 中国农业科学院饲料研究所 | 胃蛋白酶抗性和耐酸性提高的植酸酶YeAPPA突变体及其编码基因和应用 |
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2017
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Patent Citations (5)
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