JPH06507070A - 植物キチナーゼ遺伝子およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１３）テンサイキチナーゼ４酵素の下記エピトープ。

ペプチドｌ：　ＡＧＫＲＦＹＴＲＡ ペプチド２：　ＧＮＰＳＫＱＹＹ ペプチド３：　ＩＥＣＮＧＧＮＳ ペプチド４：　ＴＡＲＶＧＹＹＴＱＹＣＱの１つまたはそれ以上をコードする配 列番号１に示されたキチナーゼ４ＤＮＡ配列の部分配列。

（１４）植物に由来するものである、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＤＮ Ａ配列。

（１５）ンエノボディアセアエ、ソラナセアエ、アピアセアエ、ブラシカセアエ 、ククルビタセアエまたはファバセア工科の一員から誘導される、請求項１４記 載のＤＮＡ配列。

（１６）トウモロコン、アルファルファ、カラス麦、小麦、ライ麦、米、大麦、 モロコシ、タバコ、綿、テンサイ、飼料ビート、ヒマワリ、ニンジン、インゲン マメ、ツユニール、トマト、ジャガイモ、大豆、脂肪種子菜種、キャベツ、コシ ヨウ、レタスおよびエントウから誘導される、請求項１５記載のＤＮＡ配列。

（１７）請求項１〜１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列によりコードされるポ リペプチド。

１）機能し得るように結合したプロモーター、２）キチナーゼ４ＤＮＡ配列を含 む請求項１〜１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列またはその類縁体または部分 配列 ３）ＤＮＡ配列に機能し得るように結合した転写ターミネータ−を含む遺伝子構 築物。

（１９）配列番号１に示されたキチナーゼ４ＤＮＡ配列を含む請求項１−１６の いずれか１項記載のＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列の１つまたはそ れ以上のコピー、 テンサイキチナーゼ４とは異なる第２キチナーゼの活性を有するポリペプチドを コードするＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上のコピー、および／または、β−１ ，３−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の１つま たはそれ以上のコピー を含み、ＤＮＡ配列の各々が、ＤＮＡ配列を機能的ポリペプチドに発現させ得る プロモーターおよび転写ターミネータ−に機能し得るように結合されている、遺 伝子構築物。

（２０）第２キチナーゼをコードするＤＮＡ配列が、４．０に等しいかまたはそ れ未満のｐｉを有し、好ましくは３Ｈ−キチンを主としてキト６量体に開裂し得 る酸性キチナーゼをコードする、および／またはβ−１，３−グルカナーゼをコ ードするＤＮＡ配列が、少なくとも９．０のｐＩを有し、好ましくは３Ｈ−ラミ ナリンを主としてβ−１，３−グルカンの２量体に開裂し得る塩基性β−１，３ −グルカナーゼを特徴とする請求項１９記載の遺伝子構築物。

（２１）第２キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼが植物起源のものであ る、請求項１９または２０のいずれか１項記載の遺伝子構築物。

（２２）酸性キチナーゼをコードするＤＮＡ配列が、配列番号８に示されたアミ ノ酸配列を有する酸性テンサイキチナーゼＳＥをコードする配列番号７のＤＮＡ 配列であるか、またはｐＩが多くとも４．０であり、３Ｈ−キチンを主として６ 量体に加水分解し得る酸性キチナーゼをコードする前記ＤＮＡ配列の類縁体であ る、および／または塩基性β−１，３−グルカナーゼをコードする配列番号９に 示されたＤＮＡ配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列を有する塩基性テ ンサイβ−１，３−グルカナーゼ４をコードするＤＮＡ配列、またはｐＩが少な くとも９０であり、３Ｈ−ラミナリンを主としてβ−１，３−グルカンの２量体 に加水分解し得る塩基性β−１，３−グルカナーゼをコードするその類縁体であ る、請求項２１記載の遺伝子構築物。　− （２３）プロモーターが構成的または調節可能なプロモーターである、請求項１ ８−２２のいずれか１項記載の遺伝子構築物。

（２４）構成的プロモーターが、植物プロモーター、細菌プロモーターまたは植 物ウィルスプロモーターから成る群から選択される、請求項２３記載の遺伝子構 築物。

（２５）プロモーターが、テンサイアセトヒドロキシ酸シンターゼプロモーター （ＡＨＡ　Ｓ　）、テンサイキチナーゼ１プロモーター（この配列は配列番号１ １から明らかである）から成る群から選ばれる、請求項２４記載の遺伝子構築物 。

（２６）Ｎ＝末端先導配列が、テンサイキチナーゼ１（この配列は配列番号１１ から明らかである）、テンサイキチナーゼ４（この配列は配列番号１から明らか である）、テンサイβ−１，３−グルカナーゼ（この配列は配列番号９から明ら かである）、テンサイキチナーゼ７６（この配列は配列番号５に示されている） およびテンサイ由来の酸性キチナーゼＳＥ（この配列は配列番号７から明らかで ある）の暗号化領域から成る群から選択される、請求項１８−２５のいずれか１ 項記載の遺伝子構築物。

（２７）プロリン濃厚領域をコードするテンサイキチナーゼ１由来のＤＮＡ部分 配列を含む、請求項１８−２６のいずれか１項記載の遺伝子構築物。

（２８）プロモーターが、アグロバクテリウムのオバインシンターゼ遺伝子のＮ 。

Ｓプロモーターおよびｏｃｓプロモーターから成る群から選択される、請求項２ ４記載の遺伝子構築物。

（２９）プロモーターが、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）プロモー ター、例えばＣａＭＶ１９ＳプロモーターまたはｃａＭＶ３５ＳブＯ％−９−１ ＭＡＳ／３５ＳＳＭＡＳ２重Ｔｒｌ、２およびＴ−２ＤＮＡ遺伝子５プロモータ ーから成る群から選択される、請求項２４記載の遺伝子構築物。

（３０）調節可能なプロモーターが、成長因子、化学因子、生物学的因子および 物理的因子から成る群がら選択される少なくとも１つの因子により調節され得る 、請求項２３記載の遺伝子構築物。

（３１）プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項２３記載の遺伝 子構築物。

（３２）転写ターミネータ−が、植物転写ターミネータ−配列、細菌転写ターミ ネータ−配列、菌転写ターミネータ−および植物ウィルスターミネータ−配列か ら成る群から選択される、請求項１８−３１のいずれが１項記載の遺伝子構築物 。

（３３）転写ターミネータ−が、アグロバクテリウムのオバインシンターゼ遺伝 子のＮＯ８およびｏｃｓ転写ターミネータ−配列、ＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネ ータ−配列、ＤＮＡ遺伝子４へのＰＡＤＧ４転写ターミネータ−１Ｔ−ＤＮＡ遺 伝子７へのＰＡＤＧ７転写ターミネータ−から成る群から選択される、請求項３ ２記載の遺伝子構築物。

（３４）構築物のＤＮＡ配列の少なくとも１つが、ＤＮＡ配列（複数もあり得る ）の転写および発現の増加をもたらすエンハンサ−配列へ機能し得るように結合 されている、請求項１８−３３のいずれが１項記載の遺伝子構築物。

（３５）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物であって、Ｄ Ｎ、へ配列が、配列番号１に示されたテンサイキチナーゼ４Ｎ−末端配列、配列 番号９に示されたテンサイβ−１，３−グルカナーゼＮ−末端配列、配列番号７ に示されたテンサイ酸性キチナーゼ５ＥＮ−末端配列、および配列番号１１に示 されたテンサイキチナーゼＩＮ−末端配列から成る群から選択されるＮ−末端先 導配列をコードするＤＮＡ部分配列に結合している、遺伝子構築物。

（３６）植物、特にテンサイ植物の形質転換に使用される、請求項３５記載の遺 伝子構築物。

（３７）プロリン濃厚ドメインをコードするテンサイキチナーゼ１からのＤＮＡ 部分配列を含む、請求項１８−３６のいずれが１項記載の遺伝子構築物。

（３８）宿主生物で複製し得、請求項１−１６のいずれが１項記載のＤＮＡ配列 または請求項１８−３７のいずれが１項記載の遺伝子構築物をもつベクター。

（３９）請求項３８記載のベクターをもつ宿主生物。

（４０）請求項１−１６のいずれが１項記載のＤＮＡ配列または請求項１８−３ ７のいずれか１項記載の遺伝子構築物を複製または発現し得る、請求項３９記載 の宿主生物。

（４１）ゲノム中に、請求項１−１６のいずれが１項記載のＤＮＡ配列または請 求項１８−３７のいずれか１項記載の遺伝子構築物をもち、ＤＮＡ配列または遺 伝子構築物を複製または発現し得る、宿主生物。

（４２）微生物、例えば細菌または酵母である、請求項３９−４１のいずれが１ 項記載の宿主生物。

（４３）植物細胞または原形質である、請求項３９−４１のいずれが１項記載の 宿主生物。

（４４）ゲノム中に請求項１８−３７のいずれが１項記載の遺伝子構築物を含む 、遺伝子形質転換植物。

（４５））ウモロコノ、カラス麦、小麦、米、大麦、ライ麦およびモロコシから 成る単子葉植物の群から選択される、請求項４４記戦の遺伝子形質転換植物。

（４６）アルファルファ、タバコ、綿、テンサイ、飼料ビート、ヒマワリ、ニン ジン、ツユニール、トマト、ジャガイモ、大豆、脂肪種子菜種、キャベツ、コシ ヨウ、レタスおよびエントウから成る双子葉植物の群から選択される、請求項４ ５記載の遺伝子形質転換植物。

（４７）請求項１８−３７のいずれが１項記載の遺伝子構築物をもたない植物と 比べてキチン含有植物病原体に対する高い耐性を有する、請求項４４−４６のい ずれか１項記載の遺伝子形質転換植物。

（４８）病原菌または線虫に対して高い耐性を有する、請求項４７記載の遺伝子 形質転換植物。

（４９）セルコスポラ、リゾクトニア、フサリウム、タラトスポリウム、フィト フトラ、フォーマ、スクレロトニア、アスコキータ、ピレノフォラ、ヘルミトス ポリウム、ウスティラボ、プツシニア、ラムラリア、ボトリチスまたはベルティ シリウム属の病原菌に対して高い耐性を有する、請求項４７記載の遺伝子形質転 換植物。

（５０）リゾクトニア・ソラニ、セルコスポラ・ベティコラ、セルコスポラ・ニ コチアナエ、クラドスポリウム・ヘルバリウム、フィトフトラ・メガスペルマ、 スクレロトニア・スクレロチオルム、ラムラリア・ベティコラ、ボトリチス・シ ネレアおよびフォーマ・リンガムから成る群から選択される病原菌に対して高い 耐性を有する、請求項４９記載の遺伝子形質転換植物。

（５１）請求項４４−４９のいずれか１項記載の遺伝子形質転換植物を生長させ ることにより得られる種子、実生または植物の一部分。

（５２）請求項１８−３７のいずれが１項記載の遺伝子構築物をもち、遺伝子構 築物を植物のゲノムへ導入し得る少なくとも１つのベクターを含む形質転換系。

（５３）バイナリ−または同時組み込み（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）＜フタ− 系を含む、請求項５２記載の形質転換系。

（５４）植物およびＴ−ＤＮＡ断片の少なくとも１つの境界部分の形質転換を行 わせ得るヴイルレンス機能を含み、前記境界部分が遺伝子構築物と同じプラスミ ドに位置するものである、請求項５２または５３記載の形質転換系。

（５５）アグロバクテリウム・ツメファシェンスＴｉまたはアグロバクテリウム ・リゾゲネスＲ１プラスミドまたはその誘導体を含む、請求項５２−５４のいず れか１項記載の形質転換系。

（５６）植物に感染し、請求項５２−５５のいずれか１項記載の形質転換系をも ち得る微生物。

（５７）アグロバクテリウム類である、請求項５６記載の微生物。

（５８）天然植物の場合と比べてキチン含有植物病原体、例えば植物病原菌に対 する高い耐性を有する遺伝子形質転換植物の製造方法であって、請求項１８−３ ７のいずれか１項記載の遺伝子構築物を植物ゲノムへ移入することにより、前記 構築物を含む遺伝物質を得、続いて遺伝物質を遺伝子形質転換植物へ再生するこ とを含む方法。

（５９）遺伝子構築物が、請求項５６または５７記載の微生物手段により植物へ 移入される、請求項５８記載の方法。　：（６０）遺伝子構築物が、注射、音波 処理またはエレクトロポレーションによる裸のＤＮＡの直接導入により植物また はその一部へ移入される、請求項５８記載の方法。

（６１）請求項１−１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列または請求項１８−３ ７のいずれか１項記載の遺伝子構築物によりコードされるポリペプチドおよび適 当な賦形剤を含む抗菌組成物。

（６２）菌類の治療的および／または予防的処置で常用されている化学物質、例 えば殺菌剤を含む、請求項６１記載の抗菌組成物。

（６３）請求項１−１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列によりコードされる１ つまたはそれ以上のポリペプチドまたは請求項１８−３７のいずれか１項記載の 遺伝子構築物を発現させる条件下、適当な培地中に請求項３９−４２記載の微生 物培養し、所望により、微生物を破裂させることによってそれらの発現されたポ リペプチド（複数もあり得る）の内容物を培地中へ放出させ、培地から細胞層を 除去し、所望により、ポリペプチド（複数もあり得る）を含む培地を凍結乾燥ま たは噴霧乾燥に付すことにより、前記ＤＮＡ配列または前記遺伝子構築物により コードされるポリペプチド（複数もあり得る）を含む抗菌組成物を得ることを含 む、抗菌組成物の製造方法。

（６４）抗菌性蛋白が培地へ排出され、所望により培地から精製される、請求項 ６３記載の方法。

（６５）植物におけるキチン含有植物病原体、例えば植物病原菌の発芽および／ または成長の阻止方法であって、 １）請求項１８−３７のいずれか１項記載の遺伝子構築物により植物またはその 一部を形質転換し、生成した形質転換植物または植物部分を遺伝子形質転換植物 に再生する、および／または ２）植物またはその一部、植物を増殖させる実生または種子、または植物が生育 されている培地を、請求項６１記載の組成物により処理することを含む方法。

（６６）請求項６１記載の組成物または請求項６２記載の方法により製造される 組成物を、水または植物に補充する栄養組成物に加えた、請求項６５記載の方法 。

（６７）物質に存在するキチン含有植物病原体、例えば植物病原菌の発芽および ／または成長を生物学的に制御する方法であって、微生物の培養物を処理される 物質においてそれ自体確立させ得る条件下、請求項３９−４２記載の微生物の培 養物で物質を処理することを含む方法。

（６８）微生物が、シュードモナス類またはストレプトマイシス類または生物学 的害虫制御に常用される別の微生物である、請求項６７記載の方法。

（６９）物質が植物である、請求項６６または６７記載の方法。

（７０）物質における菌類の発芽および／または成長の阻止方法であって、請求 項６１もしくは６２記載または請求項６３もしくは６４記載の方法により製造さ れた抗菌組成物で物質を処理することを含む方法。

（７１）処理される物質が、食品、例えばパン、飲料、食品成分、例えば穀類、 または食品、飲料または食品成分用容器の一部である、請求項７０記載の方法。

（７２）ブダペスト条約の規則のもと１９９１年７月３０日付けでドイチュ・サ ムルング・フォノ・ミクロオルガニスメン・ラント・ツエルクルツレン・ゲゼル シャフト・ミツト・ベシュレンクテル・ハフラング（ＤＳＭ）にＤＳＭ６６３５ の受け入れ番号で寄託されたエシェリヒア・コリ株ＤＨ５αに組み込まれた植物 形質転換ベクターｐＢＫＬ４に４゜ 明　細　書 植物キチナーゼ遺伝子およびその使用 発明の分野 本発明は、テンサイキチナーゼ（ｓｕｇａｒ　ｂｅｅｔ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ） （以後、「テンサイキチナーゼ４」と称す）をコードするＤＮＡ配列またはテン サイキチナーゼ４の抗菌活性を有するポリペプチドをコードする前記ＤＮＡ配列 の類縁体、並びにキチンを含む植物病原体、例えば植物病原菌に対して非形質転 換植物よりも高い耐性を有する遺伝子形質転換植物構築に有用な遺伝子構築物に 関するものである。遺伝子構築物は、好ましくはテンサイキチナーゼ４とは異な る第２キチナーゼをコードするＤＮＡ配列およびβ−１，３−グルカナーゼをコ ードするＤＮＡ配列と組み合わせた形で、本発明のＤＮＡ配列を含み、かつそれ を発現することができる。

別の態様において、本発明は、遺伝子形質転換植物、特に遺伝子形質転換テンサ イ植物に関するものであり、そこからテンサイキチナーゼ４の抗菌活性を有する ポリペプチドが、好ましくはキチナーゼ活性を有するポリペプチドおよびβ−１ ゜３−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドと組み合わせた形で、非形質転換 植物と比べて多量に発現されることにより、キチン含有植物病原体に対する高い 耐性が誘発される。

発明の背景 はとんどの植物は、病原体、例えば微生物による感染を被りやすく、感染すると 、生長は遅れ、収穫量は低下し、その結果農家に経済的損失がもたらされるとい う様々な望ましくない病的徴候が現れる。植物は、幾つかの防御機構、例えばフ ィトアレキシン類、リグニン様物質の沈着、細胞壁ヒドロキシプロリン高度含有 糖蛋白質の蓄積、病原関連蛋白質（ＰＲ−蛋白質）、並びに幾つかの溶菌酵素、 例えばキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼの活性の増加により感染に反 応する。これらの応答の中には、感染によって直接誘導され得るものもあれば、 菌細胞壁から単離されたエリジターに対する植物の暴露および場合によっては外 因性化学物質、例えばエチレンに対する暴露により誘導され得るものもある。し かしながら、植物による防御機構の充分な機能行使は、通常、感染の開始に対し て遅れをとるため、植物は、その防御機構がその最大能力に達する前に激しい損 傷を被り得る。また、植物の防御機構は、それ自体感染性生物と有効に戦えるほ ど充分には強靭ではない場合があり得る。従って、通常の必要な方法は、予防的 処置としてまたは感染直後に感染植物または感染を被り易い植物を化学薬剤、例 えば殺菌剤で処置することである。

しかしながら、化学的処置の使用は、生態学的観点からも経済的観点からも望ま しくないため、遺伝子工学技術によって新規および／または改良遺伝子を導入す ることにより宿主植物自体の防御力を高め得ることが望ましい。このストラテジ ーのさらに別の有利な効果は菌攻撃の即時阻止達成であり、植物群における感染 性菌の伝染確立が遅延されるため、感染作用の全体的減少が誘導される。

多くの植物病原菌の細胞壁はキチンおよびグルカンを含有し、キチンは菌糸先端 の主成分を構成する。酵素キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼは、菌細 胞壁を酵素消化することにより、主としてＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよ びＤ−グルコースの可溶性２量体またはオリゴマーを生成し得ることが示された 。

キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼ活性は、例えばタバコ、大麦、じゃ がいも、米、とうもろこしくｍａｉｚｅ（実）、ｃｏｒｎ（穂））、豆、トマト 、きゅうり、小麦胚芽、菜種およびエントウといった種類の植物において観察さ れたことがあり、キチナーゼ活性はほとんどの植物病原菌による感染に応じて増 加することが示されている。

植物キチナーゼは、農作物、例えばタバコ、大麦、とうもろこし、トマト、豆お よびエントウから精製および特性確認されており、ｃＤＮＡおよびゲノムのクロ ーンはそこから観察されている。植物キチナーゼは、ボールおよびリンドルスト （１９９０）およびポーラ−（１９８８）により概説されている。

幾つかの出版物では、細菌および植物キチナーゼ並びに様々な微生物、例えば菌 類に対して高い耐性を有するトランスジェニック植物の構築におけるその用途が 検討されている。

ＥＰＯ２９２４３５は、基本的には多産性とうもろこしくズイーア・マイス）植 物の再生に関するものであり、特にタバコキチナーゼ遺伝子が植物に導入される ことにより病原体に対する耐性が付与され得ることを述べている。とうもろこし 以外の他の供給源および他の植物のキチナーゼ遺伝子については述べられていな い。

ＥＰ０２９０１２３、ＷＯ３８１００９７６およびＵＳ４９４０８４０は、トラ ンスジェニック植物の構築における細菌由来のキチナーゼの使用について開示し ている。植物由来のキチナーゼについては述べられていないか、または択一的に 一般用語で述べられているだけである。

ＷＯ９０１０７００１は、植物キチナーゼをコードするＤＮＡ配列に機能し得る ように結合した高レベルのプロモーターを含むＤＮＡ構築物について開示してお り、前記構築物を植物の形質転換に使用して、植物におけるキチナーゼの過剰発 現を達成させることにより、植物病原菌に対する耐性を付与する。実例が示され ている唯一の植物キチナーゼは、豆キチナーゼである。

ＥＰ０３９２２２５、ＥＰ０３０７８４１、ＥＰＯ３３２１０４、ＥＰＯ４４０ ３０４およびＥＰＯ４１８６９５は、植物病原関連蛋白質（ＰＲＰ）、例えばキ チナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列を宿すトラン スジェニック植物の構築を開示している。テンサイ植物またはトランスジェニッ クのテンサイ植物由来の病原関連蛋白質については述べられていない。

また、ＥＰＯ４４８５１１は、加水分解酵素、例えばキチナーゼおよびグルカナ ーゼをコードする組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物について述べ ている。さらに、この参考文献は、植物病原体の制御に使用される加水分解酵素 、例えばグルカナーゼおよびキチナーゼを含む組成物について報告している。

テンサイ由来のキチナーゼまたはグルカナーゼについては述べられていない。

ＷＯ９１１０６３１２は、内酵素、例えばグルカナーゼまたはキチナーゼを含む 収穫物保護用組成物について開示している。キチナーゼまたはグルカナーゼの特 定供給源については全く述べられていない。

ルソーーリムジンＭ、およびフリーティヒＢ、（１９９１）は、セルコスポラ・ ベチコラに感染したテンサイにおける塩基性および酸性ＰＲ−蛋白質の製造およ びタバコにおけるＰＲ−蛋白質に対するこれらのＰＲ−蛋白質の血清学的関連性 について報告している。報告されたＰＲ−蛋白質は、タバコＰＲ−蛋白質と血清 学的に関連していることが見出されているが、本発明のテンサイキチナーゼ４は 既知キチナーゼのいずれに対しても血清学的関連性を示さない（下記参照）。Ｐ Ｒ−蛋白質のいずれかのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に関する情報は全 く与えられていない。

結論として、上述の出版物の中で、テンサイキチナーゼ酵素またはトランスジェ ニック植物の構築におけるその使用について開示しているものは無い。

１９８９年４月１１−１３日、イギリス国ノーウィッチ、ヨーロッパ国際シンポ ジウムの植物化学学会「植物の生化学および分子生物学：病原体の相互作用」に おいて、本発明者らは、セルコスポラ・ベチコラという植物病原性キチン含有菌 に感染したテンサイ植物の葉からの、キチナーゼ４を含む６種のキチナーゼイソ 酵素の単離および精製について開示した。キチナーゼイソ酵素は、それらの分子 量およびキチン加水分解性の反応速度論を特徴としていた。キチナーゼ製品は、 生長中の菌の細胞壁において新たに合成されたキチンを加水分解し得ることが示 された。それ以外の特性は報告されておらず、キチナーゼ酵素は個別には検討さ れなかった。

アメリカ合衆国ミシガンで１９９０年８月４−８日に催されたＡＰＳ／ＣＰＳ（ ジ・アメリカン・ファイドパソロジール・ソサエティー／ザ・キャナディアン・ ファイドパソロジー・ソサエティー）１９９０ジヨイント・ミーティング・プロ グラムおよび１９９０年９月９−１４日にスイス国インターラーケンで催された に「植物−微生物相互作用の分子遺伝学に関する第５回国際シンポジウム」にお いて、本発明者らは、キチナーゼ４を含む様々なテンサイキチナーゼイソ酵素の アミノ酸組成を示す要約書およびポスターを提出した。それは、血清学的に相異 なる２群のキチナーゼ酵素がテンサイ植物に存在することを初めて述べたもので あった。この主張はそれ以上は述べられなかった。

１９９０年１０月２８日−１１月３日にモロッコのアガディールで催された第８ 回地中海性植物病原体連合会議で本発明者らが提出した要約書およびポスターで は、抗体が、小麦胚芽キチナーゼ、３種のテンサイキチナーゼおよび２種のβ− １，３−グルカナーゼに対して産生されたこと、並びにＮ−末端および部分アミ ノ酸配列決定が全部で９種の精製キチナーゼイソ酵素のうちの５種について行な われたことが述べられている。テンサイキチナーゼイソ酵素２のＮ−末端配列の みが開示された。

１９９０年８月２０日に発行されたセンター・フォー・プラント・バイオテクノ ロジー（デンマーク）からの「アニュアル・レポート１９８９」には、上記結果 が開示されており、さらにテンサイキチナーゼをコードする遺伝子の一つが、特 にヌクレオチド配列決定法により単離および特性検定されたことも開示されてい る。

しカルながら、それはこの刊行物では直接表現されていないが、この遺伝子はキ チナーゼ１をコードしても、テンサイキチナーゼ４についてはコードしない。顧 みると、また本出願の開示内容を考慮すると、このキチナーゼは、タバコおよび 豆に由来するキチナーゼ遺伝子の他の既知配列との相同性の度合が高いため（約 ５０％）、キチナーゼ４ではないことが立証されている。反対に、実施例１１か ら明らかなところによると、キチナーゼ４および他の既知キチナーゼ間には非常 に低い度合の相同性が存在する。

上述の参考文献の中で、テンサイキチナーゼ４酵素のアミノ酸配列またはテンサ イキチナーゼ４をコードするＤＮＡ配列について記述または示唆しているものは 無（、それらはまた、この配列をめるのが興味深いことであると記述または示唆 してもいない。事実、小さな機能性ドメインを伴う酵素を示したテンサイキチナ ーゼ４の初回分析は、キチナーゼ酵素が低いキチン親和力、すなわち低い酵素活 性を有することを示した。すなわち、この酵素は特に興味の対象とはならないと 思われた。

さらに、それらの参考文献の中で、テンサイキチナーゼ４酵素を酸性キチナーゼ および塩基性β−１，３−グルカナーゼと組み合わせた場合に得られる相乗的抗 菌効果について記述または示唆しているものは無い。この相乗的抗菌効果は、こ の出願と関連して初めて報告されている。

本発明者らにより、単独または他の病原関連蛋白質と組み合わせた形でキチン含 有菌の阻止において有望な結果を示す新規植物キチナーゼが解明された。

発明の簡単な開示 一態様において、本発明は、配列番号１に示されたテンサイキチナーゼ４ＤＮＡ 配列を含むＤＮＡ配列またはその類縁体に関するものであり、前記類縁体は、本 明細書に記載されたテンサイキチナーゼ４の抗菌活性を有するポリペプチドをコ ードするＤＮＡ配列であって、 ｌ）配列番号１に示されたＤＮＡ配列の特徴的部分であるか、または１１）標題 「キチナーゼ４遺伝子群に属するＤＮＡの同定」下における「原材料および方法 」の項で詳記された条件下、５５℃で配列番号１に示されたＤＮＡ配列とハイブ リダイゼーションするか、または１ｉｉ）配列番号２に示されたテンサイキチナ ーゼ４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするか、または ｉｖ）テンサイキチナーゼ４に対して産生じた抗体により認識されるポリペプチ ドをコードする。

後記配列リストに示されたキチナーゼ４ＤＮＡ配列、配列番号１は、非常に特異 的なオリゴヌクレオチドのプローブとのハイブリダイゼーションに基づいて後記 「原材料および方法」の項の記載に従い製造されたテンサイｃＤＮＡライブラリ ーから単離されたｃＤＮＡクローンに基づいて決定された。オリゴヌクレオチド プローブは、後記「原材料および方法」および実施例１の記載に従い得られた実 質的に純粋なテンサイキチナーゼ４から製造されたトリプシンのペプチドに基づ いて製造された。キチナーゼ４ＤＮＡ配列の単離に使用される方法は、後記実施 例４で概説されている。

本発明以前に、テンサイキチナーゼ４酵素のアミノ酸配列またはテンサイキチナ ーゼ４をコードするＤＮＡ配列が報告されたことは無く、これらの配列をめるの が興味深いものであり得るという指摘が為されたことも無かった。事実、小さな 機能性ドメインを伴う酵素を示したテンサイキチナーゼ４の初回分析は、キチナ ーゼ酵素が低いキチン親和力、すなわち低い酵素活性を有することを示唆した。

すなわち、この酵素が特に興味をひくものであるとは思われなかった。

テンサイキチナーゼ４のアミノ酸配列の解明は、酵素分析における重要な段階で あった。すなわち、アミノ酸配列からは、先導配列、ヘベインドメインおよび機 能性（触媒性）ドメインが含まれるという点で、テンサイキチナーゼ４が、ヘベ イン類の植物キチナーゼ類に属することは明らかであった。へベインはキチンに 結合するレクチンであり、酵素のへベインドメインは、例えば植物病原菌のキチ ンおよびキチン含有構造に結合すると予測される酵素の一部分である。

ガボリアウド等（１９８７）による方法を用いた疎水性クラスター分析により、 キチナーゼ４の一次構造は、テンサイキチナーゼ２類（より詳細に後述されてい る）に属する他の植物キチナーゼの構造よりもち密であることが見出された。酵 素を例えば病原菌の細胞壁におけるキチン構造に接近させ得るためには、キチナ ーゼ４のち密な構造が有利であることは予測される。

さらに、他の既知塩基性キチナーゼとは対照的に、キチナーゼ４は、酵素が細胞 内空間へ転座されるため、液胞へは転座されないことを意味するＣ−末端伸長部 を欠くことが見出された。細胞内空間における酵素の存在は、実験的に証明され ている。

テンサイキチナーゼ４は、驚異的に高い抗菌活性を有することが見出され、病原 菌の成長に対する特に優れた阻害作用を示した。さらに、病原菌制御においてテ ンサイキチナーゼ４、第２の異なるキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼ の組み合わせを使用すると、テンサイキチナーゼ４単独使用の場合と比べてより いっそう改善された抗菌活性が獲得されることが見出された。この相乗的抗菌効 果は、この出願に関連して初めて報告されている。

従って、別の重要な態様において、本発明は、配列番号１に示されているキチナ ーゼ４ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列、または上述のその類縁体またはその部分配 列（下記で詳述されている）の１つまたはそれ以上のコピー、 テンサイキチナーゼ４とは異なる第２キチナーゼをコードするＤＮＡ配列の１つ またはそれ以上のコピー、および β−１，３−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上のコピ ー を含み、ＤＮＡ配列の各々が、ＤＮＡ配列を機能的ポリペプチドへ発現させ得る プロモーターおよび転写ターミネータ−に機能し得るように結合されている、遺 伝子構築物に関するものである。

以下、遺伝子構築物の構成成分および相乗的効果についてさらに詳しく説明する 。

本発明の遺伝子構築物の主たる用途は、キチン含有植物病原体、例えば植物病原 菌に対し、上記構築物を含まない植物、例えば非形質転換または天然植物と比べ て強い耐性を有する遺伝子形質転換植物の製造に存する。遺伝子形質転換植物は 、本発明の遺伝子構築物をもつ植物形質転換ベクターの使用により有利に製造さ れる。

また、キチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体、および特にその特異的部分配 列（さらに下記で検討されている）は、上記のキチナーゼ４遺伝子群に属するＤ ＮＡ配列の単離にも使用され得る。また、キチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類 縁体または本発明遺伝子構築物は、強力な抗菌活性を有するポリペプチド、例え ば組換えテンサイキチナーゼ酵素、またはポリペプチド混合物の製造方法で使用 され得る。上記ポリペプチドまたはポリペプチド混合物は、組換えＤＮＡ技術の 使用により製造され得、そして様々な製品、特に食物製品の抗菌処理に使用され 得る。

発明の詳細な説明 キチナーゼ４ＤＮＡ配列、配列番号１は、塩基性テンサイキチナーゼ４酵素をコ ードし、そのアミノ酸配列はまた配列番号２から明らかである。本明細書におい て、「キチナーゼ４」および「テンサイキチナーゼ４」という語は互換的に使用 されている。

