CN101263226B

CN101263226B - 卡氏德巴利酵母植酸酶

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Publication number: CN101263226B
Application number: CN2006800326692A
Authority: CN
Inventors: 埃莱娜·布兹; 安德烈·奥美拉; 居·穆兰
Original assignee: Adisseo France SAS
Current assignee: Adisseo France SAS
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2026-07-07
Also published as: RU2008101938A; FR2888250B1; US8003360B2; NO20080702L; AR054160A1; FR2888250A1; JP2009500029A; BRPI0612650A2; ATE479747T1; WO2007006953A1; US20100266721A1; ZA200800446B; DE602006016614D1; PL1915442T3; CA2614368A1; TW200738882A; UA94712C2; AU2006268480A1; AU2006268480B2; KR20080047352A

Abstract

本发明涉及编码卡氏德巴利酵母(Debaryomyces castellii)植酸酶的基因，该酶水解植酸盐的六个磷酸键。本发明还涉及所述的植酸酶在动物的营养添加剂和饲料中用以改善它们营养价值的用途。

Description

卡氏德巴利酵母植酸酶

本发明涉及卡氏德巴利酵母(Debaryomyces castellii)的植酸酶，编码该植酸酶的基因，表达该植酸酶的重组宿主生物及其(特别是)在动物营养学领域的应用。

植酸盐(肌醇六磷酸盐)或植酸盐类(phytates)(肌醇六二氢磷酸盐，myo-inositol hexakis dihydrogen phosphate)是磷在谷类、豆类植物以及产油植物中的主要储备形式。因此，它们成为基于植物的动物饲料中主要的磷来源，单胃动物(家禽和猪)膳食中的主要成分。然而，这些动物对饲料中这种磷的生物利用度是有限的。这是因为它们不具有足量的植酸盐降解消化酶来使得植酸盐水解并从而提供它们所需量的无机磷酸盐。因此，在动物营养学领域，植酸的两种特性具有重要的作用：(1)单胃动物很难在其消化系统内降解植酸；(2)植酸是一种抗营养因子，其与蛋白质和离子(Fe³⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Mg²⁺)形成复合物，并因此降低这些元素的利用度。

因此家禽和猪的饲料的摄食中必须添加无机磷酸盐，而植酸盐的磷被排泄掉，并在单胃动物密集饲养区的地表水中形成富(养)化作用。

利用酶补充单胃动物的饲料摄食是目前用于改善植酸盐结合磷的生物利用度和用于减少有机磷补充饲料由此减少密集饲养区域磷排放的一种解决方案。

植酸酶类(肌醇六磷酸盐3-和6-磷酸水解酶EC 3.1.3.8和3.1.3.26)是组氨酸磷酸酶家族中的一部分。它们催化肌醇六磷酸(植酸，InsP₆)水解为无机单磷酸盐和具有较低磷酸化程度的肌醇磷酸盐(InsP₅至InsP₁)，和在某些情况下游离的肌醇。

用作动物饲料中添加剂的这些酶使得可能首先提高植酸磷的利用度，其次改善饲料的可消化性。此外，植酸磷酸盐的释放可观地降低由于添加磷酸盐产生的成本以及由磷酸盐的过度排泄造成的污染。

植酸酶由许多不同的生物产生：植物、动物尤其是微生物。在产植酸酶的微生物中，特别值得一提的是：曲霉菌属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)、毛霉菌属(Mucor)和根霉菌属(Rhizopus)的真菌，细菌：假单胞菌(Pseudomonas sp.)，克雷白杆菌(Klebsiella sp.)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、Enterobacter sp.，枯草杆菌(Bacillus subtilis)，以及酵母：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，球拟酵母(Torulopsis Candida)，Debaryomyces castellii，Debaryomyces occidentalis，脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)和Schwanniomyces castellii。

对于酵母，Lambrechts et al.(Biotechnology Letters，Vol.14.No.1，61-66，1992)已经鉴定了具有植酸酶活性但还没有表征相应植酸酶的多种菌株。已检测到了Schwanniomyces castellii菌株CBS2863有最高活性。也在以下菌株中观察到了植酸酶活性：Candida brumptii CBS 6145，热带假丝酵母(C.tropicalis)CBS5696，Debaryomyces castellii CBS 2923，脆壁克鲁维酵母No.111，脆壁克鲁维酵母CBS 1555，脆壁克鲁维酵母CBS 5795，酿酒酵母CBS 1253，Schwanniomyces castellii CBS 2863，球拟酵母CBS 940，口津假丝酵母(C.melibiosica)CBS 584，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)CBS 2359，T.bovina CBS 2760和接合酵母(Zygosaccharomyces fermentati)CBS6772。

类似地，Nakamura Yoshihiro et al.(Biosci.Biotechnol.Biochem.，Vol.64，No.4，841-844，2000)已经鉴定多种植酸酶，但没有表征它们。

此外，应注意，已经综述了酵母的分类。根据新的分类(Nakase T.，Suzuki M.，Phaff H.J.and Kurtzman C.P.，1998 p157-167 in C.P.Kurtzmanand J.W.Fell(ed)，The Yeasts，A taxonomic study，4th Edition，Elsevier Sci.Publication Amsterdam)，该CBS 2923菌株对应Debaryomyces castelliiCapriotti，CBS 2863菌株对应Debaryomyces occidentalis Klocker var.occidentalis，同义词为Schwanniomyces castellii Capriotti和Schwanniomyces occidentalis Klocker。发明者已经显示了SEQ ID No.2多肽的比对，即Debaryomyces castellii CBS 2923植酸酶的序列的比对，给出了与Schwanniomyces occidentalis CBS 2863植酸酶序列同一性百分比为69.2％。

大量微生物植酸酶已被研究并被用于多种工农业应用中。但是，植酸酶作为添加剂在大量生物技术应用(如动物饲料)中增长的用途促进了以下的优点：(1)分离新的有效的产植酸酶的微生物，(2)获得有效的植酸酶，即从消化道的饲料中有效释放磷酸盐的植酸酶，其在饲料的加工过程和储存中表现为热稳定，由此降低了生产的成本。

此外，至今描述的大多数植酸酶仅部分地水解植酸，并且一些具有非常慢的动力学。此外，它们的水解活性很大程度上依赖于其被使用的条件。

目前，在酵母中，仅酵母Schwanniomyces occidentalis的植酸酶被描述为水解植酸盐的所有磷酸基团(EP 0 699 762以及Segueilha L.，Lambrechts C，Boze H.，Moulin G.，Galzy P.，(1992)Purification andproperties of a phytase from Schwanniomyces castellii，J.Ferm.Bioeng.，74，7-11)。但是，Schwanniomyces occidentalis植酸酶对阳离子敏感(特别是ZnCl₂和CuCl₂)，其并不益于在动物饲料中使用，因为这些阳离子存在于食团中(Segueilha et al.，1992)。此外，此酶在pH 2.7至5的范围有活性(EP 0 699 762)并且pCMB很大程度抑制该Schwanniomycesoccidentalis植酸酶的活性，这表明，SH基团(二硫键桥)参与该酶的活性位点(Segueilha et al.，1992)。此外，该植酸酶的生物合成需要植酸盐和钙盐的存在(EP 0 699 762)。因此，此酶的活性极大地依赖其存在的环境。本发明欲解决的问题在于提供下述植酸酶，所述植酸酶水解植酸盐的所有磷酸基团并且其活性几乎不依赖于使用该酶的环境。

SEQ ID No.2的植酸酶解决了上述问题。有利地是，该酶能够水解植酸盐的所有磷酸基团直至释放肌醇。其具有广谱的活性并因此水解大量底物。有利地是，该植酸酶的生物合成由植酸盐诱导，甚至在没有钙盐存在时。有利地是，此植酸酶在宽的pH范围具有活性(pH 3至6.5)并对阳离子或pCMB不敏感。此酶还在最高达66℃下是热稳定的。本发明的酶因极具活力，其益于在动物饲料中以及其他工业应用中使用。

本发明还涉及SEQ ID No.2植酸酶的类似或同源的植酸酶，该酶的变体和片段，其保留相同的特性。

序列的描述

SEQ ID No.1：Debaryomyces castellii CBS 2923植酸酶基因的基因组序列。

SEQ ID No.2：Debaryomyces castellii CBS 2923植酸酶的序列。

SEQ ID No.3：酸性磷酸酶的共有序列。

SEQ ID No.4：对应于SEQ ID No.3的酸性磷酸酶共有序列的Debaryomyces castellii植酸酶基序。

SEQ ID Nos.5-16：克隆引物。

SEQ ID Nos.17-18：用于克隆所述基因的Debaryomyces castellii植酸酶肽。

发明内容

本发明的主题为多肽，所述多肽包含选自下列多肽的多肽：

-SEQ ID No.2的多肽，

-具有植酸酶活性的SEQ ID No.2的多肽的片段，

-具有植酸酶活性并表现与SEQ ID No.2的多肽有至少90％同一性的多肽。

本发明的主题还为编码植酸酶活性的多核苷酸，其选自以下多核苷酸：

-其序列为SEQ ID No.1的第1538位至第2923位之间的多核苷酸，

-编码权利要求1的多肽的多核苷酸。

本发明还涉及多核苷酸，其具有SEQ ID No.1的序列或与SEQ IDNo.1互补的序列。

本发明还涉及表达盒，其在转录方向上包括：

-启动子，其在宿主生物内具有功能；

-本发明的多核苷酸；及

-相同的宿主生物内的终止子序列。

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的载体，和/或本发明的表达盒。

本发明的另一主题为用本发明多核苷酸、本发明的表达盒和/或本发明的载体转化的宿主生物。

优选地，所述宿主生物选自酵母和丝状真菌。

优选地，所述宿主生物选自Debaryomyces castellii，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，绳状青霉(Penicillium funiculosum)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

本发明的主题为包含本发明的多肽的动物用营养添加剂，。

本发明的主题还为包含本发明的宿主生物和/或本发明宿主生物的发酵汁(fermentation must)的动物用营养添加剂。

在发明的一个实施方案中，所述动物用营养添加剂为液体形式或粉末形式。

本发明涉及动物饲料，其包含本发明的动物用营养基础和动物用营养添加剂。

本发明还涉及动物饲料，其包含本方面的多肽，本发明的宿主生物，和/或本发明宿主生物的发酵汁。

本发明还涉及本发明的多肽或本发明的宿主生物用于制造动物用营养添加剂或动物饲料的用途。

本发明的另一主题是本发明的多肽或本发明的宿主生物用于将肌醇六磷酸水解为无机单磷酸、具有较低级磷酸化水平的肌醇以及游离肌醇的用途。

多肽

因此，本发明涉及具有植酸酶活性的多肽。优选地，这些多肽分离自Debaryomyces castellii。

Debaryomyces castellii CBS 2923植酸酶如SEQ ID No.2所示。

术语“植酸酶”旨在表示肌醇六磷酸3-和6-磷酸水解酶(EC 3.1.3.8和3.1.3.26)。这些酶催化肌醇六磷酸(植酸，InsP₆)水解为无机单磷酸和磷酸化水平较低的肌醇磷酸(InsP₅至InsP₁)和对于某些植酸酶而言为游离的肌醇。

SEQ ID No.2的Debaryomyces castellii植酸酶为3-植酸酶。此外，其具有水解植酸所有磷酸键的可观能力。

SEQ ID No.2的植酸酶包括RHGERYP基序(SEQ ID No.4)，其对应存在于许多酸性磷酸酶活性位点的共有序列RHGXRXP(SEQ ID No.3)。发现该基序位于SEQ ID No.2的氨基酸72-78位。SEQ ID No.2的植酸酶还具有存在与许多植酸酶中的HD基序。发现该基序位于SEQ IDNo.2的C-末端氨基酸335-336位。

在本发明优选的实施方案中，本发明的多肽具有基序RHGERYP或对应共有序列RHGXRXP的另一基序。优选地，本发明的多肽还具有HD基序。

在优选的实施方案中，本发明的多肽被糖基化。特别是，SEQ ID No.2的多肽在氨基酸Asn 97，Asn 158，Asn 189，Asn 249，Asn 303，Asn 314，Asn 387，Asn 439及Asn 453具有推定的N-糖基化位点；在氨基酸Thr165，Ser 168，Thr 360和Ser 364具有推定的O-糖基化位点。在优选的实施方案中，所述SEQ ID No.2的多肽在一个或多个这些推定的N-糖基化和O-糖基化位点被磷酸化。在一个实施方案中，本发明的多肽被糖基化。

SEQ ID No.2的植酸酶还具有能够形成4个二硫桥的8个半胱氨酸：Cys 62，Cys 214，Cys 262，Cys 275，Cys 385，Cys 405，Cys 413和Cys435。在一个实施方案中，本发明的多肽携带至少一个二硫桥。

Debaryomyces castellii植酸酶一种由酵母分泌至其细胞外环境的酶。

对于重组宿主生物的表达和分泌而言，SEQ ID No.2的植酸酶可在其N-末端与被该宿主识别的信号肽融合。

本发明还涉及保留植酸酶活性的SEQ ID No.2多肽的片段。

术语多肽的“片段”表示含有其来源的多肽的一部分但并非全部的多肽。因此，本发明涉及一种多肽，所述多肽包含SEQ ID No.2多肽的至少100，200，300或400个氨基酸的片段。

SEQ ID No.2多肽的该片段保留其植酸酶活性。因此，本发明涉及SEQ ID No.2多肽的生物活性片段。

术语“生物活性片段”指多肽的片段，所述片段保留其来源的多肽的功能。SEQ ID No.2多肽的生物活性片段因此保留SEQ ID No.2的Debaryomyces castellii植酸酶的催化特性。制备多肽片段的方法以及分析植酸酶活性的技术是本领域技术人员公知的。

本方面的主题是具有植酸酶活性并表现与SEQ ID No.2的多肽有至少90％同一性的多肽。本方面的主题还为多肽，其表现有至少80％，90％，95％，98％，并优选至少99％的氨基酸与SEQ ID No.2的多肽相同。

优选地，这些多肽与SEQ ID No.2的多肽具有相同的特性，特别是相同的催化特性。优选地，这些多肽分离自其它Debaryomyces castellii株或其它酵母。或者，这些多肽可例如通过定点突变技术来获得。

术语“相同的氨基酸”旨在表示在两个序列间没有变化的氨基酸。这些多肽可表现相对于SEQ ID No.2多肽的至少一个氨基酸的缺失、添加或取代。

本方面的主题还是与SEQ ID No.2的多肽有至少80％，90％，95％，98％，并优选至少99％相似性的多肽。优选地，这些多肽与SEQ ID No.2的多肽具有相同的特性，特别是相同的催化活性。优选地，这些多肽分离至其它Debaryomyces castellii株或其它酵母。或者，这些多肽可例如通过定点突变技术来获得。

