CN118222549A - 耐高温木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体提供了一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用。所述木聚糖酶突变体包含D154Y单个突变位点，95℃条件下处理5min后，酶活残留率高达88.03%，比野生型提高了25.8%，取得了意料不到的技术效果。本发明提供的木聚糖酶突变体具有更强的耐热性，比野生型更适合应用于饲料领域，前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术
内切木聚糖酶（EC 3.2.1.8）随机水解木聚糖内部的β-1,4-木糖苷键，从而获得大小不一的木寡糖等产物；从而破解细胞壁的半纤维素结构。
畜禽动物采食的饲料中大多数为植物性饲料原料，植物性饲料原料的细胞壁中包含木聚糖这一非淀粉多糖组分，尤其是小麦等麦类饲料原料中木聚糖含量占比较高。木聚糖等非淀粉多糖物质到达畜禽的消化道内能够增加食糜的粘度，减少营养物质与蛋白酶、淀粉酶等内源酶的接触，降低饲料利用率，更多的营养物质到达畜禽后肠被有害微生物利用，影响畜禽消化道健康，并产生料便、拉稀、糊肛等问题。
外源添加木聚糖酶可降解木聚糖生成木二糖、木三糖等木寡糖，一方面能够降低畜禽消化道内食糜粘度，提高饲料利用率，另一方面生成的木寡糖可作为益生元促进肠道有益菌的繁殖，改善畜禽肠道环境，解决畜禽料便、拉稀、糊肛等问题。因此，饲料中普遍添加了木聚糖酶，从而提高饲料的消化吸收率，改善畜禽的生产性能，降低饲料成本。
GH11家族木聚糖酶比活较高，但是耐温性较差。在饲料生产过程中，高温制粒（80-85℃）极易导致木聚糖酶失活。通过定向进化和半理性设计改造提升酶的耐温性，是解决该问题的重要手段。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，对来自瘤胃厌氧真菌（Neocallimastix frontalis）的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，筛选获得了耐高温木聚糖酶突变体。所述突变体可广泛应用于饲料加工领域。
本发明一方面涉及一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的木聚糖酶的第154位氨基酸由Asp突变为Tyr。
所述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
本发明还涉及编码上述木聚糖酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达质粒。
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达质粒。
将上述质粒转入宿主细胞中，重组表达的木聚糖酶突变体的耐热性得到显著提升。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
本发明在野生型木聚糖酶PT基础上，提供了含D154Y单个突变位点的木聚糖酶突变体。所述突变体在95℃条件下处理5min后，酶活残留率提高了25.8%，耐热性显著增强，取得了意料不到的技术效果。所述木聚糖酶突变体具有更强的耐热性，比野生型更适合应用于饲料领域，前景广阔。
具体实施方式
本发明公开了一种木聚糖酶突变体、其制备方法及应用、编码该木聚糖酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLSIN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方：
大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；
酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；
酵母筛选培养基（MD培养基）：2%蛋白胨，2%琼脂糖；
BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 %生物素，1%甘油；
BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 %生物素，0.5%甲醇；
LB-AMP培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
LB-AMP平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，1.5%琼脂，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1 重组质粒的构建
将来自瘤胃厌氧真菌（Neocallimastix frontalis）的木聚糖酶基因根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化。优化后的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将该木聚糖酶基因命名PT，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
用限制性内切酶EcoR I和Not I（Fermentas）对木聚糖酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（Fermentas）将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进DH5α大肠杆菌（Invitrogen），用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序（Sangon）。
使用质粒小量制备试剂盒（Omega）从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，获得1个重组质粒，将其命名为pPIC9K-PT。
实施例2 耐高温突变体的筛选
为了进一步提高木聚糖酶PT的耐热性，申请人对其进行蛋白结构分析。该蛋白是GHI1家族木聚糖酶，其结构为β-果冻卷的结构。申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
1.1设计PCR引物PT-F1、PT-R1：
PT-F1：ggcgaattccaaagtttctgtagttcagcttctc（SEQ ID NO:3，下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）；
PT-R1：ataggcggccgcttaatcaccaatgtaaacctttg（SEQ ID NO:4，下划线为限制性内切酶NotI识别位点）。
以PT基因（SEQ ID NO：1）为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（博迈斯）进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150μl含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃、220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出30 uL裂解液至两块新的96孔板，其中一块于95℃处理5 min，两块96孔板都加入30 uL底物，于37℃反应30 min后，DNS法测定生成的还原糖，不同的突变子高温处理后保持的活性不同。实验结果表明，有些突变对木聚糖酶的耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高木聚糖酶对温度的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，得到既能显著提高木聚糖酶的耐热性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点：D154Y。
