CN118222549A - 耐高温木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域,具体提供了一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用。所述木聚糖酶突变体包含D154Y单个突变位点,95℃条件下处理5min后,酶活残留率高达88.03%,比野生型提高了25.8%,取得了意料不到的技术效果。本发明提供的木聚糖酶突变体具有更强的耐热性,比野生型更适合应用于饲料领域,前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域,具体涉及一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术
内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)随机水解木聚糖内部的β-1,4-木糖苷键,从而获得大小不一的木寡糖等产物;从而破解细胞壁的半纤维素结构。
畜禽动物采食的饲料中大多数为植物性饲料原料,植物性饲料原料的细胞壁中包含木聚糖这一非淀粉多糖组分,尤其是小麦等麦类饲料原料中木聚糖含量占比较高。木聚糖等非淀粉多糖物质到达畜禽的消化道内能够增加食糜的粘度,减少营养物质与蛋白酶、淀粉酶等内源酶的接触,降低饲料利用率,更多的营养物质到达畜禽后肠被有害微生物利用,影响畜禽消化道健康,并产生料便、拉稀、糊肛等问题。
外源添加木聚糖酶可降解木聚糖生成木二糖、木三糖等木寡糖,一方面能够降低畜禽消化道内食糜粘度,提高饲料利用率,另一方面生成的木寡糖可作为益生元促进肠道有益菌的繁殖,改善畜禽肠道环境,解决畜禽料便、拉稀、糊肛等问题。因此,饲料中普遍添加了木聚糖酶,从而提高饲料的消化吸收率,改善畜禽的生产性能,降低饲料成本。
GH11家族木聚糖酶比活较高,但是耐温性较差。在饲料生产过程中,高温制粒(80-85℃)极易导致木聚糖酶失活。通过定向进化和半理性设计改造提升酶的耐温性,是解决该问题的重要手段。
发明内容
本发明为解决现有技术问题,对来自瘤胃厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造,筛选获得了耐高温木聚糖酶突变体。所述突变体可广泛应用于饲料加工领域。
本发明一方面涉及一种木聚糖酶突变体,是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的木聚糖酶的第154位氨基酸由Asp突变为Tyr。
所述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
本发明还涉及编码上述木聚糖酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达质粒。
本发明还涉及一种宿主细胞,包含上述重组表达质粒。
将上述质粒转入宿主细胞中,重组表达的木聚糖酶突变体的耐热性得到显著提升。
在本发明的一些实施例中,宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。
本发明在野生型木聚糖酶PT基础上,提供了含D154Y单个突变位点的木聚糖酶突变体。所述突变体在95℃条件下处理5min后,酶活残留率提高了25.8%,耐热性显著增强,取得了意料不到的技术效果。所述木聚糖酶突变体具有更强的耐热性,比野生型更适合应用于饲料领域,前景广阔。
具体实施方式
本发明公开了一种木聚糖酶突变体、其制备方法及应用、编码该木聚糖酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法,例如MOLECΜLAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLSIN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是,本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上,采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂,而不限于本发明具体实施例的限定。例如,本发明可选用如下实验材料和试剂:
菌株与载体:大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒:PCR酶及连接酶购买自Takara公司,限制性内切酶购自Fermentas公司,质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司,GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方:
大肠杆菌培养基(LB培养基):0.5%酵母提取物,1%蛋白胨,1%NaCl,pH7.0;
酵母培养基(YPD培养基):1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖;
酵母筛选培养基(MD培养基):2%蛋白胨,2%琼脂糖;
BMGY培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0),1.34% YNB,4×10-5 %生物素,1%甘油;
BMMY培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0),1.34% YNB,4×10-5 %生物素,0.5%甲醇;
LB-AMP培养基:0.5%酵母提取物,1%蛋白胨,1%NaCl,100μg/mL氨苄青霉素,pH7.0;
LB-AMP平板:0.5%酵母提取物,1%蛋白胨,1%NaCl,1.5%琼脂,100μg/mL氨苄青霉素,pH7.0;
下面结合实施例,进一步阐述本发明。
实施例1 重组质粒的构建
将来自瘤胃厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)的木聚糖酶基因根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化。优化后的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将该木聚糖酶基因命名PT,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1,编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
用限制性内切酶EcoR I和Not I(Fermentas)对木聚糖酶基因进行酶切;同时,用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化,并用T4 DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进DH5α大肠杆菌(Invitrogen),用氨苄青霉素进行选择。为确保准确,对若干克隆进行测序(Sangon)。
使用质粒小量制备试剂盒(Omega)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒,获得1个重组质粒,将其命名为pPIC9K-PT。
实施例2 耐高温突变体的筛选
为了进一步提高木聚糖酶PT的耐热性,申请人对其进行蛋白结构分析。该蛋白是GHI1家族木聚糖酶,其结构为β-果冻卷的结构。申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
1.1设计PCR引物PT-F1、PT-R1:
PT-F1:ggcgaattccaaagtttctgtagttcagcttctc(SEQ ID NO:3,下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点);
PT-R1:ataggcggccgcttaatcaccaatgtaaacctttg(SEQ ID NO:4,下划线为限制性内切酶NotI识别位点)。