术语“相似性”旨在表示蛋白质或核酸序列间相似的程度。这些多肽可表现为相对于SEQ ID No.2多肽的至少一个氨基酸的缺失、添加或取代。以序列的同一性百分比和/或保守取代的百分比为基础通过打分来定量两个序列之间的相似性程度。

本领域技术人员公知检测和鉴别多肽序列之间同一性水平或相似性水平的方法。可例如利用Vector NTi 9.1.0，AlignX比对程序(Clustal W算法)(Invitrogen INFORMAX，http://www.invitrogen.com)。优选使用默认参数。

本发明的多肽分离或纯化自其天然环境。所述多肽可通过多种方法来制备。这些方法特别是从天然来源(例如天然表达这些多肽的细胞)中纯化，由适合的宿主细胞产生重组的多肽及其后续的纯化，通过化学合成来产生，或最后通过这些不同的途径的组合。这些不同的生产方法是本领域技术人员公知的。因此，本发明的植酸酶可分离至Debaryomyces castellii。在另一实施方案中，本发明的植酸酶分离自表达本发明植酸酶的重组的宿主生物。

本发明的主题还为包含本发明多肽的融合蛋白、重组蛋白或嵌合蛋白。术语“多肽”还指蛋白质和经修饰的多肽。

本发明的多肽具有植酸酶活性。优选地，所述多肽表现3-植酸酶活性并具有水解植酸的所有磷酸键的能力。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明植酸酶的多核苷酸。优选地，这些多核苷酸编码SEQ ID No.2的Debaryomyces castellii植酸酶。

根据本发明，术语“多核苷酸”旨在表示单链核苷酸链或其互补链或双链核苷酸链，其可以是DNA或RNA型。优选地，本方面的多核苷酸为DNA型，特别是双链DNA型。术语“多核苷酸”还指经修饰的多核苷酸。

本发明的多核苷酸分离或纯化自其天然环境。优选地，本发明的多核苷酸可由Sambrook et al.描述的常规的分子生物学技术(MolecularCloning：A Laboratory Manual，1989)或化学合成来制备。

在第一实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其序列位于SEQ ID No.1的第1538和2923位之间。该多核苷酸编码SEQ ID No.2的Debaryomyces castellii植酸酶。

本发明还涉及表现与其序列位于SEQ ID No.1的第1538至2923位之间的多核苷酸有至少80％，85％，90％，95％，98％，并优选99％同一性的多核苷酸。这些多核苷酸编码植酸酶活性。优选地，这些多核苷酸编码Debaryomyces castellii植酸酶。

术语“相同的核苷酸”意旨两个序列间没有变化的核苷酸。这些多核苷酸可表现相对于参考多核苷酸的至少一个核苷酸的缺失、添加或取代。

本发明还涉及表现与位于SEQ ID No.1的第1538至2923位之间的核苷酸序列有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，并优选99％相似性的多核苷酸。这些多核苷酸编码植酸酶活性。优选地这些多核苷酸编码Debaryomyces castellii植酸酶。

术语“相似性”旨在表示蛋白质或核酸序列间的相似水平。这些多核苷酸可表现为相对于参考多核苷酸的至少一个核苷酸的缺失、添加或取代。通过打分来定量的两个序列之间的相似性水平是以序列的同一性百分比和/或保守取代的百分比为基础的。

本领域技术人员公知测量和鉴别核酸序列间同一性水平或相似性水平的方法。可例如利用Vector NTi 9.1.0，AlignX比对程序(Clustal W算法)(Invitrogen INFORMAX，http://www.invitrogen.com)。优选使用默认参数。

优选地，所述多核苷酸表现保留参考序列功能的与参考多核苷酸的同一性水平或相似性水平。在本发明中，所述多核苷酸编码植酸酶活性。

本发明还涉及能够与位于SEQ ID No.1的第1538和2923位之间的核苷酸序列选择性杂交的多核苷酸。优选地，该选择性杂交在中严格度杂交条件下进行，并优选在高严格度条件下进行。

根据本发明，表述“能够选择性杂交的序列”旨在表示与参考序列在显著高于背景噪声的水平上杂交的序列。能够选择性杂交的序列与参考序列相互作用产生的信号水平通常10倍、优选100高于其它的产生背景噪声的DNA相互作用产生的信号水平。本领域技术人员公知能够允许选择性杂交的严格度杂交条件。通常，在给定的pH和给定的离子强度下，杂交和洗涤温度为至少比参考序列的Tm低5℃。典型的，对于15至50个核苷酸的多核苷酸，杂交温度为至少30℃，对于高于50个核苷酸的多核苷酸，至少为60℃。仅为示例，杂交可在以下缓冲液中进行：6X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA，500ug/ml变性的鲑精DNA。例如，洗涤可在低严格度的2X SSC缓冲液，0.1％SDS，在中严格度的0.5X SSC缓冲液，0.1％SDS和高严格度的0.1X SSC缓冲液，0.1％SDS中连续进行。当然，可根据本领域技术人员公知的其它常用方法来进行杂交。(参见，特别是，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989)。

优选地，与参考多核苷酸选择性杂交的多核苷酸保留参考序列的功能。在本发明中，与序列位于SEQ ID No.1的第1538位和2923位之间的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸编码植酸酶活性。优选地，这些多核苷酸编码Debaryomyces castellii植酸酶。

本发明通常涉及编码本发明的多肽的多核苷酸。由于遗传密码的简并性，多种多核苷酸可编码相同的多肽。

本发明的另一主题是序列如SEQ ID No.1所示的多核苷酸。SEQ IDNo.1的多核苷酸包含Debaryomyces castellii植酸酶基因的开放读码框(ORF)侧翼连接的序列。它们具体为该基因的启动子和终止子序列。该基因可利用其同源调节序列(特别是用于在Debaryomyces castellii或在其它酵母中过表达的同源调节序列)来表达。

在另一实施方案中，此基因可在不同的宿主生物中表达，例如细菌、酵母和真菌。编码SEQ ID No.2的植酸酶的基因可在本发明的SEQ IDNo.1的启动子调控下或在异源启动子的调控下在宿主生物中表达。

表达盒

根据本发明的一个实施方案，利用本领域技术人员公知的克隆技术将编码本发明多肽的多核苷酸插入到表达盒中。该表达盒包含编码本发明多肽的序列转录和翻译所需的元件。

有利地，该表达盒包含使得宿主细胞产生多肽的元件以及调节该表达所需的元件。

这些表达盒在转录方向包括：

-在宿主生物中具有功能的启动子；

-本发明的多核苷酸；及

-在相同宿主生物中的终止子序列。

任何类型的启动子序列可用在本发明的表达盒中。该启动子的选择特别依赖于选择用于表达目标基因的宿主生物。某些启动子允许组成型表达，相反，其他启动子是诱导型的。在真菌中有功能的启动子之中，特别值得一提的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子(Roberts et al.，Current Genet.15：177-180，1989)。在细菌中有功能的启动子之中，特别值得一提的是T7噬菌体RNA聚合酶的启动子(Studier et al.，Methods in enzymology 185：60-89，1990)。在酵母中有功能的启动子之中，特别值得一提的是Gall基因的启动子(Elledge et al.，ProcNatl Acad Sciences，USA.88：1731-1735，1991)或酿酒酵母的GAL4和 ADH启动子。所有这些启动子均在文献中有记载，并为本领域技术人员所公知。

为了在绳状青霉(Penicillium funiculosum)中表达，可选择例如包含H4.B组蛋白启动子、天冬氨酸蛋白酶启动子或csll3启动子(WO 00/68401)的表达盒。

为了在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达，可选择例如包含甲醇诱导型AOX1启动子(Tschopp，J.F.，Sverlow，G.，Kosson，R.，Craig，W.and Grinna，L.(1987)High-level secretion of glycosylated invertase in themethylotrophic yeast，Pichia pastoris.Biotechnology 5，1305-1308)或者强组成型GAP启动子(Waterham，H.R.，Digan，M.E.，Koutz，P.J.，Lair，S.V.and Cregg，J.M.(1997)Isolation of the Pichia pastorisglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use ofits promoter.Gene 186，37-44)的表达盒。

为了在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中表达，可选择例如包含Nmtl调节启动子(Maundrell，K.，(1989)Nmtl of fission yeast.A highly transcribed gene completely repressed by thiamine.J.Biol.Chem.265，10857-10864)的表达盒，所述启动子被硫胺抑制并在无硫胺时活化。

本发明的表达盒也可包括该多肽表达或该多核苷酸表达所需的任何其它序列，例如调节元件或用于分泌由宿主生物产生的多肽的信号序列。可具体使用任何调节序列，其可能提高插入到表达盒中的编码序列的表达水平。

根据本发明，特别有可能与启动子调节序列组合使用的是其它调节序列，其位于启动子和编码序列之间，例如转录活化子(增强子)。

此外本发明的表达盒可包括分泌宿主生物产生的多肽所需的任何其它序列，例如信号序列。对于由巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)产生的分泌，可利用使用α-因子序列作为分泌信号。

多种终止子序列可在本发明的表达盒中使用；这些序列使得转录终止并使mRNA多聚腺苷酸化。可使用任何在所选宿主生物中有功能的任何终止子序列。

为了在绳状青霉中表达，可选择例如包含H4.B组蛋白终止子、天冬氨酸蛋白酶终止子或csll3终止子(WO 00/68401)的表达盒。

本发明的主题还为包含本发明表达盒的多核苷酸；有利地，本发明的表达盒被插入到载体中。

载体

因此，本发明还涉及用于转化宿主生物的复制或表达载体，包含至少一个本发明的多核苷酸或表达盒。该载体具体地可包括其中插入了本发明的多核苷酸或表达盒的质粒、粘粒(cosmid)、噬菌体或病毒。本领域技术人员公知构建这些载体和插入将本发明多核苷酸插入这些载体中的技术。通常，可以使用任何的能够在宿主细胞中维持其自身、自我复制或繁殖的任何载体，特别是用于能够为了诱导多核苷酸或多肽的表达的。本领域技术人员能够特别地根据欲转化的宿主生物并并根据构建所使用的转化的技术来选择适合的具体的载体。

本发明的载体特别用于转化宿主生物，从而在所述宿主生物中复制载体和/或表达多核苷酸。

本发明还涉及制备本发明多肽的方法，包括以下步骤：

-用包含本发明的表达盒和/或本发明的多核苷酸的表达载体转化宿主生物；

-分离由所述宿主生物产生的所述多肽。

宿主生物

本方面的主题还为通过将至少一种本发明的多核苷酸或表达盒或载体整合进宿主生物来转化所述宿主生物的方法。所述的多核苷酸可整合到所述的宿主生物基因组中或者在所述的宿主生物中稳定复制。转化宿主生物的方法是本领域技术人员公知的，并在文献中广泛描述。

本发明还涉及用本发明的多核苷酸、表达盒或载体转化宿主生物的方法。

根据本发明，术语“宿主生物”旨在特别表示任何低等或高等的单细胞或多细胞生物，特别是选自细菌、酵母、真菌和植物。术语“宿主生物”旨在表示非人生物。

有利地，所述酵母选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、Schwanniomyces occidentalis及粟酒裂殖酵母。所述真菌选自曲菌(Aspergillus)和青霉(Penicilliums)，优选绳状青霉、里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、白曲霉(Aspergillus kawachii)和康宁木霉(Trichodermakoningii)。在一个实施方案中，所述宿主生物为其中表达本发明植酸酶的绳状青霉菌。在另一实施方案中，所述宿主生物为其中表达或过表达本发明植酸酶的Debaryomyces castellii株。在本发明优选的实施方案中，所述宿主生物为其中表达本发明植酸酶的粟酒裂殖酵母株。所述植物例如选自水稻(Oryza sativa L.)、烟草、大豆和小麦。

根据本发明，所述宿主生物用选自以下多核苷酸的多核苷酸转化：

a)其序列为SEQ ID No.1的第1538位和2923位之间的多核苷酸，

b)多核苷酸，其编码选自以下多肽的多肽：

-SEQ ID No.2的多肽，

-具有植酸酶活性的SEQ ID No.2的多肽的片段，

尽管野生型状态的宿主生物可以具有上述定义的多核苷酸，但是本发明涉及转化的宿主生物。根据本发明的一个实施方案，用本发明的多核苷酸转化宿主生物，以表达本发明的多肽。根据本发明的另一实施方案，用本发明的多核苷酸转化宿主生物，以过表达本发明的多肽。

用于构建载体、转化宿主生物以及在这些生物中表达异源蛋白质的技术已经被文献广泛地描述(Ausubel F.M.et al.，″Current Protocols inMolecular Biology″Volumes 1 and 2，Greene Publishing Associates andWiley-Interscience，1989；T.Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook，MolecularCloning A Laboratory Handbook，1982)。

膳食添加剂和动物饲料

本发明还涉及提供植酸酶活性的膳食添加剂。这种形式的酶活性的提供使得可能改善饲料的可消化性并增强其营养价值。

术语“营养添加剂”旨在表示被有意添加进饲料中(通常小量地)，从而促进其营养特性或其可消化性的物质。动物用营养添加剂可以包含例如维生素、矿物盐、氨基酸以及酶。

典型地，动物用营养添加剂包含本发明的多肽，本发明的宿主生物或本发明宿主生物的培养上清液/发酵汁(fermentation must)。因此，该具有本发明植酸酶活性的多肽可以从Debaryomyces castellii菌株或从重组宿主生物中纯化或分离，用来制造动物用营养添加剂生成用于动物饲料的添加剂。或者，产生本发明的植酸酶的Debaryomyces castellii菌株或宿主生物，可以被直接用于制造生成动物用营养添加剂。在本发明的优选的实施方案中，Debaryomyces castellii株或本发明的宿主生物的培养上清液或/发酵汁被用来制备动物用营养添加剂。当植酸酶被分泌到Debaryomyces castellii菌株或所述宿主生物的细胞外培养基液中时，该实施方案特别有益。通常，浓缩或冻干该培养上清液用来生产该营养添加剂。

因此，本发明还涉及用于制备植酸酶的方法，包括以下步骤：

a)在诱导所述植酸酶表达的条件下，培养根据本发明转化的Debaryomyces castellii菌株或宿主生物，

b)分离含有所述植酸酶的培养上清液。

可以随后浓缩或冻干该培养上清液/发酵汁，以配制膳食添加剂或动物饲料。所述方法可包括附加步骤，包括从所述的培养上清液中纯化所述的植酸酶。

如果宿主生物不将植酸酶分泌进入培养上清液，可能需要附加的步骤，包括破裂细胞并纯化纯化细胞提取物。

本发明的营养添加剂包括至少一种本发明的植酸酶，但还可以包括其它的营养物质，例如维生素、氨基酸或矿物盐。

本发明的添加剂提高饲料的可消化性，因此特别有助于提高基于谷物(小麦、大麦、玉米、燕麦、黑麦等等)和基于产油饼(大豆、葵花籽、油菜籽等等)的膳食的营养价值。

本发明还涉及包含营养基础和本发明的营养添加剂的动物饲料。这些饲料通常为粗粉或颗粒形式，其中掺入了本发明的添加剂。

本方面的主题还为包含本发明的多肽、本发明的宿主生物或本发明宿主生物发酵汁/培养上清液的动物饲料。

术语“饲料”旨在表示用于喂养动物的任何物质。

在本发明的一个实施方案中，本发明的营养添加剂和动物饲料包括至少两种具有互补活性的植酸酶的组合。这些添加剂和饲料因此包括本发明的至少一种植酸酶与另一种植酸酶的组合。与本发明的植酸酶组合的植酸酶可以选自例如以下生物的植酸酶：Schwanniomyces occidentalis、泡盛曲霉(植酸酶A和植酸酶B)、黑曲霉(植酸酶A和植酸酶B)、绳状青霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Peniophora lycii、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)及土曲霉(Aspergillus terreus)。

