CN117802072A - 木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，公开了一种木聚糖酶突变体及其应用。该突变体是基于瘤胃真菌木聚糖酶CDBFV，通过分子动力学模拟筛选出一段柔性较大的基序36GNNS39，该基序中N37、N38保守性较差，并构建了两个单点突变体N37P、N38V，在大肠杆菌中进行表达，85℃孵育3min相对活力分别为70.26%和55.13%，较野生型有提升；进而在热稳定性提升显著的N37P的基础上叠加优势突变体N88G，双突变体N37P/N88G的相对活力73.36%，比野生型CDBFV提高了24.7%；将N37P/N88G在毕赤酵母中进行分泌表达，85℃处理3min相对活力为88.84%，进而丰富了工业化耐热酶资源。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术
木聚糖是常用饲料原料中的主要抗营养因子之一，消除木聚糖的抗营养作用对进一步提高饲料资源利用率、拓宽饲料资源和提高养殖经济效益具有重要意义。木聚糖酶是通过水解木聚糖分子的β-1,4-糖苷键将木聚糖水解，木聚糖酶通过降解木聚糖抗营养因子，可提高饲料营养价值以及动物对饲料的利用率，还减少了动物排泄物造成的环境污染。因此，木聚糖酶在发展绿色环保型畜牧养殖业中具有意义重大。
木聚糖酶无论是在饲料中应用还是在纸浆漂白、纺织品纤维修饰以及人类的食品生产中应用，都面临着对其酶学性质的考验，主要包括耐温性和不同pH下的耐受性。例如，木聚糖酶在饲料制粒阶段即处于湿热环境中，其耐热性能不好将会导致木聚糖酶在饲料制备期间不可逆地失活，严重影响使用效果；在纸浆预漂白过程中碱洗的物料具有较高的温度(>80℃)，如果木聚糖酶不耐温则需要将纸浆冷却，但这意味着成本的增加。因此，提供一种适用于工业生产的耐高温木聚糖酶具有重要的现实意义。
定点突变是利用合成的寡核苷酸作诱变物，根据设计方案，在已知的核苷酸序列中准确地改变蛋白质氨基酸编码中1个或数个碱基，进而改变组成蛋白质的1个或数个氨基酸残基，以研究蛋白质的结构与功能的关系。通过定点突变可将木聚糖酶非活性中心的个别氨基酸替换，从而提高酶的热稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种木聚糖酶突变体及其应用。
来源于瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）的木聚糖酶CDBFV，目前已广泛应用于动物饲料、食品领域。为提高其热稳定性，本发明首先使用分子动力学模拟（Molecular simulation, MD）筛选出一段柔性较大的基序36GNNS39，多序列比对结果显示，该基序中N37、N38保守性较差，结合理性设计与机器学习预测，构建了两个单点突变体N37P、N38V，在大肠杆菌中进行表达，其在85℃孵育3min后，相对活力分别为70.26%和55.13%，较野生型有了不同程度的提升；进而，在热稳定性提升显著的N37P的基础上叠加优势突变体N88G，构建双突变体N37P/N88G，其相对活力达到了73.36%，比野生型CDBFV（48.66%）提高了24.7%；将N37P/N88G在毕赤酵母中进行了分泌表达，其在85℃处理3min后，相对活力达到了88.84%。结构分析结果表明，N37P突变的引入使得CDBFV形成了新的疏水相互作用，干预了糖基化对结构的影响，进而提高了热稳定性。本发明为提高GH11家族木聚糖酶的热稳定性研究提供了新思路，同时丰富了工业化耐热酶资源。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种木聚糖酶突变体（突变体N37P，SEQ ID NO:1），所述突变体包含木聚糖酶第37位氨基酸由N到P的突变。
本发明的木聚糖酶来自瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum），其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
第二方面，本发明提供木聚糖酶突变体（双突变体N37P/N88G，SEQ ID NO:3），所述突变体包含木聚糖酶第37位氨基酸由N到P的突变以及第88位氨基酸由N到G的突变。
第三方面，本发明提供编码所述突变体的核酸分子。其中，编码木聚糖酶双突变体N37P/N88G的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
第四方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
第五方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物表达所述突变体。
进一步地，所述重组微生物为大肠杆菌（Escherichia coli）或毕赤酵母（Pichia pastoris）。
第六方面，本发明提供所述重组微生物在木聚糖酶生产中的应用。
