CN102209785A - 一种耐热非-k12大肠杆菌植酸酶及其生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来源于非-K12大肠杆菌Escherichia coli strain ATCC 9637耐热植酸酶基因的克隆和测序，植酸酶基因在大肠杆菌中的表达，密码子优化及其在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)、甲醇酵母(Pichia methanolica)和克鲁维乳酸酵母(Kluyeromyces lactis)中的表达。使用经过密码子优化后的植酸酶基因，通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)发酵，可获得高产率的耐热植酸酶。

Description

一种耐热非-K12大肠杆菌植酸酶及其生产
技术领域
本发明涉及分子生物学、生物化学、及植酸酶的发酵和后加工等领域。更确切的说，本发明涉及一种新的非-K12大肠杆菌基因编码的耐热植酸酶的克隆和表达。
技术背景
植酸酶(肌型肌醇-六磷酸盐磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)是一种能够将植酸(肌型肌醇-六磷酸盐)水解为肌醇和无机磷的酶。众所周知植酸酶是很有价值的饲料添加剂。20世纪末，植酸酶作为动物饲料添加剂的年销售额估计超过一亿五千万美元，并且还在逐步增加。
目前，禽、猪日粮以谷类、豆类和油籽产品为主。这些饲料中所含有的磷约有三分之二以植酸和植酸盐的形式存在。植物中的植酸磷是钙-镁-钾植酸盐的混合物，其以螯合物的形式存在，溶解度很低。这种形式的磷很难被人、猪、禽等单胃动物所消化。
使用植酸酶水解植酸中键合磷基团的酯键，可以提高植酸磷以及结合在植酸复合物中的矿物质和微量元素的利用率。植酸酶是一种特殊的磷酸酶，其能够水解植酸成为一系列肌醇和磷酸盐的低磷酸酯。已知的植酸酶有两种类型：3-植酸酶和6-植酸酶，以其首先易于攻击的磷酸酯键的位置作为区别。虽然单胃动物缺乏能有效利用植酸磷的足够的植酸酶，但是很多真菌、细菌和酵母能生产植酸酶，并可用于对动物口粮进行补充。
补充植酸酶能够有效提高磷消化率，这已经在动物实验中得到了很好的证明(Mroz et al.，1994；Kornegay et al.，1996；Rao et al.，1999；Ravindran et al.，1999)。所使用的酶的功效，不仅取决于酶的类型、反应速率和存在的酶活力水平，还取决于酶在通过胃肠道时所遇到的不同环境中，以及在食品或饲料制剂预处理时所采用的条件下保持其活性的能力。
虽然有众多的植酸酶可用于添加剂，但是很多酶都存在一定的缺陷。例如，许多目前使用的植酸酶在饲料造粒过程中由于热处理会丧失其活性。另外，许多目前使用的植酸酶对动物消化系统中的胃蛋白酶和胰蛋白酶等没有足够的抗性。
因此，迫切需要可用于动物饲料和食品加工的优良性质的植酸酶产品。
发明概述
一方面，本发明提供一个分离的核酸分子，其包含一个选自以下组中的核酸序列：
a)一个核酸序列所编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
b)一个在严格的杂交条件下与a)中的序列所杂交的核酸序列，其所述核酸序列编码有非-K12大肠杆菌植酸酶活性的多肽；或
c)一个与a)或b)中的序列互补的核酸序列；
在本发明的一个实施例中，所分离的核酸分子含有一个选自以下组中的核酸序列：
a)一个核酸序列，其组成核苷酸67-1296如SEQ ID NO：1所示；
b)一个核酸序列，其组成核苷酸1-1230如SEQ ID NO：2所示；
c)一个如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
d)一个在严格条件下与a)到c)中任一个所杂交的核酸序列，其编码有非-K12大肠杆菌植酸酶活性的多肽；或
e)一个与a)到d)中任一个所互补的核酸序列。
另一方面，本发明提供一个载体，其包含本发明所分离的核酸分子，优选的，所述的载体是一个表达载体。例如，所述载体可以选自下组中：pTrcHis2-PhE，pPIC9K-PhE，pMET-PhE和pKLAC-PhE。
另一方面，本发明提供一个分离的细胞，其包含本发明中所述的分离的核酸分子，优选的，所述的分离的核酸分子是一个组成的表达载体。优选的，所述的细胞是酵母细胞。例如，所述的细胞可以选择大肠杆菌(Escherichia coli.)，毕氏酵母(Pichia pastoris)，甲醇酵母(Pichia methanolica)和克鲁维乳酸酵母(Kluyeromyces lactis)。更具体的说，所述细胞可以选择E.coli MG1655，P.pastoris GS115，P.methanolica PMAD16和Kluyeromyces lactis GG799。在本发明的一个实施例中，所选择的细胞包括：转化有重组质粒pTrcHis2-PhE的E.coli MG1655，转化有重组质粒pPIC9K-PhE的P.pastoris SMD1168，转化有重组质粒pMET-PhE的P.methanolica PMD16和转化有重组质粒pKLAC-PhE的Kluyeromyces lactis GG799。
另一方面，本发明提供一个多肽，其包含一个选自以下组中的氨基酸序列：
a)一个如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或
b)一个与SEQ ID NO：3的相似性不低于99％的氨基酸序列；其所述的多肽有非-K12大肠杆菌植酸酶活性。
另一方面，本发明提供通过发酵生产非-K12大肠杆菌植酸酶的工艺，其包括在适当的条件下培养含有本发明所分离的核酸分子的细胞，使其有效表达从而获得有非-K12大肠杆菌植酸酶活性的多肽。优选的，所述的细胞可选自下组中：转化有重组质粒pTrcHis2-PhE的E.coli MG1655，转化有重组质粒pPIC9K-PhE的P.pastoris SMD1168，转化有重组质粒pMET-PhE的P.methanolica PMD16和转化有重组质粒pKLAC-PhE的Kluyeromyces lactis GG799。
附图说明
图1来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC 9637菌株的编码非-K12大肠杆菌植酸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和本发明的一个实施例中的编码蛋白质的氨基酸序列。划线部分所示为信号肽，该核苷酸序列第67-1296位的核苷酸编码成熟蛋白质。用“*”所标示的为终止子TAA。
图2本发明的另一个实施例中编码非-K12植酸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，其密码子已经过优化，适合在酵母系统中进行基因表达。该核苷酸序列的第1-1230位的核苷酸编码成熟蛋白质。用“*”所标示的为终止子TAA。
图3本发明的实施例中所使用的用于克隆核酸分子的引物序列。
图4本发明的非-K12植酸酶与其它两个已知的植酸酶氨基酸序列的比较。
图5本发明的几个实施例中所构建的重组表达质粒的构建图。在质粒pTrcHis2-PhE中插入如SEQ ID NO：1所示的“植酸酶”序列，而质粒pPIC9k-PhE，pMET-PhE和pKLAC-PhE则插入如SEQ ID NO：2所示的“植酸酶”序列。
图6重组非K-12植酸酶的最适反应pH。
图7重组非K-12植酸酶的最适反应温度。
图8发酵过程中不同时间点重组非-K12植酸酶的酶活力。