本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列およびその類縁体の独特な一特性は、それらが テンサイキチナーゼ４の抗菌活性を有するポリペプチドをコードすることである 。テンサイキチナーゼ４の抗菌活性は、それがキチナーゼ４活性およびリソチー ム活性から成る２機能活性であることを特徴とする。本発明者らが知るところで は、この２機能活性が、へベイン類の他の塩基性植物キチナーゼに関して現在ま でに報告されたことは無い。

この明細書において、「テンサイキチナーゼ４の抗菌活性」という語は、この酵 素の独特な２機能活性、すなわちテンサイキチナーゼ４に見られるキチナーゼ活 性およびリソチーム活性の組み合わせを意味する。

「キチナーゼ活性」という語は、この酵素がキチンおよびキチン含有構造を分解 し得ることを意味し、キチナーゼ活性は、１）生物検定および２）化学検定によ り測定され得る。生物検定では、病原菌の生長中の菌糸に対するキチナーゼ４の 作用、すなわち菌糸壁を破壊することにより菌糸の生長を遅れさせるキチナーゼ ４の能力が直接観察される。化学検定では、キチナーゼ４による３Ｈ−キチンの 分解の結果主にキチンの２量体の生成される様子がモニターされる。

生物検定は、この明細書で「抗菌活性」という標題で「原材料および方法」に記 載された３つの相異なる方法のいずれかを用いて行なわれ得る。これらの方法の いずれかにおいて陽性の結果が得られた場合、すなわち、菌糸壁の破壊および菌 糸の生長の遅延が観察された場合、それは生物学的キチナーゼ４活性の証拠とし てみなされる。

化学検定は、「放射化学キチナーゼ検定」という標題で「原材料および方法」に 記載された要領に従い行なわれ得る。キチナーゼ４活性は、この検定では３Ｈ− キチンの加水分解およびその結果としてキチンの主たる２量体の形成により示さ れる。

「リソチーム活性」という語は、酵素の菌細胞壁溶解能力を意味する。リソチー ム活性は、「リソチーム検定」という標題で「原材料および方法」に記載された リソチーム検定を行うことにより測定される。

テンサイキチナーゼ４の抗菌活性は、植物病原菌の菌糸壁の成分、例えばキチン を破壌することにより菌の生長を阻止または遅らせるポリペプチドの能力を反映 する定性的および定量的尺度であるものと理解される。

キチナーゼ４ＤＮＡ配列の類縁体は、上記で列挙した特性ｉ）　−ｉｖ）のうち の少なくとも１つを有するＤＮＡ配列である。本発明類縁体の定義に使用されて いる語については、下記で詳述する。

上記１）記載の類縁体に関連して使用されている「特徴的部分」という語は、キ チナーゼ４ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列から得られるか、またはキチナーゼ４ ＤＮＡ配列の一部に対応するヌクレオチド配列を有し、テンサイキチナーゼ４の 抗菌活性を保持したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。典 型的には、特徴的部分はキチナーゼ４ＤＮＡ配列の部分配列を含んでおり、この 部分配列は、キチナーゼ４ＤＮＡ配列のヌクレオチドの連続的伸長部であるか、 またはキチナーゼ４ＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上の別々のヌクレオチド配列 により構成される。キチナーゼ４ＤＮＡ配列の特徴的部分によりコードされるポ リペプチドにその特徴的抗菌活性を保持させ得るためには、その部分は、通常キ チナーゼ４ＤＮＡ配列よりもごく少数短い、例えば１−５０、例えば１−２５ヌ クレオチド短いものである。

キチナーゼ４ＤＮＡ配列の特徴的部分の典型例は、キチナーゼ４の活性部位をコ ードするヌクレオチドを含む。

上記ｌｉ）記載の類縁体は、「キチナーゼ４遺伝子群に属するＤＮＡの同定」と いう標題で「原材料および方法」の項に明記された条件下、キチナーゼ４ＤＮＡ 配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列である。行なわれるハイブリダイゼーショ ンに関して定義された条件は、若干の既知植物キチナーゼおよびテンサイキチナ ーゼ４により行なわれたハイブリダイゼーション実験に基づいており、後記実施 例１１で詳述されている。

本明細書において、上述の「原材料および方法」の項に明記されたハイブリダイ ゼーション条件下でキチナーゼ４ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列は 全て、キチナーゼ４遺伝子群に属するものと定められ、テンサイキチナーゼ４の 構造および抗菌活性を有するポリペプチドをコードすると予測される。さらに、 上記ＤＮＡ配列から製造されたポリペプチドが、テンサイキチナーゼ４に対して 産生した抗体と反応する場合、それは、問題のＤＮＡ配列によりコードされるポ リペプチドがテンサイキチナーゼ４の血清学的種類に属するという強い指標とな る。本発明の一部を構成する上記ＤＮＡ配列は、天然供給源、例えば植物から単 離された配列、合成的に製造された配列を含み得るか、または合成的に修飾され たＤＮＡ配列、例えば下記の配列であり得る。以後、キチナーゼ４遺伝子群に属 するＤＮＡ配列を、「キチナーゼ４関連ＤＮＡ配列」とも称する。

上記１ｉｉ）記載の類縁体は、配列番号２に示されたアミノ酸配列、すなわち成 熟キチナーゼ４酵素のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 である。同じアミノ酸が様々なコドンによりコードされ得、コドンの使用は特に ヌクレオチド配列を発現する問題の生物の優先性と関係があることはよく知られ ている。すなわち、本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上のヌ クレオチドまたはコドンは、発現時に問題のキチナーゼ４ＤＮＡ配列によりコー ドされるポリペプチドと同一または実質的に同一であるポリペプチドを生ずる他 のヌクレオチドまたはコドンと交換され得る。

上記ｉｖ）記載の類縁体は、テンサイキチナーゼ４に対して産生ずる抗体により 認識されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である。本明細書において、「 により認識される」という語は、「に結合する」と互換的に使用される。後記実 施例３に記載されている通り、テンサイキチナーゼ４酵素は、現在までのところ 文献で報告されていない塩基性キチナーゼ４の新しい血清学的種類に属するとい うことが見出された。菜種キチナーゼの最新血清学的分析は、キチナーゼおよび テンサイキチナーゼ４間の密接な血清学的類似性を示しており、分析された菜種 キチナーゼが塩基性キチナーゼ４の同じ新規種類に属することを示している。

本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドおよび別の起 源のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチド間の血清学的関係を測定するの に使用される抗体は、単一特異的ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体 であり得る。特に適当な抗体は、キチナーゼ４ＤＮＡ配列によりコードされる１ つまたはそれ以上の特徴的エピトープに対して生産されるモノクローナルまたは ポリクローナル抗体である。それらのエピトープについては下記で詳解する。

ここで説明されている本発明のＤＮＡ配列は、天然および合成りＮＡ配列を含み 得、一般に天然配列は、例えば後述されている、通常植物由来のｃＤＮＡまたは ゲノムＤＮＡから直接誘導され得る。合成配列は、例えば固体または液体相ＤＮ Ａ合成における原理、例えばＤＮＡ合成装置３８１Ａ（アプライド・バイオシス テムズ）を用いて、ＤＮＡ分子の合成的製造に関する常法により製造され得る。

勿論、ＤＮＡ配列はまた、混合ｃＤＮＡおよびゲノム、混合ｃＤＮＡおよび合成 並びに混合ゲノムおよび合成起源によるものであり得る。

以後、キチナーゼ４ＤＮＡ配列の組成および配列番号１に示されたＤＮＡ配列に よりコードされるキチナーゼ４酵素のドメインの各々および配列番号２に示され たアミノ酸配列についてさらに詳述し、他の植物性キチナーゼと比較する。

キチナーゼ４ＤＮＡ配列番号１は、２３アミノ酸残基をコードする先導配列（ヌ クレオチド２−７０）、３５アミノ酸残基のヘベインドメインをコードする一部 分（ヌクレオチド７ｌ−１７４）および２０６アミノ酸残基の機能的ドメインを コードする一部分（ヌクレオチド１７５−７９３）を含む。成熟ポリペプチド鎖 のＮ−末端部分は遮断されており、慣用的アミノ酸配列決定法により配列の決定 は不可能であった。しかしながら、小麦麦芽凝集素（ＷＧＡ−Ａ）およびじゃが いもキチナーゼのＤＮＡ配列との比較並びに電気スプレー質量分析法による分析 （実施例４参照）に基づき、キチナーゼ４ＤＮＡ配列の開始コドンは推測された 。キチナーゼ４ＤＮＡ（配列番号１）由来の先導配列およびゲノムキチナーゼ４ ＤＮＡ（配列番号３）由来の先導配列間の比較結果は、キチナーゼ４ＤＮＡ（配 列番号１）からの先導配列において最初の２ヌクレオチドが失われていることを 示している。

すなわち、ゲノムキチナーゼ４の先導配列は２４アミノ酸残基により構成されて おり（配列番号４）、キチナーゼ４からの先導配列は２４アミノ酸残基により構 成されているが、はぼ完全長のキチナーゼ形態ｃＤＮＡは最初のアミノ酸Ｍｅｔ を失っている（配列番号２）。

植物キチナーゼは、３つの異なるグループ、すなわちヘベイン類、非ヘベイン類 およびキュウリ類に分割され得る。

テンサイキチナーゼ４は、ヘベイン類に属する塩基性キチナーゼである。しかし ながら、それは、この種類の他の塩基性キチナーゼとは明らかに異なる。まめ、 タバコ、トマト、じゃがいも、エントウ、大麦（ＴおよびＫ）およびテンサイ（ キ参照）、キチナーゼ４は小さく、分子量は約２６ｋＤａである（成熟酵素に関 して測定）。さらに、キチナーゼ４に対して産生じた抗体は上述の他の塩基性キ チナーゼを認識しないので（実施例１０参照）、キチナーゼ４はまた、へベイン 類からの全ての他の塩基性植物キチナーゼとは異なる血清学的分類に属すること が明らかである。

アミノ酸配列に基づいて決定された成熟キチナーゼ４の一次構造は、２つの相異 なるドメイン・ヘベインドメインおよび機能的ドメインを含む。ポリペプチド鎖 のＮ−末端部では、へベイン構造と比べて３５アミノ酸残基のうちの１２が保存 されている。機能的ドメインは、２０６アミノ酸残基を含む。ニコチアナ・タバ クム（品種ハバンナ）（シンク等、１９８９）由来の塩基性キチナーゼでは、へ ベインドメインは４３アミノ酸残基により構成され、機能的ドメインは２６３ア ミノ酸残基を含む。キチナーゼ４のヘベインドメイン（すなわち、キチン結合性 ドメイン）は、タバコキチナーゼのそれよりも短いが、キチナーゼ４は、へベイ ン類に属する他の塩基性キチナーゼのそれと似た大きさの結合親和力を有する。

比較するため、非ヘベイン類からのキチナーゼを調べると、結合性は非常に乏し いかまたは全く観察されない。この種類のキチナーゼはへベインドメインを含ま ず、機能的ドメインのみを含む。へベイン類および非ヘベイン類間の機能的ドメ インの相同性は非常に高い。さらに、ヘベイン類からのキチナーゼに対して産生 じたポリクローナル抗体は、非ヘベイン類からのキチナーゼを認識する。

一般に、非へベイン類、タバコからの酸性キチナーゼおよび大麦からの塩基性キ チナーゼの比活性（クラ７に、Ｍ、、ｒチーシスＪ、１９９０）は、ヘベイン類 キチナーゼの場合よりも約６倍低い。

キチナーゼ４における機能的ドメインは、塩基性タバコキチナーゼの機能的ドメ インの２６３アミノ酸残基と比べて２０６アミノ酸残基しか含まないため、比活 性の低下が予測された。しかしながら、キチナーゼ４は、非常によく機能し、本 発明者らが下記「原材料および方法」記載の放射化学酵素検定により分析すると 、大麦からのキチナーゼＴ、におよびＣより優れている（結果は示さず）ことが 示されＩこ。

上記説明から、配列番号１に示されたキチナーゼ４ＤＮＡ配列の最も重要な部分 は、ヘベインドメインをコードする部分および特に酵素の機能的ドメインをコー ドする部分であることが明らかである。はとんどの場合における先導配列の存在 は、ＤＮＡ配列から発現されるポリペプチドを、それが製造される細胞から輸送 するための必要条件であるが、使用される特定先導配列の性質および起源は変化 し得、キチナーゼ４酵素が天然に随伴する先導配列である必要は無い。さらに、 コードされたポリペプチドの標的を細胞外空間に定める場合、キチナーゼ４酵素 が天然に随伴する先導配列は、植物、特にテンサイ植物での形質転換における異 種遺伝子構築物に使用され得る。

これによると、本発明による特に興味深いＤＮＡ配列は、配列番号１に示された キチナーゼ４ＤＮＡ配列のヌクレオチド７１−７９３を含み、テンサイキチナー ゼ４酵素のヘベインドメインおよび機能的ドメインをコードするＤＮＡ配列、ま たは前記ＤＮＡ配列の類縁体である。

「類縁体」という語は、 Ａｉ）　前記ＤＮＡ配列の特徴的部分である、Ａ１１）　前記ＤＮＡ配列から製 造されたＤＮＡプローブとハイブリダイズする、Ａ１１ｉ）前記ＤＮＡ配列によ りコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード する、またはＡ　ｉｖ）　前記ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドに対 して産生じた抗体により認識されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を包含 する。

本発明のさらに別の興味深いＤＮＡ配列は、配列番号１に示されたキチナーゼ４ ＤＮＡ配列のヌクレオチド１７５−７９３を含み、テンサイキチナーゼ４酵素の 機能的ドメインをコードするＤＮＡ配列、または前記ＤＮＡ配列の類縁体である 。

「類縁体」という語は、 Ｂｉ）　前記ＤＮＡ配列の特徴的部分である、Ｂ　ｉｉ）　前記ＤＮＡ配列から 製造されたＤＮＡプローブとハイブリダイズする、Ｂ　１ｉｉ）前記ＤＮＡ配列 によりコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ードする、またはＢ　ｉｖ）　前記ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチド に対して産生した抗体により認識されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を 包含する。

上記特性Ａｉ）−Ａｉｖ）および１３ｉ）−Ｂｉｖ）により定義される類縁体は 、上記特性１）−ｉｖ）により定義されるキチナーゼ４ＤＮＡ配列の類縁体と同 様の方法で定義される。

さらに別の態様において、本発明は、テンサイキチナーゼ４遺伝子を含むＤＮＡ 配列に関するものである。本明細書において、「遺伝子」という語は、ポリペプ チド鎮の製造に必要とされ、暗号化領域に前後する領域（５゛−上流および３゛ −下流配列）並びに個々の暗号化セグメント（いわゆるエクソン）間または５゛ −上流もしくは３゛−下流領域に位置する介在配列、いわゆるイントロンを含む ＤＮＡ配列を示すのに使用される。５゛−上流領域は、遺伝子の発現を制御する 調節配列、一般的にはプロモーターを含む。３゛−下流領域は、遺伝子の転写終 結に必要とされる配列および所望により転写物のポリアデニル化に関与する配列 および３°非翻訳領域を含む。

キチナーゼ４遺伝子を含む本発明のＤＮＡ配列の一例は、ゲノムキチナーゼ４ク ローン（ｃｈｉｔ４）に含まれるゲノムテンサイＤＮＡ配列であり、その単離は 実施例４に記載されている。遺伝子の部分ヌクレオチド配列は既に解明されてお り、配列番号３に示されている。部分ＤＮＡ配列と、配列番号５に示され、さら に後記で検討されているキチナーゼ７６遺伝子のＤＮＡ配列および配列番号１に 示されたキチナーゼ４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較に基づくと（比較は図 ２４に示されている）、キチナーゼ４遺伝子配列のヌクレオチド３５６−３５８ は、キチナーゼ４遺伝子の開始コドンを構成すると考えられる。

キチナーゼ７６配列（１イントロンを含む）および配列番号１１に示されたキチ ナーゼ１のＤＮＡ配列（２イントロンを含む）による比較に基づ（と、キチナー ゼ４遺伝子は、ＡＴＧ開始コドンの下流ヌクレオチド３９８から始まる唯一のイ ントロンを含むと考えられる。イントロンの位置は、配列番号１に示されたキチ ナーゼ４ｃＤＮＡ配列におけるヌクレオチド３９５および３９６間の位置に対応 すると考えられている。

キチナーゼ４遺伝子の可能な５゛調節配列は、後記実施例１７および１８に示さ れている。

上述した通り、テンサイキチナーゼ４のアミノ酸配列を知ると、酵素の分析およ び酵素の重要な部分の解明が可能となり、これは例えば他の既知キチナーゼのア ミノ酸配列との比較に基づいて行なわれる。酵素の特に興味深い部分は、例えば 酵素の活性部位を含む部分、酵素のエピトープを含む部分および酵素の基質特異 性および／または結合特性に関与する部分である。

テンサイキチナーゼ４酵素の活性部位の予想位置は、例えば後記実施例１６に説 明されている他のオリゴ糖の加水分解を触媒する他の既知酵素の活性部位との比 較により示された。すなわち、テンサイキチナーゼ４の活性部位は、配列番号２ におけるアミノ酸残基１８３　（Ａｓｐ）および１８９（Ｇｌｕ）により構成さ れると考えられる。

慣用的Ｘ線結晶学分析の使用により解明され得るキチナーゼ４酵素の３Ｄ−構造 および酵素のアミノ酸配列に基づくと、酵素の特異的特性に関与する酵素部分の 予測ができる。すなわち、上記で明らかにされる活性部位に加えて、酵素の基質 特異性および基質結合性に関与する酵素の特異的アミノ酸もまた予見または解明 され得る。また、酵素のエピトープを形成するアミノ酸残基も解明され得る。

前記の特異的アミノ酸に関する知識に基づ（と、酵素を特異的に修飾することに より、例えば高い触媒活性、改善された、すなわち拡大された基質特異性、改善 された基質、例えばキチン結合性または修飾されたエピトープに関して、酵素の 作用の修飾モードを得ることが可能となる。それらの修飾は、例えば後記実施例 １６に記載されている通り、蛋白工学技術、例えば位置指定突然変異導入法のよ く知られた原理の使用により達成され得る。

−例として、１６９．２０４および２０６位におけるＴｒｐ残基の１個またはそ れ以上をＴｙｒ残基により置き換えると、触媒部位に対する基質（キチン）の結 合性および恐らくは基質特異性が変化すると予測される。同様に、活性部位を構 成するアミノ酸残基または折り畳まれた酵素の構造を形成するアミノ酸残基の変 更は、例えば触媒活性、基質特異性および／または基質結合性に影響すると予測 され、生成した修飾酵素の改善された特性を導き出すことが見出され得る。勿論 、行なわれる修飾の性質は、目的とする成果、すなわち生成した修飾酵素の特異 的目的機能により異なる。

本発明のＤＮＡ配列によりコードされるキチナーゼ４酵素と対応して、修飾キチ ナーゼ４酵素をコードするＤＮＡ配列は、単独または他の蛋白、例えば病原関連 蛋白質、例えばタウマチン、オスモシンおよび／またはゼアマチン（フィーゲル ス、１９９１）またはチオニン（ボールマン等、１９９１）、セルクロピン（Ｊ 。

ジャイネス、１９８９）または他の酵素、例えばキチナーゼおよびβ−１，３− グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列と組み合わせた形で、特に高く有利な抗菌 活性を有する遺伝子形質転換植物、好ましくはテンサイ植物の構築に使用され得 る。

また、修飾キチナーゼ４酵素は、下記抗菌組成物の特に興味深い成分であること が判明し得る。

一遺伝子群内では、遺伝子の暗号化領域間の相同性の度合は高いことが予測され 、非暗号化領域間では相同性は低いことが予測される。異なる遺伝子群間では、 相同性はかなり変動し得る。ここで使用されている「相同性」という語は、マイ アーズおよびミラー、バージョン１．０５（１９９０年９月）によるコンピュー タープログラムの使用により、比較マトリックス：遺伝子コード、オーブン・ギ ャップ・コスト６およびユニット・ギャップ・コスト１を用いて決定される所定 のポリペプチドのアミノ酸配列および分析されている別のポリペプチドのアミノ 酸配列間の相補性の度合の存在を意味する。マイアーズおよびミラー（１９８８ ）も参照。すなわち、相異なる遺伝子間、特に暗号化領域間の相同性の度合を用 いることにより、相異なる遺伝子間の近親性の度合が評価され得る。アミノ酸配 列は、ＤＮＡ配列から推理され得るか、または慣用的アミノ酸配列決定法により 得られる。相同性の度合は、好ましくは成熟蛋白質に基づいて、すなわち先導配 列を考慮に入れずに決定される。

これによると、本発明は、ＤＮＡ配列：配列番号１によりコードされるテンサイ キチナーゼ４酵素と少なくとも６０％の相同性を示し、配列番号１１に示された ＤＮＡ配列によりコードされるテンサイキチナーゼ１との相同性が多くとも４０ ％であるキチナーゼイソ酵素をコードするＤＮＡ配列に関するものである。少な くとも６０％という相同性の最小度合は、テンサイキチナーゼ４血清学的種類に 属することが示された菜種キチナーゼの（成熟蛋白質に基づく）分析に基づいて 決定された（実施例１１参照）。キチナーゼ１（キチナーゼ４の種類には属しな い）との４０％という相同性の度合は、キチナーゼ４の種類に属するポリペプチ ドに関して許容し得ることが予憇される最小度合を表す。

勿論、キチナーゼ４酵素との相同性の度合が高く、そのためキチナーゼ１酵素と の相同性の度合が低いということは、これとのさらに高い類似性を示しているた め、上記ＤＮＡ配列は、好ましくはＤＮＡ配列：配列番号１によりコードされる テンサイキチナーゼ４酵素との相同性が少な（とも６５％、例えば少なくとも７ ０％、例えば少なくとも７５％または好ましくは８０％であり、および／または ＤＮＡ配列：配列番号１１によりコードされるテンサイキチナーゼ１酵素との相 同性が多くとも３８％、例えば多くとも３５％であるキチナーゼイソ酵素をコー ドする。

テンサイキチナーゼ４酵素との相同性が約７５％であり、テンサイキチナーゼ１ 酵素との相同性が多くとも４０％であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の 一例は、実施例５の記載に従い得られたゲノムクローンのキチナーゼ７６に含ま れるゲノムＤＮＡ配列（キチナーゼ７６、その配列は配列番号５に示されている ）である。

実施例１０から、テンサイの葉から単離されたテンサイキチナーゼ４は、このテ ンサイキチナーゼに対して産生じた抗体によって認識されるが、テンサイキチナ ーゼ２に対して産生じた抗体によっては認識されないことが明らかである。これ は、テンサイキチナーゼ４がテンサイキチナーゼ２とは異なる種類のキチナーゼ に属すること、すなわちテンサイキチナーゼには相異なる２つの種類が存在する という事実を非常に強く示唆している。キチナーゼ４群に属する他のポリペプチ ドも似た反応パターンを示すことが予測されるため、本発明は、さらにテンサイ キチナーゼ４に対して産生じた抗体によって認識されるが、テンサイキチナーゼ ２に対して産生した抗体によっては認識されないポリペプチドをコードするＤＮ Ａ配列を含む。

さらに別の態様において、本発明は、キチナーゼ４ＤＮＡ配列または遺伝子を含 む上記ＤＮＡ配列またはその類縁体を含む修飾ＤＮＡ配列であって、少なくとも １個のヌクレオチドが欠失、置換または修飾されているか、または少なくとも１ 個の追加的ヌクレオチドが挿入されることにより、テンサイキチナーゼ４の抗菌 活性が保持されているかまたはテンサイキチナーゼ４と比べて高い抗菌活性を有 するポリペプチドをコードする修飾ＤＮＡ配列に関するものである。修飾ＤＮＡ 配列によりコードされるポリペプチドは、通常、テンサイキチナーゼ４のアミノ 酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。本発明の修飾ＤＮＡ配列は、キチナー ゼ４と比べて高い抗菌活性を有する新規ポリペプチドの製造において重要である ことが判る。

「置換」が行なわれる場合、完全ヌクレオチド配列における１個またはそれ以上 のヌクレオチドが、１個またはそれ以上の異なるヌクレオチドと置き換えられ、 「付加」が行なわれるとき、１個またはそれ以上のヌクレオチドが完全ヌクレオ チド配列のいずれかの端に加えられ、「挿入」が行なわれるとき、完全ヌクレオ チド配列内の１個またはそれ以上のヌクレオチドが挿入され、そして「欠失」が 行なわれるとき、１個またはそれ以上のヌクレオチドが、配列のいずれかの端ま たは配列内の適当な地点で完全ヌクレオチド配列から欠失される。

修飾ＤＮＡ配列は、よく知られた方法、例えば位置指定突然変異導入法の使用に より得られる。

さらに別の態様において、本発明は、テンサイキチナーゼ４の抗菌活性を有する 必要は無いが、前記活性を有し得るポリペプチドをコードする配列番号１のキチ ナーゼ４ＤＮＡ配列の部分配列に関するものである。キチナーゼ４ＤＮＡ配列ま たはゲノムＤＮＡ配列の特に興味深い部分配列は、テンサイキチナーゼ４酵素の 活性部位を画定するヌクレオチドを含む部分配列である。前記部分配列の一例は 、テンサイキチナーゼ４酵素の活性部位を含むＤＮＡ配列、例えば配列番号２の アミノ酸番号１７９−２００から成るペプチド４−２２（慣用的１文字アミノ酸 コードの使用により示される）と呼ばれる下記ペプチドをコードするＤＮＡ配列 である。

Ｓ−１−Ｇ−Ｆ−Ｄ−Ｇ−Ｌ−Ｎ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｎ−Ａ−Ｖ− Ｔ−Ａ−Ｆ−Ｒこの配列は、後記実施例１６記載の精製テンサイキチナーゼ４か ら得られるトリプシンペプチド４−２２のアミノ酸配列である。このポリペプチ ドをコードするＤＮＡ配列は、生成したポリペプチドの抗菌活性を改善する目的 で活性部位の修飾を行う場合に著しい重要性を有し得る。さらに、ＤＮＡ配列は 、テンサイキチナーゼ４の抗菌活性を有するハイブリッド酵素を得る目的で、テ ンサイキチナーゼ４とは異なる酵素をコードする別のＤＮＡ配列の一部に融合さ れるか、またはその活性部位をコードする前記酵素の一部により置換され得る。

勿論、ハイブリッド酵素のポリペプチド鎖は、活性部位の回りに有用な立体配座 を与えるために正確な方法で折り畳まれ得るべきである。

キチナーゼ４酵素の一部をコードするさらに別の興味深いＤＮＡ配列は、配列番 号６のアミノ酸番号１８３−２０４により構成される下記アミノ酸配列を有する ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である。

５−Ｉ−Ｇ−Ｆ−Ｄ−Ｇ−Ｌ−Ｎ−Ａ・Ｆ’−Ｅ−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｄ−Ａ−Ｖ −Ｉ−Ａ−Ｆ−にこのポリペプチドは、配列番号５に示されているゲノムキチナ ーゼ７６クローンのＤＮＡ配列から推理され、太字のＤがペプチド４−２２にお けるＮであるという最も重要な事実を除くと、上記で与えられたペプチド４−２ ２のＤＮＡ配列にほぼ対応する。キチナーゼ７６由来のポリペプチドは、ペプチ ド４−２２と同じまたはほぼ同じ興味深い特性および用途を有し得ると考えられ る。

２つのさらに別の興味深いＤＮＡ配列は、配列番号２のアミノ酸番号１６３−１ ６９により構成される下記ペプチドをコードする配列である。

Ｇ−Ｐ−Ｌ−Ｑ−１−Ｔ−Ｗ これは、キチナーゼ４のトリプシンペプチド４．１９．３であり、ＤＮＡ配列は 、配列番号２のアミノ酸番号２０１−２２４から成るトリプシンペプチド４−２ ６をコードする。

Ｔ−Ａ−Ｆ−Ｗ−Ｆ−Ｗ−Ｍ−Ｎ−Ｎ−Ｖ−Ｈ−５−Ｖ−Ｉ−Ｖ−Ｎ−Ｇ−Ｑ− Ｇ−Ｆ−Ｇ−Ａ−３−１この配列は、後記実施例１６に記載されている。これら のペプチドは、各々１個および２個のＴｒｐ残基を含む。Ｔｒｐ残基は、例えば 後記実施例１６でさらに詳しく検討されている通り、キチナーゼ４酵素の活性部 位および／または基質特異性に関与すると予測される。少なくとも１個のヌクレ オチドが欠失、置換または修飾されているか、または少なくとも１個の追加的ヌ クレオチドが挿入され、キチナーゼ４ＤＮＡ部分配列によりコードされる３つの 上記ペプチドの場合と同様に依然として触媒および／または結合活性を有するこ れらの上述の部分配列の類縁体は、非常に興味深いものであり得る。

本発明による興味深い部分配列の別の例は、テンサイキチナーゼ４酵素のへベイ ンドメインを含むポリペプチドをコードする配列番号１のキチナーゼ４　ＤＮＡ 配列の部分配列、または少な（とも１個のヌクレオチドが欠失、置換または修飾 されたか、または少なくとも１個の追加的ヌクレオチドが挿入された前記部分配 列の類縁体であり、前記部分配列が、「キチン・カラムの製造」という標題で「 原材料および方法」に記載された要領により製造された再生キチンに関するアフ ィニティー°カラムクロマトグラフィーによって測定された通りキチンに結合し 得るポリペプチドをコードしている類縁体である。

キチナーゼ４酵素のへベインドメインがち密であり、非常に有効である、すなわ ちキチンへの緊密な結合を確立し得ると考えられるという事実があるため、この ドメインは、キチナーゼ類により強力なキチン結合能力を付与する目的でへベイ ンドメインが弱いか全く存在しないキチナーゼ類、例えば他の植物キチナーゼを 修飾する場合に非常に有用であることが証明され得る。テンサイキチナーゼ４４ のヘベインドメインをコードするＤＮＡ配列の挿入により有利に修飾され得るキ チナーゼの例は、非ヘベイン類またはキュウリ類のキチナーゼ（例、本明細書に 開示されているテンサイキチナーゼＳＥ）である。

本発明のさらに別の興味深い部分配列は、キチナーゼ４の先導配列をコードする 配列番号１のキチナーゼ４ＤＮＡ配列の部分配列、または少なくとも１個のヌク レオチドが欠失、置換または修飾されたか、または少な（とも１個の追加的ヌク レオチドが挿入されており、融合した先導およびパラセンジャー・ポリペプチド が生成される細胞内から融合しているパラセンジャー・ポリペプチドを指図する ことにより、細胞外空間で堆積させ得るその類縁体である。

上記で説明されたところによると、テンサイキチナーゼ４酵素のエピトープを用 いることにより、キチナーゼ４血清学的分類に属するキチナーゼ４イソ酵素の同 定およびエピトープの地図作製に有用な単一特異性ポリクローナルおよびモノク ローナル抗体が生成され得る。適当なエピトープは、テンサイキチナーゼ４以外 のキチナーゼのペプチド部分とは実質的に異なると思われるため、これらのペプ チドは、配列番号２のキチナーゼ４アミノ酸配列の親水性ペプチド間から見出さ れることが予測される。抗体（モノクローナル、単一特異性または長持異性）は 、常法を用いて、例えばテンサイキチナーゼ４酵素の合成的に製造されたペプチ ド部分に基づき後記「原材料および方法」の項記載の要領により製造され得る。

キチナーゼ４ＤＮＡおよびアミノ酸配列の慣用的コンピューター分析に基づき、 配列番号２に示された配列の可能な下記エピトープが同定された。

ペプチド１：ＡＧＫＲＦＹＴＲＡ（アミノ酸番号８７−９５により構成される） ペプチド２：ＣＮＰＳＫＱＹＹ（アミノ酸番号１５３−１６０により構成される ）ペプチド３：ＩＥＣＮＧＧＮＳ（アミノ酸番号２３０−２３７により構成され る）ペプチド４：ＴＡＲＶＧＹＹＴＱＹＣＱ（アミノ酸番号２４１−２５２によ り構成される） これらのエピトープは、テンサイキチナーゼ４に対する単一特異性抗体の製造に 特に適していると考えられる。ペプチド１およびペプチド４は、キチナーゼ４に 対する単一特異性抗体の製造での使用に最も適当なペプチド配列であると考えら れる。