有利地，本发明的植酸酶水解植酸的所有磷酸基。因此其可特别用于改善或补充不能水解所有磷酸基的植酸酶的活性。优选地，本发明的植酸酶与黑曲霉植酸酶(Ullah，A.H.J，and Sethumadhavan，K.，(2003)PhyA gene product of Aspergillus ficuum and Peniophora lyciiproduces dissimilar phytases.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 303：463-468)或与绳状青霉菌株的植酸酶(WO03/054199，WO 99/57325)组合。

优选地，所述添加剂和饲料包含与黑曲霉植酸酶或绳状青霉植酸酶组合的本发明的植酸酶。

对于动物的加强饲养而言，动物饲料通常包含营养基础和营养添加剂。

术语“营养添加剂”旨在表示组成动物饲料摄取主要部分的部分，由例如，谷物、动物和/或植物来源的蛋白质和脂肪的混合物组成。

动物用营养基础适合这些动物的膳食并为本领域技术人员所公知。这些营养基础通常包括例如，玉米、小麦、豌豆和大豆。这些营养基础适合欲喂养的不同动物种类的需要。这些营养基础可已包含诸如维生素、矿物盐和氨基酸的营养添加剂。

在优选的实施方案中，本发明涉及用于单胃动物的饲料，特别是用于家禽和猪的。这些家禽特别包括蛋鸡、肉鸡、火鸡和鸭。猪特别包括生长和长成猪，以及小猪。

附图描述

图1：作为pH(pH 3至3.5，200mM甘氨酸缓冲液；pH 3.5至7，200mM醋酸钠缓冲液；pH 7至7.5，200mM tris-HCl缓冲液)函数的D.castellii植酸酶活性。在pH 3.5通过2个不同的缓冲液获得的不同的值显示缓冲液性质对植酸酶活性的作用。

图2：作为温度函数的D.castellii植酸酶活性。在pH 4，37℃检测活性20分钟。

图3：D.castellii植酸酶的热变性。在水(实线)或在125mM醋酸缓冲液、pH 4(虚线)中，将提取物在不同的温度下预孵育1，10，20，40，60和120分钟。随后在37℃检测该活性20分钟。

图4：pH稳定性和温度稳定性的研究。在两个温度(40℃或60℃)下以不同pH处理提取物1小时后测量D.castellii的植酸酶活性。在pH 4下检测该活性

图5：D.castellii的植酸酶水解植酸的示意图。

图6：在补料-分批(A)和连续模(B)式的培养中，评价作为生长率函数的重组植酸酶(圆)和生物量(方)的产率发展。

图7：InsP₆化学水解和D.castellii植酸酶酶催化水解15，75和120分钟后，层析检测不同肌醇磷酸盐的出现。

图8：含InsP1，InsP2，InsP3和InsP4的4种水解级分的波谱汇编和比较。选择指派为斜体。为了完成该比较，在化学迁移范围内，通过动力学起始时的差异获得的InsP5波谱也被表示。阳性信号为InsP5的信号，两个阴性信号对应起始的InsP6。这些表征不同肌醇磷酸盐的波谱使得跟踪不同产物在水解动力学过程中的出现和消失成为可能。

图9：在500MHz、17℃，1.7mM InsP6、10mM乙酸缓冲液、pH 4.0(500μl H₂O/D₂O，16/84v/v)的溶液和1μl的酶溶液中，跟踪了慢动力学。两种波谱的时间间隔期为23分钟。过夜后，加入20μl的酶来加速该反应。16小时后，水解完成，获得肌醇的波谱特征(顶部波谱)。这些动力学清楚的显示InsP5、InsP4和InsP3的连续出现。

图10：较快的动力学使得跟踪InsP6的完全水解成为可能(600MHz，17℃，500μl D₂O，3.8mM的InsP6，pH 4.0，5μl的酶)。每3分钟记录波谱，共20小时(400波谱)。10小时后，实际完成水解。绘制的波谱对应10个波谱之一(两个波谱间30分钟)。注释了一些特征信号。

图11：水解过程中，不同产物在5小时中的浓度发展。此图使得确定每一产品在何时能够达到最佳浓度成为可能。评价：每一化合物特征性的NMR信号最高值被用来评价浓度变化。所用信号不总代表质子的相同数目，并不总具有相同的多样性。结果是，浓度不能相互比较。

实施例

实施例1：Debaryomyces castellii植酸酶的生产、生化特征以及立体专一性

材料与方法

1.生物

所用菌株以Debaryomyces castellii CBS 2923的名称列入Centraalbureau voor Schimmelculture[真菌培养中心办公室](Delft)。

2.培养基与培养条件

用于分批培养的合成培养基(MSA-B)：葡萄糖(10g/l)；植酸钠C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂(0.4g/l)

矿物盐：(NH₄)₂SO₄(3g/l)，MnSO₄.H₂O(7.5mg/l)，KCl(0.5g/l)，MgSO₄.7H₂O(0.5g/l)，CaCl₂.2H₂O(0.1g/l)

痕量元素：H₃BO₄(500μg/l)，CuSO₄.5H₂O(40μg/l)，Kl(100μg/l)，Na₂MoO₄.2H₂O(200μg/l)，ZnSO₄.7H₂O(400μg/l)，FeCl₃.6H₂O(200μg/l)

维生素：泛酸Ca(2mg/l)，硫胺(B1)(2mg/l)，肌醇(2mg/l)，吡哆醇(B6)(2mg/l)，烟酸(PP)(0.5mg/l)，生物素(0.02mg/l)。

用于连续培养的合成培养基(MSA-C)：MSA-B培养基的组成，各种组分为10倍浓缩。

在Erlenmeyer烧瓶中培养

在YMPG(葡萄糖10g/l，酵母提取物3g/l，bactopeptone 5g/l，麦芽提取物3g/l)存在下进行首先的预培养。在Erlenmeyer烧瓶中进程培养，其中加入了1/10体积的用0.2M酒石酸盐缓冲液缓冲到pH 5.4的MSA-B培养基。它们在充气培养基中在28℃的摇床(每分钟80次振动，振幅7cm)上进行培养。

在发酵罐中培养

在Applikon发酵罐(The Netherlands)(1.51可用体积)或BraunBiostat E发酵罐(31可用体积)中进行培养。用Ingold探测器检测pH。通过加入2M氢氧化钠或1M硫酸来调节pH。通过以2v.v.m(空气体积·(培养体积)^-1(分钟)^-1)注入过滤灭菌的空气来提供充气。溶解氧分压利用Ingold极谱法(polargraphic)探测器来检测。通过改变摇动速度，将其维持在高于30％的值。将温度维持在28℃。利用Bioexpert获取软件(Applikon)在线进行数据控制和获取。

排出发酵罐的气体分析

利用Beckman Industrial 870红外线分析仪测量流出气体的CO₂浓度。利用Beckman Industrial 775A分析仪测量O₂浓度，该探测器利用分子氧的顺磁敏感性。

培养过程中碳底物的分析

通过使用FFJ(Waters)离子排阻柱的高压液相层析(HPLC)来分离和定量培养基中的底物和代谢物(葡萄糖、乙酸、乙醇)。流动相为3mM磷酸，其流速为1ml/min。每两个小时连续采集培养基的样品，并使用Applikon A-SEP过滤模块和Waters FAM获取和过滤模块对其进行切线(tangentially)无菌过滤(Millipore 0.22μm GV滤器)。利用折光测定法(refractometry)(Waters 410)检测碳底物。利用Waters 600E控制系统来控制集合。利用Millenium软件(Waters)来分析层析。

制备每一底物的1g/l至50g/l范围内的标准范围。

3.纯化

超滤

在Filtron切线流动超滤盒(表面积：836cm²)上进行超滤之前，将离心后获得的培养上清液过滤通过具有0.22μm截断阈值的膜(Millipore)，该超滤盒的排阻阈值为10kDa。用超纯水将浓缩物洗涤3次(V/V)，随后浓缩25倍。获得的提取物用于纯化。

疏水层析

在20℃、HiPrep 16/10Phenyl FF柱(Amersham)上进行蛋白质分离，该柱子具有16mm内径和100mm长度(体积20ml)。

在注入纯化凝胶之前，将样品在2M硫酸铵中平衡。将混合物在4℃放置2至16小时，随后离心(12 000g，20分钟)以去除沉淀的蛋白质。离心的上清液组成上样在凝胶上的提取物。

首先用相当于5个体积的溶液来平衡该凝胶，该溶液为50mMtris-HCl缓冲液，pH 6.1，和2M硫酸铵。注入1至5ml的样品。

利用相当于5倍体积的硫酸铵缓冲平衡溶液来洗涤，去除未结合的蛋白质。

通过产生以下三个线性段的梯度来进行洗脱：(1)2至1.7M的硫酸铵，经过相当于1.5柱体积的周期，(2)1.7M硫酸铵，经过相当于4倍柱体积的周期，(3)1.7至0M硫酸铵，经过相当于0.1柱体积的周期。植酸酶洗脱在1.7M的硫酸铵中。

将流速固定在5ml/分钟。在柱子的出口收集4ml的级分，在280nm检测吸光度。混合活性级分，用超纯水洗涤，并通过超滤浓缩(微孔膜，截断阈值为10kDa)。

4..电泳

在预制备的4％至15％丙烯酰胺凝胶(Biorad)上进行变性和非变性条件下的电泳。用库马斯亮蓝检测蛋白质。

通过在将凝胶在100ml的250mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5，含200mg α-萘基P(Sigma)和100mg的fast Garnet GBC(Sigma)和92mg植酸钠)中孵育，进行植酸酶的特异性成像。α-萘基P水解后，形成褐色的α-萘基/Fast Garnet GBC混合物。

5.用内源性糖苷酶H消化

脱糖基化：将1000单位的内源性糖苷酶H(Biolab Ozyme P0702S)加入约含20μg蛋白质的变性的样品中。将该混合物在37℃水浴中孵育2小时。

6.通过质谱测定分子量

利用MALDI-TOF Biflex III scout 384分光光度计(Bruker，Breme，Germany)进行经SDS-PAGE纯化的植酸酶的分析。

7.分析方法

7.1固体的测定

利用Beckman DU530分光光度计测量光密度(OD)来获得细胞浓度。1个OD单位对应0.570g/l的生物量。

7.2蛋白质分析

通过Bradford方法(Bradford，M.(1976) A rapid and sensitive methodfor the quantification of microgram quantities of proteins utilizing

7.3酶方法

通过跟踪无机磷随时间的释放来测定植酸酶的活性。

在8mM的植酸钠(Sigma)存在下测定该活性，该植酸钠溶解在250mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5或pH 4，含1mM CaCl₂、37℃(5倍体积))中。通过加入酶提取物(1倍体积)来启动该反应。用20％三氯乙酸(1体积的反应介质+1体积的酸)酸化培养基来终止反应。在不同的孵育时间后，测定释放的磷酸含量。

一个酶单位(U)定义为在1分钟释放1μmol无机磷酸的酶量。

酶的特性

利用以下缓冲溶液来测定pH对植酸酶活性的作用：200mM甘氨酸-HCl，pH 2-3.5；200mM乙酸钠-乙酸，pH 3.5-7；及200mM tris-HCl，pH 7-9。在+37℃利用植酸盐作为底物进行该反应。通过将温度从+30℃到+80℃变化来测定最适温度。在pH 4(200mM乙酸钠缓冲液)利用植酸盐作为底物进行该反应。通过将酶样品孵育在125mM乙酸钠缓冲液，pH 4，在+37至+70℃温度范围内孵育不同时间段来测定热稳定性。热处理后，在冰上冷却该混合物，并利用植酸盐作为底物测定植酸酶活性。在+37℃测定动力学参数，对于植酸钠的实验在pH 4进行，对于p-NPP的实验在pH 5.5进行。

7.4磷酸盐分析

通过层析法来分析所释放的磷酸盐的含量。即时制备的显色溶液含有硫酸铁(380mM，1体积)和七钼酸铵(12mM，4体积)。在室温显色30分钟后检测在700nm的吸光度(1体积的反应介质+1体积的显色溶液)，利用UV/可见分光光度计(Beckman DU 530)。

利用磷酸二氢钾预先建立标准曲线。

7.5用于立体专一性性研究的植酸酶水解条件

反应试管中含有2体积的植酸钠(20mM)，2体积的乙酸缓冲液，pH 4(0.25M)，和1体积的稀释的酶(0.6U/ml终浓度)。

在不同的时间采集样品，共6小时。通过在100℃加热(10分钟)来终止反应。

7.6肌醇磷酸盐的测定

7.6.1采用HPIC

这是利用高效离子色谱层析(HPIC)方法来分离和测定肌醇单磷酸盐至肌醇六磷酸盐的方法，所述肌醇单磷酸盐至肌醇六磷酸盐通过所研究的植酸酶对植酸的降解获得该肌醇单磷酸盐至肌醇六磷酸盐(Hatzack，F.，Hübel，F.Zhang，W.，Hansen，P.E.and Rasmussen，S.K.(2001)Inositol phosphates from barley low-phytate grain mutants analysed bymetal-dye detection HPLC and NMR.Biochem.J.354，473-480；Skoglund，E.，Carlsson，N.G.and Sanberg，A.S.，(1997)Determination of isomers ofinositol mono-to hexaphosphates in selected foods and intestinal contentsusing High-Performance Ion Chromotography.J.Agric.Food Chem.45，431-436；Turk，M.，Sandberg，A.S.，Carlsson，N.G.and Andlid，T.(2000)Inositol hexaphosphate hydrolysis by baker′s yeast.Capacity，kinetics，anddegradation products.J.Agric.Food Chem.48，100-104)。该方法包括的通过利用洗脱梯度的HPLC利用洗脱梯度在离子交换柱上分离随不同InsP_n的分离，以及柱后反应(post-column reaction)，所述柱后反应以及其中肌醇磷酸盐肌醇与铁混合络合的柱后反应，并在290nm通过UV测定。该系统使得测定检测Ins P₂至Ins P₆成为可能，但是仅有不同的Ins P₄和Ins P₅的多种异构体可以被分离。