图9发酵过程中不同时间点重组非-K12植酸酶产物样品的SDS-PAGE。
图10重组非-K12植酸酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性。
图11本发明的一个实施例中毕氏酵母(Pichia pastoris)所分泌的重组非-K12植酸酶的分子量。
图12本发明的一个实施例中所表达的重组非-K12植酸酶的pH耐受性。
图13本发明的一个实施例中所表达的重组非-K12植酸酶的热稳定性。
图14本发明中干燥制剂的重组非-K12植酸酶的热稳定性。
图15本发明的非-K12植酸酶与其它K12大肠杆菌植酸酶和来源于真菌黑曲霉(Aspergillus niger)的植酸酶热稳定性的比较。
图16本发明的非-K12植酸酶与其它K12大肠杆菌植酸酶和来源于真菌黑曲霉(Aspergillus niger)的植酸酶pH耐受性的比较。
发明详述
在本文稿中使用了大量的词组和缩写。除非特别申明，否则均应用以下的定义。
这里所使用的词组“含有”意思是存在一定的特征、数组、步骤或组成，其是在权利要求中所提及的，但是那并不排除会存在或增加一个或多个其它特征、数组、步骤、组成或群组。
词组“耐热的”表示即使暴露在给定的温度下，酶仍然能够保持其活性。
这里所使用的词组“pTrcHis2-PhE”是指质粒pTrcHis2(Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该核酸受LacO启动子和一个pBR322功能区的调控，并使用bla(Apm)基因进行DNA复制和转化的筛选，见图5所示。
这里所使用的词组“pPIC9K-PhE”是指质粒pPIC9K(Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)含有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其定位见图5所示。
这里所使用的词组“pMET-PhE”是指质粒pMETalphaA(Novagen，Inc.)含有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其定位见图5所示。
这里所使用的词组“pKLAC-PhE”是指质粒pKLAC(New England Biolabs，Inc.)含有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其定位见图5所示。
这里所使用的“分离的核酸片段”或“分离的多聚核苷酸”是一个RNA或DNA多聚体，其可以是单链或双链，可选择地含有人工合成的、非天然的、或已改变的核苷酸碱基。分离的核苷酸片段是包括一个或多个cDNA片段、基因组DNA、或人工合成DNA在内的DNA多聚体的一种形式。
“密码子简并性”是指在不影响其所编码多肽的氨基酸序列的条件下，基因编码允许核苷酸序列发生变异的性质。相应地，本发明涉及任何编码所有或大部分如图1和图2中所示的微生物多肽的氨基酸序列的核酸片段。本领域中熟练的技术人员都很清楚对于具体的宿主细胞所表现出的“密码子偏倚性”，并能对于具体的给定的氨基酸使用适当的核苷酸密码子。因此，为了提高合成基因在宿主细胞中的表达水平，需要对基因进行设计，使其密码子使用频率接近宿主细胞优选使用的密码子频率。
词组“序列分析软件”是指任何可用于分析核苷酸或氨基酸序列的计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以是市售的或是自行研制的。通常的序列分析软件将包括但不局限于GCG程序组件(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wis.)，BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)，和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228 S.Park St.Madison，Wis.53715 USA)，以及融合了史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111 20.Editor(s)：Suhai，Sandor.Publisher：Plenum，New York，N.Y.)的FASTA程序。词组“MEME”是指一个用于鉴定保守性的软件程序，其诊断程序的主旨基于隐马尔可夫模型(hidden Markov model)(Timothy L.Bailey and Charles Elkan，Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers，Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology，pp.28-36，AAAI Press，Menlo Park，Calif.(1994))。“MAST”(Timothy L.Bailey and Michael Gribskov，″Combining evidence using p-values：application to sequence homology searches″Bioinformatics，Vol.14，pp.48-54(1998))是一种从MEME程序中获取输出的程序，并从EMBL和SwissProt等蛋白质数据库搜寻鉴定相关的主题。在其应用范围内，都可使用序列分析软件进行分析，并且分析结果将以程序参考的“缺省值”为依据，除非另有指定。这里的“缺省值”意思是当第一次初始化时原本软件所附带的任何可设定的值或参数集。
这里所使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域的技术人员所熟知的，并且已经公开发表的，例如，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.等所著的《分子克隆：实验手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)(hereinafter″Maniatis″))，Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.and Enquist，L.W.等所著的《基因融合实验技术》(Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor，N.Y.(1984)(hereinafter ″Silhavy″))，以及Ausubel，F.M.等所著的《分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)(hereinafter″Ausubel″).)。
本发明提供一个从大肠杆菌Escherichia coli ATCC 9637(American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)中分离得到的多聚核苷酸，和一个人工合成的编码所述多肽的核苷酸序列。分离的多肽是非-K12大肠杆菌植酸酶。表达所得到的植酸酶能水解植酸成为相应的肌醇和无机磷。本发明亦提供转化微生物宿主细胞表达该多肽的方法。本发明还提供，使用该转化微生物生产多肽催化剂的方法，以及用该催化剂转化植酸成为肌醇和无机磷的方法。
在本发明的所有内容中，词组“非-K12大肠杆菌植酸酶”，“非-K12植酸酶”和“耐热植酸酶”可替换使用，均是指一种耐热植酸酶，其在80℃的温度下1小时仍能保留至少17％的植酸酶活性；优选的，在90℃的温度下1小时仍能保留至少33％的植酸酶活性；更优选的，在100℃的温度下1小时仍能保留至少26％的植酸酶活性；并且其对动物消化系统中的酸性环境和蛋白酶也有很好的稳定性。