以PT基因(SEQ ID NO:1)为模板,利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(博迈斯)进行PCR扩增,胶回收PCR产物,EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,涂布于LB+Amp平板,37℃倒置培养,待转化子出现后,用牙签逐个挑至96孔板,每个孔中加入150μl含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基,37℃、220rpm培养6 h左右,离心弃上清,菌体用缓冲液重悬,反复冻融破壁,获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出30 uL裂解液至两块新的96孔板,其中一块于95℃处理5 min,两块96孔板都加入30 uL底物,于37℃反应30 min后,DNS法测定生成的还原糖,不同的突变子高温处理后保持的活性不同。实验结果表明,有些突变对木聚糖酶的耐热性没有影响,有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了;另外还有些突变,虽然能提高木聚糖酶对温度的耐受性,但突变后其酶学性质发生了显著的变化,这些均不符合要求。最终,得到既能显著提高木聚糖酶的耐热性,又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点:D154Y。
在上述野生型木聚糖酶PT的基础上,本发明提供了含D154Y单个突变位点的突变体,其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
实施例3 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达
3.1表达载体的构建
依照毕赤酵母的密码偏爱性分别对木聚糖酶PT及其突变体的基因序列进行优化,由上海捷瑞生物工程有限公司合成,并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
按照实施例1中所述方法,将合成的木聚糖酶PT及其突变体的基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切,然后与经同样酶切后的pPIC-9K载体16℃过夜连接,并转化大肠杆菌DH5a,涂布于LB+Amp平板,37℃倒置培养,待转化子出现后,菌落PCR(反应体系:模板挑取的单克隆,rTaqDNA聚合酶 0.5μl,10×Buffer 2.0μL,dNTPs(2.5mM) 2.0μL,5’AOX引物(10mM):0.5μL,3’AOX引物:0.5μL,ddH2O 14.5μL,反应程序:95℃预变性5min,30个循环:94℃ 30sec,55℃ 30sec,72℃ 2min,72℃ 10min)。验证阳性克隆子,经测序验证后获得了正确的重组表达质粒。
3.2毕赤酵母工程菌株的构建
3.2.1酵母感受态制备
将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化,30℃培养48 h后接种活化的GS115单克隆于6 mL YPD液体培养基中,30℃、220 rpm,培养约12 h后转接菌液于装有30mL YPD液体培养基的三角瓶中,30℃、220 rpm培养约5h,经紫外分光光度计检测其菌体密度,待其OD600值在1.1–1.3范围后,4℃ 9000 rpm离心2 min分别收集4mL菌体至灭菌EP管中,轻轻弃上清,用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1 mL灭菌水重悬菌体,4℃、9000 rpm离心2 min,轻轻弃上清,重复用1mL灭菌水洗一遍后,4℃、9000 rpm离心2 min,轻轻弃上清,预冷的1mL山梨醇(1 mol/L)重悬菌体;4℃、9000 rpm离心2 min,轻轻弃上清,预冷的100-150μl山梨醇(1 mol/L)轻柔重悬菌体。
3.2.2转化和筛选
分别将3.1构建得到的重组表达质粒用Sac I进行线性化,线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115,在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株,然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板(0.5mg/mL-8mg/mL)上筛选多拷贝的转化子。
将获得的转化子分别转接于BMGY培养基中,30℃、250rpm振荡培养1d;再转入BMMY培养基中,30℃、250rpm振荡培养;每天添加0.5%的甲醇,诱导表达4 d;9000rpm离心10min去除菌体,即得到分别含木聚糖酶PT和木聚糖酶突变体的发酵上清液。
3.3木聚糖酶酶活测定
(1)木聚糖酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为5 mg/ml的木聚糖溶液中释放1 μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
(2)酶活测定方法
取2 ml浓度为1%的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制),加入到比色管中,37℃平衡10 min,再加入2 ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液,混匀于37℃,精确保温反应30 min。反应结束后,加入5 ml DNS试剂,混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5 min,用自来水冷却至室温,加蒸馏水定容至25 ml,混匀后,以标准空白样为空白对照,在540 nm处测定吸光值AE。
酶活计算公式:
XD=[(AE-AB)×K+ C0] ×N×1000/(M×t)。
式中:XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力,U/mL;AE为酶反应液的吸光度;AB为酶空白液的吸光度;K为标准曲线的斜率;C0为标准曲线的截距;M为木糖的摩尔质量,150.2 g/mol;t为酶解反应时间,min;N为酶液稀释倍数;1000为转化因子,1 mmol=1000 μmol。
(3)酶活测定结果
按照上述方法进行酶活检测,结果显示:上述构建得到的重组表达木聚糖酶PT及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的酶活为300-510 U/mL。
实施例4 木聚糖酶突变体耐热性分析
将上述构建得到的重组表达木聚糖酶PT及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液分别用pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至约20 U/mL,在95℃条件下处理5 min后,测定残余酶活,以未处理样品的酶活为100%,计算酶活残留率。具体结果见表1。
表1 木聚糖酶突变体耐热性分析
木聚糖酶突变体 | 95℃处理5min后酶活残留率 |
PT | 70.00% |
D154Y | 88.03% |
从表1的结果可知,与野生型木聚糖酶PT相比,含D154Y单个突变位点的木聚糖酶突变体在95℃条件下处理5min后,酶活残留率提高了25.8%,耐热性显著增强,取得了意料不到的技术效果。
综上所述,本发明提供的木聚糖酶突变体具有更强的耐热性,比野生型更适合应用于饲料领域,前景广阔。
Claims (4)
1.一种木聚糖酶突变体,其特征在于,所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的木聚糖酶的第154位氨基酸由Asp变为Tyr。
2.编码权利要求1所述木聚糖酶突变体的DNA分子。
3.包含权利要求2所述DNA分子的重组表达质粒。
4.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包含权利要求3所述的重组表达质粒;所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。
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