参考样品的制备

在化学水解后鉴定峰。50mg的植酸钠放入5ml的HCl(6M)中，在100℃16小时。25μl等分式样在Speed Vac干燥并随后采集到100ul的0.025M HCl中使得每次注射约有300nmol。

样品分析

在Omni Pac PAX-100分析柱(4×250mm)和PAX-100保护预柱(guard precolumn)(4×50mm)(Dionex Corp.，Sunnyvale，CA)上通过强的阴离子交换层析来分离多种峰。流速为0.8ml/分钟，注射环为100μl。用含有超纯水和有机溶剂(50％的2-丙醇)的5-98％HCl(0.5M)梯度来洗脱Ins P_n。根据以下的表1来混合洗脱液：

时间 (分钟)	HCl (％)	2-丙醇 (％)	水 (％)
				T(0) T(40) T(45)	5 98 5	2 2 2	93 0 93

在每次层析后需要平衡柱子15分钟。

在柱后反应后，通过UV分光光度计(Biocad，Sprint)在290nm测定吸光度来测定肌醇磷酸盐。在柱后反应中，将洗脱液与0.1％的Fe(NO₃)₃·9H₂O的2％HClO₄溶液混合。反应泵(Minipuls 3，Gilson)的流速为0.4ml/分钟。经过聚四氟乙烯圈(Teflon coil)(0.25mm，4m)使得可能将Ins P_n与铁混和用于分析(Phillippy，B.Q.and Bland，J.M.(1988)Gradient ion chromatography of inositol phosphates.Anal.Biochem.175，162-166)。

7.6.2采用NMR

水解后，将通过HPIC分离的多种肌醇样品(50-200μg)溶解在500μl的D₂O中。

在配备有冷冻器(1H，13C和15N)的Bruker Avance分光光度计上使用沿z-轴的梯度，记录500或600MHz的质子谱。利用TBI探测器在Bruker Avance 400MHz分光光度计上，记录磷未偶联质子谱和相关谱1H-31P(HMQC)。通过选择性预饱和1秒来去除残留的水信号。所有的谱在17℃下记录。相对于钠-d4(三甲基硅烷基)-3-丙酸酯(TSP，0ppm)或残留的水信号(4.914ppm在17℃)来校准质子谱。对于质子共振(proton resonance)的确定，以512倍递增(512 time increments)记录COSY和TOCSY实验。用于TOCSY的接触时间为50ms。以64倍递增(timeincremens)来获得HMQC实验。

通过COSY和TOCSY实验的分析来进行质子谱分配。应注意，对于某些具有平面对称性的异构体，H1和H3质子和H4和H6质子不能被区分。这种情况下，它们被标记为H1(或H3)以及H4(或H6)。一旦获得分配，保留磷酸化的位置用于测定。可通过两种不同的实验来测定后者，一种是磷未偶联质子谱的方法，第二通过HMQC实验。具有和不具有未偶联磷的质子谱的比较使得可能鉴定具有³J_HCOP 8.5-10Hz偶联的信号和磷酸化位置。

通过³J_HCOP偶联常数，¹H-³¹P HMQC实验部分地使得鉴别质子-磷相关性成为可能。当质子共振分配已知时，磷未偶联谱和HMQC使得清楚地鉴别磷酸化的位置成为可能。通过质子谱偶联常数的分析也可证明磷酸基团的位置。

7.6.3NMR跟踪的水解动力学

从储备溶液制备用于通过NMR跟踪的水解的样品，该溶液为在96/700mM D₂O中的InsP₆/磷酸缓冲液。典型地，将20μl的该溶液加入到480μl的D₂O(稀释25)产生含有3.8mM InsP₆和28mM乙酸钠缓冲液的样品，以及作为内对照的TSP。依据所期望的水解率，加入较多或较少的酶量(1至20μl的3U/ml的储备溶液)。通过每3分钟记录光谱(32扫描)共20小时，在17℃跟踪动力学(400波谱)。利用先前测定的不同肌醇磷酸盐的波谱特征，在整个动力学中跟踪它们的出现和消失。

结果

1-Deharyomyces Castellli植酸酶的生物合成研究

在分批培养和连续培养中跟踪了植酸酶的生物合成，以确定最佳生产条件。在合成培养基(参照，材料与方法)上进行培养。在先的研究使得我们能够确定为了产生5g/l生物量的0.4g/l的植酸酶最佳浓度。该浓度是保证最大的细胞生长但不抑制植酸酶生物合成所必需和充分的条件。随时间采集样品；测量生物量和植酸酶活性。

1.1批培养生产

在存在10g/l的葡萄糖和MSA-B培养基时，在pH 3，4，5，6和7进行五个分批培养。在pH 5获得最大生物量，在pH 3和pH 7，生长率降低20％。在培养上清液中检测到的最大植酸酶活性在pH 4时获得，在pH 3没有检测到活性。稳定期开始后12小时，植酸酶活性增加约20％。可能一些植酸酶是腔壁性的(parietal)，并在非生长期释放入培养基中。我们证实，在存在或不存在钙盐时获得相同的诱导水平。

1.2连续培养生产

在100g/l的葡萄糖和MSA-C培养基存在下，在pH 4进行连续培养。发酵罐更新至少3次后，实施生物量和植酸酶活性的检测。

生物量的产生是恒定的，直到0.20h^-1的稀释率，具有50％的Y_{生物量/底物}(g/g)产率，细胞代谢物为氧化的，呼吸系数(QR)等于1。植酸酶产生随稀释率增加。对于0.25h^-1的稀释率(D)，产率降低40％，QR高于1，细胞代谢为氧化-发酵，有诸如乙酸和乙醇的二级代谢物的形成。植酸酶产生的降低因数为5。

在D＝0.20h^-1.获得最佳生产(1487U/l)。应注意，有20％的植酸酶结合到细胞上；在4℃维持培养物至少4小时，使得该酶可能释放到培养液中。

2-植酸酶的研究

2.1纯化

纯化D.castellii植酸酶的不同步骤总结在表2中。

	总活性	总蛋白质 (U)	比活性 (mg)	纯化因数 (U/mg)	产率％
						粗提物浓缩和超滤提取物疏水层析	144 136.5 84.4	12.4 8.2 0.54	11.6 16.7 156	1 1.45 13.6	95 59

表2：疏水层析的D.castellii植酸酶的纯化

粗提取物具有11.4U/ml的比活性。在浓缩和超滤步骤后，通过疏水层析来纯化该提取物。通过因素13在单步骤中纯化植酸酶，产率为59％。比活性为156U/mg。SDS-PAGE电泳中的单蛋白质条带的存在显示该酶是纯的。

2.2摩尔质量和结构

2.2.1通过电泳或凝胶渗透层析测定摩尔质量

SDS-PAGE电泳使得可能估计该植酸酶的摩尔质量在77kDa，及用内源性糖苷酶H处理后的该酶的脱糖基化摩尔质量在51kDa，即34％的糖基化。在非变性条件下，由于模糊(smears)的存在，该酶的分子量较难确定；其在440至150kDa之间。脱糖基化的酶的分子量为87kDa。特异显色有可能显示脱糖基化的植酸酶是活性的。

由凝胶渗透层析(Pharmacia HR 200 column)测定的糖基化植酸酶的分子量为318kDa，脱糖基化的植酸酶的分子量为218kDa。

2.2.2质谱

质谱对分子量的测定确认了由SDS-PAGE电泳获得的结果，即，植酸酶为74kDa，脱糖基化酶为53kDa，即28.4％糖基化。

因此，天然的植酸酶被认为由4个相同质量的单体构成。

2.2.3晶体学

以往，通过晶体学已经确定了Debaryomyces castellii的结构(461个残基)具有2.3A的解析度。

其为四聚体，含有10分子的N-乙酰氨基葡萄糖和1256分子的水。

在RCSB蛋白质数据库(RCSB Protein Data Bank)登录位置利用以下的bdb编码：2GFI可获得该结构。

3-酶特性

3.1pH的影响

在不同缓冲液存在下，通过测定酶活性来确定pH对植酸酶的影响：对于pH 2至3.5(甘氨酸缓冲液)，对于pH 3.5至7(乙酸钠缓冲液)，对于pH 7至7.5(tris HCl缓冲液)(图1)。在2.5至6.5的pH值之间，植酸酶是有活性的，并具有pH 4至4.5的最佳pH值。在pH 3.5，可以注意到缓冲液特性对植酸酶活性的影响；与甘氨酸缓冲液比较，乙酸钠缓冲液为抑制剂。

3.2温度的影响

通过检测在不同的温度：从30至80℃下的植酸酶活性，测定对于天然植酸酶的最佳温度(图2)。

植酸酶的最佳温度为55至60℃。根据Arrhenius表示法计算的活化能为38kJ/mol。

3.3作用因子的作用

在检测的多种阳离子中，只有Mn²⁺引起72％的强抑制。在阳离子Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Mg²⁺的存在下，活性被抑制58％至22％。可以注意到，钙的存在对该酶的活性并不是必需的(表3)。

表3：作用因子对D.castellii植酸酶活性的作用

作用因子	浓度(mM)	活性％
			植酸对照 CaCl₂ MnCl₂ MgCl₂ CuCl₂ ZnCl₂ FeCl₃ CoCl₂ CrCl₂ HgCl₂	9 5 5 5 5 5 5 5 5 5	100 90 28.8 68.7 66.6 57 92 42.3 107.6 96.2

PCMB EDTA 碘乙酸 2-巯基乙醇 N-溴代琥珀酰亚胺 N-溴代琥珀酰亚胺 +色氨酸碘碘+色氨酸

3 3 3 3 0.1和1 1+3 3 1+3

94.5 104.5 100 107 1 100 25.6 88.1

在6种检测的抑制剂中，仅作用于色氨酸、酪氨酸和组氨酸基团的N-溴代琥珀酰亚胺完全抑制该植酸酶活性。加入色氨酸后重新建立该活性。对酪氨酸基特异的碘也较强抑制(75％)。色氨酸和酪氨酸表现为高度参与该酶的活化位点。

另一方面，作用于半胺胺酸、组氨酸基团的碘乙酸不引起活性的任何抑制。

2-巯基乙醇、碘乙酸和pCMB没有影响说明-SH基不参与催化位点。

3.4稳定性研究

温度

在不同温度下的热变性研究显示，该酶在60℃的水中稳定1小时，66℃的125mM乙酸缓冲液、pH 4中稳定1小时(图3)。高于68℃变性，在70℃1小时后丧失70％的活性。通过Arrhenius表示法计算的用于变性的活化的能量为606kJ/mol。

pH

对于低于5的pH，在-20℃存储21天后该植酸酶完全变性。另一方面，对于5和7之间的pH，在此相同的温度下，存储67天后没有观察到变性。

pH和温度

将酶在pH为2到8的缓冲液中在两个温度(40和60℃)下孵育后检测该植酸酶的活性(图4)。对于两个极端pH(2和8)，接触1小时后，活性完全丧失。另一方面，在pH 3至7的范围内，在40℃能够保留80％至100％的活性。在60℃，在pH 3和pH 8，该酶更高度变性。可注意到，由于pH 8的缓冲液的特性，存在强作用；在乙酸缓冲液存在下，变性完全，而在tris HCl缓冲液存在下，变性仅为50％。

环境离子强度

在20℃和66.5℃存在不同添加剂时，将酶在含1mM氯化钙的250mM乙酸缓冲液、pH 4中预孵育60分钟。处理结束后，在+4℃水中冷却该提取物。然后在pH 4、250mM缓冲液中，于37℃检测该活性20分钟(表4)。

检测了三种因素：

-糖或糖醇：蔗糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、甘油，

-不存在钙，

-缓冲液的摩尔浓度。

在20℃和66.5℃存在不同添加剂时，将酶在含1mM氯化钙的250mM乙酸缓冲液、pH 4中预孵育60分钟。处理结束后，在+4℃水中冷却该提取物。

然后在pH 4，含1mM氯化钙的pH 4、250mM缓冲液中，在37℃检测该活性20分钟(参考材料与方法)。

表4：环境对Debaryomyces castellii CBS2923植酸酶热稳定性的影响

因素	浓度	20℃1h	66.5℃1h
				对照 CaCl₂ 蔗糖乳糖海藻糖树胶糖醛	0mM 10％ 10％ 10％ 10％	99 100 97 95 94 90	47 1 57 47 56 36

甘油乙酸缓冲液乙酸缓冲液乙酸缓冲液乙酸缓冲液乙酸缓冲液

10％ 200mM 150mM 125mM 100mM 50mM

96 100 98 84 87 99

56 53 78 95 89 89

两种因素是非常重要的：钙和离子强度。尽管钙对酶活性没有影响，但是其起到非常重要的保护作用；在没有钙的存在下，变性是完全的。增加缓冲液的离子强度能够增加由温度引起的变性，在250mM时最高达50％。

4-动力学研究

特异性研究

测定了两种底物的动力学常数。

植酸酶的亲和性在植酸钙存在下4倍高于对-硝苯基磷酸酯(pNPP)存在下的活性(表5)。

表5：D.castellii植酸酶对多种底物的特异性

底物	Km (mM)	Vm (μmol/min/mg)
			pNPP 植酸钠	2.27 0.532	30.9 35.8

该植酸酶具有广谱活性，优先水解pNPP、磷酸烯醇式丙酮酸、ATP和ADP(表6A)。其属于诸如烟曲霉和E.nidulans的广谱植酸酶种类。

它还降解Ins(2)P₁(表6B)，由于其在植酸分子中是轴向位置，该分子很少被植酸酶水解。磷酸盐可抑制该酶的功能，Ki为1.3mM。

表6：在多种底物存在下D.castellii植酸酶特异性的比较。

(A)底物浓度为4mM。在250mM乙酸钠缓冲液，1mM CaCl₂，pH 4中，在37℃测定磷酸盐的释放动力学。

底物	浓度 (mM)	活性％
			植酸(对照) p-硝基苯基磷酸果糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸腺苷5′-单磷酸腺苷5′-二磷酸腺苷5′-三磷酸 L-α-甘油磷酸 D(-)3-磷酸甘油酸磷酸(烯醇)丙酮酸	9 4 4 4 4 4 4 4 4 4	100 135 35 82 50 120 133 78 95 130

(B)D.castellii植酸酶对多种肌醇磷酸盐的水解。在250mM乙酸钠缓冲液，1mM CaCl₂，pH 4中，测定磷酸盐的释放动力学。在37℃水解30分钟后，进行该检测。

底物	浓度(mM)	活性％
			植酸(对照) Ins(1)P₁ Ins(2)P₂ Ins(1，4)P₂ Ins(1，4，5)P₃	9 1 1 0.1 0.1	91 58 84 65 56