例えば上記で説明した要領で、１個またはそれ以上のヌクレオチドが修飾されて おり、部分配列の機能および／または特徴が実質的に保持されている本発明の部 分配列を含むＤＮＡ配列も、本発明の範囲内に含まれるものと理解すべきである 。

上述されたところによると、細菌性および植物性のキチナーゼが存在する。遺伝 子形質転換植物の構築である、本発明のＤＮＡ配列の重要な用途が説明されてい る本明細書において、最も興味深いタイプのキチナーゼは、植物キチナーゼであ ると考えられ、従って、本発明のＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列は 植物起源のものであるのが好ましい。特に興味深い植物キチナーゼＤＮＡ配列は 、チエノポディアセエ、ソラナセエ、アピアセエ、ブラシカセエ、ククルビタセ エまたはファバセ工科に属する一植物から誘導される。

それらの植物の例は、トウモロコン、アルファルファ、カラス麦、小麦、ライ麦 、米、大麦、モロコン、タバコ、綿、テンサイ、飼料ビート、ヒマワリ、ニン／ ン、キャノーラ、トマト、ジャガイモ、大豆、脂肪種子ナタネ、キャベツ、コン ヨウ、レタス、インゲンマメおよびエントウである。

本発明による配列、部分配列および類縁体に関してここで使用されている「０夕 １月、「部分配列」および「類縁体」という語は、勿論、それらの本来の環境で はこれらの現象を含まないが、例えば単離、精製、インビトロまたは組換え形態 では前記現象を含むものとして理解されるべきである。

上記の本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列および 特に前記ＤＮＡ配列のいずれかの鎮と実質的に相補的である１本鎖ＤＮＡまたは ＲＮＡ配列を用いることにより、他の植物から対応する配列が分離され得、その 場合、所望ならば、ここに記載された要領で修飾され得る。

上記説明から、本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配 列は、例えば融合蛋白質形態で、本発明のＤＮＡ配列の少なくとも一部を他のヌ クレオチド配列（複数もあり得る）と連係的に発現させるのを確実にする条件下 で、第２ポリペプチドまたはその一部をコードする１個またはそれ以上の第２ヌ クレオチド配列に融合され得ることが明らかである。例えば、テンサイキチナー ゼ４酵素の抗菌活性を有するポリペプチドをコードする本発明ＤＮＡ配列は、ポ リペプチドを発現する生物体の特定オルガネラへの、そこから発現された融合蛋 白の輸送を誘発するシグナルペプチドをコードするＣ−末端配列へ有利に融合さ れ得る。輸送に関与するシグナルペプチドについては、後記でより詳細に検討す る。同様に、キチナーゼ４ＤＮＡ配列の興味深い部分配列、例えば上記の配列、 例えばヘベインドメインをコードする部分配列および／またはエピトープは、他 の蛋白、例えば酵素、例えばキチナーゼをコードするＤＮＡ配列に融合されるこ とにより、キチナーゼ４ＤＮＡ配列の部分配列によりコードされるポリペプチド の望ましい特性が蛋白に付与され得る。

また、好ましくは非天然または組換え形態である、上記のキチナーゼ４　ＤＮＡ 配列またはその類縁体または部分配列によりコードされるポリペプチドも本発明 の範囲内に含まれる。天然キチナーゼ４酵素と比較したところ、本発明のポリペ プチドは、それがよく知られた常用的組換え製造技術の使用により、例えばサム プルツク等（１９９０）における記載に従い、容易に大量生産され得ること、お よびそれが天然テンサイキチナーゼ４に通常伴う不純物を含まない形態で得られ るという利点を有する。本発明のポリペプチドは、例えば下記のような抗菌組成 物における一成分として使用され得る。

上記および後記実施例で説明されている通り、テンサイキチナーゼ４酵素は、恐 らくはそのキチナーゼ／リソチームの両活性およびそのち密な構造に起因すると 思われる、他の既知キチナーゼ類、例えば他の既知テンサイキチナーゼ類と比べ て驚異的に高い抗菌活性を含む若干の有利な特性を有することが示された。また 、テンサイキチナーゼ４酵素の強いへベインドメインも、その有利な特性に加わ る。すなわち、テンサイキチナーゼ４をコードするＤＮＡ配列または上記の抗菌 活性を有するポリペプチドをコードするその類縁体は、植物病原菌に対し、非形 質転換植物の場合と比べて高い耐性を有する遺伝子修飾植物の構築において非常 に興味深いものであることが予測される。

従って、別の重要な態様において、本発明は、１）機能し得るように結合された プロモーター２）上記のキチナーゼ４ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列またはその類 縁体または部分配列および ３）ＤＮＡ配列へ機能し得るように結合された転写ターミネータ−を含む遺伝子 構築物に関するものである。

上記遺伝子構築物を遺伝子修飾植物の構築で使用することにより、実施例２で与 えられた方法により測定される高い抗菌活性、すなわち植物病原菌に対する強い 耐性を示す植物が製造され得る。さらに、遺伝子構築物は、植物のキチン分解能 力の増強に使用され得る。上記遺伝子構築物の一例は、後記実施例１８に示され ている。

さらに、テンサイキチナーゼ４の抗菌活性を有するポリペプチドを、酸性キチナ ーゼおよび塩基性β−１，３−グルカナーゼと混合した形で含む組成物により病 原菌（シー・ベティコラおよびティー・ビリデ）を処理すると、前記菌の菌糸の 生長速度は劇的に低減化され、発芽中の胞子の数は減少するという実験が示され た（実施例２参照）。この関係において、テンサイキチナーゼ４を好ましくは植 物起源の他のキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼと組み合わせて使用す ると、相乗作用が一般に観察されると予測される。

すなわち、別の重要な態様において、本発明は、配列番号１に示されたキチナー ゼ４ＤＮＡ配列を含む上記ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列の１つま たはそれ以上のコピー、テンサイキチナーゼ４とは異なる第２キチナーゼ４の活 性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上のコピー 、および／またはβ−１，３−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコード するＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上のコピー を含み、ＤＮＡ配列の各々が、ＤＮＡ配列を機能的ポリペプチドに発現させ得る プロモーターおよび転写ターミネータ−へ機能し得るように結合されている、遺 伝子構築物に関するものである。

キチナーゼまたはβ−１，３−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、好ま しくは植物起源である。キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼ活性は、後 記「原材料および方法」の項で説明されている要領により測定され得る。

特に興味深いのは、 配列番号１に示されたキチナーゼ４ＤＮＡ配列を含む上記ＤＮＡ配列、またはそ の類縁体または部分配列の１つまたはそれ以上のコピー、４０に等しいかまたは それ未満のｐｉを有する酸性キチナーゼをコードするＤＮＡ配列の１つまたはそ れ以上のコピー、および少なくとも９．０のｐｌを有する塩基性β−１，３−グ ルカナーゼをコードするＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上のコピーを含み、ＤＮ Ａ配列の各々が、ＤＮＡ配列を機能性ポリペプチドへ発現し得るプロモーターお よび転写ターミネータ−へ機能し得るように結合されている遺伝子構築物である 。

本明細書では、「酸性キチナーゼ」を、４．０未満のｐＩを有するキチナーゼと して定義する。好ましくは、酸性キチナーゼは、キチンを６量体タイプのキトオ リゴ糖に加水分解するキチナーゼである。酸性キチナーゼは、好ましくは植物に 由来するものである。それらのキチナーゼの例は、キュウリのリソチーム／キチ ナーゼおよびアラビドプシス並びに配列番号７に示されたＤＮＡ配列および配列 番号８示されたアミノ酸配列またはｐｌが多くとも４．０であり、好ましくはｓ Ｈ−キチンを主に６量体に加水分解し得る酸性キチナーゼをコードする前記ＤＮ Ａ配列の類縁体を有する酸性テンサイキチナーゼＳＥである。

本明細書において、「塩基性β−１，３−グルカナーゼ」という語は、９．０よ り高いｐＩを有するβ−１，３−グルカナーゼを意味する。好ましくは、塩基性 β−１，３−グルカナーゼは、例えば後記「原材料および方法」の項に記載され たｓＨ−ラミナリン検定により測定されたところによると、グルカンを主に２量 体に加水分解し得るものである。塩基性β−１，３−グルカナーゼは、好ましく は植物起源のものである。適当な塩基性β−１，３−グルカナーゼの例は、タバ コ（シンシ等、１９９０）、大麦（フィンチャー等、１９８６）またはテンサイ に由来する塩基性β−１，３−グルカナーゼ、例えば塩基性テンサイβ−１，３ −グルカナーゼ４であり、配列番号９に示されたＤＮＡ配列またはｐＩが少なく とも９．０であって、好ましくは３Ｈ−ラミナリンをβ−１，３−グルカンの主 に２量体に加水分解し得る塩基性β−１，３−グルカナーゼをコードするその類 縁体を有する。塩基性テンサイβ−１，３−グルカナーゼ４は、それがアミノ酸 配列番号１０から明らかなようにＣ−末端伸長部を含まないという点で、他の植 物β−１，３−グルカナーゼとは異なる。塩基性テンサイβ−１，３−グルカナ ーゼ４使用の有利な効果は、一部にはこれがＣ−末端伸長部を欠くためであり得 る。

別の興味深いテンサイキチナーゼは、本発明のテンサイキチナーゼ４との相同性 が非常に低いテンサイキチナーゼ１である（上記参照）。テンサイキチナーゼ１ のＤＮＡ配列は、配列番号１１に示されている。ＤＮＡ配列は約６．３ｋｂ長で あり、４３９アミノ酸残基を有するポリペプチドをコードする。配列番号１２に 示されたポリペプチドは、２６アミノ酸残基の先導配列、２０アミノ酸残基のへ ベインドメインおよび２３アミノ酸のＣ−末端伸長部を含む。さらに、この配列 は、２３８アミノ酸を有する非常に興味深いプロリン濃厚ドメインを含み、本発 明の興味深い態様を形成している。

後記実施例２で報告されている実験は、テンサイキチナーゼ４酵素、酸性キチナ ーゼおよび塩基性β−１，３−グルカナーゼを組み合わせると、構成成分の各々 の抗菌活性と比べて抗菌活性が増強されることを示している。この特異な組み合 わせを用いた場合に観察される高い抗菌活性は、一部には酸性キチナーゼ、塩基 性β−１，３−グルカナーゼおよびテンサイキチナーゼ４の作用モードが各々異 なるためであると考えられている。酸性キチナーゼがキチナーゼを主として６量 体に加水分解するものであり（これと比べて、キチナーゼ４は主としてキチンを ２量体に加水分解する）、塩基性α−１，３−グルカナーゼがグルカンを主とし て２量体に加水分解するものである場合、これらの相異なる開裂方式が有利な総 合的効果を生み出すのに関与し得ると考えられる。

さらに、テンサイキチナーゼ４、キチナーゼ４とは異なる第２キチナーゼの活性 を有するポリペプチド、例えば酸性キチナーゼ、およびβ−１，３−グルカナー ゼの活性を有するポリペプチド、例えば塩基性β−１，３−グルカナーゼの組み 合わせを使用した場合に得られる相乗効果は、その組み合わせが、植物病原菌の 細胞壁のキチンおよびグルカンの画構成成分並びにキチンおよびグルカン構成成 分が互いに緊密に架橋を形成している細胞壁の一部をも攻撃するという事実に因 るものと考えられている。さらにβ−１，３−グルカナーゼは、キチン含有植物 病原体、例えば植物病原菌のキチン構造を覆う外部グルカン層を除去すべく作用 するため、キチン構造はキチナーゼの酵素作用に暴露される。

上記の第２キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列 は、例えば既知供給源から得られるか、または例えば本明細書に開示されている 技術の使用により天然供給源から同定および単離され得る。

前記の多数の相異なる遺伝子構築物が設計および製造され得ることが判る。余す ところな（列挙したものは無いが、変更され得る遺伝子構築物の要素は、遺伝子 構築物のＤＮＡ配列の各々のコピー数、ＤＮＡ配列の各々の特定ヌクレオチド配 列、各ＤＮＡ配列に結合されたプロモーターおよびターミネータ−のタイプ、並 びに他に随伴した配列があればそれらの配列、例えばＣ−末端またはＮ−末端配 列（後記）のタイプである。すなわち、本発明の遺伝子構築物は広い範囲内で変 化し得る。通常、選択される遺伝子構築物の上述の可変要素の各々の組み合わせ は、例えば遺伝子量およびＤＮＡ配列の各々の特定ヌクレオチド配列の関数とし て決定され得る達成すべき抗菌作用の目的強度、並びに各ＤＮＡ配列に使用され るプロモーターおよびターミネータ−のタイプおよび強度により異なる。また、 器官に関する植物の特定部分での発現および細胞内および細胞外の位置選定は、 プロモーターおよびターミネータ−のタイプの差異により変化し得る。

しかしながら、所定の生物体、例えば植物で発現される本発明の遺伝子構築物を 設計する場合、遺伝子構築物がコードする１種またはそれ以上の蛋白があまりに も高率で発現されると毒性作用が生じ得ることを承知していなければならず、そ のため、例えば非形質転換生物または上記遺伝子構築物を含まない生物と比べて 、形質転換生物、例えば植物の収率は低（なり得る。また、本発明の遺伝子構築 物が大き過ぎると、それを植物のゲノムへ安定した状態で導入するのは困難であ り得ることから、植物ゲノムから遺伝子構築物の一部または全体が切除され得る 。すなわち、遺伝子構築物は、そこからの発現産物が一般に宿主生物に許容され 得るように適合化されるべきである。

遺伝子の活性と共に本発明の遺伝子構築物のＤＮＡ配列のコピー数は、本発明の 遺伝子構築物のＤＮＡ配列の最適コピー数を決定する。植物遺伝子工学技術分野 に含まれる知識は急速に増大しているため、改良された形質転換および生物学的 封じ込め技術が発展し得、それらの技術により、現時点で可能とされるよりも生 長を遅延させ、収量または組換え事象を妨げること無く大型外来遺伝子フラグメ ントを植物中へ導入する可能性が導かれ得る。

現時点ては、本発明のＤＮＡ配列を僅か数コピーしか含まない遺伝子構築物が好 ましい。従って、本発明の遺伝子構築物のＤＮＡ配列の各々は唯一のコピー中に 存在するのが好ましい。ＤＮＡ配列を各々１コピー含む遺伝子構築物の構築は、 後記実施例で説明されている。

上述したところによると、顕著な抗菌効果は、本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ［２ 列またはその類縁体によりコードされる蛋白から得られる。従って、本発明のキ チナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体が２コピー、並びに酸性キチナーゼおよ び塩基性β−１，３−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列が各々１コピー存在 する本発明の遺伝子構築物は、本発明の遺伝子形質転換植物に存在する場合に非 常に強力な抗菌作用を示し得ることが予想される。前述の遺伝子構築物は、それ が宿る植物にあまり負担をかけることはないと考えられる。勿論、例えば各ＤＮ Ａ配列に使用されるプロモーターの選択もまた、そこから発現される蛋白の量に 影響を及ぼす。これについては後記でさらに詳しく説明する。

上記の本発明遺伝子構築物は、１つまたは幾つかのＤＮＡフラグメントに存在し 得る。典型的な例では植物形質転換ベクタ一手段による植物の場合、生物体、例 えば植物に導入される遺伝子構築物の大きさ、並びにプロモーターおよび転写タ ーミネータ−の組み合わせによっては、二種またはそれ以上の植物形質転換ベク ターの使用により構築物を導入するのが有利であり得、従って、遺伝子構築物は 二つまたはそれ以上のＤＮＡフラグメントに存在するのが有利であり得る。唯一 の植物形質転換ベクターの使用が望ましい場合、遺伝子構築物は−ＤＮＡフラグ メントに存在するのが有利である。

本発明のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドが生物体、例えば植物にお いて発現される場合、ＤＮＡ配列はさらに先導配列をコードするヌクレオチド配 列を含むのが望ましい。先導配列は、天然先導配列または別の蛋白をコードする ＤＮＡから誘導される先導配列であり得る。いずれにしても、先導配列がＤＮＡ 配列に機能し得るように結合されることにより、生成したヌクレオチド配列から 発現されるポリペプチドは、それが製造される細胞内からＤＮＡ配列によりコー ドされるポリペプチドを指令すべく機能する。使用される先導配列の性質によっ て、ポリペプチドはそれが製造される生物体の特定位置、例えばリソソームまた は液胞へ指向され得るか、またはパラセンジャーポリペプチドは、細胞内室へ排 出され得る。先導配列は、Ｎ−末端またはＣ−末端に位置し得る。

使用されるＮ−末端配列の性質は、例えば特定の生物体およびその一部、例えば 特定の細胞または組織により異なり、そこで本発明のＤＮＡ配列によりコードさ れるポリペプチドが製造され、生物体における同じ細胞または別の場所の一部へ 前記ポリペプチドが運ばれる。典型的な先導配列は疎水性アミノ酸のコアを有す るため、本発明のＤＮＡ配列と共に使用される適当な先導配列は、疎水性アミノ 酸をコードする一伸長のコドンを含むヌクレオチド配列である。

ユニで使用される先導配列の例は、同じ（本発明の一部である後記先導配列であ る。これらの先導配列は、テンサイキチナーゼ１酵素のＮ−末端先導配列（その ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号１１および配列番号１２に各々示さ れている）、ゲノムキチナーゼ７６クローンのＮ−末端先導配列（そのヌクレオ チドおよびアミノ酸配列は配列番号５および配列番号６に各々示されている）、 酸性テンサイキチナーゼＳＥのＮ−末端先導配列（そのヌクレオチドおよびアミ ノ酸配列は配列番号７および配列番号８に各々示されている）並びにβ−１，３ −グルカナーゼ４のＮ−末端配列（そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は各々 配列番号９および配列番号１０に示されている）である。別の興味深い配列は、 １３２アミノ酸を含むキチナーゼ１遺伝子のプロリン濃厚ドメインをコードし、 配列番号１２に示されているテンサイキチナーゼ１からのＤＮＡ部分配列であり 、これはまた生物体の指定位置へポリペプチドを指向させるのに使用され得る。

上記先導配列は非限定的な例として考えられる。

本発明の上記先導配列は全てテンサイ植物に特異的なものであるため、これらの 先導配列は、本発明の別の態様において本発明の一部であるＤＮＡ配列とは異な るＤＮＡ配列へ機能し得るように結合され得、また前記ＤＮＡ配列はテンサイ植 物の形質転換で使用される。前記のＤＮＡ配列は、特にテンサイ植物には天然で は存在しないＤＮＡ配列であり得る。前記の先導配列はテンサイにおいて機能す ることが知られているため、テンサイに通常存在する先導配列の使用は、テンサ イ植物の形質転換において有利であり得る。すなわち、本発明の先導配列は、ヌ クレオチド配列からそれが製造される細胞または生物体の指定位置へ発現される ポリペプチドを指令するのに有用であり得る。

本発明のこの態様における別の興味深い部分配列は、１３２アミノ酸から成る配 列番号１２に示されたキチナーゼ１のプロリン濃厚ドメインである。プロリン濃 厚ドメインは、伸長部の場合と同様、プロ１ルをグリコジル化ヒドロキシプロ１ ルへ修飾した後、細胞壁ヘキチナーゼ１蛋白を付着させるのに必要とされ得るこ とが予想される。すなわち、ポリペプチドが生成される細胞および／または生物 体における目的位置でポリペプチドを指令および獲得する場合に、プロリン濃厚 ドメインを含む部分配列が使用され得る。

さらに、本発明の遺伝子構築物のＤＮＡ配列の少なくとも１つが、さらにＤＮＡ 配列によりコードされるポリペプチドを、それが蓄えられる生物体の一部、例え ば液胞へ指向させ得るシグナルペプチドをコードするＣ−末端配列を含むのが有 利であり得る。すなわち、同じ遺伝子構築物にＣ−末端配列が存在する場合も存 在しない場合も同じＤＮＡ配列が存在し得る。Ｃ−末端配列は、あるとすれば、 ＤＮＡ配列が通常伴うＣ−末端伸長部であり得るか、または遺伝子構築物が発現 される宿主から誘導され得るか、または別の起源によるものであり得る。これは 、特にキチナーゼ４ＤＮＡ配列並びに塩基性テンサイβ−１，３−グルカナーゼ ４および酸性キチナーゼＳＥのＤＮＡ配列（これらは全てＣ−末端伸長部を欠く ）の場合に関連している。通常Ｃ−末端伸長部を含むＤＮＡ配列では、天然Ｃ− 末端配列は別の配列と置き換えられ得る。

本発明の遺伝子構築物に含まれるＣ−末端配列の非限定例は、下記配列から選択 されるＣ−末端配列である二 アミノ酸番号４１３−４３９から成る下記ポリペプチドをコードするテンサイキ チナーゼ１（そのアミノ酸は配列番号１２に示されている）のＣ−末端配列：Ｎ ＬＤＧＹＲＱＴＰＦＤＷＧＬＫＫＬＱＧＡＲＥＳＷＳＳＳ＊配列番号２のアミノ 酸番号２６１−２６４から成る下記ポリペプチドをコードするテンサイキチナー ゼ４のＣ−末端先端部ＮＬＲＣ＊ 配列番号１３に示された下記ポリペプチドをコードするマメキチナーゼ（ＰＨＡ ）のＣ−末端配列 ＮＬＤＣＹＳＱＴＰＦＧＮＳＬＬＬＳＤＬＶＴＳＱ＊配列番号１４に示された下 記ポリペプチドをコードする塩基性タバコキチナーゼのＣ−末端配列 ＮＬＤＣＧＮＱＲ３ＦＧＮＧＬＬＶＤＴＭ＊配列番号１５に示された下記ポリペ プチドをコードする酸性タバコキチナーゼのＣ−末端配列 ＮＬＤＣＹＮＱＲＮＣＦＡＧ＊ 配列番号１６に示された下記ポリペプチドをコードする大麦キチナーゼＣＨ２６ のＣ−末端配列 ＮＬＤＣＹＳＱＲＰＦＡ＊、または 配列番号１７に示された下記ポリペプチドをコードするタバコ由来の塩基性β− １，３−グルカナーゼのＣ−末端配列ＧＶＳＧＧＶＷＤＳＳＶＥＴＮＡＴＡＳＬ ＶＳＥＭ遺伝子構築物のＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上にＣ−末端配列を付加 するか否かの選択は、例えば配列から発現されるポリペプチドが指令される植物 区画に基づいて決定される。すなわち、主として植物の細胞間空間に存在する植 物病原菌を制御するのが望ましい場合、Ｃ−末端配列の使用を回避するのが望ま しいこともあり得る。主として細胞内に存在する植物病原菌を制御する場合、遺 伝子構築物のＤＮＡ配列の大部分または全部に、ＤＮＡ配列から発現されるポリ ペプチドを液胞へ輸送し得るＣ−末端配列を付与するのが望ましいこともあり得 る。

上記説明から明らかなように、ポリペプチドにそれらの意図された機能を発揮さ せ得る、すなわちそれらの抗菌活性を発揮させ得るためには、遺伝子構築物を含 む植物において前記構築物によりコードされるポリペプチドを充分に発現させる ことが重要である。充分な発現を達成するのに不可欠な一要素は、ポリペプチド が発現されるＤＮＡ配列または遺伝子の転写および発現を満足すべき状態で調節 することである。

本発明の遺伝子構築物のＤＮＡ配列の各々または前記ＤＮＡ配列を含む遺伝子の 発現は、挿入された調節配列の制御下で前記配列または遺伝子を発現させるため ＤＮＡ配列または遺伝子に機能し得るように結合させた調節配列手段によって達 成される。一般的には、調節配列は、構成性または調節可能であり得るプロモー ターである。

「プロモーター」という語は、プロモーターが機能し得るように結合されるＤＮ Ａの転写前に、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の転写開始因子が結合する ことにより転写を行わせ得る短いＤＮＡ配列を意味するものとする。プロモータ ーは、普通暗号化配列の上流（５°）に位置する。そのより広い範囲において、 「プロモーター」という語は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、および転写開始部 位から、さらに離れていることも有るが、数百の塩基対内に位置する調節配列成 分を含む。前記調節配列は、例えば生理学的条件に応じて転写開始の有効性を制 御する蛋白因子の結合に必要とされる配列である。

「構成性プロモーター」は、実質的に調節、例えば誘導または抑制に付されるこ とはないが、転写を行わせるための他の必要条件が満たされている場合、それが 生物体の全活性細胞で機能し得るように結合しているＤＮＡ配列の定常的で実質 的に無変化の転写を可能にするプロモーターである。構成性プロモーターは増強 され得る。

「調節可能なプロモーター」は、機能が１つまたはそれ以上の因子により調節さ れるプロモーターである。これらの因子は、それらの存在によって適切なりＮＡ 配列の発現を確実にするものであり得るか、または別の場合、ＤＮＡ配列の発現 を抑制するものであり得るため、それらが存在しないと、ＤＮＡ配列の発現が誘 発される。すなわち、プロモーターおよび所望によりそれに随伴されていてもよ い調節配列は、１つまたはそれ以上の因子の存在または非存在により活性化され 、本発明の遺伝子構築物のＤＮＡ配列の各々の転写に影響を及ぼし得る。

他のタイプの調節配列は、転写終結（転写ターミネータ−の場合）およびイント ロンの除去の制御に必要とされる上流および下流配列、並びにポリアデニル化お よび転写開始に関与する配列である。調節配列が植物において機能する場合、そ れは好ましくは植物起源である。

プロモーター活性を調節する因子は、特に使用されるプロモーターの種類および それが機能する生物体により異なり得る。組織特異的調節は、所定組織に特異的 な蛋白をコードする遺伝子の発現を確実にするある種の内性因子により調節され 得る。組織特異的プロモーターの例は、葉物異的プロモーター、例えばクロロフ ィルａ／ｂプロモーターおよびＡＨＡＳプロモーター、およびさらに板物異的、 幹特異的、種子特異的および花弁特異的プロモーターである。また、因子、例え ば病原攻撃またはある種の生物学的因子もプロモーターを調節することが示され ている。さらに、熱応答プロモーターおよび植物の発生的調節に関与するプロモ ーターも興味深いものであることが見出され得る。

この場合、適当な構成性プロモーターは、植物プロモーター、菌プロモーター、 細菌プロモーターまたは植物ウィルスプロモーターから成る群から選択される。

植物ウィルスプロモーターの好ましい群は、カリフラワーモザイクウィルス（Ｃ ａＭＶ）から誘導され得るプロモーターである。前記プロモーターは、通常強力 な構成性プロモーターである。好ましいＣａＭＶプロモーターの例は、ＣａＭＶ １９ＳプロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである（オデル等、１９ ８５）。

他のプロモーターは、Ｔｉ−プラスミド、例えばオクトピンシンターゼプロモー ター、ツバリンシンターゼプロモーター（ヘレーラーエストレーラ等、１９８３ ）、マンノピンシンターゼプロモーター、およびＴ−ＤＮＡにおける他の転写解 読枠、例えば０ＲＦ７からのプロモーターから誘導され得る。適当なプロモータ ーのさらに別の例は、ＭＡＳ／３５Ｓ（ジャンセンおよびガードナー、１９８９ ）、ＭＡＳ二重Ｔｒｉ、２（ベルテン等、１９８４）およびＴ−２ＤＮＡ遺伝子 ５プロモーター（コンツおよびシェル、１９８６）である。

調節配列は、キチナーゼプロモーター、すなわち天然にキチナーゼ遺伝子と共に 見出され、その転写に関与するプロモーターであり得る。キチナーゼプロモータ ーは、単離されたキチナーゼ遺伝子、すなわち既知キチナーゼ遺伝子または例え ば本明細書に開示された方法により同定および単離され得る遺伝子から入手され 得る。一般的には、キチナーゼプロモーターは、病原攻撃に迅速に応答すること が示された植物から得られるべきである。この関係において、迅速な応答はマメ および大麦で観察されており、これらの植物由来のキチナーゼプロモーターはこ の目的に有用であり得ることが予想される。前記プロモーターの一例は、マメの キチナーゼプロモーターである（Ｋ、バド、１９９１）。ここで有用であると予 想される別のプロモーターの例は、テンサイキチナーゼ１プロモーター（配列番 号１１）およびテンサイアセトヒドロキシ酸シンターゼプロモーター（ＡＨＡＳ ＸＰ、ストウガードおよびに、ポイセン、ダニスコＡ／Ｓ、デンマーク、私的情 報）である。さらに、酸性キチナーゼＳＥ、キチナーゼ１、キチナーゼ７６およ びキチナーゼ４またはβ−１，３−グルカナーゼからのテンサイプロモーターも また有用であり得る。

所望により、および所望ならば、天然プロモーターを例えばプロモーターヌクレ オチド配列の修飾によって目的にかなうべく修飾することにより、天然プロモー ターとは別の方式で機能し、好ましくは病原による攻撃後より早く遺伝子の転写 を活性化するか、またはより強力なプロモーターが得られる。

上記で述べた通り、本発明の遺伝子構築物の暗号化ＤＮＡ配列の各々は、転写タ ーミネータ−に機能し得るように結合されている。転写ターミネータ−は、ＤＮ ＡからＲＮＡへの転写を終結させるべく作用し、好ましくは植物転写ターミネー タ−配列、細菌転写ターミネータ−配列および植物ウィルスターミネータ−配列 から成る群から選択される。

適当な転写ターミネータ−の具体例は、アグロバクテリウムのオバインシンター ゼ遺伝子のＮＯ３およびＯＣ８転写ターミネータ−配列（ヘレーラーエストレー ラ等、１９８３）、カリフラワーモザイクウィルスの３５３転写ターミネータ− 配列（バラコブスキー等、１９８４）、ＤＮＡ遺伝子４に対するＰＡＤＧ４転写 ターミネータ−（ウィング等、１９８９）、およびＴ−ＤＮＡ遺伝子７に対する ＰＡＤＧ７転写ターミネータ−である。

本発明の遺伝子構築物のＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上は、エンハンサ−配列 に機能し得るよう有利に結合され得、その結果、ＤＮＡ配列（複数もあり得る） の転写および発現は増加する。適当なエンハンサ−配列並びに転写および発現の 増加を達成する手段は当業界では公知である。

各々遺伝子構築物の各ＤＮＡ配列と結合される特異的プロモーターおよび特異的 ターミネータ−は、同一または異なり得る。遺伝子構築物の一部または全部の切 除につながり得る組換え事象の危険が回避されるため、異なるプロモーターおよ びターミネータ−を各々使用するのが有利であり得る。

別の態様において、本発明は、宿主生物を複製し得、実質的に配列番号１に示さ れたキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列を含む本発明のＤ ＮＡ配列または本発明の遺伝子構築物をもつベクターに関するものである。ベク ターは、自律複製し得るもの、例えばプラスミド、または宿主染色体により複製 されるもの、例えばバクテリオファージ、またはＴｉベクターの境界配列により 植物ゲノムへ組み込まれるものであり得る。製造目的の場合、ベクターは、製造 用に選択された生物においてＤＮＡ配列を発現し得る発現ベクターである。すな わち、発現ベクターは、発現に必要な調節配列、例えばプロモーター、開始シグ ナルおよび終止シグナル等をもつベクターである。これらの調節配列は、本発明 の遺伝子構築物がもつものであり得る。また、ベクターは、他の生物、例えば植 物からのキチナーゼ遺伝子またはパラセンジャーの同定および所望により単離に 使用されるものであり得、この目的の場合発現は要求されない。これは、例えば 下記の要領で行なわれ得る。

さらに別の態様において、本発明は、上記要領で挿入されたＤＮＡ配列、すなわ ち実質的に配列番号１に示されているヌクレオチド配列を含むキチナーゼ４ＤＮ Ａ配列、またはその類縁体または前記ＤＮＡ配列を含むキチナーゼ遺伝子もしく は偽遺伝子をもち、それを複製または発現し得る生物体に関するものである。