在一个实施例中，本发明提供一种制备耐热植酸酶的方法。该方法包括在微生物宿主细胞中进行表达，其所使用的表达机构含有连接在编码耐热植酸酶核苷酸分子上的启动子。微生物宿主细胞可以是原核生物细胞，如细菌细胞(例如大肠杆菌、芽孢杆菌等)；也可以是真核生物细胞，如酵母细胞(例如酿酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、或克鲁维乳酸酵母等)。在一个优选的实施例中，用来制备重组耐热植酸酶的微生物细胞其所产生的植酸酶以糖基化的形式存在。
本发明提供编码耐热植酸酶的核酸分子的克隆和序列测定方法，该核酸分子含有1296个核苷酸，其编码含有432个氨基酸的蛋白质，包括一个有22个氨基酸的信号肽。序列比对(图4，其中的“W-植酸酶”是指本发明的非-K12植酸酶)的结果表明本发明提供了一种新的植酸酶多肽。
优选的，编码耐热植酸酶的多聚核苷酸(第一个多聚核苷酸)被操作性的与至少一个调控序列相连接，如启动子、增强子、终止序列、或任何组合物，编码信号肽序列的第二个多聚核苷酸指引第一个核苷酸序列所编码的植酸酶到特定的细胞位置如定位到细胞外。启动子可以是构成型的启动子或诱导型的启动子。
母本多聚核苷酸可以从任何来源中获取，包括细菌或真菌核酸，并且本发明可采用多种方法从所选择的母本多聚核苷酸中制备人工合成的多聚核苷酸，例如组合诱变、循环诱变和/或DNA修饰。
在一个实施例中，本发明提供在严格的杂交条件下，与指定的序列(如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)杂交的核酸序列。“严格的杂交条件”可以是如先前在相关文献(例如Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition(1989)，Sambrook et al，.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.).)中所描述的一个常规条件，例如，一个严格的杂交条件为0.1×SSC，0.1％SDS，65。其它典型的杂交条件还包括(1)高度严格：0.1×SSPE，0.1％SDS，65；(2)中度严格：0.2×SSPE，0.1％SDS，50；(3)低度严格：1.0×SSPE，0.1％SDS，50。明显地，使用替代性的缓冲液、盐和温度可是达到等同的严格度。
因此，在本发明的一个实施例中，耐热植酸酶对于相应的植酸酶(文献)有一个或多个氨基酸替换，这些替换与在温度等于或高于60℃下酶活性保持力相关联。优选的，该耐热植酸酶在80℃的温度下1小时仍能保留至少17％的植酸酶活性；更优选的，其在90℃的温度下1小时仍能保留至少33％的植酸酶活性；最优选的，其在100℃的温度下1小时仍能保留至少26％的植酸酶活性。本发明的一个典型的耐热植酸酶为非-K12大肠杆菌植酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示(图1)。
在一个实施例中，本发明还提供一个多肽，其含有一个与SEQ ID NO：3存在一定相似性的氨基酸序列，其所述的多肽具有非-K12大肠杆菌植酸酶活性。词组“相似性”在本发明中与多肽关联使用时，其定义为候选序列与目标序列(如SEQ ID NO：3)中相同的氨基酸残基的百分比，即候选序列与目标序列进行比对后，所达到的最大的相似性百分比。氨基酸相似性可通过许多已知的方法进行测定，如Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.48：443-453(1970))序列比对法，或使用商品化地程序。因此许多序列相似性水平被用于标识相关联的多肽序列。在本发明的考虑范围内，所使用的相似性包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、90％、95％、99％或100％，也包括介于它们之间的值。
本发明还提供，含有本发明的表达结构或多聚核苷酸的质粒，和含有本发明的多聚核苷酸、表达结构或质粒的转化微生物细胞。本发明的质粒可编码不止一个包括不止一个耐热植酸酶的多肽，或编码一个含有本发明耐热植酸酶的融合多肽，并且转化的微生物细胞可含有不止一个本发明的质粒。本发明的转化的微生物细胞用于生产本发明的重组耐热植酸酶。由此，本发明提供从本发明转化的微生物细胞中分离的耐热植酸酶，以及人工合成制备的植酸酶。
另外，本发明提供通过一个含有非-K12大肠杆菌植酸酶基因的酵母菌株发酵制备耐热植酸酶的方法。采用所提供的用于生产植酸酶的发酵工艺，蛋白质的产量可达到2.7g/L。由此所制备的植酸酶，估计有部分糖基化，其在SDS-PAGE上所表现出的分子量为52kDa(实施例7)。本发明的植酸酶的最适pH范围为pH2-7.5，优选pH3-6。
另外，本发明的植酸酶有能力抵抗在工业造粒机中进行饲料造粒时所遇到的高温环境。本发明还提供动物饲料的加工方法，例如加工硬粒状地饲料颗粒应使用耐热植酸酶。进行饲料加工，先将粉状的植酸酶与饲料组分进行混合，在制粒机中有混合蒸汽的条件下预热处理后(至少可保留60％的酶活力)，将饲料挤压通过一个颗粒染色装置。该植酸酶本身可作为动物饲料添加剂使用，此外也可与维生素、矿物质、其它饲用酶制剂、农副产品(例如小麦麸或玉米麸粉)等联合使用。本发明的植酸酶也可添加到糊状食物中，例如没有进行造粒加工的食物。
由于目前可供使用的商品植酸酶都不耐热，所用其经常在造粒后应用，通常将植酸酶溶液喷涂到饲料颗粒表面。喷涂法存在以下的一些问题：仅有一小部分的饲料颗粒与酶接触，酶仅存在与包被饲料颗粒的表面，并且饲料加工厂还需投资和操作一个复合型的喷涂设备。相比之下，本发明的耐热植酸酶，其比活力高达3146U/mg，可在造粒前加入，其改善了饲料中酶的分布，因此，可促进饲料生产。
微生物重组表达
基因和直接序列的基因产物可在同源宿主细胞中进行表达，特别是在微生物宿主细胞中。重组微生物宿主中的表达方法可用于表达各种途径的中间体；对于在宿主细胞中已经存在的调节途径，或对于人工合成的新产品，迄今为止还不能使用宿主。
优选的，用于表达直接的基因和核酸片段的同源宿主细胞为微生物宿主细胞，这种微生物宿主在真菌和细菌家族中广泛存在，其可在宽的温度、pH值范围下生长，并有强的溶剂耐受性。例如，以上所述范围内的任何细菌、酵母和丝状真菌都可作为适合的宿主表达本发明的核酸片段。由于转录、翻译和蛋白质的生物合成一样都与细胞原料无关，所以与碳原料用于生成细胞生物质无关的功能基因能够被表达。对于光合作用型和化学自养型宿主来说，大规模的微生物生长和功能基因表达可广泛利用简单的或复合的碳水化合物、有机酸和醇类，甲烷或二氧化碳等饱和烃。尽管如此，功能基因也会被特殊的生长条件所调控、抑制或减少，其所述的条件包括氮、磷、硫、氧、碳的形态和含量，或包括小的无机离子在内的任何微量元素。另外，通过存在或缺乏添加到培养基中地特殊的调节分子，也可实现对功能基因的调控，其所述的调节分子不是常规的营养源或能量源。