5-立体专一性

5.1通过层析(HPIC)对肌醇磷酸的分离和鉴定

在Omni Pac-100分析柱上，利用5％至8％HCl(0.5M)的梯度和H₂O/2-丙醇(v/v)分离肌醇磷酸异构体。在将洗提液在柱后反应器中与 0.1％Fe(NO₃)₃.9H₂O和2％HClO₄的溶液(Phillippy，B.Q.and Bland，J.M.(1988)Gradient ion chromatography of inositol phosphates.Anal.Biochem.175，162-166)混合。总流速为1.2ml/min。这些条件可能分离不同的Ins Ps(Ins P₆至Ins P₁)和鉴定Ins P₅和Ins P₄的不同异构体。

通过与以下获得的光谱进行比较来鉴定多种异构体，(1)在相同的条件下获得的，由文献描述的光谱(Skoglund，E.，Carlsson，N.G.and Sanberg，A.S.(1997)Determination of isomers of inositol mono-to hexaphosphatesin selected foods and intestinal contents using High-Performance IonChromatography.J.Agric.Food Chem.45，431-436)，(2)通过化学水解获得的化合物(Turk，M.，Sandberg，A.S.，Carlsson，N.G.and Andlid，T.(2000)Inositol hexaphosphate hydrolysis by baker′s yeast.Capacity，kinetics，anddegradation products.J.Agric.Food Chem.48，100-104)的光谱及(3)利用黑曲霉和P.lycii植酸酶水解植酸获得的产物的光谱(Lassen，S.F.，Been，L.，Fuglsang，C.C.，Ohmann，A.，Breinholt，J.and Stergaard，P.R.(2000)，美国专利号6060298)。

5.1.2化学水解

化学水解(6M HCl，100℃，16小时)后，获得的层析图使得我们能够鉴定Ins P₅和Ins P4中的12种异构体。该方法不能分离Ins P₃、Ins P₂ 和Ins P₁的异构体。

5.1.3D.castellii植酸酶水解植酸中形成的肌醇的鉴定

在材料与方法中已描述了水解条件。随时间监测多种Ins P_n的出现。水解15分钟后，Ins P₆已经实质上消失，检测到4种主要的峰并对应Ins(1，2，4，5，6)P₅，Ins(1，2，5，6)P₄，此方法没有检测到Ins P3，Ins P2和Ins P1的峰(图7)。通过添加可靠的肌醇样品确认Ins P5和Ins P4的分配。水解120分钟后，以Ins P3和Ins P1峰为主。这可以反映了Ins P3与Ins P₄，Ins P₅和Ins P₆相比较慢的水解率。水解300分钟后，分析的磷酸的量对应100％的植酸分子的潜在磷酸。该酶释放所有的磷酸。由层析分离的Ins P_n级分的特征由NMR分析完成。

5.2NMR(图8-图11)

5.2.1样品的制备

根据上文中所述的方法利用离子交换层析分离由D.castellii植酸酶水解Ins P₆的多种产物。注射的量对应369.5μg的InsP₆。用水来代替柱后试剂，实施12个层析分析。

收集、混合并冻干对应Ins P5，Ins P4，Ins P3，Ins P₂和Ins P₁的级分。用0.5ml的D₂O再水合冻干物，并在17℃利用NMR进行分析。

5.2.2InsP分析

如材料与方法中所详述，通过质子谱(1D和2D的COSY和TOCSY)和它们的31P-1H相关谱(HMQC)分析来表征不同的肌醇级分。可以区分非镜像的立体异构体，但不可能区分给出镜像和相同光谱的对映异构体。

结果是，水解产物的NMR特征不能区分3-植酸酶与1-植酸酶，以及6-植酸酶与4-植酸酶。通常，根据文献，当3-或1-键首先水解时，命名为3-植酸酶；类似地，6-或4-键首先水解时，命名为6-植酸酶。

5.2.2.1分析含Ins P1s的HPLC级分

质子光谱显示三种产物的混合物的存在，对其通过TOCSY和COSY实验鉴定了旋转系统(spin system)。这三种产物为：Ins(2)P1(36％)，Ins(1和3)P1(16％)和肌醇(48％)。磷光谱表明无机磷的存在，其以精细信号(fine signal)为特征。HMQC证明它们中的两种被单磷酸化，但第3中为非磷酸化，即肌醇。

5.2.2.2分析含Ins P2s的HPLC部分

质子光谱表明主导产物的存在(≈90％)。从对应H2质子(4.741ppm)的信号起始，COSY能够分配该光谱。偶联常数的分析表明，2-和1-位(或者2-和3-位)被磷酸化，并且该主导产物对应Ins(2，1或2，3)P2。31P的未偶联谱和HMQC证实了这种分配。次要产物(至少2种)没有被鉴定。

5.2.2.3分析含Ins P3s的HPLC部分

质子谱表明实质上纯产物的存在。该光谱的分析表明其对应(2，1，6或2，3，4)P3。这三种连续位置的磷酸化由31P未偶联光谱和HMQC证实。

5.2.2.4分析含Ins P4s的HPLC级分

质子光谱表明，主导产物(≈90％)的存在，其为Ins(2，1，6，5或2，3，4，5)P4。从偶联常数(3JHCOP＝8-10Hz)分析中导出的磷酸基位置被31P未偶联实验和HMQC实验证实。未鉴定次要产物。

5.2.2.5Ins P5的表征

由于InsP5是首先形成的产物且其立即被降解为InsP4，所以我们不可能将其通过HPLC充分分离而能够通过NMR进行表征。

为了逾越此障碍，在17℃通过少量植酸酶(参见下文)进行的水解动力学中，原位表征了Ins P5。在这些条件下，可获得Ins P5的质子光谱(COSY，TOCSY和ID差异光谱)。所有这些光谱使得可能表征Ins(1，2，4，5，6)P5，表明3-位(或者1-位)为去磷酸化的第一位置。未记录Ins P5的31P光谱(图8)。

5.2.3InsP6的水解动力学

初步研究可能首先显示该酶对氘的存在不敏感，其次，调节酶浓度能够使得动力学相对于所观察的技术约束既不太快也不太慢。

依赖温度(此情况下为17℃)和酶的浓度，动力学可以较慢(1μl的酶)并且可以容易地观察到第一中间物的出现。在这些条件下获得到InsP5的光谱特征并可以清楚地观察到Ins P5，Ins P4和Ins P3的连续出现。

5μl的酶存在时，观察到Ins P2，Ins P1和肌醇的形成。在中间阶段，所观察到的光谱的复杂性说明了Ins Pns的混合物。10小时后，水解不完全。在20μl酶的存在下，在约4小时获得完全水解。这些动力学结果证实先前观察到的6磷酸键的水解。这些清楚地表明，至少2个键的水解比其他的明显慢。积累在介质中的磷酸盐的抑制作用可能部分地对此负责(图9，10和11)。

在此研究中，我们描述了D.castellii植酸酶水解植酸的途径。层析及同核和异核NMR分析有可能清楚地确定所形成的主要和不同的InsPs结构：Ins P5，Ins P4，Ins P3，Ins P2和Ins P1。脱磷酸化的顺序如图5所示。将其总结在3/4/5/6/1，2型中。尽管NMR不能分辨位置1与3和4与6的异构体，但是，我们能够通过HPIC分析确定：3-位随后是4-位的磷酸基团是首先水解的两个基团。NMR跟踪的动力学证实了该观察结果。后续的水解位于与羟基临近的磷酸上。至少两个磷酸键Ins(1，2)P2的水解同时发生。但是，2-位的水解率显示两倍低于1-位(或3-位)的水解率。最终，与所使用的方法无关(酶、HPLC或NMR)，水解结束时肌醇的定量生产表明酵母D.castellii植酸酶水解了六个磷酸键。该植酸酶可分类为3-植酸酶(EC 3.1.3.8)，类似于许多微生物的植酸酶。

实施例2：重组植酸酶的克隆、过表达和生化表征

材料与方法

生物、载体和寡核苷酸序列

此研究使用的菌株、质粒、和引物如表7所示。

表7：此研究使用的菌株、质粒和寡核苷酸

菌株、质粒或引物	描述或特征	参考或来源
			菌株
D.castellii CBS 2923	植酸酶产生者	CBS，Delft(NL)
			E.coli XL1-Blue MRF’	Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)113 endAl supE44 thi-1 rec A1 lac[F’proAB lac I^qZΔM15 Tn10(Tet^t)]	Stratagene
巴斯德毕赤酵母 X33		Invitrogen

质粒
			p GEM-T	含有赋予氨苄青霉素抗性的基因	Promega
pPICZcxB	诱导型AOX1启动子；酿酒酵母α因子的信号序列；赋予zeocin抗性的Sh ble基因；完整	Invitrogen

	的
			pGAPZαB	组成型GAP启动子；酿酒酵母α因子的信号序列；赋予zeocin抗性的Sh ble基因；完整的；	Invitrogen

			引物
phyt-Nter-正向	5′-TCIAA(A/G)TT(A/G)AT(T/C/A)AA(T/C)AA (T/C)GG-3’对应的肽：SKLINNG
			phyt-pepl-反向	5′-GG(A/T/C/G)AC(A/G)AA(A/G)TA(C/T)TC( A/G)TA(A/G)TC-3′对应的肽：PVFYEYD
API	5′-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3′	BD Biosciences
			AP2	5′-ACT ATA GGG CAC GCG TGG T-3′	BD Biosciences
5phyt-spe-1	5′-TATGGAGCAGCTCCTCCTAAGAATCTG- 3’
			5pnyt-spe-2	5’-ATGATGTTATATTGCTCGACGGACGCT TG-3′
3phyt-spe-1	5′-TATGGAGCAGCTCCTCCTAAGAATCTG- 3′
			3phyt-spe-2	5′-CTGGCTCCGGAAAGAAATATAAGGCTG TA-3′
3bisphyt-spe-1	5′-GAAGTGTAGCTCTGGTCCTGGTTTCTCA TG-3′
			3bisphyt-spe-2	5′-ATGTTGCTGAAAGAGTTGCAGGTACCA ACT-3′
phytDc-Pstl-正向	5′-GCACTGCAGTCTCAGTCTCAAAGTTAA TTAAC-3′

phytDc-Xbal-反向

5′-AGTTCTAGATTAACTGTTGATAAGGGA AGCGGT-3’

将酵母Debaryomyces castellii CBS 2923在填充了1/10容量的Erlenmeyer烧瓶中，在有氧条件下和28℃进行培养。当提取基因组DNA时，将菌株培养在有500ml的YPD培养基或20ml的MSA培养基中。

将DNA扩增中使用的E.coli菌株XLl-Blue MRF′在填充了1/10容量的Erlenmeyer烧瓶中，在有氧条件下和37℃，在添加氨苄青霉素(100mg/l)的Luria-Bertani培养基(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)Molecular cloning：a laboratory manual.2nd edn.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA)中，或在“低盐”Luria-Bertani培养基(5g/l NaCl)中进行培养，用氢氧化钠调节该低盐培养基pH至7.5，并添加了zeocin(25mg/l)。当在固体培养基中进行培养时，上述培养基中添加15g/l的Bacto琼脂。

将酵母菌株巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33用于异源表达编码植酸酶的基因。在有氧条件下于28℃，在添加了zeocin(100mg/l)的YPDS琼脂培养基上进行转化株的选择。

将载体pGEM-T(Promega)用于将通过聚合酶链式反应(PCR)扩增的片段克隆进入大肠杆菌，并用于该DNA的测序。此质粒中的选择标记为氨苄青霉素抗性基因。使用了两种表达载体pPICzαB和pGAPZαB(表7)。载体pPICzαB含有醇(甲醇)氧化酶基因(AOXl)启动子，其使得可能获得巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中目的基因的高水平表达，重组蛋白的表达是甲醇诱导的(Cereghino，J.L.and Cregg，J.M.(2000)Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.Ferns Microbiology Reviews 24，45-66)。载体pGAPZαB含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)基因的启动子，其允许巴斯德毕赤酵母中重组蛋白的高水平的组成型表达(Waterham，H.R.，Digan，M.E.，Koutz，P.J.，Lair，S.V.and Cregg，J.M.(1997)Isolation of the Pichia pastorisglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use ofits promoter.Gene 186，37-44)。这两种载体还具有在细菌中复制所需的序列。用这些载体转化的克隆的挑选是基于选择性标记，zeocin，并且这种选择可以在巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌中应用。此外，重组蛋白作为与酿酒酵母(S.cerevisiae)α-因子的信号肽序列的融合蛋白被表达。

培养基

将D.castellii CBS 2923在用100mM邻苯二甲酸盐缓冲液缓冲至pH5.4的YPD培养基(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖)或MSA-B培养基(参见，实施例1，材料与方法)上培养。转化后，在固体YPDS培养基(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖，1M山梨醇，20g/l Bacto琼脂)上选择巴斯德毕赤酵母X33转化株。在琼脂培养基中产生克隆的挑选中，将巴斯德毕赤酵母转化株培养在合成的固体培养基中，该培养基含有0.5％葡萄糖或甲醇，20g/l Bacto琼脂，100ml/lFM21盐(10X FM21：1.5g/l CaSO₄.2H₂O，23.8g/l K₂SO₄，19.5g/lMgSO₄.7H₂O，6.5g/l KOH，H₃PO₄ 85％ 3.5％v/v)，10ml/l PTM1痕量元素(100X PTM1：2g/l ZnCl₂，6.5g/l Fe(SO₄).7H₂O，0.6g/lCuSO₄.5H₂O，0.3g/l MnSO₄.H₂O，10mg/l KI，2mg/l H3BO4，20mg/lNa₂MoO₄，H₂SO₄ 96％ 0.2％)，4g/l(NH₄)₂SO₄，12g/l H₂PO₄NH₄和80μg/l D-生物素，用200mM酒石酸盐-磷酸盐缓冲液至pH 5.4。当在液体培养基中选择产生克隆时，将巴斯德毕赤酵母转化株培养在合成的培养基中，该培养基含有碳源(10g/l葡萄糖，20g/l甘油或3.9g/l甲醇，100ml/l FM21盐，10ml/l PTM1痕量元素，4g/l(NH₄)₂SO₄，12g/lH₂PO₄NH₄和80μg/l D-生物素，用200mM酒石酸盐-磷酸盐缓冲液至pH 5.4。当培养在生物反应器中进行时，在YMPG培养基(3g/l酵母提取物，3g/l麦芽提取物，5g/l蛋白胨，10g/l葡萄糖)中进行预培养，并随后在合成培养基中培养，该培养基为：40g/l甘油，100ml/l FM21盐，10ml/l PTM1痕量元素，4g/l(NH₄)₂SO₄，12g/l 5H₂PO₄NH₄和80μg/l D-生物素，用200mM酒石酸盐-磷酸盐缓冲液至pH 5.4(Klein et al.，1998)。分批模式培养在合成培养基中进行，该培养基含40g/l甘油或20g/l葡萄糖，100ml/l FM21盐，10ml/l PTM1痕量元素和80μg/l D-生物素。当进行第二批培养时，将甘油溶液中加入到发酵罐中，使得甘油的终浓度为40g/l。该添加在最初的甘油完全消耗之后进行，该消耗可能通过溶解氧含量的突然上升来观察。补料-分批(fed-batch)模式培养用合成培养基来饲养，该培养基含有400g/l甘油，400g/l葡萄糖或780g/l甲醇，50ml/l PTM1痕量元素和1mg/l D-生物素。连续模式培养用合成培养基来进行，该培养基为：66.67g/l甲醇，50ml/l FM21盐，25ml/l PTM1痕量元素和500μg/l D-生物素。