「挿入された」という語は、ＤＮＡ配列（または部分配列または類縁体、または 遺伝子もしくは偽遺伝子）が遺伝子操作により生物体またはその祖先へ挿入され ている、言い替えれば、生物体が天然または本来の状態ではそのゲノム中に前記 のＤＮＡ配列を含んでいなかったものであり得るか、または生物体が天然または 本来の状態でも前記のＤＮＡ配列を含むが、その数が少ないものであり得るため 、挿入されたＤＮＡ配列または挿入された遺伝子構築物がその天然対応物質より も多数の前記配列を有すること示す。

生物体がもつＤＮＡ配列は、生物体のゲノムの一部であり得るか、または生物体 に宿る上記ベクターに含まれ得る。ＤＮＡ配列が、第２ポリペプチドまたはその 一部をコードする１つまたはそれ以上の第２ＤＮＡ配列を伴う枠内で上記ゲノム または発現ベクターに存在することにより、例えば上記の融合蛋白がコードされ 得る。

生物体は、高等な生物、例えば植物、または下等な生物、例えば微生物であり得 る。下等な生物、例えば細菌、例えばゲノム陰性菌、エシェリヒア属の細菌、例 えばエシェリヒア・コリ、またはシュードモナス属の細菌、例えばシュードモナ ス・プチダおよびシュードモナス・フルオレセンス、またはゲノム陽性菌、例え ばバシラス属の細菌、例えばバシラス・サチリス、または酵母、例えばサツカロ マイシス属の酵母、または真菌、例えばアスペルギルス属の菌が、上記の組換え ポリペプチドの製造に有用である。多くの生物は生得的にキチナーゼを製造する ため、本発明によるＤＮＡ配列または遺伝子構築物を挿入すると、キチナーゼお よび所望によりβ−１，３−グルカナーゼの発現性がかなり高められ、それに応 じて抗菌活性も増強され得る。組換え技法による製造は、例えばサムプルツク等 （１９９０）による記載に従い、慣用的技術の使用により遂行され得る。

下記でより詳細に検討されている通り、キチナーゼを製造する微生物は、土壌植 物病原体、すなわち土壌に存在し、植物の生長遅延および致死に関与する病原体 との闘争に使用され得る。それらの植物病原体の例は、例えば根圏に存在する土 壌菌である。

また、生物体は、セルライン、例えば植物セルラインであり得る。最も好ましく は、生物体は植物、すなわち、例えば下記でより詳細に検討されている遺伝子修 飾植物である。

上述したところによると、遺伝子構築物は、好ましくは植物の修飾に使用される 。従って、本発明はまた、そのゲノムに上記遺伝子構築物を含む遺伝子形質転換 植物に関するものである。遺伝子形質転換植物は、本発明の遺伝子構築物を含ま ない植物、例えば非形質転換もしくは天然植物または遺伝子形質転換には付され たが本発明の遺伝子構築物によるものではない植物と比べて高い抗菌活性を有す る。通常、遺伝子構築物によりコードされるポリペプチドの構成的発現は望まし いが、場合によっては、様々な因子、例えば温度、病原体および生物学的因子と いった因子により調節された遺伝子構築物によりコードされるポリペプチドを発 現させるのが興味深いこともあり得る。

キチナーゼ遺伝子は、単子葉および双子葉植物から見出されており、そこで病原 菌の細胞壁破壊に活性を示すキチナーゼに発現されることが見出された。

従って、本発明の遺伝子構築物は単子葉および双子葉の種類に属する植物におい て活性を示すことが予想されるため、前記遺伝子構築物により形質転換される植 物は単子葉および双子葉植物であり得る。植物の非限定的な例は、トウモロコン 、カラス麦、小麦、ライ麦、米、大麦およびモロコシである。

遺伝子形質転換に付され得る双子葉植物の非限定的な例は、アルファルファ、タ バコ、綿、テンサイ、飼料ビート、ヒマワリ、にんじん、キャノーラ、トマト、 じゃがいも、大豆、脂肪種子菜種、キャベツ、こしょう、レタス、インゲン豆お よびエントウである。

上記開示から、本発明による遺伝子形質転換植物は、本発明による遺伝子形質転 換に付されていない植物または上記遺伝子構築物を含まない植物と比べてキチン 含有植物病原体、例えば植物病原菌および線虫類に対して高い耐性を有すること が明らかである。

本発明により制御される最も重要なキチン含有植物病原体は、植物病原菌に代表 される。植物病原菌は、それらが感染中にそれらの宿主植物と相互作用する方法 が異なる。天然開口部または損傷組織から植物に侵入し、完全な感染サイクル中 に、細胞間空間における植物細胞間で成長する種類もある。菌類の菌糸は、植物 細胞を弱めるかまたは破壊する毒素または酵素を排出することにより、植物細胞 内から漏出している細胞構成成分を菌に供給する。他の菌類病原体は、健康な宿 主細胞の細胞壁を貫通することにより宿主細胞を急速に破壊し、それらの原形質 体を崩壊させる。

異なる宿主相互作用戦略をもつキチンおよびグルカン含有病原菌の幾つかの°例 を下記に示す。それらは全て、本発明のトランスジェニック植物に感受性を示す と予想される。

セルコスポラ・エスピーピーは、その生長が細胞間空間に制限されている菌であ る。菌からの分生子（すなわち胞子）は、葉の表面で発芽し、葉の気孔を通って 貫通する。葉の内側では、細胞間空間で生長している菌糸に近い植物細胞は菌か ら排出される毒素により深刻な影響を受ける。毒素が原形質膜の分解を誘発する ことにより、細胞内容物は細胞間空間中へ漏出する。感染サイクルの後期では、 植物細胞は崩壊し、死んだ植物細胞を含む壊死領域および（菌の）菌糸体が現れ る。

ベルティシリウム・アルポアトルムは、細胞間空間では増殖するが、側根の発生 により形成された開口部、機械的に損傷した領域を通って貫通したり、細胞伸長 または分裂活性領域における柔らかい根組織を通る菌糸の直接貫通によって貫通 することはない根の病原体である。菌類は柔組織細胞を破壊し、トレサリー成分 は機械的にふさがれる。

細胞間感染サイクルをもつ他の植物病原菌には、スフレロチニア・スクレロチオ ルム、リゾクトニア・ソラニ、フィトフトラ・メガスペルマおよびヘルミントス ポリウム・エスピーピーがある。

コレトトリクム・リンデムチアヌムは、「インゲン豆炭そ病」を誘発する。この 菌からの分生子は、感染コート（ｃｏｕｒｔ）中に水の薄膜で発芽し、形成され た発芽管は鶏皮を貫通し、インゲン豆の葉およびさやの表皮細胞へ生長する。そ の後の感染中、菌類は、生きている細胞を貫通し、原形質の崩壊を誘発する寄生 病原体として作用する。

フザリウム・エスピーピーは、根を通って植物に感染する典型的な土壌伝播性菌 であり、菌糸は着根の表皮細胞を貫通し、根および幹の木質部へ侵入する。導管 は粒状物質によりふさがれ、外部し部および皮質の周辺細胞は破壊される。

ブシニア・グラミニスは、小麦の「黒サビ病」を誘発する。小生子は植物表面に おける水の薄膜で発芽し、発芽管は角度を貫通する。生長中の菌糸体は、宿主細 胞の壁を貫通し、それらの原形質を陥入させる吸器を生成する。

ウスティラボ・マイディスは、主として細胞間で生長する菌であるが、時折宿主 細胞の細胞壁を貫通する。

さらに別の態様において、本発明は、上記遺伝子形質転換植物を生長させること により得られる種子、実生または植物部分に関するものである。本発明の遺伝子 形質転換植物から誘導され得る植物部分または細胞も全て本発明の範囲内に含ま れるものとみなされることが解る。

この数年間、望ましい特性をコードする新規遺伝情報を植物へ移入することによ って特異的で望ましい特性を有する新規植物または植物細胞を構築するための有 用な方法の開発に多大な努力が向けられており、組換えＤＮＡ技術に基づく若干 の前記方法および適当な植物形質転換システムは現在利用可能である。通常、遺 伝情報は、ベクター系の使用または直接導入法、例えばヘレーラーエストレーラ 等（１９８８）、ロジャース等（１９８８）、サウル等（１９８８）、アン等（ １９８８）、ホーイカアス（１９８８）、ホルシュ等（１９８８）、レイナエル ッ等（１９８８）およびトメス等（１９９０）により与えられた方法の使用によ り植物に導入される。

すなわち、別の態様において、本発明は、上記遺伝子構築物をもち、植物、例え ばチエノポディアセ工科、特にベータ属の植物、特にベータ・ブルガリスのゲノ ムへ遺伝子構築物を導入し得る少な（とも１つのベクターを含む形質転換システ ムに関するものである。

通常、植物形質転換システムは、アグロバクテリウム菌のプラスミドまたはプラ スミド誘導体の使用に基づく。最もよく知られた２種のアグロバクテリウムは、 アク宅バクテリウム・ツメファシェンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネス （それらのプラスミドは、以後各々ｐＴｉおよびｐＲｌと称す）である。前記植 物形質転換システムの使用は、アグロバクテリウム菌がＤＮＡの特定断片（Ｔ− ＤＮＡ）を損傷領域の植物細胞へ転移させる能力に基づいている。実際に、Ｔ− ＤＮＡは、さらにＴ−ＤＮＡを植物へ移入するのに必要なヴイルレンス遺伝子を もつｐＴｉまたはｐＲｌにおける特定の境界ＤＮＡ配列間に位置する。アグロバ クテリウム形質転換システムは、「境界」間に位置するＤＮＡ配列の転移を仲介 するため、野生型アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡを望ましいＤＮＡ断片と交換し て植物中へ導入することが可能である。

好ましくは、本発明の植物形質転換システムは、野生型Ｔ−ＤＮＡが除去された ｐＴｉまたはｐＲｌの誘導体をもつ安全化したアグロバクテリウムに基づいてい る。

通常、植物を形質転換するベクターシステムは、１種または２種のプラスミドを 含む。１プラスミドシステム（同時組み込みベクターシステムとも称す）では、 ｐＴｉまたはｐＲｉのＴ−ＤＮＡは、除去され、ＤＮＡにより置換されている。

２プラスミドシステム（バイナリ−ベクターシステムとも称す）では、Ｔ−ＤＮ Ａおよび境界配列は両方ともｐＴｉまたはｐＲｌから除去されている。ｐＴｉま たはｐＲｉ同一境界配列および適当な複製開始点間に移されるＤＮＡを含む小プ ラスミドの安全化アグロバクテリウムにおける導入の結果、ヴイルレンス機能が 安全化ｐＲ１またはｐＴｉに位置し、Ｔ−ＤＮＡおよび境界配列が別のプラスミ ドに存在するベクターシステムが得られる。

適当な植物形質転換ベクターの一例は、ｐＢ１１２１およびその誘導体、例えば ジェファーソンにより報告されたもの（１９８７）である。

好適には、使用されるベクターには、真核生物および原核生物の適当なマーカー 、例えば抗生物質耐性または除草剤耐性またはグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコ ードする遺伝子、例えばハイグロマイシンまたは他の既知マーカー、例えばリン ゼイ（１９９０）およびレイナエルッ（１９８８）により開示されたマーカーが 付与される。マーカーが存在することにより、ＤＮＡ挿入体がプラスミドの目的 位置に挿入されたか否かが決定でき、ベクターにより形質転換された植物細胞が 選択され得る。

一形質転換事象において複数のベクターを使用する場合、現在知られている植物 形質転換技術によると、通常、植物形質転換を成功させ得るためには異なる選択 遺伝子が各ベクターに存在することを必要とする。

プラスミド、例えばｐＴｉまたはｐＲｌまたはその誘導体を用いてトランスジェ ニック植物を構築する場合、まず植物において挿入される遺伝子構築物を、プラ スミドが複製し得、操作が容易な微生物において構築するのが好ましい。有用な 微生物の一例はエシェリヒア・コリであるが、上記特性を有する他の微生物も使 用され得る。上記ベクターシステムのプラスミドをエシェリヒア・コリにおいて 構築した場合、それは、必要ならば適当なアグロバクテリウム株、例えばアグロ バクテリウム・ツメファシェンスへ移入される。

すなわち、本発明の遺伝子構築物をもつプラスミドを、好ましくは適当なアグロ バクテリウム株、例えばアグロバクテリウム・ツメファシェンスへ移入すること により、本発明の遺伝子構築物をもつアグロバクテリウム細胞が得られ、続いて そのＤＮＡは修飾される植物細胞へ移入される。この形質転換は、若干の方法、 例えばアン等（１９８８）により報告された方法で遂行され得る。

アグロバクテリウムによる植物組織の直接感染は、広範に使用され、ブッチャー 等（１９８０）により報告されている単純な技術である。一般的には、感染させ る植物を、例えば剃刀の刃で植物を切断するか、または針で植物を穿刺するか、 または植物を研摩剤でこするか、または鋼鉄ブラシで植物を磨くことにより傷付 ける（例えば実施例１５に記載）。次いで、傷口にアグロバクテリウムを例えば 懸濁液で接種する。別法として、植物の感染は、植物のある部分または組織、す なわち葉、根、幹の一部または植物の別の部分で行なわれ得る。次いで、接種さ れた植物または植物の一部を選別および再生に付し、適当な培養培地で生育し、 成熟植物に生長させる。これは当業界における公知方法の使用により行なわれる 。

他の非常に好適な植物形質転換方法は、音波処理、エレクトロポレーション（ジ ョエルスポ、１９９０）またはパーティクルガン方法の使用によるもので、例え ばフレイン等（１９８９）による記載に従い行なわれる。

遺伝子形質転換植物細胞が製造されるとき、これらの細胞は、よく知られた組織 培養方法に従い、例えば必要な生長因子、例えばアミノ酸、植物ホルモン類、ビ タミン類等を補った適当な培養培地で細胞を培養することにより生育および維持 され得る。形質転換細胞の遺伝子修飾植物への再生は、細胞または組織培養物か らの植物の再生に関する公知方法を用いて、例えば抗生物質を用いて形質転換苗 条を選択し、適当な栄養素、植物ホルモン等を含む培地で苗条を継代培養するこ とにより達成され得る。

よく知られた植物育種技術によると、遺伝子形質転換細胞の製造は、二重形質転 換事象（２つの形質転換システムで遺伝子構築物を導入する）として遂行され得 るか、または慣用的育種技術の使用と組み合わされ得る。すなわち、本発明によ る２種の遺伝子修飾植物を交雑育種することにより、その親植物の各々の遺伝子 構築物を含む植物を得ることができることが解る。

本明細書の緒論部から理解されるところによると、本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ 配列またはその類縁体は、診断用途に使用され得、これについては後記でさらに 詳しく説明する。

本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列の使用により様々なタイプの診断が遂行され得 る。与えられた例では、キチナーゼ４遺伝子群に属する遺伝子から転写されたキ チナーゼのメツセンジャーＲＮＡは、ハイブリダイゼーションに適した条件下キ チナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列を含む本発明ＤＮＡ配列 へのハイブリダイゼーションにより定性的および定量的に測定され得る。さらに 、キチナーゼ４遺伝子群に属し、生物、例えば植物に存在する遺伝子は、本発明 ＤＮＡ配列の使用により、例えば前記生物の遺伝子ライブラリーのスクリーニン グにより同定および単離される。

キチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列を含むＤＮＡ配列が診 断用途に使用される場合、検出に使用され得る標識をそれに付すことが有用であ る場合が多い。有用な標識は当業界では公知であり、例えば蛍光団、放射性同位 元素、同位体または複合体形成剤、例えばビオチンである。

また、キチナーゼ４ＤＮＡ配列またその類縁体または部分配列を含む本発明のＤ ＮＡ配列は、生物体、例えば植物、特に双子葉植物からのキチナーゼ４遺伝子群 に属するか、またはそれに由来する遺伝子またはメツセンジャーの単離方法で使 用され得、前記方法は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡコピーおよび試料の核酸間のハ イブリダイゼーションに適した条件下、所望により標識形態、変性形態またはそ のＲＮＡコピーでもよい、キチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分 配列を含む本発明ＤＮＡ配列と生物体からの遺伝子ライブラリーまたはｃＤＮＡ ライブラリーから得られた核酸含有試料をハイブリダイズし、ハイブリダイズし たクローンを採取することにより、生物体のキチナーゼ４遺伝子群に属する遺伝 子またはｃＤＮＡを得ることを含む。

本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体、特にその部分配列の使用に よる、キチナーゼ４遺伝子群に属する試料における遺伝子またはｃＤＮＡクロー ンの同定および単離は、標準的方法に基づき、例えばサムプルツク等（１９９０ ）による記載に従い行なわれ得る。例えば、他の植物でキチナーゼ４関連遺伝子 について特性検定するためには、標準的サザーン技術を用いるのが好ましい。

本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列はまた、生物 体、例えば植物の様々な組織に存在するキチナーゼ４関連メツセンジャーの量の 定量方法で使用され得、前記方法は、変性ＤＮＡ配列またはＲＮＡコピーおよび 試料のＲＮＡ間のハイブリダイゼーションに好適な条件下、所望により標識形態 、変性形態またはそのＲＮＡコピーでもよい、実質的に配列番号１に示されてい るヌクレオチド配列を含む本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体、 特にその部分配列と、生物体から得られた核酸含有試料をハイブリダイズし、ハ イブリダイズした核酸の量を測定することを含む（パルカルトッテイア等、１９ ８７）。

ハイブリダイゼーションは、例えばストリンジエンシー、インキュベーション時 間、温度、同定に使用されるキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部 分配列を含む本発明ＤＮＡ配列および分析される試料間の比率、緩衝剤および塩 濃度に関して適当な条件またはハイブリダイゼーシヨンに重要な他の条件下、慣 用的ハイブリダイゼーション方法に従い実施されるべきである。条件の選択は特 にハイブリダイズされる断片間の相補性の度合により異なり、すなわち、ハイブ リダイゼーションを行わせるためには、高度の相補性の場合、よりストリンジェ ントな条件、例えば低い塩濃度、緩衝剤の低いイオン強度および高温を必要し、 低度の相補性の場合、低ストリンジェントな条件、例えば高い塩濃度、緩衝剤の 高し’Ｎイオン強度または低温を必要とする。

分析される試料のＤＮＡまたはＲＮＡ断片が変性形態で結合する支持体は、好ま しくは固体支持体であり、ＤＮＡおよびＲＮＡ分析で常用される支持体のいずれ かであり得る。

キチナーゼ４関連遺伝子の存在検出に使用されるＤＮＡ配列は、好ましくは例え ば上記で説明されている要領で標識されており、ハイブリダイズしたＤＮＡの存 在は、オートラジオグラフィー、ンンチレーション計数、ルミネセンスまたは化 学反応により測定される。

生物体、例えば植物、特に双子葉植物における、例えば先に記載した遺伝子操作 方法により導入されたキチナーゼ４関連遺伝子またはその一部の存在を検出する 別の方法では、例えば後記「原材料および方法」の項に記載されている要領で、 よく知られたポリメラーゼ連鎖反応の原理を使用する。

上記で概説された方法に従いキチナーゼ４関連遺伝子またはその一部の存在につ いて分析される試料は、葉、幹、塊茎、花、根、新芽、苗条および種子から成る 植物部分の群から採取され得る。

上記と同じ原理は、本発明の遺伝子構築物の製造に使用されるＤＮＡ配列、例え ばキチナーゼまたはβ−１，３−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコー ドするＤＮＡ配列の単離にも使用され得る。

制限酵素断片長身型（ＲＦＬＰ）は、様々な生物における遺伝子の特定アレル（ 対立遺伝子）の追跡に多く使用されている。対立遺伝子はそれら自体が追跡され るか、またはそれらは他の特徴、例えば病原体耐性および形態的特徴、例えば塊 茎着色を伴う交雑におけるマーカー（非結合または結合状態）として使用される 。これまでのところ、この方法は、主としてヒトにおいて使用されているが、そ れは植物においても使用されている。本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはそ の類縁体は、特にテンサイにおける、キチナーゼ４関連遺伝子のＲＦＬＰ分析に おいて有用であり得ることが予想される。

さらに別の態様において、本発明は、上述の配列番号１に示されているキチナー ゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列を含むＤＮＡ配列、または上述 の本発明遺伝子構築物および適当な賦形剤によりコードされるポリペプチドを含 む抗菌組成物に関するものである。別の態様において、本発明は、上述の配列番 号１に示されているキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列を 含むＤＮＡ配列、または上述の本発明遺伝子構築物および適当な賦形剤によりコ ードされるポリペプチドを発現し得る微生物を含む抗菌組成物に関するものであ る。抗菌組成物における構成成分に適した微生物は上述されている。

本発明による抗菌組成物は、適当な培地中、ＤＮＡ配列によりコードされる１種 またはそれ以上の抗菌性ポリペプチドを発現させる条件下で、配列番号ｌに示さ れているキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列を含む本発明 ＤＮＡ配列、または本発明の遺伝子構築物をもつかまたはそれを発現し得る微生 物を培養し、所望により微生物を破裂させることにより、それらの発現された抗 菌性ポリペプチド（複数もあり得る）の内容物を培地中へ放出させ、培地から細 胞屑を除去し、所望によりポリペプチド（複数もあり得る）を含む培地を凍結乾 燥または噴霧乾燥に付すことにより、抗菌性ポリペプチド（複数もあり得る）を 含む抗菌組成物を得ることを含む方法により製造され得る。別法として、抗菌性 蛋白は培地へ排出され得、所望により微生物を常法により除去するか、または蛋 白を常法により精製するか、または常法によりプロリンを精製した後、培地は直 接または凍結乾燥後に使用され得る。

本発明による抗菌組成物は、植物中もしくは植物上または菌の存在が望ましくな い他の物質における病原菌の発芽および／または成長の抑制または阻止に使用さ れ得る。これについてはさらに下記で検討する。

勿論、本発明の抗菌組成物は、抗菌剤が存在する、使用される賦形剤および形態 の両方の点で、その意図された目的に適合化される。「抗菌剤」という語は、抗 菌活性の付与に関与するか、または必要とされる抗菌組成物の有効成分を意味す る。「抗菌性ポリペプチド」という語は、本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列また はその類縁体、または抗菌活性、すなわち上述のキチナーゼ活性および所望によ りβ−１，３−グルカナーゼ活性を有する本発明の遺伝子構築物によりコードさ れるポリペプチドを包含する。

抗菌組成物は、本発明のキチナーゼ４ＤＮＡ配列またはその類縁体または抗菌活 性、すなわち上述のキチナーゼ活性および所望によりβ−１，３−グルカナーゼ 活性を有する本発明の遺伝子構築物によりコードされるポリペプチドに加えて、 １種または数種の化学物質、例えば治療的または予防的に菌類との闘争で常用さ れている殺菌剤を含み得る。

通常、抗菌剤は、それ自体微生物であるが、または微生物により製造される。

はとんどの場合、抗菌組成物の最も容易で安価な製造方法は、微生物それ自体ま たはそれが抗菌剤として生育されている培地を使用することである。微生物から 発現される抗菌性ポリペプチド（複数もあり得る）は、例えばポリペプチドを培 地中へ放出させるべく指令し得る適当なシグナルペプチドの作用の結果として培 地中へ分泌され得るか、またはよく知られた機械的または化学的手段により微生 物から放出され得る。使用前、培地から微生物または細胞屑を除去するのが有利 であり得る。

培地は、原則として、抗菌剤用の賦形剤として機能するが、特定の目的用途に適 したさらに別の賦形剤を加えるのが好ましい。

抗菌性ポリペプチド（複数もあり得る）を発現する微生物の培養物は、当業界で 公知の方法を用いて上記要領に従い達成され得る。上述したところによると、微 生物培養物をさらに別の処理に付すことにより、抗菌性ポリペプチド（複数もあ り得る）の内容物を培地中へ放出させるか、または分泌により放出される量を増 やすことが必要または有利であり得る。

かなりの量の抗菌性ポリペプチド（複数もあり得る）を含む培地は、植物が存在 するか、または植物が生育されている土壌、または植物もしくは植物の一部また は潅水に直接適用され得る。別法として、培地を所望により慣用的種子被覆組成 物と組み合わせた形で、種子を処理することもできる。

抗菌性ポリペプチド（複数もあり得る）を発現する微生物は、微生物の有益な作 用を最大にすべく選択された用量および濃度で、栽培学的に許容し得る賦形剤、 すなわちアジュバントまたは担体を含む様々な製剤で適用され得る。しかしなが ら、微生物はまた、処理される物質中で微生物それら自体を確立させ得る環境下 においてそのまま散布され得る。微生物が通常土壌から見出される微生物、例え ばリゾバクテリウムである場合、形質転換微生物が土壌で定着することにより、 それが連続的に抗菌性ポリペプチド（複数もあり得る）を植物周囲の土壌中へ分 泌し得ることが一般に望ましい。

抗菌性ポリペプチド（複数もあり得る）を含む微生物または培地を、予め混合し たもの、例えば人工成長培地または問題の植物の栽培に使用される他の土壌混合 物に加えるのが有利であり得る。かかる目的の場合、微生物または培地は固体形 管、例えば粉末形態またはか粒形態であるのが好都合である。粉末形態は、慣用 的手段、例えば噴霧乾燥または均等内容の方法により微生物を粒状担体へ適用す ることにより得られる。

抗菌性ポリペプチド（複数もあり得る）を発現する微生物が湿った状態で使用さ れる場合、それは、懸濁液または分散液形態、例えば水性懸濁液として使用され 得る。

形質転換微生物のキチナーゼ活性を誘導するためには、形質転換微生物が存在す る培地へ少量のキチンを加えるのが有利であり得る。

上記によると、さらに本発明は、植物中または植物上において、キチン含有植物 病原体、例えば植物病原菌の発芽および／または成長を阻止する方法であって、 １）植物またはその一部を上記遺伝子構築物により形質転換し、生成した形質転 換植物または植物の一部を遺伝子形質転換植物へ再生し、および／または２）植 物またはその一部、植物を増殖させる実生または種子、またはそれが生育されて いる培地を上記抗菌組成物で処理することを含む方法に関するものである。

植物の遺伝子形質転換がほとんどの目的にとって好ましい方法である場合、形質 転換を本発明の抗菌組成物による植物の処理と組み合わせるのが有利であり得る 。遺伝子形質転換は時間がかかり、ある種の態様では難しい方法であるため、慣 用的に使用され、環境的観点からは望ましくない化学殺菌剤の代わりまたはそれ に加えて生物学的組成物を使用するのが有利であり得る。

はとんどの場合、本発明の抗菌組成物で処理される物質は植物である。しかしな がら、菌の存在および成長が望ましくない植物以外の物質、例えば食品、例えば パンまたはパン製品、乳製品のチーズ、野菜、穀物に感染する若干のキチン含有 菌も存在する。本発明による抗菌組成物は、前記菌に対する制御または闘争に使 用され得ると予想される。この点で、食品または飲み動用に使用される飲料およ び容器（その一部）もまた、予防的処理または抑制的処理として本発明の抗菌組 成物により処理され得ると考えられる。

以下、本発明を配列、実施例および添付図面においてさらに詳しく説明するが、 これらに限定されるわけではない。

図面： 図１は、ｐＨ４，５でのモノ−Ｓカチオン交換クロマトグラフィーによるテンサ イキチナーゼ２．３および４の精製を示す。蛋白の溶離は、ＮａＣ１の一次勾配 により行なわれた。吸光度は２８０μｍで記録された。

図２は、モノ−３ＦＰＬＣカラムでの精製後におけるテンサイキチナーゼ２．３ および４のポリペプチドパターンを示す。レーンは５０μｇの下記蛋白を含む。

レーンａおよびｂ１キチナーゼ４；　レーンｄおよびｅ１キチナーゼ３；　レー ンｆおよびｇ１キチナーゼ２；　並びにレーンＣおよびｈ１分子量マーカー。蛋 白は銀で染色された。

図３は、キチナーゼ４により３Ｈ−キチンから放出された水溶性生成物の分析を 示す。３７℃で０．２５．０．５．３および２４時間３Ｈ−キチンを４μｇのキ チナーゼ４とインキュベーションした。対照として　ｓＨ−キチンを３７℃で２ ４時間酵素を用いずにインキュベーションした。放出されたキトオリゴ糖をＴＬ Ｃにより分離し、それらの移動を、Ｎ−アセチルグルコサミン（単量体）（図３ Ａ）、キトビオース（２量体）（図３Ｂ）、キトトリオース（３量体）（図３Ｃ ）およびキトテトラオース（４量体）（図３Ｄ）標準物質の場合と比較すること により同定した。ＴＬＣプレートを断片に切断後シンチレーション計数法により 、キトオリゴ糖を表す放射能を測定した。

図４は、キチナーゼ４のリソチーム活性を示す。１Ｈｇの酵素を、ミクロコツカ ス・リソデイクチクスから得られた細胞壁とインキュベーションし、４５Ｑｒ＋ ｍでの吸光度の減少を特定の時間間隔で記録した。１ＨｇのＳＥ（「シュア・エ レン」）を対照として使用し、（５０ｎｇおよび５μｇ）リソチーム（ｌｙｓ） を標準として使用した。

図５は、願微鏡スライド生物検定法を用いたキチナーゼ４、酸性キチナーゼＳＥ およびβ−１，３−グルカナーゼ４の組み合わせによるセルコスポラの成長阻害 を示す。４８時間のインキュベーション後、培養物をカルコフルオア・ホワイト で染色し、蛍光下で調べた。

図５Ａは、各々２０μｇの酵素キチナーゼ４、酸性キチナーゼＳＥおよびβ−１ ，３−グルカナーゼ４を０時点で培養物に加えた場合における菌の成長を示す。

図５Ｂは、抗菌性蛋白を全く加えなかった場合における対照培養物の成長を示す 。

図６は、マイクロタイタープレート生物検定法を用いたキチナーゼによるセルコ スポラの成長阻害を示す。時間経過曲線（６２０ｎｇでの吸光度）は、最初の９ ２時間のインキュベーション中における菌の成長を描く。吸光度（成長の指標） を８〜１６時間間隔で測定し、各測定値は５回反復の平均である。曲線Ａは、成 長阻害剤を培養物に全く加えなかった場合におけるセルコスポラの成長を示す対 照曲線である。曲線Ｂは、キチンカラムから得られたキチナーゼ含有フラクショ ン２０μｌを０時点で加えた場合における菌の成長を示す。曲線Ｃでは、２０μ ｇの精製キチナーゼ４を０時点で培養物に加えた。

図７は、セルコスポラ菌糸の頂部におけるキチンに対するキチナーゼ４の効果を 示すオートラジオグラフィーである。セルコスポラ・ベティコラの菌糸への３Ｈ −標識Ｎ−アセチルグルコサミンの取り込みは、キチンの放射性単量体を含む成 長培地で２０分間菌を成長させることにより行なわれた。菌の菌糸の頂部におけ る細胞壁へのＮ−アセチルグルコサミンの取り込みは、黒点として表されている 。

図７Ａは、精製キチナーゼ４による処理前の菌糸を示す。

図７Ｂは、放射性取り込み、次いで２４時間精製キチナーゼ４による処理後の菌 糸を示す。

図８は、バイダックＲＰ−１８カラムでの逆相ＨＰＬＣによるキチナーゼ４のト リプシンペプチドの分離を示す。ペプチドは、２５〜７５分間１０％〜４５％ア セトニトリルの一次勾配で溶離された。緩衝液Ａは水であり、Ｂはアセトニトリ ルであった。両溶媒とも０１％トリフルオロ酢酸を含んでいた。流速は０．７ｍ ｌ／分であった。

図９は、ＦＰＬＣシステムによるアニオン交換カラム（モノＰ）での３種の酸性 ＳＥキチナーゼイソ酵素の分離を示す。蛋白は、ｐＨ７，Ｑで２５ミリモルのビ ス−トリス緩衝液中−次項化ナトリウム勾配で溶離された。