实例的宿主菌株包括，但不限于细菌、真菌或酵母，如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、啤酒酵母属(Saccharomyces)、毕氏酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动细菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤杆菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、黄杆菌红素(Flavobacterium)、噬胞菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奇异球菌属(Deinococcus)、大肠杆菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛生菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微球菌属(Methylomicrobium)、甲基胞囊菌属(Methylocystis)、甲基营养细菌属(Methylobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)、项圈藻属(Anabaena)、产硫酸杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、粘球菌属(Myxococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)。在一个实施例中，适合的宿主菌株从以下组中选取：曲霉属(Aspergillus)、酿酒酵母属(Saccharomyces)、毕氏酵母属(Pichia)、念珠酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansuela)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、大肠杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、集胞藻属(Synechocystis)和克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)。在另一个实施例中，适合的宿主菌株从以下组中选取：芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、大肠杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)和甲基单胞菌属(Methylomonas)。
可直接高效表达外源蛋白质的微生物表达系统和含有调控序列表达载体均为本领域中熟练的技术人员所共知。其中的任何一个都能用于构建嵌合型基因，以用于表达本发明的植酸酶。通过转换将这些嵌合型基因导入到适合的宿主细胞中，从而实现酶的高水平表达。
据此预计，例如，在恰当启动子的控制下，采用嵌合型基因编码细菌植酸酶，将有效提高植酸向磷酸盐和肌醇转化。慎重考虑其对同时在天然宿主细胞，以及同源宿主细胞中表达直接基因的益处。将已有的基因导入到天然宿主中将会导致所存在的植酸酶活力水平的变化。
可用于转化适当宿主细胞的载体或结构为本领域中熟练的技术人员所共知。典型的载体或结构包含相关基因的直接转录和翻译序列，选择性标记，以及允许自主复制或染色体整合的序列。适合的载体由一个控制转录起始的5’区基因和一个控制转录终止的3’区DNA片段所组成。最优选的为当两个控制区的来源都和与转化宿主细胞基因同源时，尽管，众所周知，这样的控制区不是必须来自于选作生产宿主的特定菌株的天然基因。
用于促进预定宿主细胞中即时开放式阅读框表达的起始控制区或启动子有很多，并为本领域中熟练的技术人员所熟悉。几乎任何能够促进这些基因表达的启动子，都适用于本发明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于酿酒酵母中的表达)，AOX1(用于毕氏酵母中的表达)，与lac、ara、tet、trp、IP.sub.L、IP.sub.R、T7、tac、和trc(用于大肠杆菌中的表达)，以及amy，apr，npr启动子和各种用于芽孢杆菌表达的噬菌体启动子。外加，脱氧木酮糖磷酸合成酶或甲醇脱氢酶操纵型启动子(Springer et al.，FEMS Microbiol Lett 160：119-124(1998))，进行聚羟链烷酸合成的启动子(Foellner et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.40：284-291(1993))，从甲基营养菌天然质粒中鉴定出来的启动子(EP 296484)，从甲烷氧化菌中鉴定出来的启动子(PCT/US03/33698)，以及与抗生素抗性相关联的启动子[e.g.，卡那霉素(Springer et al.，supra；Ueda et al.，Appl.Environ.Microbiol.57：924-926(1991))或四环素(U.S.Pat.No.4,824,786)]，均适用于表达现有编码序列，尤其是在C1代谢中。
同样，终止控制区也可源自优选的宿主所产生的各种基因。随意地，可以不必需一个终止位点，尽管最优选为含有终止位点。
操纵基因途径的方法为本领域中常规的及众所周知的方法。通过各种方法对特定途径中所选择的基因进行正调控或负调控。另外，通过基因打断和相似的方法，消除或净化竞争性途径。
一旦完成关键基因途径的鉴定和测序，可对具体的基因进行正调控以增加该途径的产量，例如，在如pBR322等多拷贝质粒上，增加可导入宿主细胞的目标基因的拷贝数。或者对目标基因进行修饰，以便其置于非原生启动子的调控之下。预期的途径操控在细胞周期的特定点，或在发酵过程中进行，使用调控型或诱导型启动子替换目标基因的原生启动子。同样地，在某些情况下，可对原生或内源性启动子进行改造，以提高基因表达水平。例如，可通过体内突变、缺失、和/或替换等方法改变内源性启动子(see，Kmiec，U.S.Pat.No.5,565,350；Zarling et al.，PCT/US93/03868)。
或者，在一个途径中，或一个可作为能量或碳源竞争汇的竞争性途径中，需要降低或消除某些基因的表达。已经开发出的基因负调控法可用于实现此目的。若已经知道何处的基因序列需要被打断，一个最有效的基因负调控方法是靶基因打断，即将外源DNA插入到该位置的结构基因中，从而中断转录。这能够通过创建的基因结构盒予以实现，其由被插入DNA(通常是一个基因标记)所组成，并且该被插入DNA的两端含有与需要被打断的基因部分有高度相似性的序列。将基因结构盒导入到宿主细胞，使得外源DNA通过细胞原生DNA复制机制插入到结构基因中(Hamilton et al.，J.Bacteriol.171：4617-4622(1989)；Balbas et al.，Gene 136：211-213(1993)；Gueldener et al.，Nucleic Acids Res.24：2519-2524(1996)；and Smith et al.，Methods Mol.Cell.Biol.5：270-277(1996))。
反义核酸技术是在目标基因序列已知条件下，实现基因负调控的另一个方法。为此，需从预期的基因上克隆一个核酸片段，并将其操作性连接到一个启动子上，从而使RNA的反义链能够被转录。然后将该构建子导入到宿主细胞，细胞中将产生RNA的反义链。反义RNA通过阻止编码插入蛋白质的mRNA的累积而抑制基因表达。本领域中熟练的技术人员均熟知与使用反义核酸技术以降低特定基因的表达相关联的特殊事项。例如，技术人员熟知需要使用不同的嵌合型基因，利用不同的调控组件，以获得适合的反义基因的表达水平。