第七方面，本发明提供包含所述突变体的饲料添加剂。
第八方面，本发明提供所述突变体在木聚糖水解中的应用。
第九方面，本发明提供所述突变体在制备饲料添加剂中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的基于木聚糖酶CDBFV设计的木聚糖酶突变体N37P（含N37P突变位点，SEQ ID NO:1），N88G（含N88G突变位点），N37P/N88G（含N37P/N88G双突变位点，SEQ ID NO:3），其耐热性得到提升，在大肠杆菌中表达的三个突变体在85℃处理3min后，N37P、N88G、N37P/N88G的酶活存留率分别为70.26%、60.24%、73.36%，与木聚糖酶CDBFV（SEQ ID NO:5）相比，酶活存留率分别提升了21.6、11.58和24.7个百分点。其中，木聚糖酶双突变体N37P/N88G的耐热性最强，其在85℃处理3min后的酶活存留率比单突变体N37P和N88G分别提高了3.1和18.13个百分点。在毕赤酵母中表达的N37P/N88G在85℃处理3min后，N37P/N88G的酶活存留率为88.84%，比毕赤酵母表达的野生型CDBFV酶活存留率提高了12.25个百分点。
所述木聚糖酶突变体耐热性高，有利于其在饲料中的应用，市场前景广阔。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中木聚糖酶CDBFV的氨基酸序列分析及突变位点的筛选。其中，A：通过MD模拟中的RMSF值筛选柔性区域；B：多序列比对确定柔性区域中的不保守位点；C：CDBFV的3D结构模型及突变位点在结构中的位置。
图2为本发明较佳实施例中木聚糖酶CDBFV单突变体在大肠杆菌中的表达及酶学性质表征。其中，A：野生型和突变体的SDS-PAGE检测结果图；B：野生型和突变体在85℃水浴3min的相对热稳定性；C：野生型和突变体在pH3-9范围内的相对活性；D：野生型和突变体在最适pH下测定30℃-90℃温度范围内的相对活性；E：野生型和突变体在85℃水浴3min的热稳定性。
图3为本发明较佳实施例中木聚糖酶CDBFV双突变体在大肠杆菌的表达及酶学性质表征。其中，A：野生型和双突变体的SDS-PAGE检测结果图；B：野生型和双突变体在85℃水浴3min的热稳定性；C：野生型和双突变体在pH3-9范围内的相对活性；D：野生型和双突变体在最适pH下测定30℃-90℃温度范围内的相对活性。
图4为本发明较佳实施例中木聚糖酶CDBFV双突变体在毕赤酵母的表达及酶学性质表征。其中，A：野生型和双突变体的SDS-PAGE检测结果图；B：野生型和双突变体在85℃水浴3min的热稳定性；C：野生型和双突变体在pH3-9范围内的相对活性；D：野生型和双突变体在最适pH下测定30℃-90℃温度范围内的相对活性；E：野生型及双突变体在70℃下处理0-60min的温度稳定性；F：野生型及双突变体在80℃下处理0-60min的温度稳定性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1
1. 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌Escherichia coli Trans1-T1和E.coli BL21(DE3)感受态分别购自北京全式金公司和北京博迈德公司。大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)和毕赤酵母表达质粒pPICZαA由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的构建
对来自瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）的木聚糖酶CDBFV基因序列进行了针对E.coli中表达的密码子优化，优化后基因由武汉华大基因有限公司合成。将目的基因通过酶切连接构建至pET-28a(+)载体上，得到重组质粒并转化至Escherichia coli Trans1-T1感受态细胞中，均匀涂布到30 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落，培养后提取质粒，使用NotⅠ对其酶切验证，随后送测序验证正确后得到重组质粒pET-28a(+)-CDBFV。
同时对木聚糖酶CDBFV基因序列进行了针对毕赤酵母中表达的密码子优化，优化后的目的基因由本实验室通过酶切连接到pPICZαA载体上，得到重组质粒并转化至Escherichia coli Trans1-T1感受态细胞中，均匀涂布到25 μg/mL博莱霉素的LLB平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落，培养后提取穿梭质粒，使用Not Ⅰ对其酶切验证，随后送测序验证正确后得到重组质粒pPICZαA-CDBFV。
1.2.2 定点突变