基因组DNA提取

基因组DNA(gDNA)的快速提取

在培养9小时后，收获来自MSA培养基中的D.castellii CBS 2923培养物的细胞，离心(3500xg，20分钟，+4℃)并用10ml的无菌水洗涤。随后将细胞重悬在200μl的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8，1mMEDTA，100mM NaCl，2％v/v triton X-100，1％w/v SDS)，200μl玻璃珠(直径0.45-0.5mm)和200μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1；v/v/v)混合物中。通过强烈的震荡3分钟来进行细胞裂解，并随后加入200μl的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8)。离心该溶液(8000xg，5分钟，+4℃)。用一体积的氯仿/异戊醇(24/1；v/v)混合物从水相提取蛋白质，并离心(8000xg，2分钟，+4℃)。用1ml无水乙醇(-20℃)来沉淀基因组DNA，离心(12000xg，5分钟，+4℃)并重新溶解在370μl的TE缓冲液中。在75μg/ml RNase A存在下+37℃孵育15分钟来去除RNA。随后用无水乙醇(-20℃)来沉淀该DNA，重悬在50μl的TE缓冲液中，并在-20℃中保存。

液体高分子量酵母DNA制备

收获来自500ml的YPD培养基中指数期的D.castellii CBS 2923培养物的细胞，离心(6000xg，15分钟，+4℃)并用40ml的无菌水洗涤。将沉淀重新溶解在3.5ml的SCE溶液(1M山梨醇，0.1M柠檬酸钠，60mM EDTA)中，该溶液含有40μl的2M二硫苏糖醇和5mg(5000单位)的zymolase 100-T(ICN Biomedical，32093)，并在+37℃孵育1小时。随后加入7ml的裂解溶液(0.5M Tris-HCl，pH 6.5，3.2％w/v十二烷基肌氨酸钠，0.2M EDTA，100μg/ml蛋白酶K(RocheDiagnostics，Meylan，France))，将悬浮液在+65℃孵育15钟，随后快速冷却至室温。

通过连续地向超速离心管中加入11ml的20％w/v蔗糖，11ml的15％w/v蔗糖以及3ml的50％w/v蔗糖来制备蔗糖梯度。将裂解的细胞悬浮液直接加入到该梯度上，并在26 000rpm在+20℃超速离心3小时(Centrikon T-1075 ultracentrifuge，Kontron Instrument)。用移液器将在梯度上形成的云状DNA回收，用乙醇沉淀并重悬在100μl的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8)中。在50μg/ml的RNase A中+37℃孵育3小时来去除RNA。用乙醇再次沉淀该gDNA，然后重悬在200μl的TE缓冲液中并在-20℃保存。

植酸酶基因的克隆

该基因第一片段的扩增

以通过快速基因组DNA提取方法获得的D.castellii CBS 2923gDNA作为模板来进行多聚酶链式反应(PCR)。依据蛋白质序列来设计引物对phyt-Nter-正向/phyt-pepl-反向，限于最大程度的简并性(表7)。通过Taq聚合酶(Promega)利用Minicycler热循环仪(MJ Research)扩增该DNA。将gDNA在+94℃第一次变性3分钟后，根据以下温度设置来进行30循环的扩增：+94℃变性1分钟，+45℃杂交1分钟，随后是+72℃聚合1分钟。这些循环后是+72℃、10分钟的平台期。

植酸酶基因全序列的克隆

利用“基因组步行步移”技术(Universal Genome Walker Kit，BDBiosciences)根据提供者的指导来获得该基因的全序列。The，extractedby the通过“液体酵母高分子量DNA制备”方法提取的D.castellii CBS2923gDNA(2.5μg)分别用4种限制性内切酶(50单位的DraI，EcoRV，PvuII或StuI)在+37℃消化16小时(50单位的DraI，EcoRV，PvuII或StuI)。因此，每一片段具有平末端。通过苯酚/氯仿提取并用乙醇来沉淀来纯化该片段。然后将该片段与用“基因组步行(genome walking)步移”试剂盒提供的adapter接头(adaptor)在+16℃，连接片段16小时。通过在+70℃加热5分钟来终止该连接，随后加入9个体积的TE缓冲液。因此构建了4个文库并命名为“DraI，EcoRV，PvuII和StuI文库”。利用每一文库作为模板和一对引物(其包含对接头特异的以及含有对该adapter特异的引物API，和对该基因特异的引物5phyt-spe-1/3phyt-spe-1)的引物对进行第一基因组步移循环(表7)。在1.5％LE的琼脂糖电泳胶中验证此第一PCR循环的效率。将得自第一PCR的混合物稀释50倍，并用作第二PCR循环的模板。使用对第二接头特异的引物AP2和对该基因特异的引物5phyt-spe-2/3phyt-spe-2进行第二循环(表7)。由此扩增的片段在1.2％低熔点琼脂糖电泳胶上分离，利用″GeneClean″试剂盒纯化并克隆至载体pGEM-T中以进行测序。第二基因组步移循环对获得该基因的全序列是必要的。对于每一文库，如前所述，在第一循环中利用引物AP1/3bisphyt-spe-1和在第二循环中利用引物AP2/3bisphyt-spe-2(表7)，进行两轮PCR循环。

表达质粒的构建

为了利用表达载体pPICzαB和pGAPZαB克隆巴斯德毕赤酵母中的phytDc基因，通过PCT扩增该基因的全序列。使用通过快速基因组DNA提取方法提取的D.castellii CBS 2923 gDNA作为模板，利用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)来进行该PCR。在此扩增中，所使用的引物对phytDc-Pstl-正向和phytDc-Xbal-反向(表7)使得分别在该基因的5’和3’位产生PstI和Xbal限制性位点。将gDNA在+95℃第一次变性2分钟后，根据以下温度设置来进行25循环的扩增：+95℃变性30s，+55℃杂交30s，随后是+72℃聚合1.5分钟。这些循环后是+72℃、10分钟的平台期。通过测序验证没有突变。

转化

如Sambrook et al.(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)Molecular cloning：a laboratory manual.2^nd edn.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA)所述，通过热激法来转化大肠杆菌XL1-blue MRF′细胞。通过电穿孔(Invitrogen instructionmanual pPICZaA，B and C，version E or Invitrogen instruction manualpGAPZcxA，B and C，version F，Invitrogen Ltd.，UK)转化该巴斯德毕赤酵母X33细胞。使用设置在1.5kV电压和25μF的电容的基因脉冲发射器(Biorad)，以及设置在200ohms的脉冲控制器(Biorad)来实施该转化。

序列的合成与分析

由MWG-Biotech公司(Germany)合成作为PCR引物使用的寡核苷酸。利用蛋白质微测序仪(Beckman/porton LF 3000)，使用厂商推荐的试剂和方法来进行N-末端序列和植酸酶内在肽的微测序。将该微测序仪直接连接到具有268nm的UV-检测器(Beckman 166)的RP-HPLC层析系统(Beckman 125S)上。用Gold V8.20软件处理数据。利用BLAST2(BasicLocal Alignment Search Tool)和FASTA软件来搜索核酸或蛋白质间的区域比对以及所概括的数据库。核酸或蛋白质LALIGN以及FASTA软件包的LFASTA程序进行两个序列间的比较。这些程序在Infobiogen服务器(http://www.infobiogen.fr)上提供。用Antheprot 2000 V5.2 release1.1.6软件进行蛋白质序列的信号肽的预测和理论的pHi值计算。利用NetNGlyc 1.0，DictyOGlyc 1.1和NetOGlyc 2.0服务器(生物序列分析中心，丹麦科技大学)预测糖基化位点。

液体培养基中生产者克隆的挑选

将巴斯德毕赤酵母pGAPphyt转化株培养在+28℃、5ml合成培养基(其含10g/l的葡萄糖)上。48小时后，将培养物在1676xg离心5分钟。将上清液保存在+4℃。巴斯德毕赤酵母pPICphyt转化株培养在+28℃、5ml的相同合成培养基(含20g/l代替葡萄糖的甘油)中。48小时后，将培养物在1676xg离心5分钟。通过向含有该细胞的试管中加入2.5ml的相同培养基(含3.9g/l代替葡萄糖的甲醇)来诱导recPhyt的产生。诱导24小时后，将培养物在1676xg离心5分钟。将2.5ml的相同培养基(含有3.9g/l代替葡萄糖的甲醇)加入到含有该细胞的试管中。诱导24小时后，将细胞在1676xg离心5分钟。上清液保存在+4℃。这些培养在13ml的无菌试管中进行。

重组植酸酶的产生

Erlenmeyer烧瓶中的预培养

预培养在加入了1/10体积YMPG培养基的Erlenmeyer烧瓶中进行。将其在+28℃震荡(每分钟80振动，振幅7cm)孵育24小时。将该预培养物在合成培养基中生产24小时。

生物反应器中的培养

在11或31Applikon发酵罐(The Netherlands)中进行分批、补料-分批和连续模式培养。通过自动添加16％(v/v)NH₃或2N H₂SO₄将pH调节至4，并将温度维持在+28℃。为了防止泡沫的形成，在培养时加入Biospumex 153K消泡剂(Cognis Dusseldorf，Germany)：对于补料-分批模式培养加入5％v/v消泡剂，或对于连续模式培养加入1％(v/v)的消泡剂。利用Applisens探测器(The Netherlands)检测溶解氧分压，并通过搅动和通风来维持高于30％的值。

利用Applikon BioExpert软件来进行培养数据的获取和确认。

培养条件

参见实施例1，在发酵罐中的培养。

生物量浓度的测定

利用分光光度计(DU530，Beckman Instruments Inc.，Fullerton，CA，USA)在600nm通过光密度(OD)来检测细胞的浓度。

一个光密度单位对应甘油上的0.462g/l(g S/l)，甲醇上的0.442gS/l以及葡萄糖上的0.491g S/l的固体。

重组植酸酶的纯化

参见实施例1，材料与方法3。

SDS-PAGE电泳

参见实施例1，材料与方法4。

蛋白质浓度的测定

参见实施例1，材料与方法7.2。

酶技术

琼脂培养基植酸酶活性的检测

利用Kim et al.(Kim，Y.O.，Kim，H.K.，Bae，K.S.，Yu，J.H.and Oh，T.K.(1998)Purification and properties of a thermostable phytase fromBacillus sp.DS11.Enzyme Microb.Technol.22，2-7)的方法，对于聚丙烯酰胺凝胶中的磷酸酯酶的特异性显色进行改进，测定植酸酶活性。将巴斯德毕赤酵母转化株培养在有氧条件、+30℃、含0.5％的葡萄糖或甲醇(依赖所用载体)的固体合成培养基中。这些培养物被孵育3天。在用修饰的载体pPICzαB转化的巴斯德毕赤酵母克隆的情况下，从第三天起，每天向Petri培养皿的盖中加入50μl甲醇。临用前，制备显色溶液(10g/l Bacto琼脂，2g/l α-萘磷酸酯，1g/l FastGarnetGBC，0.92g/l植酸钠，用0.25M乙酸钠缓冲液缓冲至pH 5.5)，冷却至45℃，并以薄层倒在菌落上。产植酸酶的克隆的染色(褐色、深红)立即出现。

通过植酸盐的水解测定植酸酶活性

参见实施例1，材料与方法7.3。

通过对-硝基苯基-磷酸(p-NPP)水解测定植酸酶活性

通过实现酶动力学来测定该活性。(用125mM乙酸钠)缓冲为pH 5.5的反应培养基(总计2个体积总量)，含有6mM的对-硝基苯基磷酸和经稀释或未经稀释(1个体积)的酶提取物。在室温孵育不同时间后，通过添加0.3N的氢氧化钠(1个体积)来终止该反应。为，从而碱化该培养基并显示染色。利用Sanofi Pasteur PR 2100微孔板阅读器分光光度仪在450nm检测吸光度。酶单位(U)被定义为在设定的条件(室温，pH 5.5)下从p-硝基苯基磷酸溶液中每分钟释放1微摩尔对-硝基酚的酶量。利用对-硝基苯基磷酸(0.012-0.12μmol)事先建立标准曲线。

动力学研究

参见实施例1，7.5和7.6。

结果

植酸酶基因的特性

D.castellii CBS 2923植酸酶基因的克隆

测序纯的D.castellii植酸酶内在肽和N-末端肽。根据这些肽的序列设计PCR引物，限于简并的最大程度(表7)。利用D.castellii CBS 2923gDNA作为模板实施PCR。由此可扩增约300碱基对(bp)的片段。为了克隆D.castellii CBS 2923植酸酶基因的全序列，我们选择使用“基因组步移”技术。从先前获得的300bp片段序列，合成对应该片段末端并使得临近该片段的序列能够扩增的引物(表7)。利用D.castellii CBS 2923gDNA文库作为模板进行PCR。第一循环可以分别从EcoRV和PvuII文库中扩增300bp序列的约1600bp上游片段和约1100bp下游片段。因此，我们能够重构含3’位截短的1325bp开发读码框(ORF)的约3000bp的片段。第二PCR循环使用从第一PCR获得的片段的3’末端设计的新引物。此PCR可能从EcoRV文库扩增约100bp的片段。我们因此能够重构1386bp的开发读码框。从此ORF导出的蛋白质序列包含先前测序的两种肽，其能够证实该基因对应于编码D.castellii CBS 2923植酸酶(参见SEQ ID No.1)序列。为了证实该序列，合成了对应该基因末端的引物(表7)。通过PCR扩增了该全基因并测序验证了先前获得的结果。

核苷酸和蛋白质序列的分析

根据“基因步移”实验，可以重构2990bp片段。此片段含有称为“phytDc序列”的1386bp的开发读码框。对应的461氨基酸蛋白质序列包含几个基序(SEQ ID No.2)。RHGERYP基序对应存在于许多高分子量酸性磷酸酶活性位点的RHGXRXP共有序列。该序列也具有在C末端部分的HD基序，其为在许多植酸酶序列中存在的基序。N-末端序列从导出蛋白质的第二氨基酸起始，其出现表明，该蛋白质尽管被分泌但不具有信号肽。下述事实支持了此观察：利用Antheprot软件查询潜在的信号肽剪切位点时获得阴性结果。该导出的蛋白质具有51.2kDa的估计分子量，与通过质谱实验获得的分子量(53/55kDa)类似，所述质谱使用在D.castellii CBS 2923中表达、纯化并通过内源性糖苷酶H脱糖基化的蛋白质。N-乙酰氨基葡萄糖残基或未被内源性糖苷酶H去除的O-糖基化基序的存在可以解释该质量差异。蛋白质序列的分析显示9个潜在的N-糖基化位点和4个潜在的O-糖基化位点的存在。该蛋白质的pHi估计为4.3。利用数据库的同源性查询显示，D.castellii CBS 2923植酸酶与酵母或真菌来源的多种植酸酶有21-36％的同源性。这些植酸酶序列的大小是非常相似的(440-480氨基酸)，但是D.castellii CBS 2923植酸酶在其序列的全长上并不完全对齐。该phytDc序列在其序列全长上与S.occidentalis植酸酶共有69.2％的同源性。因为编码S.occidentalis植酸酶的基因序列是从互补DNA中获得的，这种比对使得我们考虑编码D.castellii植酸酶的基因不含有内含子。此外，此序列表现与磷酸酶有同源性。