虽然靶基因打断和反义核酸技术是序列已知时实现基因负调控的有效手段，但其它不依赖序列的低特异性方法也得到了开发。例如，可将细胞暴露在紫外线辐射下，接受一定剂量的辐射后，从中筛选预期的显型。化学试剂诱变也是一个获得传代突变体有效方法，通常使用的物质包括影响非复制性DNA的化合物如HNO2和NH2OH，以及影响复制性DNA的试剂如吖啶燃料，其对引起移码突变有显著效果。使用辐射或化学试剂构建突变型的具体方法在本领域中有充分的文献可作依据(例如，Thomas D.Brock.Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass.(在下文中″Brock″)，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)(在下文中″Deshpande″)。
另一个基因打断的非特异性方法是使用转座元件或转座子。转座子是随机插入到DNA中的基因元件，但随后能够根据序列进行检索来确定插入点所在的位置。体内和体外的转座方法都是已知的。两种方法都涉及使用一个与一个转座酶相结合的转座元件。在转座酶存在的情况下，当转座元件或转座子与一个核酸片段接触时，转座元件将随机插入到该核酸片段中。该技术可用于随机突变和基因分离，因为可根据转座元件的序列对打断基因进行鉴定。用于进行体外转座的试剂盒为市售的产品(例如，The Primer Island Transposition Kit，订购于Perkin Elmer Applied Biosystems，Branchburg，N.J.，基于酵母Ty1转座元件；The Genome Priming System，订购于New England Biolabs，Beverly，Mass.，基于细菌转座子Tn7；和EZ::TN Transposon Insertion Systems，订购于Epicentre Technologies，Madison，Wis.，基于Tn5细菌转座元件。)。
生物催化转化植酸为磷酸盐和肌醇
通过将肌醇六磷酸与适当植酸酶的水悬液相混合，制备含有植酸的水相反应混合物。通过测定5.0mmol/L植酸底物(植酸钠)溶液中，植酸转化为期望的磷酸盐和肌醇产物的转化率，以确定植酸酶的比活力(U/mg酶，“U/mg”)。植酸酶活性测定是依据在700nm下，使用钼酸铵作为显色剂，比色定量通过植酸水解所释放出的游离磷。在测试条件下(pH5.0，37℃，植酸钠底物浓度0.005mol/L)，每分钟释放1umol无机正磷酸盐所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
水解反应的温度选择反应速率和植酸酶稳定性均最佳时的温度。反应温度可在从反应混合物的凝固温度(大约0℃)至65℃的范围内进行调整，一个优选的反应温度范围为5-45℃。植酸酶溶液可通过将植酸酶悬浮于蒸馏水中进行制备；或将其悬浮于使反应的初始pH保持在5.0-10.0之间的缓冲液的水相反应混合物中，优选pH6.0-8.0之间；或将固定化植酸酶悬浮于相似的混合物中；或通过制备细胞提取物溶液，尤其是纯化的或纯的植酸酶；或将细胞培养物上清液溶于相似的混合物中。底物加入后，反应即开始进行，由于产物的形成，反应混合物的pH可能会变化。无pH控制下，反应可一直进行至完全转化植酸，或在反应过程中添加适当的酸或碱，以维持预期的pH。
实施例
在以下的实施例中，本发明所作的进一步的描述，将展示本发明中优选的实施方式。一个本领域中熟练的技术人员，都能够从以上的讨论及那些实例中明确本发明的基本特征，即针对各种用途和条件对其进行适当的改造和修饰，但不偏离其本质和范围。
常规方法
使用植酸酶活性分析的标准方法，从不同大肠杆菌菌株中筛选耐热植酸酶。将大肠杆菌菌株在LB培养基中37℃震荡培养16hr。使用弗氏细胞压碎器将细胞破碎后，悬浮于缓冲液中，在设定的条件下进行植酸酶活性分析。
耐热植酸酶筛选的另一个方法为，使用根据数据库中的植酸酶基因序列设计的序列引物，通过基因组DNA序列分析技术对新的植酸酶基因进行鉴定。
实施例中所使用的标准重组DNA和分子克隆技术均为本领域中所熟知的技术。例如，可在《分子克隆手册3》(Joseph Sambrook & David W.Russell，Cold Spring Harbor Laboratory)查找实验操作与实验条件的相关说明。
适用于细菌保藏和生长的培养材料和方法为本领域的技术人员所熟知。适用于以下实施例的技术可在《普通细菌生物学实验方法指南》(Phillip Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.Briggs Phillips，eds.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1994))中找到。
说明书中与测量单位、技术、特定或组分相应的缩写词如下：″sec″代表秒，″min″代表分钟，″h″代表小时，″d″代表天，″mL″代表毫升，″L″代表升，″mM″代表毫摩尔每升，″M″代表摩尔每升，″mmol″代表毫摩尔，″rpm″代表旋转周每分钟，″slpm″代表标准升每分钟，″psig″磅每平方英尺，″wt″代表重量.″HPLC″代表高压液相色谱，″ca″意思为大约，″O.D.″代表特定波长下的光密度值，″dcw″代表细胞干重，和″IU″代表国际单位。
实施例1非-K12大肠杆菌植酸酶的克隆
将大肠杆菌(ATCC 9637，从ATCC订购)在LB培养基(LB营养琼脂，北京陆桥生物技术有限公司)中37℃震荡培养过夜。按照生产厂商的产品说明书，使用Puregene DNA提取试剂盒(Gentra Systems，Minneapolis，Minn.)提取所培养大肠杆菌的基因组DNA。设计并合成(Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)用于克隆非-K12大肠杆菌植酸酶的基因序列PCR引物(OLIGO ID NO：1-6，图3)。使用InsT/AcloneTM PCR产物克隆试剂盒(Fermentas Life Sciences)进行PCR反应，以获取基因序列。PCR反应混合物：0.1mM dNTP，0.05mM引物，10ng基因组模板DNA，2U Taq DNA聚合酶，5mM MgCl2，和10mM Tris-HCl缓冲液，反应液总体积为0.1ml。将以上0.1ml反应液在0.2ml反应管中混合，并置于DNA热循环仪中(Perkin-Elmer Thermocycler Type 2400)进行PCR反应，所使用的温度程序为：先95℃ 3min；然后94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，进行35个循环；再94℃ 7min。
使用2个多聚物(由Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd合成)对通过PCR从大肠杆菌ATCC 9637菌株中获得的非-K12植酸酶编码序列进行扩增。5’端引物编码成熟多肽的N端MQSEPELKL，并含有核糖体结合位点和限制性酶切位点NcoI(OLIGO ID NO.7，图3)。3’端引物编码植酸酶多肽的C端IPACSL，并含有TAA终止子和限制性酶切位点SnaBI(OLIGO ID NO.8，图3)。在1.0％琼脂糖凝胶电泳上鉴定扩增产物，结果显示其为1.4kb的DNA片段。使用DNA凝胶纯化系统(Qiagen Biochemical Co.)分离纯化该DNA片段。用限制性内切酶NcoI/SnaBI(Fermentas Life Sciences)对纯化的PCR产物进行酶切，然后连接到质粒pTrcHis2(Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)上，获得重组质粒pTrcHis2-PhE(见图5)。重组质粒pTrcHis2-PhE的序列分析结果表明目标序列得到了正确插入，其序列如SEQ ID NO：1所示，但不包括信号肽序列。