使用SnapGene软件设计突变体N37P和N38V的引物，引物序列信息如表1所示。大肠杆菌定点突变以携带CDBFV基因的质粒pET-28a(+)-CDBFV为模板，反应体系含25μL PCRMaster Mix、1μL模板质粒、上下游引物各1μL、ddH2O 22 μL。PCR条件：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸6 min。PCR产物经DpnI消化，转化Trans-T1感受态细胞，涂布在含有卡那霉素LB平板上。毕赤酵母表达以携带CDBFV基因的质粒pPICZαA-CDBFV为模板，体系和条件同上，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞作为穿梭质粒。分别挑取阳性克隆并提质粒，送擎科生物有限公司进行测序。
表1 突变引物
注：下划线为突变位点。
1.2.3 野生型及突变体酶的表达及纯化
大肠杆菌中酶的表达纯化：将含有pET-28a(+)-CDBFV和突变体的重组表达质粒的大肠杆菌在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养至OD600约0.6-0.8，降温至16℃后加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG，诱导过夜，离心后收集细胞，并均质破碎、离心后获得粗酶液，进而通过Ni柱亲和纯化、分子筛Superdex 200纯化。用12%的SDS-PAGE电泳检测纯化后的蛋白纯度，用索莱宝蛋白浓度测定试剂盒检测纯化后的蛋白浓度。
毕赤酵母中酶的表达纯化：将pPICZαA-CDBFV和突变体的重组质粒经SalI单酶切线性化，电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，转化液涂布于含博莱霉素的YPD平板，30℃条件下培养2-3天，挑取转化子并菌落PCR验证，阳性转化子经测序验证正确后用于发酵表达。将阳性转化子接种于含有100 mLBMGY培养基的1 L摇瓶中，29℃、220 rpm至OD600达到4.0-6.0，4℃静置8小时以上，待菌体充分沉降后弃上清，使用300 mL BMMY培养基重悬菌体，在29℃、220 rpm继续培养，每24 h补加1%（v/v）的甲醇，72h后于4℃离心，收集上清获得粗酶液，粗酶液纯化方法同上。
1.2.4 野生型及突变体酶学性质的测定
活性测定方法：采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定木聚糖酶酶活，反应体系为1 mL，其中包括100 μL适当稀释的酶和900 μL 1%的榉木木聚糖溶液，在37℃下反应10 min，反应结束后加入1.5mL DNS终止反应，100℃显色5min后取200μL在波长540 nm下测定吸光值，每个反应做三组平行实验。木聚糖酶酶活单位定义为：在最适条件下1min释放1μmol还原糖所需要的酶量为1U。
最适温度测定方法：采用DNS法，在30～90 ℃条件下测定野生型CDBFV和突变体酶活性，以最高酶活性为100%，计算各温度条件下酶的相对活性。
最适pH测定方法：采用DNS法，在最适反应温度下，分别测定pH3.0～9.0条件下野生型CDBFV和突变体的酶活性，以最高酶活性为100%，计算各pH值条件下酶的相对活性。
热稳定性测定方法：将野生型重组木聚糖酶CDBFV和突变体在85℃下水浴处理3min，立即取出于冰上冷却，利用DNS法分别测定重组木聚糖酶的剩余酶活力，以未85℃水浴处理的酶活力为100%，计算热处理后的残余相对酶活力，确定酶的热稳定性。
温度稳定性测定方法：采用DNS法，将适当稀释的酶在70℃、80℃下分别处理0min，5 min，10 min，20 min，30 min，60 min，按照酶活测定方法测定酶活力，将最高酶活力定义为100%，计算其余突变体或者野生型的相对酶活力。
2. 结果与分析
2.1 突变体的构建
本研究使用的原始木聚糖序列是来自瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶CDBFV（SEQ ID NO:5），使用Alphafold 2预测了CDBFV的三维结构，并利用MD研究氨基酸残基的RMSF值的变化，筛选蛋白质的柔性区域。结果表明，在298K模拟温度下，位于CDBFV N端的基序36GNNS39和活性中心附近的151SIDGD155在298K时RMSF值较大，具有较大的柔性（图1，A）。其中，151SIDGD155位于活性中心附近，可能会引起酶活性与稳定性之间的trade-off效应，因此本发明主要聚焦在远端基序36GNNS39的改造上。将野生型与4个来自GH11家族的嗜热木聚糖酶进行多序列比对，这四个木聚糖酶XynSW1、Xyn11B、Xyn11NX和PVX分别来自Streptomyces sp.、Aspergillus niger、Nesterenkonia Xinjiangensis和Paecilonyces variotii，如图1中B所示，36GNNS39基序中，37、38位点保守性较差，表明这两个位点可能是影响热稳定性的潜在位点。结合理性设计与机器学习预测结果，设计单突变体N37P和N38V（SEQ ID NO:1和2）。各突变体在结构中的位置如图1中C所示。