重组植酸酶高量生产者(hyperproducer)的P.pastorls克隆的挑选

通过PCR扩增phytDc基因并插入到表达载体pPICzαB和pGAPZαB中。在含有zeocin的YPDS培养基中挑选转化株。转化率为10²转化株每μg DNA。利用载体pPICZαB获得的克隆称为“PIC克隆”，利用载体pGAPZαB获得的克隆称为“GAP克隆”。对于每一转化，随机采样100个克隆，并在琼脂培养基上评价其重组植酸酶(recPhyt)生产。显色后，为最高生产者的克隆表现出围绕菌落的褐色环。96％的PIC克隆和66％的GAP克隆为生产者。在最高生产者的克隆中，在Erlenmeyer烧瓶的合成培养基中试验了10个GAP克隆和10个PIC克隆。对于每个克隆，测定了生物量(通过检测OD值来评价)对培养上清液中植酸酶活性(通过p-NPP水解检测)的比值。在PIC克隆中比值范围为0至0.48，在GAP克隆中比值范围为1.28至6.07。在这些培养条件下，GAP克隆是最好的生产者。根据Waterham et al.(Waterham，H.R.，Digan，M.E.，Koutz，P.J.，Lair，S.V.and Cregg，J.M.(1997)Isolation of the Pichia pastorisglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use ofits promoter.Gene 186，37-44)，在Erlenmeyer培养中，葡萄糖培养中的GAP引物要强于甲醇培养中的AOX1启动子。

为完成此选择阶段，在发酵罐中首先试验了PIC81和PIC61克隆，其次是GAP29和GAP66克隆。对于PIC克隆，在甘油(40g/l)上的两个连续分批能够在补料-分批模式中用甲醇(780g/l)诱导前获得高的生物量。对于GAP克隆，在葡萄糖(20g/l)上的第一批培养随后是在葡萄糖400g/l上的补料-分批模式产生阶段。PIC81克隆能够获得81g S/l的最终生物量，而PIC61克隆的最终生物量仅为65g S/l。另一方面，两种克隆产生基本相同量的recPhyt(100U/ml)。在培养结束时，GAP克隆表现相同的生长(100g S/l)，但GAP29克隆产生11U/ml的产物，GAP66克隆产生9U/ml的产物。获得的重组株分别产生100(PIC株)和10(GAP 株)倍高于野生型D.castellii CBS 2923株的植酸酶。在发酵罐中最优化了PIC81和GAP29克隆的生产。

重组植酸酶的产生

组成型表达-碳源和比生长率对GAP克隆的生产的影响

在葡萄糖(400g/l)，甘油(400g/l)和甲醇(780g/l)的补料-分批模式培养中研究了recPhyt的生产。结果如表8所示。

表8：GAP29克隆补料-分批培养中获得的参数比较。

对于所有的试验，在含有40g/1的甘油的相同培养基中进行分批培养阶段。

补料-分批的底物	μ 加入量 h^-1	培养阶段	生物量 g S/l	Yx/ S g/g	μ 总 h^-1	recPhyt U/ml	YrecPhyt/x U/g S
								葡萄糖	0.010	分批(49h)^a 补料-分批(94h)^a 最终(143h)^b	19.3 34.6 53.9	0.5 0.3	0.20 0.009	6.5 10 16.5	340 289 306
甘油	0.010	分批(49h)^a 补料-分批(94h)^a 最终(143h)^b	20.5 35.2 55.7	0.5 0.3	0.20 0.008	7 9.6 16.6	341 272 298
								葡萄糖	0.040	分批(26h)^a 补料-分批阶段 1(38h)^a 补料-分批阶段2 (24h)^a 最终(88h)^b	19.2 44.6 17.7 81.5	0.5 0.5 6 0.3 8	0.20 0.037 0.016	5 7.1 3.9 16	260 159 220 196
甘油	0.040	分批(31h)^a 补料-分批阶段 1(38.5h)^a 补料-分批阶段2 (24h)^a 最终(93.5h)^b	20.3 45.3 13.2 78.8	0.5 0.5 5 0.3	0.20 0.039 0.016	6 7.3 3.3 16.6	295 161 250 210
								甲醇	0.010	分批(29h)^a 补料-分批(113h)^a 最终(142h)^b	40 43.8 83.8	0.5 0.1 6	0.15 0.009	9.6 4.9 14.5	240 112 173

^a：这些值对应每一阶段获得的值。

^b：这些值对应在培养结束时的值

对于前两种底物，基于在甘油(40g/l)的单批能够获得20g/l的生物量和0.2h^-1的特异比生长率。依赖补料-分批之前的静止期时间，recPhyt的产生是不同的：对于12小时的静止期，区域为7U/ml，即340U/g S，对于3小时的静止期，区域为5.5U/ml，即275U/g S。基于葡萄糖和甘油的补料-分批模式的生产(比生长率为0.01h^-1)使得可能获得55g/l的生物量，16.5U/ml即280U/g S的植酸酶生产。在两批甘油(40g/l)和0.01h^-1特异的比生长率后基于甲醇的补料-分批培养中，获得的生物量为84g/l，植酸酶生产为14.5U/ml，即112U/g S。基于葡萄糖和甘油的补料-分批模式(比生长率为0.04h^-1)能够获得80g/l的生物量和16.5U/ml即200U/g S的植酸酶的产生。

当植酸酶的生产在GAP启动子控制下时，与甲醇比较，葡萄糖和甘油是用于生产重组植酸酶的更好底物，其更适宜生长。

诱导型表达-比生长率对PIC克隆进行的生产的影响

在补料-分批模式(图6和表9)和连续模式(图6和表9)中研究了由PIC81克隆进行的生产。

表9：PIC81克隆的补料-分批模式和连续模式培养中获得的参数比较

培养模式		μ或D h^-1	生物量 g S/l	Yx/s g/g	recPhyt U/ml	YrecPbyt/x U/g S
							补料-分批 0.01h^-1	阶段1(64h)^a 阶段2(54h)^a 最终(118h)^b	0.012 0.011	28.8 22.9 51.7	0.21 0.18	34.7 72.3 107	1105 2342 1337
补料-分批0.03 h^-1	阶段1(22.5h)^a 阶段2(28.5h)^a 最终(51h)^b	0.047 0.033	32.5 49.6 82.1	0.41 0.28	16.7 47.2 63.9	472 880 614
							连续^c		0.032 0.053 0.077 0.095	21.6 27.2 26.3 26.6	0.32 0.41 0.39 0.40	57.7 11.6 5.7 3	2700 430 210 116

^a：这些值对应在每一阶段获得的值。

^b：这些值对应在培养结束时获得的值。

^c：对于每一稀释率，在至少进行3次发酵罐内容更新之后实施检测。

在补料-分批培养中，利用两种特异的比生长速率(μ)值(0.01h^-1和0.03h^-1)。获得的生物量在μ＝0.03h^-1(82g/l)时1.5倍高于μ＝0.01h^-1 (52g/l)的时。植酸酶生产在两个阶段中发生了植酸酶生产(表9)。对于采用的特异比生长率0.01h^-1，第一阶段产生28.8g/l的生物量，具有植酸酶1105U/g S的产量的植酸酶生产。在第二阶段，获得22.9g/l的生物量，并且植酸酶的产量生产达到2342U/g S，即107U/ml。在当μ＝0.03h^-1中时获得了类似的结果，其中植酸酶的产量从第一阶段的472U/g S到成为第二阶段的880U/g S，即64U/ml。特异比生长率的增加与重组植酸酶的产生比较相比，更适于细胞生长。在连续培养中，采用了四个稀释率(表9)。对于高于0.053h^-1的稀释率值，在平衡的生物量为27g/l，而在0.032h^-1稀释率时，仅为21.6g/l。在补料-分批模式培养中，增加稀释率适宜生物量的产生，而有损于重组蛋白质的产生。在对于0.032h^-1获得最大值为2700U/g S，即57.7U/ml。诱导型系统(AOX1启动子，PIC81克隆)与组成型系统(GAP启动子，GAP29克隆)的植酸酶的产生生产的比较说明，AOX1引物明显地优于GAP启动子。PIC81株能够获得107U/ml的重组植酸酶，即7倍高于GAP29株(16U/ml)。比产量分别为2700U/g S(PIC81)和340U/g S(GAP29)，即100和10倍高于D.castellii株。

纯化

将PIC81克隆补料-分批模式培养物之一后获得的上清液一步纯化，参见材料与方法部分所述。比植酸酶活性为粗提取物中101U/mg蛋白质以及在纯化的提取物中182U/mg蛋白质。因此，纯化因子为1.8。此相对低的值表明，重组的植酸酶为粗提取物中的主导蛋白质。通过SDS-PAGE电泳证实了该假说。在凝胶上，对应重组植酸酶的条带代表60％的总蛋白质。此外，纯化后，观察到单条带，因此证实了蛋白质的同质纯化。

纯化后获得的比活性高于在巴斯德毕赤酵母中表达烟曲霉(Aspergillus fumigatus)植酸酶时获得的活性(43U/mg的蛋白质)(Rodriguez，E.，Mullaney，E.J.and Lei，X.G.(2000) Expression of theAspergillus fumigatus phytase gene in Pichia pastoris and characterizationof the re

重组植酸酶表征

pH的作用

RecPhyt在2-6.5之间的pH值下有活性，最佳的pH值为4-4.5之间。D.castellii CBS 2923植酸酶表现类似的特性。

温度的作用

在不同温度下植酸酶活性的测定表明，重组植酸酶对于高温更有活性，并具有最佳温度+60℃，类似于D.castellii CBS 2923植酸酶。所引用的最佳温度的大多值均低于+45℃，除了一些真菌或酵母的植酸酶，例如来自无花果曲霉(+58℃)(Ullah，A.H.J，and Gibson，D.M.(1987)Extracellular phytase(EC 3.1.3.8)from Aspergillus ficuum NRRL 3135：purification and characterization.Prep.Biochem.17，63-91)，土曲霉(Aspergillus terreus)(+70℃)(Yamada，K.，Minoda，Y.and Yamamoto，S.(1968)phytase from Aspergillus terreus.I.Production，purification andsome general properties the enzyme.Agric.Biol.Chem.32，1275-1282)以及S.castellii(+77℃)(Segueilha，L.，Lambrechts，C，Boze，H.，Moulin，G.andGalzy，P.(1992)Purification and properties of the phytase fromSchwanniomyces castellii.J.Ferment.Bioeng.74，7-11)的植酸酶。Arrhenius表示法能够计算反应的活化能，E＝37.9kJ/mol。热变性研究表明，重组植酸酶对于低于+67℃的温度是稳定的，在高于+70℃时强烈变性。根据Arrhenius表示法计算的活化能为E＝794.2kJ/mol。D.castelliiCBS 2923植酸酶表现类似的耐热性特征。

底物特异性

重组植酸酶遵循Michaelis-Menten动力学，对植酸钠具有0.24mM的K_m和137.8U/mg的V_m，对p-NPP具有2.05mM的K_m和274.6U/mg的V_m(根据Lineweaver-Burk表示法确定；未发表数据)。因此该酶对植酸盐具有较高的亲和性。D.castellii CBS 2923植酸酶具有类似的K_m值。动力学研究

InsP6降解的主要产物为DL-Ins(1、2、4、5、6)P₅和DL-Ins(1、2、5、6)P₄。因此该重组植酸酶为3-植酸酶。此外，层析显示，InsP₅，InsP₄，InsP₃和InsP₂的降解甚至在InsP₆耗尽前开始，并有InsP₃的积累。这说明重组植酸酶对InsP₃有比对InsP₄、InsP₅和InsP₆更弱的亲和性。D.castellii CBS 2923植酸酶显示相同的层析特性。

序列表

<110>安迪苏法国联合股份有限公司

<120>Debaryomyces castellii植酸酶

<130>HL/SG/EP-49825

<150>FR05.07336

<151>2005-08-07

<160>18

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>2973

<212>DNA

<213>Debaryomyces castellii

<220>

<221>misc_feature

<222>(782)..(782)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

<221>CDS

<222>(1538)..(2923)

<400>1

aagattgtgt tagataataa gaagcaaacc cttgatgatt tttttggaaa aaaggatttt 60

gctcttatag aaagggccgc tgctgttgat aaagaaggtt ctacagaacc tgagattata 120

aatgatgctt ctaaggaaaa atcagcaagt ccgtcagata gcagaatttc tcgatcagaa 180

attgaaaaca tgaattctaa cgaagaaaat ctctcgcttt taggtaagaa gcgcttaagc 240

gcaaaggaaa gaagattgtt aagaaagaat aaaaagaatg actctgctgc tcaaagtgat 300

gatgatgatg atgtgttaga tccaattaaa caacagttgc aaaaattaaa acttcaagaa 360

agtaaggcta ctgaaaaaga agctcctaac cagaaaccac ctaatgttag aggtaaaaaa 420

gccaagctta agaagattgc agctaagtat gcagatcaaa cagaggaaga aagaagattg 480

agaatggaag cattgggaac tttgaagcaa gttgaacagg aaaagcaaaa tcaattgcaa 540

aatgatcata agaatgagct caacaatgaa aaggcacaaa tgaatcttga aaagaaaaag 600

aaacaggaag aaagagaata ccgtaaatat atcatggatg aagtagacga gtcggaatca 660

tccttgacaa attacttaga aatacttgat tccttcattt caaagccgca gccatctgat 720

gtgctttctc atccaatcgc ggtgtttgca ccgtggtcct ctctccaaaa attcaaatat 780

atggtcaaaa tccacccggg ttcaggaaag aagggtaaat gcatcaacga cactcttaac 840

tacttcacta ctcggaaatt ggatgagctg cgttctgata ccgatttgga ctggctgcat 900

gaaagagata tgcttaagcg cataaagccc aacgatctta tgggggtgtt taccgttagc 960

aaagttaaat tagtgctacc aggtggcctg gagtcaaaca aagctctggg tgcgaataag 1020

aaggcgactg gctccaaaag gaaaaagtga ttaacgcccc aatcggacct ttgttttatg 1080

tacaattaat tagtttaatt agttcgtatt tgcattgatt tactctttct ctagaatatg 1140

acctgatagg acactacata ccattcttaa taatagatac atatcccgga ctaatatgtt 1200

ttgtgtcaaa ttaggaaatc ctctgtcaaa tctgtctaat aacaatgtaa attagtgaga 1260

ctaattacat tatctacagc acgtgtatca ctactttaag ctttgaccct tgtgacctaa 1320

aggattcttt tacacgtgtg tggaagcagc agaactattg gacacagacg aaagtgtgct 1380

tcttcatcga tcaatataga atgcataata agcgaattgt ttttgagtcc caaaaaagca 1440

gagaactgtt atgaatatgg ttgtgaaaag tataaaagac aaagaagtcc tcgaattgct 1500

atggatagat tcataagtat caaagtaaat agtcaat atg gtc tca gtc tca aag 1555

Met Val Ser Val Ser Lys

1 5

tta att aac aat ggt tta ttg ttg gta ggt caa ggt gcc tac caa gat 1603

Leu Ile Asn Asn Gly Leu Leu Leu Val Gly Gln Gly Ala Tyr Gln Asp

10 15 20

ttg gct tcc cca caa caa gcg tcc gtc gag caa tat aac atc atc aga 1651

Leu Ala Ser Pro Gln Gln Ala Ser Val Glu Gln Tyr Asn Ile Ile Arg

25 30 35

ttc tta gga gga gct gct cca tat atc caa aac aaa ggg ttc ggt atc 1699

Phe Leu Gly Gly Ala Ala Pro Tyr Ile Gln Asn Lys Gly Phe Gly Ile

40 45 50

tct act gat atc cca gat caa tgt act ctt gag caa gtc caa ttg ttc 1747

Ser Thr Asp Ile Pro Asp Gln Cys Thr Leu Glu Gln Val Gln Leu Phe

55 60 65 70

agc aga cat ggt gaa aga tac cca tcc act ggc tcc gga aag aaa tat 1795

Ser Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr Gly Ser Gly Lys Lys Tyr