将1ul连接反应液与50ul感受态大肠杆菌MG1655细胞(ATCC 700926，从ATCC订购)混合。将混合液置于高压脉冲仪(Bio-Rad electroporation system)上进行电转化。然后将反应液加入到0.45ml SOC培养基(0.5％酵母粉，2.0％蛋白胨，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4和20mM葡萄糖)中，37℃震荡孵育1hr。再将培养液涂布到含有100mg/ml硫酸氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养过夜。挑选转化子克隆(pTrcHis2-PhE/MG1655)，并用于进行植酸酶基因表达。
实施例2在大肠杆菌中表达非-K12大肠杆菌植酸酶(W-PhE)
将实施例1所获得的大肠杆菌转化子在培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠，50ug/ml氨苄青霉素)中，37℃震荡培养20小时。按照1/100的体积比率将过夜培养物加入到与以上相同的新鲜培养基中，然后在同样的条件下进行培养。培养至OD550＝0.5时，加入1M IPTG，使其终浓度为1mM。然后继续培养20小时，诱导植酸酶基因表达。离心收集菌体细胞，用无菌水洗涤2次，然后按100mg细胞湿重/ml的浓度将其冲洗悬浮在乙酸-乙酸钠缓冲液中(0.1M，pH5.8)。使用超声波破碎仪(COSMO BIO CO.，LTD)对所得到的细胞进行破碎。从破碎液中分离上清液，并用于进行SDS-PAGE分析。通过电泳对表达蛋白进行鉴定，结果表明存在分子量为47kDa的蛋白，与理论分子量一致。另外，使用埃德曼降解法(Edman degradation)对以下实施例7所述的纯化的蛋白质进行N端氨基酸序列测定，结果表明其与SEQ ID NO：3中的氨基酸序列一致。
对所收获的细胞进行植酸酶活性分析。在常温下，将50mg/ml收获细胞，0.3M植酸酶溶液和0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.8)混合。参考文献“Chen QC，Li BW(2003)Separation of phytic acid and other related inositol phosphates by high-performance ionchromatography and its applications.J Chromatogr A 1018：41-52”，使用高效液相色谱仪测定植酸转化率。
实施例3通过大肠杆菌发酵生产非-K12大肠杆菌植酸酶(W-PhE)
在14L的Braun Biostat C发酵罐(B.Braun Biotech International Gmbh，Melsungen，Germany)中，使用含有葡萄糖、氨水和酵母粉(OXOID LTD.，BASINFSTOKE HAMPSHIRE，ENGLAND)的矿质培养基，生产非-K12大肠杆菌植酸酶。
在LB培养基中培养包含有实施例1所制备的质粒pTrcHis2-PhE的大肠杆菌菌株pTrcHis2-PhE/MG1655，以制备用于发酵接种的种子。在2L三角瓶中培养500ml种子，37℃、300rpm下培养至OD(λ.＝550)＞2.0。这可能需要大约10小时。
先在容器中用无菌水配制7.5L初始培养基(含：32g KH2PO4，8.0g MgSO4·7H2O，8.0g(NH4)2SO4，50g酵母粉，和10mL Mazu DF204消泡剂(BASF Corporation，Mount Olive，N.J.))。将所配制的培养基倒入发酵罐中，用蒸汽进行灭菌。灭菌后，再向发酵罐中无菌加入369g葡萄糖的水溶液(60％，w/v)(已进行蒸汽灭菌)、160mL微量元素溶液(表1)(已过滤灭菌)、和氨苄青霉素溶液(已经过滤灭菌，使其在发酵罐培养基中的终浓度为100mg/L)。然后再用NH4OH(40％，w/v)和H2SO4(20％，w/v)调节培养基的pH至6.8。
表1微量元素溶液
  微量元素   浓度(g/L)   微量元素   浓度(g/L)
  MnSO4·5H2O   0.001   H3BO4   0.0005
  CoCl2·6H2O   0.004   FeSO4·7H2O   0.02
  Na2MoO4·2H2O   0.002   CaCl2·2H2O   0.02
  ZnCl2   0.002   MgSO4·7H2O   0.3
  CuSO4·5H2O   0.001
按以上容器中所配制初始培养基体积5％的比率向发酵罐中接种种子培养液。
按照表2中所描述的条件控制搅拌、通气、pH、压力、溶解氧浓度(DO)和温度。根据氧需求的变化，通过调节搅拌和通气控制溶解氧浓度在25％的空气饱和度。在培养基中葡萄糖含量＜5g/L时(0时)开始葡萄糖饲喂，很好的控制饲喂速率，从而控制细胞比生长速率在10-35％/hr。如果培养基中累积的葡萄糖超过2g/L，需降低葡萄糖饲喂速率。
表2发酵参数设定
  搅拌   200rpm   压力   1atm
  通气   0.4L/min   溶解氧浓度(DO)   85-90％
  pH   6.8   温度   37℃
当发酵罐中培养液密度达到OD(λ＝550)＝20-30时，向发酵罐中加入氨苄青霉素溶液，使其在培养液中的终浓度为100mg/L。当培养液密度达到OD(λ＝550)＝30-35时，向发酵罐中加入IPTG溶液，使其终浓度为1mM。
IPTG添加约5小时后，将培养液冷却降温至5-10℃，然后放罐。于10℃下25000×g离心10min，收获细胞。共得到490g细胞(湿重)。
使用超声波破碎仪(COSMO BIO CO.，LTD)对所得到的细胞进行破碎。从破碎液中分离上清液进行SDS-PAGE分析。电泳结果表明存在分子量为47kDa的蛋白质，与理论分子量一致。
实施例4酵母表达系统的密码子优化
使用酵母系统(NCBI数据库)中优选的密码子，对非-K12植酸酶氨基酸序列(如图2所示，SEQ ID NO：3)进行逆向翻译。用高使用频率的密码子替换低使用频率(＜10％)的密码子。设计的编码序列如图2所示(SEQ ID NO：2)，并由英杰生物技术有限公司(Invitrogen Biotechnology Co)进行人工合成。
实施例5酵母植酸酶基因表达菌株的构建
1.巴斯德酵母植酸酶基因表达菌株的构建(Pichia pastoris(S-Ph/Pp))
使用合成引物OLIGO ID NO：9和10(图3)将两个限制性酶切位点EcoRI和NotI，分别加入到实施例4中所制备的人工合成序列的5’末端和3’末端。用内切酶EcoRI和NotI对所得到的序列进行酶切，然后将其连接到质粒pPIC9K(Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)上。所得质粒转化进入大肠杆菌(Escherichia coli strain MG1655，ATCC 700926，purchased from ATCC)进行DNA扩增。在含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基上过夜培养筛选转化的大肠杆菌克隆。使用小柱DNA制备试剂盒(Qiagen Biochemical Co.)从细胞培养物中制备重组质粒DNA。测序分析表明目标DNA得到了正确插入。