図１０は、２種の相異なる血清学的種類のテンサイ、キチナーゼ２およびキチナ ーゼ４類を示す。テンサイキチナーゼ２に対する抗体（図１ＯＡ）またはテンサ イキチナーゼ４に対する抗体（図１０Ｂ）との反応前に、５μｇの両キチナーゼ ２（３２ｋＤ）および４（２６ｋＤ）をニトロセルロース膜にプロットした。

図１１は、特異的ハイブリダイゼーション条件下におけるキチナーゼ４ｃＤＮＡ プローブと異なるキチナーゼ遺伝子とのハイブリダイゼーションを示す。異なる キチナーゼ遺伝子を、キチナーゼ配列を含むプラスミド製品の１μｍプローブと してハイボンドＮ−ナイロン膜にスポットした。

１　テンサイからのキチナーゼ１クローン２　テンサイからのキチナーゼ４クロ ーン３　テンサイからのキチナーゼ７６クローン４　エントウからのキチナーゼ クローン５　テンサイからの酸性キチナーゼ１クローン６　タバコからのキチナ ーゼクローン１７　タバコからのキチナーゼクローン２８　タバコからのキチナ ーゼクローン３９　インゲン豆からのキチナーゼクローン１０　菜種からのキチ ナーゼ４様クローンハイブリダイゼーシヨンは、−夜５５℃で下記ハイブリダイ ゼーション緩衝液２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、ｌＱｘデンハルツ、５０μｇ／ ｍｌのさけ精液ＤＮＡおよびプローブとしてキチナーゼ４ｃＤＮＡ配列中、５５ ℃、１５分で２回２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ、次いで２回１５分１ｘｓｓｃ、 ０．１％ＳＤＳ、５５℃の洗浄条件下で行なわれた。

図１２は、セルコスポラ・ベティコラ感染後のテンサイ葉におけるキチナーゼお よびβ−１，３−グルカナーゼの誘導を示す。菌胞子の懸濁液を植物に接種した 。特定時間間隔後、葉を採取し、粗抽出物を製造した。各々基質としてｓＨ−キ チンおよび３Ｈ−ラミナリンを用いた放射性トレーサー検定法により、キチナー ゼ（図１２Ａ）およびβ−１，３−グルカナーゼ（図１２Ｂ）の酵素活性を測定 した。

図１３は、セルコスポラ感染テンサイ葉の蛋白抽出物におけるテンサイキチナー ゼ２および４並びにβ−１，３−グルカナーゼ３の免疫検出法を示す。レーン！ およびＣは、各々感染および対照植物からの蛋白抽出物を含む。キチナーゼ２（ 左）、キチナーゼ４（中央）およびβ−１，３−グルカナーゼ３（右）に対して 産生じた抗体を使用した。

図１４は、「原材料および方法」記載のＰＣＲ技術の使用による、キチナーゼ４ 酵素の活性部位の一部を形成することが予測されるアミノ酸の位置指定突然変異 導入を示す。ＳＤＯは、提案された全ＰＣＲ反応に関する５゛プライマーとして 使用される。配列は矢印により示され、５゛〜非反復Ｂａ＋ａＨＩ部位まで選択 される。ＳＤｌ、ＳＤ２、ＳＤ３、ＳＤ４およびＳＤ５プライマーに関する配列 は、矢印により示されている。これらの３゛プライマーの場合、示された置換を 伴う相補的配列が使用される。プライマーは、配列番号４に示されたアミノ酸配 列をコードするゲノムキチナーゼＤＮＡ配列（配列番号３）に関する下記置換に 使用され得る。括弧内の数は、キチナーゼ４ｃＤＮＡ（配列番号２）からコード された対応するアミノ酸の数を示す。

ＳＤＩ：　Ｔｒｐ１７０→Ｔｙｒ　（１６９）ＴＧＧ−４ＴＡＣ５Ｄ２：　Ｇｌ ｕ１９０−”Ｇｉｎ　（１８９）ＧＡＡ−＋ＣＡＡＳＤ３：　Ａｓｐ１８４→Ａ ｓｎ　（１８３）ＧＡＴ　→ＡＡＴＳＤ４：　Ｔｒｐ２０７−Ｔｙｒ　（２０６ ）ＴＧＧ−ＴＡＣ３Ｄ５：　Ｔｒｐ２０５−Ｔｙｒ　（２０４）ＴＧＧ−ＴＡＣ ＰＣＲ産物を、適切な制限酵素で消化し、キチナーゼ４遺伝子における対応する 配列と交換する。図１４Ａおよび図１４Ｂは１つの図としてみなされるべきであ る。

図１５は、タバコからのＣ−末端伸長部を伴うハイブリッドβ−１，３−グルカ ナーゼ遺伝子構築物の構築を示す。

図１５Ａは、下線部のタバコＣ−末端伸長部を伴うテンサイｃＤＮＡβ−１゜３ −グルカナーゼクローンである。

図１５Ｂおよび図１５Ｃは、停止コドンの変更およびＣ−末端伸長部の導入に使 用され得るＰＣＲプライマーを示し、ＤｒａＩ部位は３°末端に作成される。

矢印はＰＣＲプライマーを示す。５°プライマーの場合、矢印下部の配列が使用 され、３′プライマーの場合、示された置換を伴う相補的配列が使用される。

図１５Ｂおよび図１５Ｃは１つの図としてみなされるべきである。

図１５Ｄは、Ｃ−末端伸長部の最終部分、停止コドン、Ｓ＋ａ１部位およびＢｇ １１１部位を含むアニーリングされた４つの合成オリゴヌクレオチドである。

融合遺伝子産物は、グルカナーゼ遺伝子をＸｂａｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、 それをＸｂａｌおよびＤｒａｌで消化されたＰＣＲ産物並びにＳｍａｌおよびＢ ｇｌＩＩで消化されアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドとライゲーショ ンすることにより作製され得る。

図１６は、Ｃ−末端伸長部を伴うハイブリッドキチナーゼ４遺伝子構築物の構築 を示す。

図１６Ａは、下線部のタバコＣ−末端伸長部を伴うキチナーゼ４を示す。

図１６Ｂおよび図１６Ｃは、キチナーゼ４遺伝子における停止コドン付近のＳｍ ａ１部位の導入に使用され得るＰＣＲプライマーを示す。矢印はＰＣＲプライマ ーを示す。５′プライマーの場合、矢印下部の配列が使用され、３′プライマー の場合、示された置換を伴う相補的配列が使用される。図１６Ｂおよび図１６Ｃ は、１つの図としてみなされるべきである。

図１６Ｄは、Ｃ−末端伸長部の最終部分、変更された停止コドン、Ｓｍａ１部位 およびＥｃｏＲ１部位に関する配列を含むアニーリングされた４つの合成オリゴ ヌクレオチドである。

融合遺伝子産物は、キチナーゼ４遺伝子をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し 、それをＢａｍＨＩおよびＳｍａｌで消化されたＰＣＲ産物並びにＳｍａＩおよ びＥｃｏＲＩで消化されアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドとライゲー ションすることにより作製され得る。

図１７は、配列番号１に示されたキチナーゼ４ＤＮＡ配列を含む植物形質転換ベ クターｐＢＫＬ４に４の構築を示す。箱形配列は、構築に使用されるＢ１５キチ ナーゼ４ｃＤＮＡ、増強された３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネータ− 配列を示す。ｐＢ１５に４．１は、キチナーゼ４をコードする９６６ｂｐのＥｃ ｏＲ工断片をもつｐ　Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔである。けば入すの箱形は、最終 生成物に含まれる暗号化領域を示す。Ｋｂ３（＝ＫＢ３）およびＫｂ４（＝ＫＢ ４）は、鋳型としてｐＢ１５に４．１ＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）においてプライマーとして作用する合成オリゴヌクレオチドである。ＫＨ ２およびＫＨ４のＤＮＡ配列は各々実施例１８で与えられており、配列番号４９ および配列番号５０に示されている。プラスミドｐｐ　Ｓ　４８は、非反復クロ ーニング部位を含むポリリンカーにより分離される慣用的３５３強化プロモータ ーおよび慣用的３５Ｓターミネータ−をもつ。植物形質転換ベクターｐＢＫＬ４ （ｐＢｉｎ１９の修飾、ベボン、１９８４）は、アグロバクテリウムＴｉプラス ミドｐＴｉＴ３７からの右および左Ｔ−ＤＮＡ境界配列、３５Ｓプロモーターお よび慣用的ＮＯＳターミネータ−を伴うＧＵＳ遺伝子並びに３５３プロモーター および慣用的ＯＣＳターミネータ−を伴う慣用的ＮＰＴＩＩ遺伝子もつ。幾つか の非反復クローニング部位を含むポリリンカーは、ＧＵＳおよびＮＰＴＩＩ遺伝 子間に位置する。図１７Ａおよび図１７Ｂは、１つの図としてみなされるべきで ある。

図１８は、各々配列番号１および配列番号８に示されたキチナーゼ４および酸性 キチナーゼＳＥをコードするＤＮＡ配列を含む植物形質転換ベクターｐＢＫＬ４ に４ＫＳＥ１の構築を示す。箱形配列は、同じく図１７で示された構築物に関し て使用される酸性キチナーゼ５ＥｃＤＮＡ、強化３５Ｓプロモーターおよび３５ Ｓターミネータ−配列を示す。ｐｓｕｒｌは、ＳＥ遺伝子の５゛末端をもつｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔである。ｐＳＥ２２は、同じくほぼ完全な５ＥｃＤＮＡをも ツｐ　Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔである。けば入りの箱形は、最終生成物に含まれ る暗号化領域を示す。！’ＡＧＣＴＧＴＡＣ”は、Ｋｐｎ　ｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ ライゲーションに使用されるアダプターである。ｐＰＳ４８は、図１７のところ で述べられている。キチナーゼ４配列をもつ植物形質転換ベクター（ｐＢＫＬ４ に４）の構築は、図１７で描かれている。図１８Ａおよび図１８Ｂは１つの図と してみなされるべきである。

図１９は、ゲノムキチナーゼ７６遺伝子を含む植物形質転換ベクターｐＢＫＬ４ に７６の構築であり、その配列は配列番号５に示されている。箱形配列は、キチ ナーゼ７６遺伝子、強化３５Ｓプロモーターおよび３５Ｓターミネータ−配列を 示す。ｐＫ７６．１は、ｐＵＣ１９ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ／　ＥｃｏＲ １部位においてキチナーゼ７６をコードするＨｉｎｄＩＩＩ　−ＥｃｏＲＩ断片 をもつｐＵｃ１９である。けば入り箱形は、最終生成物に含まれる暗号化領域を 示す。ＫＢ３および３４０は、鋳型としてｐＫ７６．１を用いるポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして作用する合成オリゴヌクレオチドで ある。ＫＢ３および３４０のＤＮＡ配列は、各々実施例１８で与えられており、 配列番号４９および配列番号５１に示されている。プラスミドｐＰＳ４８は図１ ７に関して使用されている。

植物形質転換ベクターｐＢＫＬ４は、図１７に描かれている。図１９Ａおよび図 １９Ｂは１つの図としてみなされるべきである。

図２０は、鋳型として＋ｍＲＮＡを用いる酸性キチナーゼ５ＥｃＤＮＡの一部の ＰＣＲ増幅である。ｍＲＮＡは、２つの制限部位（２７０）に結合したオリゴ− ｄＴから成るプライマーを用いて逆転写された（実施例７参照）。増幅は、５゛ プライマーとして制限部位に結合した遺伝子特異的混合オリゴヌクレオチド（Ｘ ｂａｌ　−ＫＢ７）および３゛プライマーとして２７０を用いて行なわれた。次 いで、増幅の第２ラウンドは、５′プライマーとして制限部位に結合した別の遺 伝子特異的混合オリゴヌクレオチド（ＢａｍＨＩ　−ＫＢ　９）および３′プラ イマーとして２７０を用いて行なわれた。２７０のＤＮＡは、実施例７および配 列番号３０に示されている。

図２１は、ｐＨ４，５でのモノ−Ｓカチオン交換クロマトグラフィーによるテン サイβ−１，３−グルカナーゼ１．２．３および４の分離を示す。溶離は、Ｎａ Ｃ１の一次勾配で行なわれた。吸光度は２ｓｏｎｍで測定された。

図２２は、キチナーゼ４、酸性キチナーゼＳＥおよびβ−１，３−グルカナーゼ を各々コードし、配列番号１、配列番号７および配列番号９に示されているＤＮ Ａ配列を含む植物形質転換ベクターｐＢＫＬ４に４ＫｓＥＩＧ１の構築を示す。

箱形配列は、β−１，３−グルカナーゼｃＤＮＡ、強化３５Ｓプロモーターおよ び３５Ｓターミネータ−を示す。ｐＧｌｕｃｌは、β−１，３−グルカナーゼを コードする１２４９ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をもつｐ　Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔで ある。けば入りの箱形は、暗号化領域を示す。プラスミドｐＰＳ４８Ｍは、図１ ７で示された構築物に関して記載されたｐＰＳ４８と同じであるが、ただし、こ のプラスミドの場合、Ｅ３５Ｓ−３５Ｓｔボツクスの各部位に２つの追加的制限 部位（ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ）を補った点が異なる。キチナーゼ４およびＳ Ｅ配列をもつ植物形質転換ベクターの構築は、図１７および図１８に記載されて いる。図２２Ａおよび図２２Ｂは１つの図としてみなされるべきである。

図２３は、テンサイキチナーゼ４に対して産生した抗体を用いたトランスジェニ ックのニコチアナ・ペンタミナナからの蛋白抽出物におけるテンサイキチナーゼ ４および酸性キチナーゼの免疫検出法を示す。

Ｃ＝ＧＵＳおよびＮＰＴ遺伝子構築物を含む対照植物。

ＳＥ＝酸性キチナーゼ。

Ｋ７６＝ゲノムキチナーゼ（図１９参照）。

Ｋ４＝キチナーゼ４（図１７参照）。

Ｋ＋ＳＥ＝キチナーゼ４および酸性キチナーゼ（ＳＥＸ図１８参照）。

Ｓｔｄ、　＝　１０ｐｇの精製テンサイキチナーゼ４゜図２４は、配列番号１に 示されたキチナーゼ４ｃＤＮＡ配列および配列番号５に示されたゲノムクローン キチナーゼ７６のＤＮＡ配列間の比較を示す。キチナーゼ７６イントロンの位置 は、８７５〜１２６２位で容易にみとめられる。配列の相同性は約７３％である 。図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ１図２４Ｄ５図２４Ｅおよび図２４Ｆは、１つ の図としてみなされるべきである。

、は、同一ヌクレオチドを示す。

図２５は、配列番号２に示されたキチナーゼ４ｃＤＮＡ配列および配列番号６に 示されたキチナーゼ７６のアミノ酸配列間の比較である。約８０％の相同性がみ とめられる。キチナーゼ７６における余分の３アミノ酸は、６２−６４位のアミ ノ酸（Ｓｅｒ、　ＴｈｒＳＰｒｏ）である。図２５Ａおよび図２５Ｂは、１つの 図としてみなされるべきである。

：　は、同一ヌクレオチドを示す。

図２６は、各々配列番号３および配列番号５に示されたキチナーゼ４およびキチ ナーゼ７６ゲノム配列の非暗号化５′配列間の比較である。相同性の強い８ボツ クスは、非暗号化５′配列で観察される。これらのボックスの中には調節的重要 性を有するものもあり得ると考えられる。図２６Ａおよび図２６Ｂは、１つの図 としてみなされるべきである。

配列一覧表 配列番号１　キチナーゼｃＤＮＡ配列（ｃＤＮＡテンサイキチナーゼ４クローン Ｂ１５に含まれる）。

配列番号２　キチナーゼ４アミノ酸配列（ｃＤＮＡテンサイキチナーゼ４クロー ンＢ１５に含まれる）。

配列番号３　ゲノムキチナーゼ４クローンの部分的ＤＮＡ配列。

配列番号４　ゲノムキチナーゼ４クローンの部分的アミノ酸配列。

配列番号５　ゲノムクローンキチナーゼ７６のＤＮＡ配列。

配列番号６　ゲノムクローンキチナーゼ７６の推定的アミノ酸配列。

配列番号７　酸性テンサイキチナーゼＳＥのｃＤＮＡ配列。

配列番号８　酸性テンサイキチナーゼＳＥの推定的アミノ酸配列。

配列番号９　塩基性テンサイβ−１，３−グルカナーゼのｃＤＮＡ配列。

配列番号１０　塩基性テンサイβ−１，３−グルカナーゼの推定的アミノ酸配列 。

配列番号１１　イントロン、プロモーターおよび先導配列を含む全テンサイキチ ナーゼ１遺伝子のＤＮＡ配列、およびキチナーゼ１遺伝子の暗号化領域から推定 されたアミノ酸配列。

配列番号１２　キチナーゼ１遺伝子の暗号化領域から推定されたアミノ酸配列。

配列番号１３　インゲンまめ（ＰＨＡ）キチナーゼのＣ−末端アミノ酸配列。

配列番号１４　塩基性タバコキチナーゼのＣ−末端アミノ酸配列。

配列番号１５　酸性タバコキチナーゼのＣ−末端アミノ酸配列。

配列番号１６　大麦キチナーゼＣＨ２６のＣ−末端アミノ酸配列。

配列番号１７　タバコ由来の塩基性β−１，３−グルカナーゼのＣ−末端アミノ 酸配列。

配列番号１８　テンサイ由来のキチナーゼ３のトリプシンペプチドのアミノ酸配 列。

配列番号１９　テンサイ由来のキチナーゼ３のトリプシンペプチドのアミノ酸配 列。

配列番号１９　テンサイ由来のキチナーゼ３のトリプシンペプチドのアミノ酸配 列。

配列番号２０　テンサイ由来のキチナーゼ３のトリプシンペプチドのアミノ酸配 列。

配列番号２１　テンサイ由来のキチナーゼ３のトリプシンペプチドのアミノ酸配 列。

配列番号２２　テンサイ由来のキチナーゼ３のトリプシンペプチドのアミノ酸配 列。

配列番号２３　ＷＧＡ−Ａ（１−リチクム・アエスティブム）由来のキチン結合 性蛋白のアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸配列。

配列番号２４　へベイン（ヘベア・ブラシリエンシス）由来のキチン結合性蛋白 のアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸配列。

配列番号２５　インゲンまめ（ファセオルス・ブルガリス）由来のキチン結合性 蛋白のアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸配列。

配列番号２６　タバコにニコチアナ・タバクム）由来のキチン結合性蛋白のアミ ノ酸配列のＮ−末端アミノ酸配列。

配列番号２７　テンサイ由来のキチナーゼ２からのアミノ酸配列のＮ−末端アミ ノ酸配列。

配列番号２８　テンサイ由来の酸性キチナーゼ（配列番号９）のポリペプチド配 列から部分的に構築されたＫＢ−７と呼ばれるＤＮＡプライマ配列番号２９　テ ンサイ由来の酸性キチナーゼ（配列番号９）のポリペプチド配列から部分的に構 築されたＫＢ−９と呼ばれる相補的ＤＮＡプライマー。

配列番号３０　ポリＡ　ｍＲＮＡの一般知識から構築されたオリゴ−ｄＴと呼ば れる相補的ＤＮＡプライマー。

配列番号３１　キュウｌバククミス・サチブス）由来のリソチーム／キチナーゼ のアミノ酸配列。

配列番号３２　アラビドプシス・タリアナ由来のリソチーム／キチナーゼのアミ ノ酸配列。

配列番号３３　テンサイ由来のβ−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列のアミ ノ酸部分配列３−１５゜ 配列番号３４　テンサイ由来のβ−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列のアミ ノ酸部分配列３−１７゜ 配列番号３５　テンサイ由来のβ−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列のアミ ノ酸部分配列３−１６゜ 配列番号３６　テンサイ由来のβ−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列から構 築されたオリゴＴＧ−１と呼ばれるＤＮＡ　５°プライマー。

配列番号３７　テンサイ由来のβ−１，３−グルカナーゼのアミノ酸配列から構 築されたオリゴＴＧ−２と呼ばれるＤＮＡ　５°プライマー。

配列番号３８　タバコおよび大麦由来のグルカナーゼのアミノ酸配列から構築さ れたオリゴＴＧ−３と呼ばれるＤＮＡ　３’プライマー。

配列番号３９　オリゴＴＧ−３プライマーの構築に使用される大麦由来のグルカ ナーゼのアミノ酸配列からのアミノ酸部分配列。

配列番号４０　オリゴＴＧ−３プライマーの構築に使用されるタバコ由来のグル カナーゼのアミノ酸配列からのアミノ酸部分配列。

配列番号４１　エントウキチナーゼＢ由来のアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸　 ゛配列。

配列番号４２　エントウキチナーゼＡ１由来のアミノ酸配列のＮ−末端アミン酸 配列。

配列番号４３　エントウキチナーゼＡ２由来のアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸 配列。

配列番号４４　大麦キチナーゼに由来のアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸配列。

配列番号４５　大麦キチナーゼＴ由来のアミノ酸配列のＮ−末端アミノ酸配列。

配列番号４６　タバコ由来のキチナーゼからのアミノ酸配列の活性部位のアミノ 酸部分配列。

配列番号４７　タバコ由来のキチナーゼからのポリペプチドの活性部位のアミノ 酸部分配列。

配列番号４８　タバコ由来のキチナーゼからのポリペプチドの活性部位のアミノ 酸配列。

配列番号４９　配列番号１のヌクレオチド番号１−１５および配列番号５からの ヌクレオチド番号４７１−４８５から部分的に構築されたＫＢ−３と呼ばれるＤ ＮＡ５’プライマー。

配列番号５０　配列番号１のヌクレオチド番号２６１−２４１から構築されたＫ Ｂ−４と呼ばれる相補的ＤＮＡ　３’プライマー。

配列番号５１　配列番号１のヌクレオチド番号３４１−３２３から部分的に構築 された３４０と呼ばれる相補的ＤＮＡプライマー。

配列番号１−１２の詳細な説明 配列番号１および配列番号２ テンサイλＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＢ１５キチナーゼ４ｃ ＤＮＡクローンのＤＮＡ配列（配列番号１）および推定されたアミノ酸配列（配 列番号２）。

この配列は、９６６ｂｐ長であり、ポリペプチド鎖中に２６４アミノ酸残基を有 する蛋白をコードする。先導配列は、２３アミノ酸残基、次いで３５アミノ酸残 基のヘベインドメインおよび２０６アミノ酸残基の機能ドメインにより構成され る。停止コドンの後、ｃＤＮＡは、８４７位に推定的ポリアデニル化シグナルお よびポリＡテール（尾部）を伴う１５８ｂｐ３’フランキング領域を有する。

比較すると、キチナーゼ４遺伝子（その部分ヌクレオチド配列は配列番号３に示 されている）は、配列番号４に示された２６５アミノ酸残基を有する蛋白をコー ドする。この遺伝子によりコードされる先導配列は、２４アミノ酸残基により構 成される。すなわち、配列番号１はヌクレオチドＡおよびＴを失っており、最初 のアミノ酸Ｍｅｔは、キチナーゼ４ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配 列には存在しない。

配列番号３および配列番号４ テンサイＥＭＢＬ３ゲノムライブラリーから単離されたキチナーゼ遺伝子をコー ドするゲノムクローンの部分的ＤＮＡ配列（配列番号３）および推定されたアミ ノ酸配列（配列番号４）。

この配列は、６９１ｂｐ長であり、キチナーゼ４ポリペプチド鎖の２６５アミノ 酸の最初の１１２をコードする。先導配列は、２４アミノ酸残基、次いで３５ア ミノ酸のヘベインドメインにより構成される。部分的に配列決定されたクローン は、ＡＴＧ出発コドンの７０ｂｐ上流である、２８５位に位置するＴＡＴＡボッ クス配列（ＴＡＴＡＡＡ）を伴う３５５ｂｐの５′非暗号化領域を有する。

配列番号５および配列番号６ テンサイＥＭＢＬ３ゲノムライブラリーから単離されたキチナーゼ７６遺伝子を コードするゲノムクローンのＤＮＡ配列（配列番号５）および推定されたアミノ 酸配列（配列番号６）。

この配列は、１８３８ｂｐ長であり、ポリペプチド鎖中に２６８アミノ酸残基を 有する蛋白をコードする。先導配列は、２４アミノ酸残基、次いで３５アミノ酸 残基のヘベインドメインおよび２０９アミノ酸残基の機能ドメインにより構成さ れる。この遺伝子は、８７５〜１２６２位に位置する１つのイントロンを含む。

このイントロンの正確な位置は、Ｂ１５ｃｈｉｔ４ｃＤＮＡとの位置調整に基づ （（図２４）。イントロン境界は共通ＧＴ／ＡＧ配列を含む。ＴＡＴＡボックス 配列（ＴＡＴＡＡＡ）は３７８位に位置し、これはＡＴＧ出発コドンの９０ｂｐ 上流である。

推定的ポリＡシグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は１７２５位に位置する。

配列番号７および配列番号８ テンサイλＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーから単離された酸性キチナーゼ５Ｅｃ ＤＮＡクローンのＤＮＡ配列（配列番号７）および推定されたアミノ酸配列（配 列番号８）。

この配列は、１１０６ｂｐ長であり、ポリペプチド鎖中に２９３アミノ酸残基を 有する蛋白をコードする。先導配列は、２５アミノ酸残基および２６８アミノ酸 残基の機能ドメインにより構成される。ｃＤＮＡクローンは、１７ｂｐの５°非 暗号化領域および２０２ｂｐの３゛フランキング領域を有する。

配列番号９および配列番号１０ テンサイλＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーから単離されたβ−１，３−グルカナ ーゼ４ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列（配列番号９）および推定されたアミノ酸 配列（配列番号１０）。

この配列は、１２４９ｂｌ）長であり、ポリペプチド鎖中に３３６アミノ酸残基 を有する蛋白をコートする。ｃＤＮＡクローンは、３３ｂｐの５゛非暗化領域並 びに１１５７位に推定的ポリアデニル化シグナルおよびポリＡテールを含む１８ ２ｂｐ３°フランキング領域を有する。

配列番号１１および配列番号１２ テンサイＥＭＢＧ３ゲノムライブラリーから単離されたキチナーゼ１遺伝子をコ ードするゲノムクローンのＤＮＡ配列（配列番号１１）および推定されたアミノ 酸配列（配列番号１２）。

この配列は、約６．３ｋｂ長であり、ポリペプチド鎖中に４３９アミノ酸残基を 有する蛋白をコードする。先導配列は、２６アミノ酸残基、次いで２０アミノ酸 残基のへベインドメイン、１３２アミノ酸残基のプロリン濃厚ドメインおよび２ ３８アミノ酸残基の機能ドメインから成ることが推定される。この蛋白は、恐ら くは蛋白を液胞へ指向させると思われる２３アミノ酸残基のＣ−末端伸長部を有 する。

この配列は、２１７０−４６１８位および４７７６−５４０６位に２つのイント ロンを含む。イントロン境界は、共通ＧＴ／ＡＧ配列を含む。ＴＡＴＡボックス 配列（ＴＡＴＡＡＡ）は、ＡＴＧ出発コドンの約７０ｂｐ上流である１３５５− １３６０位に位置する。推定的ポリＡシグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は、６０３２位 に位置する。

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材料および方法 生物学的材料 植物 ベータ・ブルガリス、栽培変種「モノバ」の種子を、粘度混合ビート（「サイカ ス」）に播種し、１１／１３時間の夜／昼サイクル、２５／１８℃（昼／夜）お よび７０％相対湿度で生長チャンバー中に置いた。光強度は約２５０００ルクス であった（「オスラムＨＱ　Ｉ−ＴＪ、４００Ｗ／ＤＨ）。播種の３週間後、実 生を、同じ生長培地を含む１２ｃ＋ａのプラスチック製鉢に植え替えた。１日２ 回、領１％肥料：「ストジエルネ」万能肥料４：１：４（Ｎ：Ｐ：Ｋ）を含む水 を植物に補充した。播種の６週間後、植物は、セルコスポラ・ベティコラによる 感染実験に使用できる状態であった。

ニコチアナ・タバクムおよびニコチアナ・ペンタミアナ植物は、上記要領で得ら れた。

菌類 セルコスポラ・ベティコラ菌の単離株を感染実験用に使用した。単離株ｒＦ５７ ３」は、ユナテイッド・ステーブ・デパートソフト・オブ・アグリカルチャー、 アグリカルチュラル・リサーチ・ディビジョン（フォートコリンズ、コロラド、 アメリカ合衆国）から入手された。

セルコスポラ・ニコチアナ植物の単離株（ＡＴＣＣ１８３６６）は、アメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクションから入手された。

セルコスポラ種の成長 この菌を、ペトリ皿中固体成長培地で成長させた。滅菌「ジャガイモデキストロ ース寒天」（「ディフコ」、３９ｇ／ｌ）を成長培地として使用した。菌糸体の プラグをベトリ皿の中心に置き、培養物を室温で４週間インキュベーションした 。

ある程度の寒天を含む菌糸体「マット」全体を切断することにより、胞子誘導用 の「菌糸体」を「採取コした。

セルコスポラ種の胞子形成 ５０ｍ１の滅菌ガラス管において菌糸体を蒸留水と混合（１：２）Ｌ、、８００ ０　ｒｐｍで２分間稼動させる「ウルトラ・ターラックスＴ２５」ミキサーを用 いてホモジナイズした。

ホモジネート１ｍｌを、固体胞子形成培地を含むペトリ皿に移した。ｒＶ−８Ｊ を培地として使用した。それは、２００ｍ１のｒＶ−８Ｊ液（キャンベル、イタ リア）、８００ｎ＋１の水、３ｇのＣａＣＯ３および２０ｇの寒天を含んでいた 。

＠濁液をそのまま１時間静置した。培養物を風乾後（約１時間）、ペトリ皿を閉 じ、密封し、１３℃および２４時間照明（クールホワイト）でインキュベーショ ンチャンバー中に入れた。

インキュベーションの７日後、ペトリ皿へ１０ｍ１の蒸留水を注ぎ、培養物表面 を滅菌ブラシでしっかり磨くことにより、胞子を採取した。

生成した胞子懸濁液は、約１０００００胞子／ｍｌを含んでいた。

セルコスポラ種による感染　゛ 接種用として、２０ｇｇのトウィーン−２０を含む水１ｓｌに、１２５００の胞 子を懸濁し在。クロマトグラフィー噴霧器を用いて、懸濁液を、「溢れ出る」ま で６通合テンサイまたはニコチアナ植物の上部葉裏面に適用した。接種直後、植 物を、３０℃、１００％相対湿度および２４時間照明（クールホワイト）で保っ た「ミストチャンバー」中に入れた。５日間のインキュベーション後、３０℃、 ８０％相対湿度および２４時間照明で保った生長チャンバーへ植物を移した。接 種の約１０日後、セルコスポラ感染が確立されたことを示す壊死スポットが成熟 葉に現れた。接種後、 １）　キチナーゼ４、酸性キチナーゼＳＥおよびβ−１，３−グルカナーゼの小 規模精製、および ｉｉ）放射化学検定法および免疫プロッティングを用いた全酵素活性の発現レベ ルを測定するための時間推移試験、 １ｉｉ）上記（ｉｉ）技術を用いたトランスジェニック植物における酵素の各々 の発現レベルの測定、 ｖｉ）ｃＤＮＡライブラリーの構築に使用するｍＲＮＡの単離に使用するため、 特定時間間隔でテンサイ植物を採取した。

根病原体リゾクトニア・ソラニによるニコチアナ植物の感染リゾクトニア・ソラ ニの単離株は、Ｋ、ツァベラークロナビ博士（サロニキ、ギリシャ）から入手さ れた。

１％のジャガイモデキストロースのブロスに２回浸漬し、オートクレーブで処理 した大麦の粒において、リゾクトニア・ソラニの接種物を製造した。菌の成長培 養物の寒天ディスクに穀粒を接種し、２週間インキュベーションした後、それら を風乾した。