2.2 单突变体在大肠杆菌中的重组表达、纯化及酶学性质表征
野生型及两个单突变体均能在大肠杆菌中可溶性表达，经Ni-NTA亲和层析、Superdex200分子筛纯化后可得到性质均一、纯度达99%以上的目标蛋白。其野生型及突变体蛋白分子量均约为24.5kDa，与理论分子量一致。如图2中B所示，根据其在分子筛上的出峰位置15mL计算，其在溶液中以单体形式存在。
为了研究突变位点对酶催化性能的影响，将纯化后的酶按照1.2.4所述的方法测定了最适温度、最适pH和热稳定性。相关突变体的酶学特性如图2和表2所示。如图2中C和D所示，采用DNS法测定不同pH下的酶活性，野生型与突变体的最适pH均为6.0，测定不同温度下的酶活性（30~90℃），野生型与突变体的最适温度均为60℃，说明突变并没有改变酶的最适pH和最适温度。如图2中E所示，在85℃水浴3 min测定热稳定性，野生型的相对活力为48.66 %，N38V的热稳定性略微提升，其剩余活力为55.13 %，N37P的相对活力为70.26 %，比野生型的相对酶活力提高了21.6个百分点，与野生型相比两个单点突变体的热稳定性有显著的提高。
表2 野生型和突变体的酶学特性
2.3 双突变体在大肠杆菌中的重组表达、纯化及酶学性质表征
综合已发表的研究（表3），我们选择优势突变体N88G，研究了其在85℃下的热稳定性。测定其在85℃水浴3 min相对酶活力达到了60.24 %。进而，再选择上述突变体中的两个表现较好的位点进行叠加，设计并制备了双突变体N37P/N88G。该双突也能在大肠杆菌中稳定表达，蛋白性质均一。其最适pH、最适温度与野生型蛋白一致（图3，C和D），但在85℃下的热稳定性相对酶活力为73.36 %（表2），比单突变体N37P和N38V分别提高了3.1和18.23个百分点，比野生型（48.66 %）的相对活力高出24.7个百分点，双突变体具有更高的热稳定性。
表3 已发表研究中相关突变体的热稳定性
2.4 双突变体在毕赤酵母中重组表达、纯化及酶学性质表征
毕赤酵母因具有较强的蛋白表达、分泌、翻译后修饰等特点，被广泛用于工业酶的表达。为了进一步评估该突变体酶在工业中的应用潜力，我们将野生型及其双突变体基因在进行密码子优化后，转入毕赤酵母体系，经甲醇诱导后获得了分泌型粗酶液。纯化后的野生型和双突变体的蛋白如图4中A所示，蛋白条带清晰且单一。野生型蛋白条带位置大约为32 kDa，高于其在大肠杆菌中表达的24.5kDa；双突变体的条带与大肠杆菌野生型蛋白的位置一致，可能是突变影响了糖基化翻译后修饰所致。巧合的是，该酶中的两个潜在的糖基化位点（N37和N88）与我们选择的双突变位置一致，这也是其突变后导致分子量下降的主要原因。为进一步研究毕赤酵母表达双突变体对酶催化性能的影响，将纯化后的酶按照1.2.4所述的方法测定了最适pH、最适温度、热稳定性和温度稳定性（表2、图4）。其最适pH、最适温度与野生型蛋白一致（图4，C和D），但在85℃下处理的热稳定性相对活力达到了88.84 %，比野生型CDBFV高12.25个百分点。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含木聚糖酶第37位氨基酸由N到P的突变；
其中，所述木聚糖酶来自瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）。
2.木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含木聚糖酶第37位氨基酸由N到P的突变以及第88位氨基酸由N到G的突变；
其中，所述木聚糖酶来自瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）。
3.编码权利要求1或2所述突变体的核酸分子。
4.含有权利要求3所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
5.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求1或2所述突变体。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为大肠杆菌（Escherichia coli）或毕赤酵母（Pichia pastoris）。
7.权利要求5或6所述重组微生物在木聚糖酶生产中的应用。
8.包含权利要求1或2所述突变体的饲料添加剂。
9.权利要求1或2所述突变体在木聚糖水解中的应用。
10.权利要求1或2所述突变体在制备饲料添加剂中的应用。
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