用内切酶BglII对以上所制备的重组质粒(pPIC9K-PhE，图5)进行线性化酶切后，通过电转仪将其转入P.pastoris strain SMD1168(Invitrogen Biotechnology Co.，Ltd)中。通过G418抗性(Scorer，C.A.，Clare，J.J.，McCombie，W.R.，Romanos，M.A.and Sreekrishna，K.(1994)Rapid selection using G418 of high copy number transformants of Pichia pastoris for high-level foreign gene expression.Biotechnology 12，181-184)筛选含有多拷贝插入植酸酶基因表达结构的转化子(S-Ph/Pp)。
2.甲醇酵母植酸酶基因表达菌株的构建(Pichia methanolica(S-Ph/Pm))
该菌株的构建方法与以上的方法大体上相同。使用合成引物OLIGO ID NO：11和12(图3)将两个限制性酶切位点PstI和NotI，分别加入到实施例4中所制备的人工合成序列的5’末端和3’末端。用内切酶PstI和NotI对所得到的序列进行酶切，然后将其连接到质粒pMETalphaA(Novagen，Inc.)。按照以上所述的方法，在大肠杆菌MG1655中对获得的质粒进行扩增，并回收。测序分析表明目标DNA得到了正确插入。
用内切酶AscI对以上所制备的重组质粒(pMET-PhE，图5)进行线性化酶切后，通过电转仪将其转入Pichia methanolica PMD16(Novagen，Inc.)中。按照以上所述的方法筛选得到重组子(S-Ph/Pm)。
3.克鲁维乳酸酵母植酸酶基因表达菌株的构建(Kluyeromyces lactis(S-Ph/Kill))
该菌株的构建方法与以上的方法大体上相同。使用合成引物OLIGO ID NO：13和14(图3)将两个限制性酶切位点BglII和StuI，分别加入到实施例4中所制备的人工合成序列的5’末端和3’末端。用内切酶BglII和StuI对所得到的序列进行酶切，然后将其连接到质粒pKLAC1(New England Biolabs，Inc.)。按照以上所述的方法，在大肠杆菌MG1655中对获得的质粒进行扩增，并回收。测序分析表明目标DNA得到了正确插入。
用内切酶SacII对以上所制备的重组质粒(pKLAC-PhE，图5)进行线性化酶切后，通过电转仪将其转入Kluyeromyces lactis GG799(New England Biolabs，Inc.)中。按照以上所述的方法筛选得到重组子(S-Ph/Kill)。
实施例6巴斯德酵母菌株的发酵(S-Ph/Pp)
本实施例展示在5L发酵罐(上海高机生物技术有限公司，中国上海)中所进行的，转化的巴斯德酵母(Pichia pastoris(S-Ph/Pp))的高密度发酵工艺。该发酵工艺包括3个主要阶段。
第一阶段(细胞生长阶段)，将200ml YPD培养基(葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，在30℃下培养至OD550＝0.3-0.4，大约需20小时)中的巴斯德酵母培养物(S-Ph/Pp，实施例5中所制备)接种至2000ml基础盐培养基中(磷酸26.7ml/L，硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，葡萄糖40g/L)，在接种前已经用28％的氨水调节其pH至5.0。以4.37ml/L的体积比例向培养基中加大PTM1(硫酸铜24mM，碘化钠0.534mM，硫酸锰17.8mM，钼酸钠0.827mM，硼酸0.323mM，氯化钴2.1mM，氯化锌0.147mM，硫酸亚铁0.234mM，生物素1.64mM，硫酸0.188M)。通气、搅拌培养约18-24小时。菌体生长时溶解氧会降低至100％以下，当碳源耗尽时溶解氧会上升至80％以上。那时，细胞密度可达到90-110g/L(湿重)。
第二阶段(碳源饲喂阶段)，以28ml/hr的速度流加用蒸馏水配制的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持续流加4小时以上。并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到代该阶段的末期，菌湿重可达到18-220g/L(湿重)。
最后，第三阶段(诱导阶段)，以20-40ml/hr的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量搅拌转速，使溶氧维持在20％上下。在诱导阶段每隔约10小时收集一次培养物样品进行酶活性分析和SDS-PAGE分析(见图9所示)。
194小时的细胞密度可到达OD600＝150，209小时的植酸酶活性可达到4770U/ml(见图8)。
将培养物样品25000×g离心10min，收集上清液进行SDS-PAGE，并分析蛋白质浓度。蛋白质含量测定采用Lowry法(Lowry OH et al.PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT.J Biol Chem.1951，193(1)：265-75)。198小时样品的蛋白质含量为2.7g/L。采用本领域中所熟知的常规方法测定生长和生产速率，并以此来判断发酵终点和放罐时间。
如图9所示，通过对分泌到培养基中的重组植酸酶进行植酸酶活性分析(见实施例7)，以鉴定SDS-PAGE(12％胶浓度)上所出现的条带。采用该发酵工艺可以提高重组植酸酶的浓度。蛋白质的分子量约为52kDa。
实施例7重组植酸酶的纯化
以下所有操作均在4℃下进行。所使用的为巴斯德酵母表达的重组非-K12植酸酶(实施例6)。将培养物25000×g离心10min，收集上清液。在上清液中加入硫酸铵，使其终浓度达到75％(w/v)，充分搅拌溶解后，静置沉降2小时，然后将混合物25000×g离心15min，收集沉淀物。用20ml 20mM乙酸缓冲液(pH5.0)重新溶解沉淀物，置于相同的缓冲液中透析过夜。
将透析液上样经20mM乙酸缓冲液(pH5.0)平衡后的CM-Sephadex C-50柱(Pharmacia)进行分离。先用相同的缓冲液冲洗柱子以除去未结合的组分，然后用0-500mM NaCl+初始缓冲液(pH5.0，20mM乙酸-乙酸钠缓冲液)的线性梯度，洗脱结合的植酸酶。
收集洗脱液中植酸酶活性最高的部分，用去离子水进行透析，所得到的透析液用于以下的研究。
纯的蛋白质的氨基酸测序分析表明重组植酸酶有正确的氨基酸序列，如SEQ ID NO：3所示。
实施例8非-K12植酸酶活性表征
1.植酸酶活性测定
植酸酶样品中的蛋白质含量采用Lowry进行测定(Lowry OH et al.PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT.J Biol Chem.1951，193(1)：265-75)。
植酸酶活性测定所依据的原理为：使用钼酸铵作为显色剂，在700nm比色定量植酸水解所释放出的游离磷酸根。一个酶活单位(U)定义为：在标准的分析条件下(pH5.0，温度37℃，底物植酸钠浓度0.005mol/L均参照国标GB/T 18634-2002，并参考“应用钼黄法和钼兰法测定植酸酶活性测定条件的研究.邹大琼.中国饲料，2005(03)”)，每分钟释放出1umol的无机磷所需要的酶量。
酶的比活力可按照下面的公式进行计算：
Uc＝U/C
Uc——植酸酶比活力，U/mg；
U——植酸酶活力，U/ml；
C——植酸酶样品的蛋白质含量，mg/ml
由此所测得的实施例6所纯化的植酸酶的比活力为3146U/mg。
2.最适pH和最适温度