別法として、ジャガイモデキストロース寒天で成長しているリゾクトニア・ソラ ニのディスクは、接種物として直接使用され得る。

接種物を異なる濃度で鉢植え土壌中に混合し、１４日間根付いたトランスジェニ ック植物を感染土壌に移植した。生き残っている植物のパーセンテージは、１． ２および３週間後に各々記録され得、３週間後、生き残っている植物を根の損傷 について評価する。別法として、トランスジェニック植物からの種子を、感染土 壌に直接播種した。

１ｇのテンサイ葉材料からの蛋白の抽出さらに具体的には、小規模精製を下記要 領で行った。１ミリモルの両ベンズアミジン、ンチオトレイトールおよびフェニ ルメチルスルホニルフルオリドを含む（えん酸緩衝液（０，１モル、ｐＨ５，２ ｍｌ／ｇ組織）中ウルトラ・ターラックス・ホモジナイザーにより、葉材料１ｇ をホモジナイズした。１５分間１５０００Ｘｇでの遠心分離により粒状物質を除 去した。遠心分離を反復する前に酵素を含む上清を別の試験管に移した。

テンサイ葉材料からの蛋白の大規模抽出酵素の抗菌潜在能力およびアミノ酸配列 を測定するためには、大量の純粋酵素が要求される。充分な量、すなわちｍｇ量 を得るため、キチナーゼ４、酸性キチナーゼｓＥおよびβ−１，３−グルカナー ゼの大規模精製を、天然感染テンサイ植物、栽培変種「モノバ」から得た２ｋｇ の葉材料により行った。５０またはそれ以上の壊死病変をもつ天然感染葉を、イ タリアにある育種場の畑（マリボーイタリア、ボローニヤ）から摘み取り、キチ ナーゼ４の抽出が実施されるまで４℃で貯蔵した。

キチンカラムの製造 ３０ｇのキトサン（プロタンから、シー・キュアＰ１ナンバー７０９、ノルウェ ー）を、６００＋ｎｌの１０％酢酸に溶かした。３０分後、６００１１のメタノ ールを混合しながらゆっくりと加えた。濁った粘ちょう性溶液を２回ろ過するこ とにより（最初はグラスウール、次に焼結ガラス漏斗を使用）、粒状物質を除去 した。ろ液を磁気撹はん装置上のビーカーに移し、４０ｍ１の無水酢酸を充分に 撹はんしながらゆっくりと加えた。約２分後、溶液はゲルに変わった。反応を１ ０分間続行させた後、ゲルをスパチュラで断片に切断した。ゲル断片をワーリン グ配合機へ移し、メタノールで被覆し、２分間全力でホモジネートした。メタノ ール、酢酸および未反応の無水酢酸を、ホヮットマン・ナンバー１ろ紙を用いた ブフナー漏斗でのろ過により除去した。ろ液をビーカーに移し、１リツトルの１ モルＮａｇ　ＣＯ３を加え、ｐＨを６Ｎ　ＮａＯＨで９に調節した。５０＋ｅｌ の無水酢酸をゆっくりと加え、ｐＨを９に調節した。反応を１時間行わせた後、 ブフナー漏斗でのろ過により最終生成物を集めた。充分に水で洗浄した後、４℃ で貯蔵前に生成物をｐＨ８，０で１０ミリモルのトリス緩衝液中において平衡さ せた。収量は７００ｍ１の再生キチンであった。ファーマシアによる慣用的方法 の使用により、再生キチンからキチンカラムを製造した。

放射性コロイド状キチンの製造 非標識キチンの合成に関する記載に従い（上記参照）、３Ｈ−標識無水酢酸によ り２ｇのキトサンをアセチル化した。ブフナー漏斗で３Ｈ−標識キチンを充分に 洗浄した後、それをビーカーに移した。５０ｍ１の濃縮氷冷ＨＣＩを加え、０℃ で５分間撹はんすることによりキチンを溶がした。シロップ状液体を焼結ガラス 漏斗でろ過し、激しく撹はんした５０％水性エタノールへゆっくりと注ぐと、高 度分散状態でキチンが沈澱した。遠心分離により残留物を沈降させ、数回水に懸 濁することにより、過剰の酸およびエタノールを除去した。最後に、コロイド状 キチンを２００ｍ１の水に懸濁し、５×１分間全力で音波処理した。使用時まで ｓＨ−標識キチンを４℃で貯蔵した。

ラミナリン力ラムの製造 ジビニルスルホン活性化アガロース（ミニ−リーク・ハイ、ＫＥＭ−ＥＮ−ＴＥ Ｃ１デンマーク）を用いて、ラミナリン（β−１，３−グルカン）（ラミナリア ・ディジタリアから、ングマ）を固定化した。５０ｇのミニ−リーク・ハイを、 ｐＨ１１で２００ｍ１の１モル燐酸カリウム（Ｋ−Ｐ）に分散させ、５ｍｌのＨ ２Ｏに溶がした７５Ｑ＋ｎｇのラミナリンを加えた。反応を振動板上で１６時間 ２５℃で続行させた。ｐＨ９，５で１モルに−Ｐ緩衝液中５％メルカプトエタノ ールの溶液とのインキュベーションにより、未反応のジビニルスルホン基を遮断 した。反応時間は２５℃で１６時間であった。ブフナー漏斗でゲルを充分に洗浄 することにより、残留メルカプトエタノールを除去した。ラミナリンーアガロー スを、ｐＨ８，０で２０ミリモルのトリス緩衝液に懸濁し、４℃で貯蔵した。フ ァーマシアによる慣用的方法を用いて、ラミナリンーアガロースからラミナリン カラムを製造した。

３Ｈ−標識ラミナリンの合成 ３Ｈ−標識ＮａＢ”Ｈ，で還元することにより、ラミナリンを放射能で標識した 。

５００ｍｇのラミナリン（ラミナリア・ディジタリアから、シグマ）を２＋ｉｌ のＨ！０に溶かし、８０（ｂｚｌのＮａＣ１（０，２ｇ／ｍｌ）、次いで８１１ の無水エタノールを加えて沈澱させることにより精製した。１５０００ｇで５分 間の遠心分離により沈澱物を集めた。上清を廃棄し、ラミナリンを含む沈澱物を ４ｍｌの０．ｌＮＮａＯＨに溶かした。この溶液を、５ｍＣ１のＮａＢ”Ｈ，を 含む反応容器に移した。２５℃で９０分間撹はん後、６００μｌの１モルＨＣＩ を加えて、未反応ＮａＢ’Ｈ４を破壊した。反応混合物を５００μｍアリコート に分割し、２００μｍのＮａＣ１および２ｍｌの無水エタノールを各試験管に加 えた。０℃で１０分間貯蔵後、１５０００Ｘｇで５分間の遠心分離により沈澱物 を集めた。３Ｈ−標識ラミナリンを５００μｍの８２０に溶かし、上清における 基底値が２０μｌ当たり１１００ｃｐ未満となるまで、沈澱を反復した。ラミナ リンの標識溶液を一２０℃で貯蔵した。β−１゜３−グルカナーゼ検定での使用 前、溶液を水で２０倍に希釈した。

逆相ＨＰＬＣ ２モデルの４２０ポンプおよび溶媒ミキサーにより構成されるコントロン・アク チェン・ゲゼルシャフト（チューリヒ、スイス）の器械を使用した。製造会社の 使用説明書に従いコントロン・モデル４５０−ＭＴデータシステムにより、勾配 制御およびデータ獲得を遂行した。モノＳカラム（下記参照）から溶離した蛋白 を、バイダックＲＰ４（０，４６Ｘ１５ｃｍ、１０μｍ粒子サイズ、ザ・セバレ ーションズ・グループ、エスペリア、カリフォルニア）カラムまたはポリＦ（デ ュポン・ド・ヌモア）カラムでのＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。ＲＰ−ＨＰＬＣに使 用された移動系は、緩衝液Ａ：水中領１％ＴＦＡおよび緩衝液Ｂニアセトニトリ ル中０．１％ＴＦＡてあった。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ ンヤカーオヨヒフォン・ジャボウ（１９８７）により記載されたトリシン５ＤＳ −ＰＡＧＥシステムを用いたイージー−４装置（Ｋｅｇ−Ｅｎ−Ｔｅｃ、デンマ ーク）において、粗植物抽出物または部分精製キチナーゼの５ＤＳ−ＰＡＧＥを 行った。

合計２５μｇの蛋白を各レーンに適用した。製造会社の使用説明書に従いファス ト−システム（ファーマシア）において、純粋キチナーゼイソ酵素を分析した。

酵素検定法 放射化学的キチナーゼ検定法 基質として３Ｈ−キチンを用いて、キチナーゼ活性を放射化学的に測定した。

３Ｈ−キチンの比活性は、４６０ｃｐ＋ｍ／ナノモルＮ−アセチルグルコサミン （ＧｌｕＮＡｃ）当量（または２．３　Ｘ　１０　’ｃｐｏ＋／ｍｇ３Ｈ−キチ ン）テアツタ。ソレハ、テンサイ葉から得られた粗キチナーゼ製品およびセラチ ア・マルセセンスまたはストレプトマイシス・グリセウスから得られたエキソキ チナーゼにょる３Ｈ−キチンの全体的加水分解後に、Ｇ　１ｕＮ　Ａｃのシンチ レーション計数法および比色測定法により測定された。

検定混合物は、酵素溶液２００μｍの全容量中、５０μｍの３Ｈ−キチン懸濁液 （１０００００ｃｐｍ含有）および１０マイクロモルのくえん酸ナトリウム（ｐ Ｈ５，０）を含んでいた。混合後、３Ｈ−キチンの酵素的加水分解を４０℃で１ ５分間行わせた後、３００μｌの１０％（ｖ／ｖ）ＴＣＡを加えた。基底値読み 取りを減少させるため、１００μｍの牛血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）を加 えた後、１５０００Ｘｇで５分間の遠心分離により不溶性３Ｈ−キチンを除去し た。３００μｍ上清における放射能をシンチレーション計数法により測定した。

放射化学的β−１，３−グルカナーゼ検定法基質として３Ｈ−標識ラミナリンを 用いて、β−１，３−グルカナーゼ活性を放射化学的に測定した。

検定混合物は、５０μｍの酵素抽出物、５０μｍの０．１モルＮａ−（えん酸（ ｐＨ５，０）および１０μｌの３Ｈ−標識ラミナリン（１９２０００ｃｐｍ）に より構成された。４０℃で１５分間インキュベーションを行った。反応を測定す るため、１０００μｍの無水エタノールおよび５０μｍの飽和ＮａＣ１溶液を加 えた。０℃で１０分後、１１００００ｘで５分間の遠心分離により未反応ラミナ リンを除去した。

上清４００μｍのアリコートをシンチレーションガラス瓶に移した。５＋１のＰ ＩＣｏ−ＦＬＵＯＲ−４０を加え、放射能の量を液体シンチレーション計数法に より測定した。

リソチーム検定法 キチナーゼ４のリソチーム活性を、セルステス等（１９８０）により記載された 方法により測定した。さらに具体的には、リソチーム活性をマイクロタイタープ レートで測定した。各ウェルは、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む２０ミリモルの燐 酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に懸濁したミクロコツカス・リソデイクチシ スから得た細胞壁を含む。４５０ｎｍでの初期吸光度を０．６に調節した後、卵 白リソチームまたは植物キチナーゼ４を加えた。この反応の後、５０分間５分間 隔で吸光度の減少を測定した。

β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）検定法ＧＵＳを、本発明による遺伝子形質転換 植物の構造に関するリポータ−遺伝子として使用する場合、形質転換の成功は、 ジェファーソン（１９８７）により記載された下記ＧＵＳ検定法の使用により決 定され得る。葉先を薄片（＜０．５ｍｍ）に刻み、０５ミリモルのフェリンアン 化カリウムおよび１０ミリモルのＥＤＴＡを含む０１モル燐酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７，０）に溶かしたｘ−ｇｌｕｅ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インド リル−β−グルクロニド）の２ミリモル溶液中でインキュベーションした。葉片 を３７℃で２−４時間処理し、水で洗浄し、染色強度を顕微鏡による視覚検査に より記録した。

キチナーゼ２．３および４、酸性キチナーゼＳＥおよびβ−１，３−グルカナー ゼイソ酵素の精製 下記流れ図に示されている通り、酸性および塩基性キチナーゼイソ酵素を、テン サイ葉から得られたβ−１，３−グルカナーゼと一緒に精製した。

２ｋｇのテンサイ葉 テンサイ葉は、イタリアで入手された（大規模、「生物学的材料」参照）。以下 、下記で概説されている精製段階の各々について説明する。各段階で使用される 装置および方法は、下記要領に従い行なわれる。

モノじスポラ・ベティコラ感染テンサイ葉がら得られた蛋白の抽出全段階とも４ ℃で行なわれた。遠心分離は、この精製方法全体を通して、セントリコンモデル Ｈ−４０１Ｂ遠心機中２０分間２００００　ｘｇで行なわれた。

細胞不含有抽出物の製造 ２ｋｇのセルコスポラ感染葉を、１ミリモルＤＴＴ（ジチオトレイトール）、１ ミリモルＢＡＭ（ベンズアミジン）（出発緩衝液）および２００ｇのダウエック ス１×２（１００μ■／メツシユサイズ）を含む４リツトルのＮａ−（えん酸緩 衝液（ｐＨ５゜０）中でホモジネートした。遠心分離前、ホモジネートを２重層 の３１μｍメツシュのナイロンガーゼにより圧搾した。

加熱および硫酸アンモニウムによる沈澱遠心分離後に得られた上清分画を５０℃ で２０分間加熱し、４℃に冷却後、沈澱物を遠心分離により集めた。９０％飽和 度が達成されるまで固体硫酸アンモニウムを上清に加えた。遠心分離後、沈澱し た蛋白を出発緩衝液：１ｉｉの緩衝液／１０ｇの出発物質に溶かした。

カラムクロマトグラフィーによるキチナーゼ２．３および４、酸性キチナーゼＳ Ｅおよびβ−１，３−グルカナーゼの精製キチナーゼおよびβ−１，３−グルカ ナーゼイソ酵素を、硫酸アンモニウム沈澱蛋白分画から精製した。可溶化後、蛋 白溶液を、１ミリモルのＤＴＴおよび１ミリモルのＢＡＭを含む１０ミリモルの トリス（ｐＨ８，０）に対して透析した。変性した蛋白を遠心分離により除去し 、上清を上記で概説した２つのカラム、例えばｉ）５０ｍｌファースト・フロー ・セファロースＱ（ファーマシア）およびｉｉ）１００ｍｌキチンカラム（上記 要領に従い製造）（これらのカラムは連結されている）に充填した。カラムをト リス緩衝液により平衡状態にした後、２８１＋ｎｌの試料を加えた。出発緩衝液 で充分に洗浄することにより、β−１，３−グルカナーゼを含む非結合蛋白を除 去した。ファースト・フロー・セファロースＱカラムを取り外した後、キチナー ゼが、１ミリモルのＤＴＴを含む２０ミリモルの酢酸（ｐＨ３，２）によりキチ ンカラムから溶離した。酸性キチナーゼＳＥは、０．５モルのＮａＣ１を含むト リス緩衝液によりファースト・フロー・セファ０−スＱカラムから溶離した。

β−１，３−グルカナーゼの精製 カチオン交換クロマトグラフィーによるβ−１，３−グルカナーゼの分離ファー スト・フロー・セファロースＱにもキチンカラムにも吸着されなかった蛋白を集 め、アミコンＰＭ−１０フィルター（ダンパー、マサチューセッツ、アメリカ合 衆国）による圧力透析により６０■１に濃縮した。１ミリモルＤＴＴおよび１ミ リモルＲＡＭを含む２０ミリモルＮａ−酢酸緩衝液（ｐＨ４，２）に対して一夜 透析後、透析緩衝液中で平衡させた５Ｑｍｌファースト・フロー・セファロース Ｓカラム（ファーマシア）に、蛋白溶液を充填した。平衡緩衝液で洗浄すること により非吸着蛋白を除去した。結合蛋白は、出発緩衝液中０〜０．５モルＮａＣ １の６００１１１−次勾配により溶離した。

β−１，３−グルカナーゼ活性の３つの主要ピークＡ、ＢおよびＣが観察された 。ラミナリンーアガロースにおけるアフィニティーカラム・クロマトグラフィー により、ピークＢをさらに分画化した。ピークＡおよびＣはそれ以上精製しなか った。

ラミナリンーアガロースにおけるβ−１，３−グルカナーゼの精製ラミナリンー アガロースの２８ｍ１カラムを、１ミリモルの両ＤＴＴおよびＢＡＭを含む１０ ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ８，０）により平衡状態にした。ピークＢからの 蛋白分画を合わせ、圧力透析により１５ｍ１に濃縮し、トリス緩衝液に対して透 析した。ラミナリンーアガロース力ラムに試料を載せた後、カラムを通る流れを ２０分間止めることにより、β−１，３−グルカナーゼをアフィニティーリガン ドに結合させた。トリス緩衝液で洗浄することにより非吸着蛋白を除去し、β− １，３−グルカナーゼをトリス緩衝液中１モルＮａＣ１で溶離した。

ＦＰＬＣによる４種のβ−１，３−グルカナーゼイソ酵素の精製β−１，３−グ ルカナーゼ活性を伴うラミナリンーアガロース力ラムからの分画を合わせ、濃縮 し、２０ミリモルの酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）に対して一夜透析した。１次Ｎａ Ｃ１勾配を用いたＦＰＬＣシステムにおけるカチオン交換カラム（七）Ｓ）（フ ァーマシア）で蛋白を分離させた。４つの主要蛋白ピークが観察された（図２１ 参照）。それらは全て、β−１，３−グルカナーゼに関する放射化学検定（上記 参照）において３Ｈ−標識ラミナリン基質を加水分解した。

逆相ＨＰＬＣにおけるβ−１，３−グルカナーゼの精製上記ポリＦ逆相ＨＰＬＣ カラムへＦＰＬＣ精製β−１，３−グルカナーゼを注入することにより、精製を 行った。０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中１０％アセトニトリルで洗浄す ることにより、非吸着物質（緩衝液、塩等）を除去した。

蛋白は、１０〜７０％のアセトニトリルの１次勾配を用いることにより溶離され た。

この脱塩／精製段階後、ピーク３および４は、１）Ｎ−末端アミノ酸配列決定、 ｉｉ）アミノ酸組成分析（実施例８参照）、１ｉｉ）　）リブシン消化によるペ プチド獲得およびｉｖ）うさぎへの注入によるポリクローナル抗体の製造に使用 できる状態であった。

キチナーゼ２．３および４の精製 ２０ミリモル酢酸（ｐＨ３，２）でキチンカラムを溶離することにより、キチナ ーゼ活性をもつ４０分画（１０ｍｌ／分画）が得られた。分画を合わせ、ｐＨ４ ，５に調節し、１５ｗ１に濃縮し、２０ミリモルＮａ−酢酸緩衝液（ｐＨ４，５ ）に対して透析した。

２ｍｌアリコートを、ＦＰＬＣシステム（ファーマシア）により上述のカチオン 交換カラム（モノ−８）に充填した。酢酸緩衝液で洗浄することにより、非吸着 物質を除去した。キチナーゼイソ酵素の溶離は、酢酸緩衝液中０〜１モルＮａＣ １の１次勾配により達成された。溶離プロフィールは図１に示されている。さら に精製するため、逆相バイダックＲＰＪ　ＨＰＬＣカラムを使用した。条件は、 β−１゜３−グルカナーゼの精製に関する上記条件と同様であった。

酸性キチナーゼＳＥの精製 アニオン交換クロマトグラフィーにおける酸性キチナーゼＳＥの精製酸性キチナ ーゼＳＥは、精製概略図に示されている通り０，５モルＮａＣ１を含むトリス緩 衝液により上記ファースト・フロー・セファロースＱカラムから溶離された。蛋 白を１０ミリモルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）に対して透析し、同緩衝液で 平衡状態にした４０ｍ１ｒフアースト・フロー・セファロースＱ」カラムに載せ た。蛋白は、Ｏ〜０．５ミリモルＮａＣ１の８００ｍ１−次項化ナトリウム勾配 で溶離された。上記放射化学キチナーゼ検定により測定されたキチナーゼ活性を 含む分画をプールした。

クロマトフオーカシングにおける酸性キチナーゼＳＥの精製蛋白分画を２５ミリ モルのビス−トリスに対して透析し、イミノジ酢酸によりｐＨ７，０に調節した 。１５ｍ１の「ボリバファ−・エクスチェンジャー」カラム（ファーマシア、Ｐ ＢＥ７４）を同緩衝液により平衡状態にし、５Ｑｍｌの試料を充填した。ビス− トリス緩衝液で洗浄することにより、非吸着蛋白を除去した。

ｐＨ３，６に調節された「ポリバファ−７４」の適用により、７〜３．６の一次 ｐＨ勾配が生じ、幾つかの蛋白が脱着された。酸性キチナーゼＳＥはこのｐＨで はカラムにまだ保持されていたが、０．３モルＮａＣ１を「ポリバファ−７４」 に加えることにより、それは脱着された。

ＦＰＬＣによる酸性キチナーゼＳＥの精製上記放射化学キチナーゼ検定により測 定された高いキチナーゼ活性をもつ蛋白分画をプールし、２５ミリモルのビス− トリス（ｐＨ７，０）に対して透析した。ビス−トリス緩衝液で平衡状態にした モノ−Ｐ　ＦＰＬＣカラム（ファーマシア）で蛋白を分割した。出発緩衝液によ る初回洗浄後、０〜０．３モルＮａＣ１の一次塩勾配を用いることにより（図３ ）、酸性キチナーゼＳＥの３種のイソ酵素が分離された。

テンサイキチナーゼ４の酵素開裂パターンの分析４０μｌの３Ｈ−標識キチン（ ５０００Ｑｃｐｍ）を、０．１モルくえん酸緩衝液（ｐＨ６５）中７μｇのキチ ナーゼ４（上記要領で精製）とインキュベーションした。総容量は３００μｌで あった。特定時間（１５分、３０分、１時間および２４時間）後、３００μｍの １０％（ｖ／Ｖ）ＴＣＡを加えることにより反応を止めた。３Ｈ−標識キチンの 未反応ポリマーを除去し、上清のアリコート（３００μｍ）を薄層クロマトグラ フィー（ＴＬＣ）プレート（シリカゲル６０Ｈ１メルク）に適用した。移動相は ｎ−プロパツール／ＨｚＯ／ＮＨｓ（７０／３０／１：ｖ／ｖ／ｖ）　であった 。

キチンの酸加水分解により、Ｎ−アセチルグルコサミン誘導オリゴ糖の標準物質 を製造した（ルブレイ、１９６４）。この標準物質を用いて、ＴＬＣプレートに おける酵素開裂による生成物を局在させた。剃刀の刃で削ることにより、ＴＬＣ プレート上の興味の対象である領域を取り出し、３Ｈ−標識オリゴ糖を含むシリ カゲルをシンチレーションガラス瓶に移した。ｌＱ＋ａｌのシンチレーション液 体ジミルム（パラカード・インスツルメンツ）を加え、液体シンチレーション分 光測光法により放射能を測定した。

抗菌活性 セルコスポラ・ベティコラおよびトリコデルマ・レーセイの成長に対するテンサ イキチナーゼ４の阻害効果は、単独または酸性キチナーゼＳＥおよび塩基性β− １，３−グルカナーゼと組み合わせた形で観察された。抗菌性蛋白の存在下にお ける、病原菌、例えばセルコスポラからの胞子の発芽および／または菌糸の成長 は、３つの相異なる方法で分析され得る。

方法Ｉは、培地の薄膜で覆い、緩衝液（対照）またはμｇ量の抗菌性蛋白とイン キュベーションした顕微鏡スライドにおいて行なわれる。胞子の発芽または菌糸 体の成長をカルコフルオーホワイト染色により追跡した後、蛍光顕微鏡により分 析する。

方法ＩＩは、成長培地、セルコスポラからの１０または１００の胞子、緩衝液（ 対照）または抗菌性蛋白を含むマイクロタイタープレートにおいて行なわれる。

プレートを２５℃でインキュベーションした後、光学密度（６２０ｎｍで）を特 定時間間隔で測定する。

方法ＩＩＩでは、放射性トレーサー技術をオートラジオグラフィーと組み合わせ て用いることにより、キチンおよびβ−１，３−グルカンがセルコスポラにおけ る重要な細胞壁成分であること、およびキチナーゼ４がセルコスポラの菌糸先端 に堆積した放射能を除去し得ることを立証する。

方法Ｉ：　顕微鏡スライド生物検定 顕微鏡スライドを、ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）の薄層で被覆し、 ペトリ皿中湿らせたろ紙の上で６時間貯蔵した。胞子懸濁液（１００００胞子／ ＩＩ＋１）１０μｍをスライドの中央に置いた。１０ミリモルのトリス緩衝液（ ｐＨ８，０）１０μｌまたは試験される抗菌性蛋白２０μｇを含む製品１０μｌ を、胞子懸濁液に適用した。抗菌性蛋白をトリス緩衝液に溶かし、０．２２μ膓 フイルターでろ過した後、胞子懸濁液と混合した。ペトリ皿をテープで密閉し、 ３０℃および充分な照明下で２４−４８時間インキュベーションした。評価時点 で、培養物を１゜分間蛍光染料カルコフルオーホワイト（水中り０５％（ＩＦ／ Ｖ））で染色した。カルコフルオーホワイトは、主としてキチンの形成されつつ ある構造を含む細胞壁に結合するため、蛍光染料は菌糸細胞壁の分化および成長 に関するマーカーとして機能し得る。

方法ＩＩ：　マイクロタイタープレート生物検定１００μｍのジャガイモデキス トロース・ブロス（ＰＤＢ）液体成長培地を、マイクロタイタープレートの各ウ ェルに入れた。セルコスポラの胞子懸濁液（１０００００／ａ＋１）を４層の滅 菌ガーゼで２回ろ過することにより、少量の菌糸体片を除去した。胞子懸濁液を 滅菌水で１：１００および１：１０００に希釈した後、１００μｍのアリコート をマイクロタイターウェルに移した。抗菌性蛋白を同緩衝液に溶かし、方法Ｉに 関する上記要領と同様にして処理した。生物検定は、菌胞子の各希釈率に関して ５回反復して行なわれた。マイクロタイタープレートをテープで密閉することに より、蒸発および汚染を回避した。５０ｒｐｖＡで稼動させたアジテータ−にお いて室温でインキュベーション後、テープを取り外し、１日２回６２０ｒ＋ｍで 吸光度を測定した。吸光度を測定することにより、菌の発芽および成長を４日間 追跡した。抗菌性蛋白および胞子希釈率の各組み合わせに関して、吸光度対時間 をプロットした。

方法ＩＩＩオートラノオグラフィー セルコスポラ培養物を方法Ｉでの記載に従い顕微鏡スライドにおいて成長させた 。３Ｈ−標識Ｎ−アセチルグルコサミンを含む液体成長培地（ＰＤＢ）を、１日 令培養吻合体に均一分布させた。２０分間インキュベーション（パルス標識）後 、顕微鏡スライドを６％（Ｗ／Ｖ）のＴＣＡに浸すことにより、反応（成長／取 り込み）を止めた。製品をエタノール勾配（７０−１００％）で脱水し、乾燥し た。

パルス標識後、１０ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ８，０）中にキチナーゼ４を 含む分画５０−１００μｇを、固定および脱水培養物の半分に分布させた。顕微 鏡スライドをベトリ皿中の湿らせたろ紙上に置いた。ペトリ皿を密閉後、製品を ３０℃で２０時間インキュベーションした。スライドを６％ＴＣＡに浸すことに より、酵素処理を止め、製品を上記と同様エタノール中で脱水した。

顕微鏡スライドを、オートラジオグラフィー用エマルジョン（イルフォードに５ ）で被覆した。エマルジョンを「送風式乾燥機」により充分に乾燥後、スライド を露出するため７℃および低い相対湿度で７日間暗所に置いた。スライドを１０ 分間コダソクＤ−１９現像液中に置き、次いで２分間固定することにより、エマ ルジョンを展開し、１０分間流水中で洗浄した。乾燥後、製品は菌類の菌糸の顕 微鏡分析に使用できる状態であった。

血清学的分析で使用される抗体の製造 キチナーゼ２．３および４に対するポリクローナル抗体の製造凍結乾燥した精製 キチナーゼ２．３および４（上記要領で得られる）を、トリス緩衝液（１０ミリ モル、ｐＨ８，０）に溶かし、フロインド不完全アジュバントで１：１に希釈し た。ダコパッツ（テンマーク）による常法に従い、うさぎにおいてポリクローナ ル抗体を生じさせた。

キチナーゼ４ペプチドに対する単一特異的ポリクローナル抗体の製造この方法は 、ＡＨＡＳペプチドに対する単一特異的抗体の製造に関して詳述された要領（フ ルクッセンおよびボウルセン、１９９１）に従い行なわれた。キチナーゼ４に関 するアミノ酸配列のコンピューター分析に基づき、４つのペプチドを、キチナー ゼ４および他の塩基性キチナーゼ間の親水性および変化性の基準で選択した。ペ プチドは、ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズ（イギリス国）により特 注合成された。構造は、純度を評価するための質量分光法およびアミノ酸分析に より立証された。

免疫化前、ペプチドをジフテリアトキソイドにコンジュゲートした。担体のジフ テリアトキソイドは、カルボジイミド（ＥＤＣ）、次いでＮ−ヒドロキシスル不 スクシンイミドとの反応によりトキソイド−スルホスクシニル−エステル誘導体 に変換された。結合後、４つの相異なるペプチド−ジフテリアトキソイドコンジ ュゲートを、セファクリルＳ−３００カラムでのゲルろ過により精製した。高分 子量分画を集め、凍結乾燥し、水に溶かした。うさぎでの免疫化は、キチナーゼ ２および４に対するポリクローナル抗体に関する上記要領で行なわれた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロッティング免疫プロッティングするため、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥによる分離後、蛋白を半乾燥プロッティングにより０．４５μｍニ トロセルロース膜（シュライヒエルおよびシュエル、ドイツ）へ移した。抗原を 、キチナーゼ２および４に対して産生した１次ポリクローナルうさぎ抗体（上記 参照）によりプローブし、続いてキーゼーアンデルセン（１９８４）に従いアル カリ性ホスファターゼ複合第２抗体（ダコパッッ、テンマーク）を用いて明視化 した。

トランスジェニックのタバコにおける発現レベルを測定するため、アマ−ジャム から入手したＥＣＬ（強化化学ルミネッセンス）を使用した。葉材料の抽出後、 １μｇの蛋白を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各レーンに適用した。プロッティング後 、ニトロセルロース膜をアマ−ジャムのプロトコルに従い処理した。簡単に述べ ると、まずニトロセルロース膜を１０％ＢＳＡで処理した後、１：１０００に希 釈したテンサイキチナーゼ４に対する１次抗体を加えた。抗原は、西洋わさびベ ルオキシダーゼ複合２次抗体により検出された。検出試薬を加え、２公債蛋白バ ンドはハイパーフィルム−ＥＣＬにおいて明視化される。

精製キチナーゼイソ酵素２．３および４並びにβ−１，３−グルカナーゼ３およ び４のアミノ酸組成の分析 凍結乾燥後、精製キチナーゼイソ酵素２．３および４並びにβ−１，３−グルカ ナーゼ３および４を、バークホルトおよびジエンセン（１９８９）による記載に 従いアミノ酸分析に付した。キチナーゼイソ酵素およびβ−１，３−グルカナー ゼの各々のアリコート（４，２μｇ）を、３．３−ジチオプロピオン酸とインキ ュベーションすることにより、酸加水分解前にシスティン残基を誘導体化した。

測定は２回反復された。

テンサイキチナーゼ３および４、ＳＥ並びにβ−１，３−グルカナーゼ３および ４のトリプシンペプチドの製造およびアミノ酸配列分析トリプシン消化 上記ＲＰ−ＨＰＬＣおよび凍結乾燥後、１００μｇの蛋白を、７モルのグアニジ ン塩酸塩を含む０．２モルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，４）２００μｍに再溶解 した。