在上述野生型木聚糖酶PT的基础上，本发明提供了含D154Y单个突变位点的突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
实施例3 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达
3.1表达载体的构建
依照毕赤酵母的密码偏爱性分别对木聚糖酶PT及其突变体的基因序列进行优化，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
按照实施例1中所述方法，将合成的木聚糖酶PT及其突变体的基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经同样酶切后的pPIC-9K载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR（反应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA聚合酶 0.5μl，10×Buffer 2.0μL，dNTPs(2.5mM) 2.0μL，5’AOX引物（10mM）：0.5μL，3’AOX引物：0.5μL，ddH2O 14.5μL，反应程序：95℃预变性5min，30个循环：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，72℃ 10min）。验证阳性克隆子，经测序验证后获得了正确的重组表达质粒。
3.2毕赤酵母工程菌株的构建
3.2.1酵母感受态制备
将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48 h后接种活化的GS115单克隆于6 mL YPD液体培养基中，30℃、220 rpm，培养约12 h后转接菌液于装有30mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220 rpm培养约5h，经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1–1.3范围后，4℃ 9000 rpm离心2 min分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1 mL灭菌水重悬菌体，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，重复用1mL灭菌水洗一遍后，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的1mL山梨醇(1 mol/L)重悬菌体；4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1 mol/L)轻柔重悬菌体。
3.2.2转化和筛选
分别将3.1构建得到的重组表达质粒用Sac I进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板（0.5mg/mL-8mg/mL）上筛选多拷贝的转化子。
将获得的转化子分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含木聚糖酶PT和木聚糖酶突变体的发酵上清液。
3.3木聚糖酶酶活测定
（1）木聚糖酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5 mg/ml的木聚糖溶液中释放1 μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
（2）酶活测定方法
取2 ml浓度为1%的木聚糖底物（pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制），加入到比色管中，37℃平衡10 min，再加入2 ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃,精确保温反应30 min。反应结束后，加入5 ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5 min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25 ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光值AE。
酶活计算公式：
XD=[(AE-AB)×K+ C0] ×N×1000/(M×t)。
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/mL；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2 g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1 mmol=1000 μmol。
（3）酶活测定结果
按照上述方法进行酶活检测，结果显示：上述构建得到的重组表达木聚糖酶PT及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的酶活为300-510 U/mL。
实施例4 木聚糖酶突变体耐热性分析
将上述构建得到的重组表达木聚糖酶PT及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液分别用pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至约20 U/mL，在95℃条件下处理5 min后，测定残余酶活，以未处理样品的酶活为100%，计算酶活残留率。具体结果见表1。
表1 木聚糖酶突变体耐热性分析
| 木聚糖酶突变体 | 95℃处理5min后酶活残留率 |
| PT | 70.00% |
| D154Y | 88.03% |
从表1的结果可知，与野生型木聚糖酶PT相比，含D154Y单个突变位点的木聚糖酶突变体在95℃条件下处理5min后，酶活残留率提高了25.8%，耐热性显著增强，取得了意料不到的技术效果。
综上所述，本发明提供的木聚糖酶突变体具有更强的耐热性，比野生型更适合应用于饲料领域，前景广阔。
Claims (4)
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的木聚糖酶的第154位氨基酸由Asp变为Tyr。
2.编码权利要求1所述木聚糖酶突变体的DNA分子。
3.包含权利要求2所述DNA分子的重组表达质粒。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求3所述的重组表达质粒；所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
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