在标准分析条件下(如上所示)测定不同反应pH样品的植酸酶活性，pH3.0-6.0时使用0.05mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液，pH6.0-9.0时使用0.04mol/L巴比妥钠-盐酸缓冲液。在标准分析条件下(如上所示)测定不同反应温度时样品的植酸酶活性。进行以上测定时使用实施例7所纯化的植酸酶样品。结果如图6和7所示。
纯化的植酸酶的最适反应pH为3.0-6.0(图6)，最适反应温度为55℃(图7)。
3.pH和温度对重组植酸酶的影响
将实施例7所纯化的非-K12植酸酶用各种不同pH值的缓冲液(pH3.0-6.0时使用0.05mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液，pH6.0-9.0时使用0.04mol/L巴比妥钠-盐酸缓冲液)进行稀释，使其蛋白质的终浓重为1.5mg/ml，然后在37℃下保温1小时。将植酸酶用0.05mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.0)进行稀释，然后于不同温度下保温1小时。在标准分析条件下(如上所示)测定经以上处理后样品植酸酶活性，分别考察pH和温度对重组植酸酶活性的影响。结果如图12和13所示。
如图12所示，本发明的非-K12植酸酶在2.0-5.5的低pH下仍然温度(见如12)。本发明的非-K12植酸酶的热稳定性如图13所示，在80℃下保温1小时仍能保持不低于17％的残余酶活性；在90℃下保温1小时仍能保持不低于33％的残余酶活性；在100℃下保温1小时仍能保持不低于26％的残余酶活性(图13)。
4.植酸酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性
将实施例7所纯化的本发明的非-K12植酸酶分别置于胃蛋白酶(300U/ml，pH2.5，37℃，2hrs)和胰蛋白酶(30U/ml，at pH7.0，37℃，2hrs)溶液中，37℃保温2小时。在每种处理条件下，纯的非-K12植酸酶均能保留不低于91％的残余酶活性(如图10所示)。对照组(100％酶活性)出未加蛋白酶外，其余条件与样品组相同。
5.重组植酸酶的分子量
SDS-PAGE(12％胶浓度)表明巴斯德酵母表达的重组植酸酶(实施例6)的分子量约为51kDa。并且巴斯德酵母表达的重组植酸酶有部分的糖基化，如SDS-PAGE上模糊的条带所示(图11)。
6.温度对干的植酸酶制剂的影响
将实施例7所纯化的非-K12植酸酶按照配方(25％淀粉，12.5％糊精，5％氯化钠，5％山梨酸钾，1.5％硫酸钙(w/w))进行喷雾干燥。将干的植酸酶制剂在不同温度下保温1小时，然后在标准分析条件下(如上所示)测定样品的残余植酸酶活性。
冷冻干燥的植酸酶制剂的热稳定性如图14所示，在100℃的高温下处理1小时后，仍能保留70％的残余酶活力。
实施例9非-K12植酸酶与大肠杆菌K12植酸酶和黑曲霉真菌植酸酶的比较
在如上所示的各种pH值和温度(实施例8，“pH值和温度对重组植酸酶的影响”)条件下，测试来源于黑曲霉的真菌植酸酶(Robert F.M.Van Gorcom et al.Cloning and expression of phytase from aspergillus.US PATENT NO.5436156)和大肠杆菌K12植酸酶(Jay M.Short et al.Recombinant bacterial phytases and uses thereof.US PATENT NO.6855365)的稳定性。将所得到的结果，与使用实施例6中所制备的和实施例7中所纯化的本发明的非-K12植酸酶所得到的结果进行比较。比较结果如图15和16所示。表明，本发明的非-K12植酸酶有更好的热稳定性(图15)和酸性环境耐受性(图16)。
Figure IPA00001372123000011
Figure IPA00001372123000021
Figure IPA00001372123000031
Figure IPA00001372123000041
Figure IPA00001372123000061

Claims (13)

1.一个分离的核酸分子，其含有一个选自以下组中的核苷酸序列：
(a)一个核苷酸序列，其编码如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽；
(b)一个在严格杂交条件下与(a)杂交的核苷酸序列，其所述核苷酸序列编码具有非-K12大肠杆菌植酸酶活性的多肽；或
(c)一个与(a)或(b)互补的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其含有一个选自以下组中的核苷酸序列：
(a)一个由如SEQ ID NO：1中所示第67-1296位核苷酸所组成的核素序列；
(b)一个由如SEQ ID NO：2中所示第1-1230位核苷酸所组成的核素序列；
(c)一个如SEQ ID NO：1所示的核酸序列；
(d)一个在严格杂交条件下与(a)至(c)中任一个杂交的核酸序列，其编码具有非-K12大肠杆菌植酸酶活性的多肽；或
(e)一个与(a)至(d)中任一个互补的核苷酸序列。
3.一个含有如权利要求1中所述分离的核酸分子的载体。
4.如权利要求3所述的载体，其是一个表达载体。
5.如权利要求4所述的载体，其可以从由pTrcHis2-PhE，pPIC9K-PhE，pMET-PhE和pKLAC-PhE所组成的组中选取。
6.一个含有如权利要求1所述的分离的核酸分子的细胞；
7.如权利要求6所述的细胞，其所述的分离的核酸分子包含在一个表达载体上。
8.如权利要求6所述的细胞，其是一个酵母细胞。
9.如权利要求6所述的细胞，其可以从由大肠杆菌(Escherichia coli.)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇酵母(Pichia methanolica)和克鲁维乳酸酵母(Kluyeromyces lactis)所组成的组中选取。
10.如权利要求6所述的细胞，其可以选自以下组中：E.coli MG1655，P.pastoris GS115，P.methanolica PMAD16和Kluyeromyces lactis GG799。
11.如权利要求6所述的细胞，其可以选自以下组中：转化有pTrcHis2-PhE载体的E.coli MG1655细胞，转化有pPIC9K-PhE载体的P.pastoris SMD1168细胞，转化有pMET-PhE载体的P.methanolica PMD16细胞和转化有pKLAC-PhE载体的Kluyeromyces lactis GG799细胞。
12.一个多肽，其含有一个选自以下组中的氨基酸序列：
(a)一个如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；或
(b)一个与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的相似性99％以上的氨基酸序列，其所述的多肽具有非-K12大肠杆菌植酸酶活性。
13.一个通过发酵生产非K-12大肠杆菌植酸酶的工艺，其包括在一个有利于表达的条件下培养如权利要求6所述的细胞，以获得具有非-K12大肠杆菌植酸酶活性的多肽。优选的，所选择的细胞株为转化有pTrcHis2-PhE载体的E.coli MG1655细胞，转化有pPIC9K-PhE载体的P.pastoris SMD1168细胞，转化有pMET-PhE载体的P.methanolicaPMD16细胞和转化有pKLAC-PhE载体的Kluyeromyces lactis GG799细胞。
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