２０ミリモルのジチオトレイトールを加え、蛋白を窒素下３７℃で４時間還元し た。３０ミリモルのヨードアセトアミドを加え、反応を窒素下２５℃で４０分間 暗所で続行させた。５μｍのβ−メルカプトエタノールを加え、次に暗所で１５ 分間２５℃でインキュベーションすることにより、未反応ヨードアセトアミドを 不活化した。小さな穴があけられた蓋の下に透析管（１０ｋＤａカツトオフ、セ ルバポア、セルバ、ドイツ）が挿入されたエッペンドルフ試験管を用いて、暗所 で２４時間４℃で０２モルの炭酸アンモニウム（ｐＨ８，０）に対して蛋白溶液 を透析した。その後、沈降した蛋白を、１１００００Ｘで５分間の遠心分離によ り沈澱させ、上演を別の試験管に移した。数粒子のグアニジン塩酸塩を加えるこ とにより、蛋白沈澱物を部分的に可溶化し、４０℃で３０分間２０μｇの炭酸ア ンモニウム（ｐＨ８，０）中４μｇのＴＰＣＫ処理トリプシンとインキュベーシ ョンした。

最後に、上演および６μｇのＴＰＣＫ処理トリプシンを加えた。消化を４０℃で ４時間行わせ、２０μｌのＴＦＡを加えることにより止めた。ペプチド溶液を、 蛋白のＲＰ−ＨＰＬＣ用の上記移動系を用いるバイダックＣ１８カラム（０，４ ６ｘ１５ｃｍ、１０μｍ粒子サイズ、セバレーションズ・グループ、カリフォル ニア）でのＲＰ−ＨＰＬＣにかけた（図４参照）。集められたペプチドを緩衝液 入で３倍希釈し、上記移動系を用いるデベロシルｃｐｓカラム（０，４Ｘ　１０ ｃｍ、　５μｍ粒子サイズ、オ・／ヨウ博士、ノボ−ノルディスク、テンマーク ）での再クロマトグラフィーにかけた。選択されたペプチドをアミノ酸配列分析 にかけた。

アミノ酸配列決定 ペプチドのアミノ酸配列決定は、製造会社の使用説明書に従い、アプライド・バ イオシステムズ（カリフォルニア、アメリカ合衆国）製のパルス液相蛋白／ペプ チド合成装置モデル４７７およびＨＰＬＣオンラインＰＴＨ−アミノ酸分析装置 モデル１２０Ａにより行なわれた。

細菌株および酵素 制限酵素、フレノウポリメラーゼおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼは、ベーリンガー ・マンハイムから入手し、製造会社の使用説明書に従い使用した。

ｐ　Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔは、ストラタジーン（アメリカ合衆国）から入手し た。

ｐＵｃ１９は、ベーリンガー・マンハイムから入手した。

エンエリヒア・コリにおいてサブクローニングするため、ＤＮＡの転移は、製造 会社の使用説明書に従いＤＨ５αエシェリヒア・コリ細胞（ＢＲＬから）を用い て行なわれた。

テンサイ葉からのＲＮＡの単離 ＲＮＡの単離は、チャーブウィン等（１９７６）による記載に従い行なわれた。

ポリ−Ａ　ＲＮＡの精製 ポリーＡテールをもっＲＮＡを、オリゴ−ｄＴセルロースカラムによるアフィニ ティー・クロマトグラフィーにより精製した。０．５ｇのオリゴ−ｄＴセルロー スを、５ｍｌの０．５モルＮａＯＨ中で５分間混合した（Ｉｇのオリゴ−ｄＴセ ルロースは、１．２ｍｇのポリ−Ａ　ＲＮＡと結合する）。生成した混合物を、 ｐＨが７．５になるまで１０ミリモルのトリス（ｐＨ７，５）により中和した。

直径ＩＣＤＩの１ｃｍカラムを作製し、２０ｍ１のカラム緩衝液（５００ミリモ ルのＮａＣ１，１０ミリモルのトリスｐＨ７，５，１ミリモルのＥＤＴＡ）で平 衡状態にした。ＲＮＡを５分間６５℃で変性さ也５容量のカラム緩衝液をＲＮＡ に加えた後、カラムクロマトグラフィーにかけた。「貫流物（ｒｕｎ−ｔｈｒｏ ｕｇｈ）Ｊを集め、再びクロマトグラフィーにかけた。ＯＤ２．。が０．ｏｌま たはそれ未満に達するまで、カラムをカラム緩衝液で洗浄した。ポリ−Ａ　ＲＮ Ａをｌａ１分画中ＴＥ緩衝液により溶離し、各分画に関するＲＮＡ濃度をＯＤ２ ．。で測定した。ポリ−Ａ　ＲＮＡ含有分画をプールし、１００ミリモルのＮａ Ｃ１に調製し、−２０℃で２．５容量の９６％エタノールによりＲＮＡを一夜沈 澱させた。ポリ−Ａ　ＲＮＡを回転させ、１μｇ／１μｍの濃度でＨ２Ｏに溶か し、−２０℃で貯蔵した。収率は、カラムに適用された全ＲＮＡの約１−２％で あった。

テンサイ葉からのゲノムＤＮＡの分離 ゲノムＤＮＡをテンサイ葉（変種６０．１５９．８３８−１３１−４の）から分 離した（デラボルタ等、１９８３）。

上記要領で得られた２ｇのセルコスポラ感染テンサイ葉を、液体Ｎ！中で粉砕し 、凍結させ、凍結材料を４０＋ａｌのポリエチレン遠心分離管に移し入れた。１ ５１ｍ１の抽出緩衝液（１００ミリモルのトリス、ｐＨ８，０，５０ミリモルの ＥＤＴＡおよび５００ミリモルのＮａＣ１）を、１ｍｌの２０％ＳＤＳと一緒に 加え、混合後、混合物を６５℃で２０分間インキュベーションした。３モルの酢 酸カリウム５＋ａｌを加え、溶液を混合しくポルテックス）、氷上で２０分間イ ンキュベージジンした。

続いて、混合物を、４℃で２０分間２５０００Ｘｇでの遠心分離にかけた。上清 を１−２層のミラクロスに通して新しい遠心分離管中へろ過し、１５■１のイソ プロパツールを加え、混合物を一２０℃で３０分間インキュベーションした。さ らに２００００　Ｘｇで１５分間遠心分離後、沈澱物を７０％エタノールで洗浄 し、その後、簡単に乾燥した後、０７ｍｌのＸ−ＴＥ緩衝液（５０ミリモルのト リス、ｐＨ８，０および１０ミリモルのＥＤＴＡ）に再懸濁した。懸濁液をエツ ペンドルフ管に移し入れ、５分間遠心分離した。上清をフェノール／クロロホル ムで２回抽出した。７５μｌの３モルＮａ−酢酸および５００μｌのイソプロパ ツールを加え、混合し、３０秒間回転させることにより、ＤＮＡを沈澱させた。

その後、沈澱物を４００μｌのＨ２Ｏに溶かし、懸濁液を１００ミリモルＮａＣ １に調節し、９６％エタノールにより沈澱させた。懸濁液を５分間遠心分離にか け、上清を除去した。沈澱物を簡単に乾燥し、ＤＮＡを２００μｍのＴＥ緩衝液 に溶かした。０ＤＨｅでの吸光度を用いてＤＮＡ濃度を測定した（ただし、ＯＤ 、、。＝１＝５０μｇＤＮＡ／ｍｌ）。ＤＮＡを使用時まで一２０℃で貯蔵した 。

テンサイｃＤＮＡライブラリーの構築 上記要領で分離されたテンサイ＋ａＲＮＡに基づき、ストラタジーン・クローニ ング・システムによりλＺＡＰｃＤＮＡライブラリーを構築した。

テンサイゲノムＤＮＡライブラリーの構築ＳＡＵ　３Ａにより部分消化された、 上記要領で得られるゲノムテンサイＤＮＡに基づき、ゲノムテンサイライブラリ ーを、ベクターＥＭＢＬ３のＢａｍＨ１部位でゲノムＤＮＡをクローニングする ことにより構築した。ライブラリーは、クロンチックにより構築された。

関連したＤＮＡ配列をスクリーニングするためのプレートライブラリーサムプル ツク等（１９９０’）に従い、ライブラリーの力価（ｃＤＮＡまたはゲノムライ ブラリーの）を測定し、約１０６のファージを各スクリーニング用に使用した。

各２４．５Ｘ２４．５ｍｍプレートに関して、２．５Ｘ１０’フアージを、３＋ ａｌのエシェリヒア・コリ株ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（テンサイλＺＡＰｃＤＮＡライ ブラリーの場合）またはＬＥ３９２（テンサイゲノムライブラリー（ＥＭＢＬ３ ）の場合）と混合し、１０ミリモルのＭｇ　Ｓ　Ｏ４および０．２％マルトース を含むＬＢ培地でＯＤ、。ｏ＝ｌに成長させた。混合物を３７℃で２０−３０分 間放置した。

続いて、３０ｍ１の上部寒天（１０ミリモルのＭｇＳＯ４および０２％マルトー スを含むＬＢ培地中０．７％アガロース）（４８℃）を加え、生成した混合物を 、２０ＱｍｌのＬＢ寒天を含む２４．５ｘ２４．５＋ａｍプレートへ培養し、３ ７℃で一夜成長させた。

その場でのニトロセルロースフィルターへのプラークの移動その場での単一プラ ークへのハイブリダイゼーションによるλＺＡＰ組換えクローンのスクリーニン グは、下記要領で行なわれた。

３７℃で一夜成長させた後、プレートを５℃で約１５分間冷却した。乾燥フィル ターを細胞の菌叢上に置くことにより、ファージおよびＤＮＡを７１イポンドー Ｎナイロン膜（アマーンヤム）に移した。ファージを１〜５分間フィルターに吸 着させた。吸着の間、フィルターおよびプレートに針で方向を示す印を付すのが 好都合であった。複製フィルターを作製する場合、プレート上のマークをインク で満たし、次いで複製フィルターに似たマークで印を付すことができた。

次いて、フィルターを、３０秒間０．５モルＮａＯＨ，１，５モルＮａＣ１で浸 したホワットマン３ＭＭろ紙シートにおいて「プラーク側」上部で置いた。次Ｌ ＮＴ、それらを、下記溶液の各々において３０秒間洗浄した：１）０．５モルＮ ａＯＨ，１゜５モルＮａＣ１，２）０．５モルのトリス、ｐＨ７，５，１，５モ ルＮａＣ１，３）２ＸＳＳＣ（修飾ベントン、１９７７）。フィルターを風乾し 、３分間ファージ側上部で紫外線により照明した。

テンサイゲノムライブラリーのテンサイキチナーゼ４のスクリーニングに用いる 放射活性プローブの調製 関連オリゴヌクレオチドをサムプルツク等（１９９０）に記載される方法に従っ てバクテリオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いるリン酸化により標 識化した。より特異的には、オリゴヌクレオチドをそれらの５′末端でリン酸基 なしに合成し、酵素バタテリオファージＴ４ヌクレオチドキナーゼを用い［γ− ３２Ｐ］ＡＴＰからのγ−３２ｐで標識化した。

エタノールを用いる沈澱による放射能標識オリゴヌクレオチドの精製加熱による バクテリオファージＴ４オリゴヌクレオチドキナーゼの不活性化後、４０μｌの Ｈ２Ｏを管に加え、その内容物を十分に混合した。次いで、酢酸アンモニウムの ５Ｍ溶液２４０μｌと１μ９のニシン精子ＤＮＡを加えた。得られる混合物をよ （混合し、７５０μｌの水冷エタノールを加えた。再び十分に混合し、得られる 混合物を３０分間Ｏ℃に保持した。

放射能標識オリゴヌクレオチドを、ミクロ遠心機（１１ｉｃｒｏｆｕｇｅ）中４ ℃で２０分間１２．０００Ｘ９て遠心することにより採取した。使い捨て先端具 を備えた自動ピペット装置を用い、全上清溶液（取り込まれていない［γ−３２ Ｐ］ＡＴＰのほとんどを含む）とリン酸化反応の間に産生じた全ての遊離３２ｐ を注意して除去した。

得られる残渣を１００μｌのＨ２Ｏに再び溶解し、１０μｔの３Ｍ酢酸ナトリウ ム及びその後で２５０μｌの９６％エタノールを加えた。混合物を４°Ｃで２０ 分間遠心に付し乾燥して２００μｌのＨ２Ｏに再び溶解した。

フィルターハイブリダイゼーションによるキチナーゼ４ＤＮＡのオリゴヌクレオ チドハイブリダイゼーション 用いたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、Ａ−Ｔ対Ｇ−Ｃ塩基対の 選択的融解を排除し、ハイブリダイゼーションの緊縮性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ）をプローブの長さだけの機能として制御されるようにする。ノーイブリダイゼ ーション（よ、実質的にウッド等（１９８５）により記載されたように実施した 。上記のよう（こして得たニトロセルロースフィルターは２ＸＳＳＳで表面を湿 らせ、次しＸで）＼イブリダイゼーション緩衝液（６ＸＳＳＣ，１％ＢＳＡ、１ ％フィコール４０００．１％ＰＶＰ、５０％μ９／ｍｌの熱変性サケ精子ＤＮＡ 、５０ａ＋Ｍ’ル酸ナトリウム、ｐＨ６，８）中でプレハイブリダイズした。／ １イブリダイゼーションはプラスチ・ツクバッグ中３７℃で４時間、振盪しなが ら実施した。同じ溶液に放射活性第１ノゴヌクレオチドブロープ（２３−ｍｅｒ 　ｃｈｉｔ４プローブ）を加えた溶液中、３７℃で振盪しながら一夜、フィルタ ーを／＼イブリダイズした。ノλイブリダイゼーション緩衝液のＩ　Ｘ　１０　 ’ｃｐｍ／　ｍｌ溶液を用いた。フィルターを６ｘＳＳＣ＋＝４℃で３回すすぎ 、その後、６ｘＳＳＣ中、４℃で３０分間２回洗浄した。さら１ニフイルターを 、ＴＭＡＣ−緩衝液（３Ｍテトラメチルアンモニウムクロリド、５Ｑａ＋Ｍト１ ノスｐＨ８，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％５ＤＳ）中、３７℃で５分間３回 洗浄した。

（テトラメチルアンモニウムクロリドは５Ｍ貯蔵液中で造る。ＴＭＡＣ１ｔ水中 透明性（ｈｙｄｒｏｓｃｏｐｉｃ）であるから、真のモル濃度（ｃ）Ｉ；を式ｃ ＝（ｎ−１，３３１）／　０．０１８により屈折率（ｎ）から決定しなければな らない）。次Ｌ１でフィルターをＴＭＡＣ緩衝液中、５５℃で２０分間２回洗浄 した。

フィルターを空気中、室温で乾燥した。フィルターと寒天プレート（こよる自動 放射線写真を整列させるようにしているフィルター上のインクマーク（ま、Ｘ線 撮影マーカー（ウルターミット、シュ・ボン・ド・ネモアス）で指標しｊこ。フ ィルりＧｆ　ラ：／ラップてｉｉい、Ｘ−ｔｉフィルム（ＡＧＦＡ　ＣＵＲＩＸ 　ＲＰ２）を増感スクリーンで一７０℃で１６−１７時間フィルターにさらした 。フィルムを現像し、正のプラークは、フィルム上の点を寒天プレート上のそれ らとそろえることにより確認した。

プラーク採取 正のプラークを含んでいる寒天断片を緩和吸込み管を用Ｌ１て寒天プレートから 採取し、エッペンドルフ管中の５００μｌの３Ｍファージ緩衝液（サムプルツク 等、１９９０）と、１滴のクロロホルム中に置いた。エツペンドルフ管を室温で １−２時間放置し、ファージ粒子が寒天の外に拡散するようにした。プラーク当 り約１０’−１０’フアージを得た。

次いでファージをファージ緩衝液に希釈し、２００μｌのＸＬＩ青色細胞（ｂｌ ｕｅｃｅ１１ＸＯＤａｏｏ＝１）と混合した。混合物を３７℃で２０分間放置し 、２．３ｙｓｌの最高（ｔｏｐ）アガロース（４８℃）を加えた。混合物をペト リ皿にあけ、フィルタープリントを再スクリーニング用に造った。

インビボ切断に用いるためファージ株を作るのに有用な単一ウェル分離した正の プラークを数段階のプレート作り及びスクリーニングを用いサムプルツク等（１ ９９０）により記載された方法に従って寒天プレートから採取した。

ファージ株をサムプルツク等の方法（１９９０）に従って調製した。

インビボ切断 プラークのインビボ切断を未分解ラムダＺＡＰＩ［クローニングキット、ストラ タジンクローニングシステムズ用ジ・インストラクション・マニュアル（ＣＡＴ ＃２３６２０１．８月３０．１９８８）における「インビボ切断プロトコール」 に記載されるように実施した。

プラスミドＤＮＡの調製 プラスミドＤＮＡの調製は、サムプルツク等の方法（１９９０）を修飾して次の ように実施した。

プラスミドを含んでいる細菌株（ＤＨ５α及びＸＬＩ　−Ｂｌｕｅ）を関連抗生 物質を与えたＬＢ培地５ｍｌ中に一夜生育し、３０００Ｘｖで１０分間遠心する ことにより５ｍｌの一夜培養物を収集した。ベレットを１．５ｍ／管中の２００ μｌの溶液１（５０ｍＭグルコース、２５ｏＭ）リスｐＨ８，０，１０ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ）に再び懸濁した。４００ｕｌの溶液１１（０，２ＮＮａＯＨ，１％５Ｄ Ｓ）を加え、混合物をゆるやかに撹拌し、５分間氷上に置いた。３００μｌの５ Ｍ　ＫＯＡｃｐＨ４，８を加えて撹拌に付した。得られる混合物を１０分間水上 に置き、次いで４℃で１０分間１５、０００　Ｘ９で遠心に付した。

上清（９００μｌ）を、新しい管に移し０．６容量（５４０μｌ）の水冷イソプ ロパツールを加えた。得られる混合物を室温で１５分間放置した。混合物を再び １５゜０００Ｘ９及び４℃で１０分間遠心に付し上清を除去した。

ベレットを１００μｌのＴＥに溶解し１００μｌの５ＭＬｉＣ／を加えた。混合 物を氷上に５分間放置し、１５．ＯＯＯＸｗ及び４℃で１０分間遠心に付した。

上清を新しい管を移し、５００μｌの９６％エタノールを加えた。管を１５，０ ００×９及び４℃で３０分間遠心し、上清を除去した。ペレットを７０％エタノ ール（約１００μｌ）で洗浄し乾燥した。乾燥ベレットを３０μｌのＴＥに再び 溶解した。

ＤＮＡ配列決定 配列決定すべきプラスミドＤＮＡ（二本鎖鋳型）を上記方法により精製した。配 列決定を以下のように実施した。

約２μ９の関連プラスミド、１ｔｔｌの２Ｍ　ＮａＯＨ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　 １ｍｕｌのプライマー（１００μ９／ｍｌ）及びＨ２Ｏ１０μｌまでの混合物を ８５℃で５分間インキュベートし、次いで水上に置いた。

混合物を１μｌの５Ｍ　ＮＨ４Ａｃを加えることにより中和し、次いで２０ｍ１ の９６％エタノールを加えることにより沈澱させた。得られる混合物を４℃で３ ０分間遠心し６μｌの８２０に再び懸濁し、１．５μｌの５×濃濃縮列緩衝液を 加えた。

混合物を３７℃で５分間放置した。

４μｌのシーケチド（ｓｅｑｕｅｔｉｄｅ）（バイオチクノロシイ・システムズ ＮＥＮ（商標）リサーチ・プロダクツ・シュ・ボン・ド・ニモアス）及び２μｌ のシーケナーゼ（ＳｅｑｕｅｎａｓｅＸユナイテッド・ステイソ・バイオケミカ ル）を加え、１３．５ｕｌの全容量混合物を得た。混合物を室温で５分間放置し た。

３１μｌの標識化反応を２．５μｌのｄＮＴＰ終止混合物を含む各終止管（Ｇｏ 、へ。

Ｔ及びＣ）に移した。各管中の混合物を３７℃で３分間反応させ、４μｔの停止 溶液を加えた。次いで混合物を８５℃に加熱し、２μｌの加熱混合物を６％スク リーニングゲル（ＢＲＬからのＧｅ１−ｍ１ｘ）上に供給した。ゲルを真空乾燥 し、Ｘ−線フィルムにさらした。

テンサイＳＥ　ＤＮＡプローブの標識化テンサイ酸性キチナーゼＳＥの分離に用 いるべきＤＮＡプローブをストラテジンオリゴ標識化キットプライムＩＴ（ラン トム・プライマー・キット）を用い、製造指針に従って標識した。より特異的に 以下の方法を用いた。

２５＋ｖ（１２３μＩりの標識すべきＤＮＡ鋳型、０　２２　ｕｌ（ＤＨ＊０及 ＣＪ１０μｌのランダムオリゴヌクレオチドプライマー（３３μｌの全容量を構 成する）を含む試料をきれいなミクロ遠心管の底に加えた。反応管を沸騰水浴中 で５分間９５−１００℃に加熱し、次いで室温で簡単に遠心し、溶液を収集し、 これは管のふた上で凝固しうる。ＬＭＴアガロース中にＤＮＡ試料を含んでいる 反応管を３７℃で置き、以下の試薬を反応管に加えた：１０μｌの、ｄＡＴＰＳ ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む５×プライマー緩衝液、５、ｃｚ＃）標識ヌクレオ チドａ−”ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍＭ）（７ｖ−シ＋Ｌ）及び２μｌの希 釈Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、使用直前に水冷酵素希 釈緩衝液に最終濃度ＩＵ／μｌまで希釈した。反応成分はピペットの先端で混合 した。

ｌの停止ミックスの添加により停止した。３４ｐ−標識ＤＮＡを従うプローブを エリュティップ（商標）・Ｄカラムシステム（ンユライチャー・アンド・シュエ ル）ｆ：用いさらに精製した。

次いで、適当量の放射活性プローブを２００　ｌｉｎの１０ｍｖ／＋＋ｊ’サケ 精子ＤＮＡと混合することにより、プローブＤＮＡをハイブリダイゼーション用 に容易に作った。混合物を沸騰水浴中９５−１００℃で５分間加熱し、氷上で冷 却した。得られるプローブは２０℃で１週間まで貯蔵され、使用前、沸騰水浴中 ９５−１００℃に加熱し、氷上で冷却した。

５Ｅ−ＤＮＡのハイブリダイゼーションテンサイλ−ＺＡＰライブラリィの「オ リゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション」の下に上記のようにして得たフィ ルタープリントを２ＸＳＳＣ，ＩＯＸデンテンズ、０．１％ＳＤＳ及び５０μｇ ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液を用い慣用プレハ イブリダイゼーション条件下、６７℃で２時間プレハイブリダイゼーションに付 した。

上記のように調製した放射活性ＤＮＡプローブを加えたこと以外、プレハイブリ ダイゼーションと一致するハイブリダイゼーション溶液を用い、ハイブリダイゼ ーションを一夜実施した。

ハイブリダイゼーション後、洗浄操作を以下の計画に従って実施した：２Ｘ１５ 分、２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中及び２×１５分、ｌＸ５ＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中。

正のプラークは、「フィルターハイブリダイゼーションでのキチナーゼ４ＤＮへ のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション」の下に記載されたものであると 確認した。

キチナーゼ４遺伝子群に属するＤＮＡの同定キチナーゼ４遺伝子群に属するＤＮ Ａを確認するため、キチナーゼ４を有する問題のＤＮＡのハイブリダイゼーショ ンを、ハイブリダイゼーションを５５℃の温度で行なうこと以外、ｒＳＥ−ＤＮ Ａのハイブリダイゼーション」に記載されたハイブリダイゼーション操作を用い 実施した。キチナーゼ４プローブは５ＥＱＩＤＮｏ、１に示されるキチナーゼ４ ＤＮＡ配列でありうる。本明細書に開示された通りのキチナーゼ４ＤＮＡ配列の 特徴部分又は特異的サブ配列を基に調製したプローブ、例えばペプチド４−２６ を基に調製したプローブも有用でありうることを意図する。キチナーゼ４ＤＮＡ 配列の特異的サブ配列にハイブリダイズし、又、キチナーゼ４ＤＮＡ配列の特異 的部分をプログラムしているＤＮＡ配列を確認するため、ヌクレオチドプローブ は、該特異的部分のアミノ酸配列又はそのサブ配列を基に有利に調製される。

アガロースゲルからＤＮＡの切断 例えば本発明による遺伝構造物の構築に用いられるべきＤＮＡ断片は次のように 分離した。

ＤＮＡをＴＡＥ（０，０４Ｍ　トリス−酢酸塩、領００２ＭＥＤＴＡ）緩衝液中 、ＬＭＴ（低融解温度）アガロース（シー・プラーク（商標）ＧＴＧ、ＦＭＣ） 上を泳動させた。ＤＮＡバンドをパスツールピペットで切断した。切断ＤＮＡに 、１容量２００ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭＥＤＴＡを加えた。ゲルを６８℃で１０ 分間溶融し、３７℃まで再び平衡化した。次いで２Ｕ／１００μｌのアガロース （フリーのＤＮエース、カルビオケムから）を加えた。混合物を３７℃で一夜放 置し、次いでフェノールで２回とクロロホルムで２回抽出し、ＥｔＯＨ沈澱に付 し最後にＨ，０に再び溶解した。

ＳＥ、β−１，３−グルカナーゼ及びテンサイｍＲＮＡ上のｃｈｉｔ７６の増幅 に用いるＰＣＲ 部分ｃＤＮＡ分子の調製は、ジーン・ＡｍＰ（商標）ＲＮＡ増幅試薬キット（パ ーキン・エルマー・ンータス、ＵＳＡ）の使用により行なった。ＰＣＲはわずか な修飾を伴う製造指針に従って実施した。逆転写プロトコールは、以下の計画で の濃度を用いた。

成分　容量　最終濃度 ＭｇＣ１□溶液　４μｌ　５＋ａＭ １０ＸＰＣＲ緩衝液ＩＩ　２ｕｌ　１ｍＭｄＧＴＰ　２μｌ　１ｍＭ ｄＡＴＰ　２μｉ　１ｍＭ ｄＴＴＰ　２μｌ　ＩＩＩＭ ｄＣＴＰ　２ｕｌ　１ｍＭ ＲＮエース抑制因子　１μｌ　ＩＵ／μｌ逆転写酵素　１μｌ　２．５Ｕ／μｌ プライマー２７０　０．４μｍ　２．５μＭ試料当りの全容量　２０μｌ 段階サイクルにおいて、以下の操作を用いた。

断片１：　４２℃２時間 断片２：　９９℃５分間 断片３：　５℃５分間 Ｔａｑポリメラーゼを後れて添加した（ＰＣＲサイクル参照）以外、ＰＣＲプロ トコールに従い温度循環は次のように変化した。

ＰＣＲサイクル サイクルの番号　℃　時間（分） Ｔａｑポリメラーゼ及び油の添加 ＰＣＲは本発明の遺伝構造物の構築に、及びクローン化されたＤＮＡ鋳型を基に した位置指定突然変異導入法に用いた。

関連ＤＮＡ分子の調製は、ジーンＡｍｐ（商標）アンプリファイケイシコン・リ エイジェント・キット（パーキン・エルマー・シータス、ＵＳＡ）の使用により 、又、温度循環以外製造指針に従って行った。ここでは以下の操作を用いた。

ＰＣＲサイクル 実施例１ キチナーゼ・２．３及び４の精製及び特性表示再生キチンの合成に用いた方法は 、活性キチナーゼ４の高収量を得ることを可能にするため特異的に開発した。活 性且つ純粋なキチナーゼの高収量は、ｌ）抗真菌潜在力を測定する、 Ｕ）キチナーゼを暗号化しているＤＮＡの分離に適しこオリゴヌクレオチドプフ ーブを調製するのを可能にするトリプシンペプチドを調製し分析する、１ｉｉ） 加えてモノクローナル及びポリクローナル抗体を生成する、ための十分な蛋白材 料を得るために必要である。

キチナーゼを暗号化しているＤＮＡの分離及び特性表示は、ＤＮＡが高キチナー ゼ活性を有する遺伝的に修飾された植物の構築に用いられるべき場合に必要であ る。又、酵素の重要な部分、例えば活性部位を明らかにし、そして特徴づ（）る ことを可能にするには、大量の純粋なキチナーゼが必要である。

再生キチンは、上記したように低及び高ｐＨで遊離アミノ基をアセチル化するこ とにより得た（この合成を低いｐＨでのみ実施する慣用方法に比べ）。アセチ、 ノ化が低ｐＨでのみ実施される慣用方法よりも、新しい組合せ方法は容易で速く 、且つ非常に高収量でより適当な生成物が得られる。

酵素の純度の程度を「材料及び方法」に記載されるようにファスト−システムで の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより精製段階を経て実験した。モノＳ　ＦＰＬＣカラムで の分離後（図１）、各キチナーゼアイソザイム２．３及び４に対する単一銀染色 バンドが５ＤＳ−ゲル上に観察できた（図２）。さらにＶＹＤＡＣＲＰ４カラム 上の逆相ＨＰＬＣによる分析で、各アイソザイムについて唯一の蛋白ピークを得 た。

これは、各基体キチナーゼアイソザイムに対する均一蛋白調製についてのさらな る証拠である。

キチナーゼ２．３及び４についての５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された分子量は 、それぞれ３２．２７及び２６ＫＤａである（図２）。等電点電気泳動により、 キチナーゼ２．３及び４の等電点はそれぞれ８．３．９．０及び９．１と測定さ れた。上記の放射化学キチナーゼ検定法を用い、３つの全アイソザイムは、最大 活性が約４゜５である広い至適ｐＨを有することが判った。キチナーゼ４につい ての特異活性は４８Ｑ　ｎｋａｔ／　ｍｇ蛋白で、これに対しキチナーゼ３及び ２のそれは、それぞれ２０８及び１６４のｎｋａｔ／ｍｇ蛋白である。

キチナーゼ４がキトオリゴ糖を生成するエンドキチナーゼであるか、キチン又は キトオリゴ糖の非還元末端からＮ−アセチルグルコサミンのみを遊離するエンド キチナーゼであるかを決定するため　ｓＨ−キチンからのキチナーゼ４により放 出された反応生成物のパターンをＴＬＣにより分析した（図３）。インキュベー ションの期間に関りなく、Ｎ−アセチルグルコサミンだけがごくわずかな反応生 成物であり、これに対しキトビオース、キトトリオース及びキトテトラオースが 主生成物であった。これはキチナーゼ４がエンドキナーゼであることを強く暗示 する。

３Ｈ−キチンに発揮される酵素活性に加えて、キチナーゼ４も「材料及び方法」 に記載されるリゾチーム検定を用いミクロコツカス・リソディクティクスの細胞 壁を加水分解しつる（図４参照）。これは、キチナーゼ４がキチナーゼ及びリゾ チーム活性を有する二官能性酵素であることを示す。

実施例２ テンサイ葉からの精製キチナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼアイソザイムの 抗菌作用 ３つの異なるバイオアッセーを、セルコスポラ・ベティコラの発芽及び生育に関 するキチナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼアイソゲイムのインビトロ抗菌活 性を確かめるために実施した。同様の方法で、他の起源からのキチナーゼ及びβ −１，３−グルカナーゼ並びにテンサイからの他のアイソザイムの抗菌活性を精 製酵素又は酵素を含有する抽出物を用い測定した。又、検定は、与えられた遺伝 子導入植物が本発明の範囲内にあるかどうかを決定するのに用いつる。

方法工　顕微鏡スライドバイオアッセーセルコスポラの胞子培養物は顕微鏡スラ イド上のＰＤＡの薄いフィルム上に発芽しよく生育する。増殖は発芽している胞 子の数及び全／平均菌糸増殖の光顕微鏡研究により続けることができる。さらに 如何なる特異的時間においても、増殖活性はカルコフラワー・ホワイトで染色す ることにより、次いで蛍光下での０１鏡研究により視覚化できる。蛍光先端を伴 う菌糸の数及び個々の先端での染色の伸張は培養中の増殖活性を反映する。