75 80 85

aag gct gta tat gaa aag ttg atg tca tac aac ggt act ttc aag gga 1843

Lys Ala Val Tyr Glu Lys Leu Met Ser Tyr Asn Gly Thr Phe Lys Gly

90 95 100

gaa ttg gct ttc ctc aat gac gat tat gaa tat ttt gtt cct gac tca 1891

Glu Leu Ala Phe Leu Asn Asp Asp Tyr Glu Tyr Phe Val Pro Asp Ser

105 110 115

gtg tat ctt gaa aag gaa aca tca cca aag aat tct gac agt atc tac 1939

Val Tyr Leu Glu Lys Glu Thr Ser Pro Lys Asn Ser Asp Ser Ile Tyr

120 125 130

gct ggt acc act gat gcc atg aag cat ggt atc gcc ttt aga acc aag 1987

Ala Gly Thr Thr Asp Ala Met Lys His Gly Ile Ala Phe Arg Thr Lys

135 140 145 150

tac ggt gaa ttg ttc gat act aat gac act ctt cca gtt ttc act tcc 2035

Tyr Gly Glu Leu Phe Asp Thr Asn Asp Thr Leu Pro Val Phe Thr Ser

155 160 165

aat tct ggt aga gta tat caa acc tct caa tac ttt gca aga ggt ttt 2083

Asn Ser Gly Arg Val Tyr Gln Thr Ser Gln Tyr Phe Ala Arg Gly Phe

170 175 180

atg gga gat gat ttc agt aac gat acc gtc aaa acc aat att atc tct 2131

Met Gly Asp Asp Phe Ser Asn Asp Thr Val Lys Thr Asn Ile Ile Ser

185 190 195

gaa gac gct gat atg ggt gcc aac tca tta aca cca aga gat ggt tgt 2179

Glu Asp Ala Asp Met Gly Ala Asn Ser Leu Thr Pro Arg Asp Gly Cys

200 205 210

ttc aac tac aat gaa aat gct aac act gct att gtt gat gaa tac act 2227

Phe Asn Tyr Asn Glu Asn Ala Asn Thr Ala Ile Val Asp Glu Tyr Thr

215 220 225 230

act gaa tat tta act aaa gct ctt aac aga ttt aaa gct tct aat cct 2275

Thr Glu Tyr Leu Thr Lys Ala Leu Asn Arg Phe Lys Ala Ser Asn Pro

235 240 245

ggt ttg aac att act gaa gat gat gtt tct aat ctt ttt gga tac tgt 2323

Gly Leu Asn Ile Thr Glu Asp Asp Val Ser Asn Leu Phe Gly Tyr Cys

250 255 260

gct tat gaa tta aat gtt aaa gga gct tct cca atg tgt gat atc ttt 2371

Ala Tyr Glu Leu Asn Val Lys Gly Ala Ser Pro Met Cys Asp Ile Phe

265 270 275

act aat gaa gag ttc att caa tac tct tac agt gtt gat ctt gat gac 2419

Thr Asn Glu Glu Phe Ile Gln Tyr Ser Tyr Ser Val Asp Leu Asp Asp

280 285 290

tat tac tcc aac agt gca ggt aat aat atg act aga gtc atc ggt tca 2467

Tyr Tyr Ser Asn Ser Ala Gly Asn Asn Met Thr Arg Val Ile Gly Ser

295 300 305 310

aca tta tta aac gca tcc ttg gaa tta tta aac cat gac aaa aat gag 2515

Thr Leu Leu Asn Ala Ser Leu Glu Leu Leu Asn His Asp Lys Asn Glu

315 320 325

aat aag att tgg tta tct ttc act cac gat act gat att gaa att ttt 2563

Asn Lys Ile Trp Leu Ser Phe Thr His Asp Thr Asp Ile Glu Ile Phe

330 335 340

cat tct gct att ggt att ctt atc cct gat gaa gat tta cca gtt gat 2611

His Ser Ala Ile Gly Ile Leu Ile Pro Asp Glu Asp Leu Pro Val Asp

345 350 355

tac act cca ttc cca tct cct tat tct cac gtt gga att act cct caa 2659

Tyr Thr Pro Phe Pro Ser Pro Tyr Ser His Val Gly Ile Thr Pro Gln

360 365 370

ggt gct aga act att att gaa aag tac gcg tgt ggt aat gaa tct tat 2707

Gly Ala Arg ThrIle Ile Glu Lys Tyr Ala Cys Gly Asn Glu Ser Tyr

375 380 385 390

gtt aga tat gtt atc aat gat gct gtt att cca att aag aag tgt agc 2755

Val Arg Tyr Val Ile Asn Asp Ala Val Ile Pro Ile Lys Lys Cys Ser

395 400 405

tct ggt cct ggt ttc tca tgt aat ctt aat gat tat aat gat tat gtt 2803

Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Asn Leu Asn Asp Tyr Asn Asp Tyr Val

410 415 420

gct gaa aga gtt gca ggt acc aac tat gtt gaa caa tgt ggt aat aac 2851

Ala Glu Arg Val Ala Gly Thr Asn Tyr Val Glu Gln Cys Gly Asn Asn

425 430 435

aat gct tca gct gtt aca ttc tac tgg gat tac gaa act act aac tac 2899

Asn Ala Ser Ala Val Thr Phe Tyr Trp Asp Tyr Glu Thr Thr Asn Tyr

440 445 450

acc gct tcc ctt atc aac agt taa aatttttctt tcttttactt tcttcttcaa 2953

Thr Ala Ser Leu Ile Asn Ser

455 460

aacaagtttc tatttctttt 2973

<210>2

<211>461

<212>PRT

<213>Debaryomyces castellii

<400>2

Met Val Ser Val Ser Lys Leu Ile Asn Asn Gly Leu Leu Leu Val Gly

1 5 10 15

Gln Gly Ala Tyr Gln Asp Leu Ala Ser Pro Gln Gln Ala Ser Val Glu

20 25 30

Gln Tyr Asn Ile Ile Arg Phe Leu Gly Gly Ala Ala Pro Tyr Ile Gln

35 40 45

Asn Lys Gly Phe Gly Ile Ser Thr Asp Ile Pro Asp Gln Cys Thr Leu

50 55 60

Glu Gln Val Gln Leu Phe Ser Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr

65 70 75 80

Gly Ser Gly Lys Lys Tyr Lys Ala Val Tyr Glu Lys Leu Met Ser Tyr

85 90 95

Asn Gly Thr Phe Lys Gly Glu Leu Ala Phe Leu Asn Asp Asp Tyr Glu

100 105 110

Tyr Phe Val Pro Asp Ser Val Tyr Leu Glu Lys Glu Thr Ser Pro Lys

115 120 125

Asn Ser Asp Ser Ile Tyr Ala Gly Thr Thr Asp Ala Met Lys His Gly

130 135 140

Ile Ala Phe Arg Thr Lys Tyr Gly Glu Leu Phe Asp Thr Asn Asp Thr

145 150 155 160

Leu Pro Val Phe Thr Ser Asn Ser Gly Arg Val Tyr Gln Thr Ser Gln

165 170 175

Tyr Phe Ala Arg Gly Phe Met Gly Asp Asp Phe Ser Asn Asp Thr Val

180 185 190

Lys Thr Asn Ile Ile Ser Glu Asp Ala Asp Met Gly Ala Asn Ser Leu

195 200 205

Thr Pro Arg Asp Gly Cys Phe Asn Tyr Asn Glu Asn Ala Asn Thr Ala

210 215 220

Ile Val Asp Glu Tyr Thr Thr Glu Tyr Leu Thr Lys Ala Leu Asn Arg

225 230 235 240

Phe Lys Ala Ser Asn Pro Gly Leu Asn Ile Thr Glu Asp Asp Val Ser

245 250 255

Asn Leu Phe Gly Tyr Cys Ala Tyr Glu Leu Asn Val Lys Gly Ala Ser

260 265 270

Pro Met Cys Asp Ile Phe Thr Asn Glu Glu Phe Ile Gln Tyr Ser Tyr

275 280 285

Ser Val Asp Leu Asp Asp Tyr Tyr Ser Asn Ser Ala Gly Asn Asn Met

290 295 300

Thr Arg Val Ile Gly Ser Thr Leu Leu Asn Ala Ser Leu Glu Leu Leu

305 310 315 320

Asn His Asp Lys Asn Glu Asn Lys Ile Trp Leu Ser Phe Thr His Asp

Thr Asp Ile Glu Ile Phe His Ser Ala Ile Gly Ile Leu Ile Pro Asp

340 345 350

Glu Asp Leu Pro Val Asp Tyr Thr Pro Phe Pro Ser Pro Tyr Ser His

355 360 365

Val Gly Ile Thr Pro Gln Gly Ala Arg Thr Ile Ile Glu Lys Tyr Ala

370 375 380

Cys Gly Asn Glu Ser Tyr Val Arg Tyr Val Ile Asn Asp Ala Val Ile

385 390 395 400

Pro Ile Lys Lys Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Asn Leu Asn

405 410 415

Asp Tyr Asn Asp Tyr Val Ala Glu Arg Val Ala Gly Thr Asn Tyr Val

420 425 430

Glu Gln Cys Gly Asn Asn Asn Ala Ser Ala Val Thr Phe Tyr Trp Asp

435 440 445

Tyr Glu Thr Thr Asn Tyr Thr Ala Ser Leu Ile Asn Ser

450 455 460

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>Xaa可以被任何天然存在的氨基酸取代

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa可以被任何天然存在的氨基酸取代

<400>3

Arg His Gly Xaa Arg Xaa Pro

1 5

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>Debaryomyces castellii

<400>4

Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro

1 5

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce Phyt-Nter-for

<400>5

tcaarttrat haayaaygg 19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce Phyt-pep1-rev

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>n is a，c，g，or t

<400>6

ggnacraart aytcrtartc 20

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce AP1

<400>7

gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce AP2

<400>8

actatagggc acgcgtggt 19

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce 5phyt-spe-1

<400>9

tatggagcag ctcctcctaa gaatctg 27

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce 5phyt-spe-2

<400>10

atgatgttat attgctcgac ggacgcttg 29

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce 3phyt-spe-1

<400>11

tatggagcag ctcctcctaa gaatctg 27

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce 3phyt-spe-2

<400>12

ctggctccgg aaagaaatat aaggctgta 29

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce 3bisphyt-spe-1

<400>13

gaagtgtagctctggtcctg gtttctcatg 30

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce 3bisphyt-spe-2

<400>14

atgttgctga aagagttgca ggtaccaact 30

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce phytDC-PstI-for

<400>15

gcactgcagt ctcagtctca aagttaatta ac 32

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Amorce phytDC-XbaI-rev

<400>16

agttctagat taactgttga taagggaagc ggt 33

<210>17

<211>7

<212>PRT

<213>Debaryomyces castellii

<400>17

Ser Lys Leu Ile Asn Asn Gly

1 5

<210>18

<211>7

<212>PRT

<213>Debaryomyces castellii

<400>18

Pro Val Phe Tyr Glu Tyr Asp

1 5

Claims

1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码植酸酶的多核苷酸，其特征在于，其序列为SEQ ID No.1的第1538位至第2923位核苷酸所示的序列。

3.多核苷酸，其特征在于，其序列为SEQ ID No.1所示序列或与SEQ ID No.1互补的序列。

4.表达盒，其特征在于在转录方向上包含：

-启动子，其在宿主生物内具有功能；

-根据权利要求2的多核苷酸；及

-在相同的宿主生物中的终止子序列。

5.载体，其包含根据权利要求2和3任一项中的多核苷酸和/或根据权利要求4的表达盒。

6.用根据权利要求2和3任一项中的多核苷酸和/或根据权利要求4的表达盒和/或根据权利要求5的载体转化的宿主生物，该宿主生物选自细菌或真菌。

7.用根据权利要求2或3所述的多核苷酸和/或根据权利要求4所述的表达盒和/或根据权利要求5所述的载体转化的宿主生物，该宿主生物选自酵母和丝状真菌。

8.根据权利要求7的宿主生物，其特征在于所述宿主生物选自巴斯德毕赤酵母、绳状青霉和粟酒裂殖酵母。

9.动物用营养添加剂，其特征在于其包含根据权利要求6-8中任一项的宿主生物和/或根据权利要求6-8中任一项的宿主生物的发酵汁。

10.根据权利要求9的动物用营养添加剂，其特征在于其为液体形式或粉末形式。

11.动物饲料，其特征在于包含动物用营养基础和根据权利要求9的动物用营养添加剂。

12.动物饲料，其特征在于包含根据权利要求1的多肽、根据权利要求6-8中任一项的宿主生物和/或根据权利要求6-8中任一项的宿主生物的发酵汁。

13.根据权利要求6-8中任一项的宿主生物在制备动物用营养添加剂和动物饲料中的用途。

14.根据权利要求6-8中任一项的宿主生物在将肌醇六磷酸水解为无机单磷酸、具有较低级磷酸化水平的肌醇以及游离肌醇中的用途。