強い抗菌活性を有する蛋白を加えた場合、生育胞子の数が減少し、菌糸の生殖速 度が劇的に減する。図５はキチナーゼ４、酸性キチナーゼＳＥ及びβ−１，３＝ グルカナーゼ３の組合せを培養に適用した場合の結果を示す。、２０μ９の各抗 菌性蛋白を含む６０μｌの蛋白溶液を各顕微鏡スライドに適用した。キチナーゼ を単独或いはβ−１，３−グルカナーゼ３又はＳＥのいずれかとの組合せで用い たとき、阻止効果はより少なかった。β−１，３−グルカナーゼ３もＳＥも、単 独でも組合せても有意な阻止効果を有しなかった。しかしながら、図５から判る ように、全ての３つの酵素を一緒に用いると、キチナーゼ４、ＳＥ及びβ−１゜ ３−グルカナーゼの間の有意な効果を示す非常に強い阻止効果が見られた。

方法■　ミクロタイタープレートバイオアッセー胞子の発芽及び菌糸の増殖は、 定めた時間間隙で吸収（６２０＋ｕ＋）で測定する二とによりミクロタイタープ レート中で追跡することができる。対照実験で、セルコスポラの増殖は約４０時 間遅滞間隙後開始し、次の４０−５０時間、はとんど線状に増加する（図６の曲 線Ａ）。純粋のキチナーゼ４（ウェル当り５μｇ）を含むと、始めの遅滞間隙は ７５時間まで増加し、生育速度は対照と比べ減少する（図６の曲線Ｃ）。キチン カラムからの溶出を比較として示す。

方法■　オートラジオグラフィー 第三のバイオアッセーで、菌糸細胞壁のキチンを３Ｈ−標識Ｎ−アセチルグルコ サミンで標識化した。短いパルスの後、放射活性が細菌菌糸の先端に蓄積した（ 図７参照）。キチナーゼを単独又はＳＥ及びβ−１，３−グルコサミンと組合せ て、パルス標識化後加えると、菌糸先端に蓄積された放射活性は効果的に除去し た。酵素の量は方法工（上記参照）に記載したものと類似である。これは、セル コスポラの細胞壁上のキチナーゼ４の作用のモードが菌糸先端のチキン線維を有 意に加水分解し、これにより細胞壁合成を阻害することを強く示す。

以下の結論は上記実験を基になすことができた。

テンサイ葉からのキチナーゼ分画の添加により胞子培養中のセルコスポラの増殖 を阻止することが可能である。

阻止は生育のための遅滞時間、生育阻止因子の強さと濃度によるその長さとして 主として見られる。

キチナーゼ及びβ−１，３−グルカナーセを共に含む分画は、キチナーゼ単独よ りも強い阻止効果を有する。

セルコスポラ感染テンサイ植物からのキチナーゼ／グルカナ−上分画は対照植物 から同一方法で精製した分画よりも強い阻止効果を有する。

実施例３ 精製キチナーゼアイソサイム２．３及び４のアミノ酸組成及び部分アミノ酸配列 凍結乾燥後、精製テンサイキチナーゼ２．３及び４のアミノ酸組成物を測定した （「材料及び方法」参照）。

結果は表１に示す。比較のため、オオムギ、コムギ及びマメからのキチナーゼの アミノ酸組成物（り一等、１９８７）を表に含める。キチナーゼ２のアミノ酸組 成はマメキチナーゼのそれとアミノ酸残基、例えばアスパラギン酸、プロリン、 グリシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、バリン及びリジンの数にお いて類似する。これに対し、キチナーゼ３及び４は、他のキチナーゼよりも有意 に異なるアミノ酸組成を有する。

さらに、シグナルペプチドのないテンサイキチナーゼ４を暗号化するｃＤＮＡ配 列から誘導されたアミノ酸組成をも示す。ｃＤＮＡ配列は以下の実施例５に記載 したようにして得た。

表エ オオムギ、コムギ、マメ及びテンサイキチナーゼ２．３及び４のアミノ酸組絞ア ミノ酸　オオムギ　コムギ　マメ　Ｓ、Ｂ、２　Ｓ、Ｂ、３　Ｓ、Ｂ、４　ｃＤ ＼入アスパラギン酸　２３　２８　２９　３４．４　２４，７　２４．４　２２ スレオニン　１３．８　２２　２２　１６．２　１３，０　１２．８　１２セリ ン　１７．７　２４　２６　２１．０　２４．８　２４．８　２４グルタミン酸 　１８　２０　２２　２４．９　２２，１　２１．０　１８プロリン　１７　１ ５　２０　１７．１　１０，３　１０．２　９グリ／ン　３０．７　５２　３７ 　３９．７　３０，６　３０．４　２７アラニン　３７．３　２７　２６　２８ ．０　２ｇ、２　２８．５　２６ンステイン　７．２　１２　１６　１６．９　 １６．８　１６．９　１５バリン　１２．５　１４　１０　８．６　１４，４　 １４．３　１４メチオニン　１．６　３　２　１．８　１．１　１．１　１イソ ロイシン　１０．８　９　１１　１１．９　１０，９　１１．０　１１０インン 　１１．３　１３　１７　１６．２　９．０　９．０　８チロノン　１１．９　 １４　１５　１７．３　１２，７　１２．７　１２フエニルアラニン　１２．７ 　１４　１３　１１．５　１８．３　１８．１　１７ヒヌチジン　４．９　４　 ３　４．４　４．７　５．４　４リシン　６．９　８　８　８．７　４．３　３ ．１　３アルギニン　１５．２　１４　１６　１１．３　１４．２　１６．１　 １５トリプトフアン　３．２　７　４　ｎｄ　ｎｄ　ｎｄ　３分子量（ＫＤ）　 ２７　２９　３２　３０．６　２７，６　２７，７　２５．９Ｓ、Ｂ、２＝テン サイキチナーゼ２ Ｓ、Ｂ、３＝テンサイキチナーゼ３ Ｓ、Ｂ、４＝テンサイキチナーゼ４ ｃＤＮＡ＝成熟蛋白、キチナーゼ４を暗号化するｃＤＮＡ配列から誘導されたア ミノ酸組成 ｎｄ＝測定されなかった。

テンサイキチナーゼ３及び４のトリプシン消化純粋のキチナーゼ４酵素の分析に より、酵素のＮ末端部分がブロックされていることが明らかになった。即ち、成 熟キチナーゼ４の分析により、そのアミノ酸配列を決定することが直接可能でな かった。そして、それによりそれが暗号化されるＤＮＡを分離し特徴づけするこ とを可能にする最終的意図を有する酵素についての十分な情報を得るために、ア ミン配列決定しやすい蛋白断片（ペプチド）を得るための成熟酵素をトリプシン 分解に付すことを選んだ。

精製キチナーゼ酵素のトリプシン消化は上記「材料及び方法」に記載されるよう に実施した。トリプシンペプチドは、「材料及び方法」に特定された条件下に、 上述したＶｙｄａｃ　ＲＰ−１８カラム上、逆相ＨＰＬＣにより分離した（図８ 参照）。

２１４ｎｍの吸収で大きなピークを示し、高い保持時間を示しているペプチド（ 長いポリペプチド鎖を示している）はデベロシルＰＲ−１８カラムでさらに精製 した。

精製ペプチドは、上記「材料及び方法」に記載されるようにアミノ酸配列分析に 付した。そして各ペプチドのアミノ酸配列は以下の表Ｈに示す。

各ポリペプチドのアミノ酸配列を既知のキチナーゼ（テンサイ由来ではない）の アミノ酸配列と比較すると、低い程度の類似性が見られた。

トリプシンペプチドの一つがオリゴヌクレオチドプローブの構築用の基礎を形成 するのに非常に有利であることが判明した。即ち、トリプシンペプチド４−２６ のアミノ酸配列の分析により、オリゴヌクレオチドプローブの構築でこの配列を 使用することはほとんどコドン選択を必要としないことが判った。即ち、このペ プチドはキチナーゼ４を暗号化するＤＮＡの分離に使用すべきオリゴヌクレオチ ドプローブの構築の基礎を形成するために選択した（以下の実施例４参照）。

表■ キチナーゼ３及び４のトリプシンペプチド３−１６．　Ｌ　Ａ−Ｃ−Ｖ−Ｔ−Ｈ −Ｅ−Ｔ−Ｇ−Ｈ−Ｆ−Ｃ，−Ｙ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｉ−＾−Ｘ３−１６．２　Ｖ− Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｔ−Ｑ−Ｙ−Ｃ−Ｑ−Ｑ３−２２．３　Ｇ−Ｐ−Ｌ−Ｑ−Ｉ−Ｔ− １４−４，２Ｖ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｔ−Ｑ−Ｙ４−１９．３　Ｇ−Ｐ−Ｌ−Ｑ−Ｉ− Ｔ−ｆ３−１０．３：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：１８に示す。

３−１６．１：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　：１９に示す。

３−１６．２：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　：２０に示す。

３−２３．３：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　：２１に示す。

３−２３．３：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　＋２２に示す。

４−４．２：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　＋２のアミノ酸番号２４４−２５０から なる。

４−１９．３＋アミノ酸番号１６３−１６９からなる４−２２＋　ＮＯ，１７９ −２００ ４−２３：　ＮＯ，３７−５２ ４−２４：　Ｎｏ、５８−７５ ４−２６：　Ｎｏ、２０１−２２４ 実施例４ キチナーゼ４についてのＤＮＡ遺伝子の分離及び特性表示ペプチド４−２６につ いて得たアミノ酸配列（実施例３の表■参照）から、以下の非常に特異的なオリ ゴヌクレオチド遺伝子プローブを、ＤＮＡシンセサイザー３８１Ａ（アプライド ・バイオシステムズ）を用い合成した。

ペプチド４−２６ ・　ＦｆＦｆＭＮＮＶ、、。

Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　ＡｓｎＴＴＴ　ＴＧＧ　Ｔ ＴＴ　ＴＧＧ　ＡＴＧ　＾＾Ｔ　＾＾Ｔ　ＧＴｃ　ｃ　ｃｃ この遺伝子プローブを用い、発現ｃＤＮＡライブラリィλＺＡＰを上記「材料及 び方法」に与えられる操作を用いスクリーンした。λＺＡＰから３ｃＤＮＡクロ ーンを得、クローンの一つは十分に配列を決定したが他は部分的に配列を決定し た。

配列決定は上記「材料及び方法」に記載されたように実施した。はとんど完全な 長さのｃＤＮＡクローン、ｃｈｉｔ４−Ｂ１５をλＺＡＰライブラリィから得、 そのＤＮＡ配列をＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：１に示す。

ｃＤＮＡ配列を基にキチナーゼ４の推定アミノ酸配列をＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、： ２に得た。推定アミノ酸配列を（上記実施例３に記載されるように）キチナーゼ ４から得た部分配列と連合させ、はとんど１００％同一性を観察した。これは、 分離したｃＤＮＡクローンが上記のクロマトグラフィ操作により精製したキチナ ーゼ４ポリペプチドをコードすることを示す。ｃｈｉｔ　４−Ｂｌ５ｃＤＮＡク ローンは９６６ｂｐ長で、キチナーゼ４ゲノムＤＮＡを予言する２６５アミノ酸 からポリペプチド中の２６４アミノ酸残基を有する蛋白を暗号化する。リーダー 配列は、（ゲノムキチナーゼ４ＤＮＡを測定したように２４アミノ酸残基から、 以下参照）多分２３アミノ酸残基、次いで３５のへベイン（ｈｅｖｅｉｎ）ドメ イン及び２０６アミノ酸残基の機能ドメインからなる。停止コドン後、ｃＤＮＡ は１５８ｂｐ非コ一ド部分を有する。

上記実施例３に記載したように、Ｎ−末端は阻止されているので、キチナーゼ４ ＯＮ−末端アミノ酸を直接配列決定することはできない。しかしながらコムギ胚 芽アグルチニン（ＷＧＡ−Ａ）及びジャガイモ　キチナーゼと比べると、最初の アミノ酸はＧｉｎであると推測される。以下、キチナーゼ４Ｎ−末端のアミノ酸 配列の残余は、ＤＮＡ配列がＧｉｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｙｓ・・・・ ・・であると推定された。

さらにキチナーゼ４のＮ−末端配列をジー・ジェイ・フェイストナー等、１９９ ０により記載されるようにエレクトロスプレィ質量分析により成熟キチナーゼ４ の分子量（ＭＷ）を測定することにより試験した。２５８９３．６＋／−１０の ＭＷを観察した。アミノ酸配列を基に２５９２３のＭＷを計算した。成熟キチナ ーゼ４が７つのＳ−Ｓブリッジを含む（１４プロトンのロス）こと及び最初のア ミノ酸残基Ｇｌｎが、ピログルタミル誘導体に変換する（　ＮＨ２＝１５ＭＷの ロス）ことから、成熟キチナーゼの計算ＭＷは２５８９４である。これはエレク トロスプレィ質量分析により観測されたデータと一致し、成熟キチナーゼ４に上 で与えられた推定Ｎ−末端アミノ酸配列であることを確認する。

Ｎ−末端アミノ酸配列はキチナーゼ２に対しても測定でき、以下の末端アミノ酸 配列をキチナーゼ２に見いだした：Ｇ１ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ− Ｇｉｎ−Ａ１表■ 異なるキチン結合蛋白間のＮ−末端アミノ酸配列の比較へベイン：　ＥＱ零＊Ｒ 本＾ＧＧＫＬ＊零本本本本本木本Ｗ−木Ｗ＊本５ＴＤＥ木木５ＰＤＨＮ本本ＳＮ −＊ＫＤキチン、ＳＢ２：　ＥＩＪ本に零＾ＧＧＡＩＪ木本Ｇ木林本木本一本Ｗ 本＊ＮＴＮＰ本零零ＮｆＧ＾−Ａ：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　：２３に示すヘベ イン：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯｌ：２４に示すキチン、マメ　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 、　：２５に示すキチン、Ｔａｂ、　：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　：２６に示す キチンＳＢ　２：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：２７に示すキチンＳＢ　４：　ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ、　：２のアミノ酸ＮＯ，２４−５４から成る実施例５ テンサイゲノムクローンＣＨＩＴ７６及びＣＨＩＴ４の分離及び特性表示部分５ ａｕ３Ａ分解からのゲノムテンサイ挿入体を含んでいる増幅ＥＭＢＬ３ライブラ リィから５００，０００クローンの配列決定の結果、プローブとしてキチナーゼ ４ｃＤＮＡを伴う３つのクローンを分離した。

３つのハイブリダイズしているクローンは制限断片分析及び配列決定により特徴 づけた。これらの分析は、クローンの一つがキチナーゼ７６と呼ばれるキチナー ゼ遺伝子を含むことを示し、その配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、＋５に示した。こ の遺伝子の配列決定はλＺＡＰライブラリィの配列決定に用いたプライマーで開 始しく実施例４参照）ｃｈｉｔ７５遺伝子内で配列に相補の他のプライマーと継 続する。

ｃｈｉｔ７６遺伝子は、キチナーゼ４アミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：１ 参照）に８０％類似するが、全キチナーゼ１蛋白（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、＋１１ 参照）に３４％しか類似しない２６８アミノ酸長キチナーゼをコードする。遺伝 子は位置８７５ないし１２６２に位置する１つのイントロンを含む。このイント ロンの正確な位置はキチナーゼ４ｃＤＮＡ　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：１との線列 に基づく（図２４）。

インドロンボーダーはコンセンサスＧＴ／ＡＧ配列を含む。ｃｈｉｔ７６イント ロンは、キチナーゼ１とｃｈｉｔ７６のアミノ酸配列を線列すると、キチナーゼ １遺伝子の第二イントロンとして同一位置に正に位置する。

ＴＡＴＡ−ｂｏｘ配列（ＴＡＴＡＡＡ）は翻訳用ＡＴＧ開始コドンに対し９０ｂ ｐ上流である位置３７８に位置する。ポリＡシグナル（ＡＡＴＡＡＡ）はＳＥＱ 　ＩＤＮｏ、：５の位置１７２５に位置する。

同様の方法で、キチナーゼ４を暗号化するゲノムクローンで分離した。ＤＮＡを 部分配列し、５′非コ一ド化部分の約３５のヌクレオチドを明らかにした。コー ド化部分の約３４のヌクレオチドを配列決定した。配列は５ＥＫＤ　ＩＤ　Ｎｏ 。

３に示す。

２つのゲノム遺伝子からの５゛非コ一ド化部分の線列は類似性のボックスを示す （例えばキチナーゼ４ヌクレオチド１４−４９．６０−１２２．１２３−１３５ ．１５９−１７３．１７４−２０７及び２７７−３２８（図２６））。

ｃｈｉｔ４　Ｂ　１５ｃＤＮＡ配列及び部分的に配列決定したゲノムキチナーゼ ４遺伝子の知識に基づき、遺伝子の残りは容易に配列決定できる。キチナーゼ４ 遺伝子は少なくとも１つのイントロン、多分キチナーゼ７６配列のそれと同じ位 置にあるものに対応する１つだけを含むことを意図する。

実施例６ 酸性キチナーゼアイソザイムＳＥの特性表示及び部分アミノ酸配列の決定酸性キ チナーゼＳＥを上記「材料及び方法」に記載したように精製した。モノＰＦＰＬ Ｃカラム上の最終精製の後、ＳＥの３つのアイソザイムを分離した（図９参照） 。５ＤＳ−ＰＡＧＡによる分析により、各アイソザイムについて単一の蛋白バン ドのみを示した。５ＤＳ−ＰＡＧＥにより２９ｋＤの同一分子量を測定した。等 電点電気泳動による分析によってＳＥの３つのアイソザイムについて約３０の等 電点を測定した。これは、３．８７に決定された理論等電点によく対応する。

塩基性キチナーゼ２．３及び４と対照的に酸性キチナーゼＳＥは、ギチンーアフ ィニティカラム上に、通笥の条件ｐ１（８でも（「材料及び方法」参照）ヌより 高いｐＨでも低いｐＨでも保持されなかった。しがしながらＳＥは、保持され、 Ｈ”ｉ＊職キチンを容易に崩解した。酵素的加水分解の主生成物はキチンの六量 体又はキチンオリゴサツカリドの高同族体であった。キチナーゼ４に・ついての 主生成物は二量体であるから、ＳＥについての作用は異なるモードであることが 推定される。

リゾチーム活性はＳＥについてはｐＨ４，９で測定できなかった。

精製酵素を上記「材料及び方法」で又上記実施例３に記載したようにトリプシン 分解に付し、キチナーゼ４及び６ベブチドを選んだ、ペプチドを上記実施例３に 記載しこキチナーゼ４のトリプシンペプチドと同様の方法でさらに精製に付し、 ６ベブチドのアミノ酸配列を測定した。キチナーゼ４に関して用いたものと同じ 基準を用い、ペプチドを選択した。これらのペプチドのアミノ酸配列は表■に示 す。加えて、Ｎ−末端アミノ酸配列も、表■に示すように測定した。

表■ Ｎ−末端：　５−Ｑ（−Ｖ−Ｉ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｑ−Ｎ−Ｇ−Ｄ−Ｅ−Ｇ−３−Ｌ −Ａ−Ｄ−Ｔ−Ｃ−ＮＳＥ２２．５：　Ｖ−Ｌ−Ｌ−８−Ｉ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ− Ｇ−Ｇ−ＹＳＥ２３．Ｏ＾−Ｄ−Ｙ−Ｌ−Ｗ−Ｎ−Ｔ−ＹＳＥ　２５．　Ｉ　Ｎ −Ｎ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−Ｑ−Ｙ−Ｄ−Ｔ−３−＾−Ｄ−Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｓ−３ＳＥ　２ ６．　Ｉ　Ｙ−Ｇ−Ｇ−Ｖ−Ｍ−Ｌ−ｆＳＥ　３０．４　５−Ｌ−３−３−Ｔ− Ｄ−Ｄ−Ｘ−Ｎ−Ｔ−Ｆ−Ｘ−Ｄ−Ｙ−Ｌ−Ｗ−Ｎ−Ｔ−ＹＳＥ　３１．１　丁 −Ｔ−ｖ−Ｑ−Ａ、−Ｎ−Ｑ−Ｉ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｐ−Ａ−３−Ｔ−Ｄ−Ａ− Ａ−Ｇ−３−Ｇ−Ｆ−Ｉｈ−末端　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　：８（７）アミノ酸 Ｎｏ、　２６−４６がら成る５Ｂ２２．５：　５ＥＱＩＤＮＯ，：８ノアミノ酸 ＮＯ，９８−１０９から成る５Ｂ２３．０：　５ＥＱＩＤＮＯ，：８（７）アミ ノ酸ＮＯ，１，２１−１２８から成る５Ｂ２５．１：　５ＥＱＩＤＮＯ，：８（ ７）７ミ／酸ＮＯ，２０８−２２４から成る５Ｂ２６．１：　５ＥＱＩＤＮＯ， ：８ｆ７）７ミ／酸ＮＯ，２７１−２７７から成るＳＢ　３０．４：　ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ，：８ノアミノ酸Ｎｏ、　１１０−１２８がら成るＳＢ　３１．１： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：８ノアミノ酸Ｎｏ、　２２９−２５２から成る実施例 ７ 酸悸キチプ・−ゼアイソザイムＳＥに関するｅＤＮＡの分離及び特性表示表■に 示したトリプシンペプチドのアミノ酸配列の基に、ペプチド５Ｅ２５゜１及びＳ Ｔε３１１（表■）からの２つのサブ配列を、それらが最善のコドンを有するの で混合オリゴヌク１．／オチドの合成に選んだ。！ｌ；ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：２ ８１ご示し、ｆ、Ｔ、　Ｐ　ＣＲブ・５１′−ｚ−ＫＢ７（ＳＥ２５．１．）Ｓ ＥＱ　ｉＤ　ＮＯ，：２９１：示したＫＢ−９（ＳＥ３１．１）及びｓＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ，：３０１ｍ示１．．　；ｊ　７ｉ−ＩＪゴーｄＴプライマー（２７０ ）を、キチ六−ゼ４に関（７、実施例４（、一記載Ｉまたと同様の方法で調製し 穴。

遺伝子プロ　ブのゾクレオ訃ド配列は表Ｖ１こ示ず７、表■ ＮＰＩ”ＣＱＹＤＴ ＡＮＱＴＦ Ｋ１１−９　５°−ＧＧ＾ＧＧＡＴＣＣＣＡ父ＧＣＧＡＡ；ｕｃＡ父ＡＴＡＴＴ −３’２’ｉ［１，５”ＣＣ，ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴ丁１’ＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３゜Ｋ３−’／：　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、　：２８Ｎ： 示ｔＫ８−９．　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２９に示′す２７０：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ，：３０に）ミす部分ｃＤＮＡ分子はＦ”　ＣＮぐ一扶術及びｍＲＮＡを用い る２ステツプで調製し７た、最初のステップは上記のプライマーＫＢ７及び２７ ０を用いる。ＰＣＲ−技術は、目■−１及び方法−！で上記したように実施した 。合成１．たｃＤｈｉＡをアカロースケル４−で分離腰アカロース苓アカー２− アー　スで除去シフ７コ。続＜ＰＣＲ反応１′ニプライマーＫ　Ｂ　９及び２７ ０を用いた。方法は図２０に示１゜第二ＰＣＲ反応がらの生成物をｐｔＪｃ１９ （べ〜リンガー・マンハイム）にクローンし、配列決定し７た。

ＤＮＡ配列のヌク１／オチド７１１−９６２により構成されな部分ＣＤＮＡ分子 として得たＤＮＡ配列をＳＥＱ　ＩＤＮｏ、＋７に示す。このｅＤλＡは「ネ４ 料及び方法」に記載１７たλ−ＺＡＰｅＤＮＡライブラリィをスクリーンするの （：″用い、２３ｃＤＮＡり１］−ンを得た。最も長いｃＤＮＡり「」−ンを上 記「材恥１及び方法」に記１、した方ｌ去を用い１列決定し７．１０７　Ｏｂｐ ＆であることが判った。「列は５ＥＱＩＤＮＯ，＋７に示されるＤＮＡ配列のヌ クレオチド３７−　コ１０６にＪり構成される。ｃＤＮ、Ａの分離に関して通′ ホ見られるように、全ｃＤＮＡは分離するのが異なることが判、りた。ＩＦＩ− 長ｃＤＮＡクローン（Ｓ　Ｅ　２２）の５゛末端がら］、、２２ｂｐＥｃｏＲ， Ｉ−Ｋｐｎ　Ｎを伴うλＺＡＰライブラリィの再スクリーニングにより、全５゛ 末端を含む配列をｉコｊ：：　ｏクローンをＫｐｎ１部位を用いＪ結し／Ｊ、） 構造遺伝子は、１７ｂｐの非コード化部分、２５アミノ酸残基のｉルーグー配列 、２６８７ミノ酵残基の官能ドメイン及びストツブ装置／ｉ＆２０２ｂｐのニー （°非コー　トイに部分を有づる。

ζ：ＤＮＡ配列及１ブアミノ酸Ｖ列を＋れそ、ｔＬＳＥＱ　＋　Ｄ　Ｎｏ、ニー ７及σＳ　Ｅ　Ｃ，）　目）＼０８１１ｍ示す。

Ｎ−末端及び６トリブ、ノンペプチド（１０７残肌）から得たアミノ酸配列を比 べると、ｃＤＮＡ誘導配列とほとんど１００％一致堪ることをＶ察した。これは 、分離Ｉ、たＣＤＮＡクロー：ノが上記クロマ）・グラフィ操作により精製（− たＳＥボリベプ千トをコードすることを示す。、ｃＤＮＡは成Ｍ白のＮ−末端及 び（゛−末端を危む。成熟ＳＥのＮ−末端は表■から明らかである。

表Ｘ］ ５Ｅ２２ＳＡｌｉ１．、　ＭＡＡＮＩＶＳ−−１’ＬＦＩＪＳＬＬＩＦＡＳＦＥ ＳＳＨＧＳ−−ＱＩＶＩＹＷＧＱＮＧＤＦ、ＧＳＬＡＤ丁Ｃm　４６ イ、ウリ　ＩＪＡＡＨＫＩＴ−−ＴＴＬＳＩＦＦＬＬＳＳＩＦＲ３ＳＤＡＡ−− ＧＩＡＩＹＷＧＱＮＧＮＥＧＳｌ、ＡＳＴＣＡ　４６／υイヌナズナ　ＭＴＮｖ ＴＬＲＫＨＶＩＹＦＬＦＦＩＳＣ８ＬＳＫＰＳＤＡＳＲＧＧＩＡＩＹＷＧＱＮＧ ＮＥＧＮＬＳＡＴＣＡ　５０ＳＥ２２ＳＡＭ１．　５ＧＮＹＧＴｌ′ＩＬＡＦＶ ＡＴＦＧＮＧＱＴＰＡｌ−ｈＬＡＧＨｃＤＰＡＴＮ−ＣＳＳＬＳＳＤＩＫＴＣＱ ＱＡＧ　X５ ４）’ｌｉｔ　ＩＧＮＹＥＦＩｏＮＩＡＦＬＳＳＦＧＳにＱＡＰＶＬＮＩ−ＡＧ ＩＩＣＮＰＤＮＮＧＣＡＦＬＳＤＥＩＮＳＣＫＳＱ＼　９５ノＯイスナズナ　Ｔ ＧＲＹＡＹＶＮＶＡＦＬＶＫＦＧＮＧＱＴＰＥＬＮＬＡＧＨＣｌＶＰＡＡＮＴＣ ＴＨＦＧＳＱＶＫＤＣＱＳＲＧ　１００＋ｌｌ＋１１　４　番＠−”ＩＳ”−φ ＋６　ａｍ拳・ｐｓ＋ｅＨｔ＋’・　争會　シ蕾―魯’−１−　−キュウリ　ｌ ／ＫＶＬＬＳＩＧＧＧＡＧＳＹＳＬＳＳＡＤＩＩＡＫＱＶＡＮＦＩＷＮＳＹＬＧ ＧＱＳＤＳＲＰＬＧＡＡＶＬＤＧ　１４６ＳＥ２２ＳＡＭＬ　ＩＤＦＤＩＥＳＧ ＤＧＲＦｆＤＤＬＡＲルＡＧＨＮＮＧＱＸＴＶＹＬＳＡＡＰＱＣＰＬＰＤＡＳＬ Ｓ丁ＡＩＡ　１９５ｂつＩＩ　ＶＤＦＤＩＥＳＧＳＧＱＦＷＤＶＬＡＱＥＬＫＮ ＦＧＱ−−−−ｖＩＬＳＡＡＰＱＣＰＩＰＤＡＨＬＤＡＡＩＫ　１９２ＳＥ２２ ＳＡＭＬ　ＴＧＬＦＤＹｖｆＶＱＦＹＮＮＰＰＣＱＹＤＴ−３ＡＤＮＬＬＳＳＹ ＮＱＷＴＴ−ＶＱＡＮＱＩＦＬＧＬＰＡＳ　２４３キユウリ　ＴＧＬＦＤＳＶｆ ＶＱＦＹＮＮＰＰＣＭＦＡＤ−ｈＡＤＮＬＬｓ！ＪＮＱＷＴ＾−ＦＰＴＳＫＬＹ ＭＧＬＰＡＡ　２４０ＳＥ２２ＳＡｉ　ＴＤＡＡ−ＧＳＧＦＩＰＡＤＡＬＴＳＱ ＶＬＰＴＩＫＧＳＡＫＹＧＧＶｌｌＩＬＴＳＸＡＹＤ−３ＧＹＳＳＡＩＫ　２９ ０＋、、’ＩＩＩ　ＲＥＡＡＰＳＧＧＦＩＰＡＤＶＬＩＳＱＶＬＰ丁ＩＫＡＳＳ ＮＹＧＧＩＩＭＩＪＳＫＡＦＤ−ＮＧＹＳＤＳＩＫ　２８８ＳＥ２２ＳＡ１１Ｌ 　５ＳＶ−２９３共通長さ、３０４キコウリ　ＧＳＩＧ　２９２　同一　１３７ 　（４５，１％）キュウリ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３１に示されるノロイヌナズナ 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：３２に示される表■は、酸性キチナーゼＥについての 構造遺伝子に対応するアミノ酸配列並びにキュウリリゾチーム／キチナーゼ（Ｅ ＰＯ３９２２２５及びメトラウシス等、１９８９）及びシロイヌナズナリゾチー ム／キチナーゼ（サヂ・ツク等、１９９０）のアミノ酸配列の線列を示す。これ から、３つの全切片を比べると約４５％の類似性があるように見える。ＳＥをキ ュウリリゾチーム／キチナーゼと比べると、約６０％の類似性が観察された。

実施例８ テンサイβ−１，３−グルカナーゼ３及び４についての部分アミノ酸配列の特性 表示及び決定 したようにセルコスポラ感染テンサイ葉から分離した。それらはβ−１，３−グ ルカゴンに強い親和性を有する塩基性蛋白である。テンサイβ−１，３−グルカ ナーゼ３及び４イソ酵素のアミノ酸組成は表■に示すようにタバコ及びオオムギ からのβ−１，３−グルカナーゼに与えられたものと類似である。

表■ タバコ及びテンサイβ−１，３−グルカナーゼのアミノ酸組成アミノ酸　タバコ ａ）テンサイ３　テンサイ４　オオムギＧ　ｓｂ）アスパラギン酸　３５　４６ ．４　５３．４　３９スレオニン　１０　１２．６　１２．１　１４セリン　２ ３　２５．０　２７．４　２３グルタミン酸　２０　２３．４　２６．７　２０ プロリン　１９　１８．４　２１．７　１５グリシン　２６　２７．８　３２． ２　３１アラニン　２０　３１．５　３５．１　４３７ステイン　１　０　０　 ０．７ バリン　１８　２１．３　２５．６　１８メチオニン　１　５．１　６．６　４ ．８イソロイノン　１７　１５，９　１９．２　１４．９０インン　２３　２２ ．７　２７，０　２２．１チロシン　１６　１３．５　１５．４　１５．４フ二 ニルアラニン　１３　１２．８　１４，６　１２．９ヒスチジン　５　３．１　 １．９　１．２１ルン　１３　１２．９　１６．２　９．７アルギニン　１２　 １２．７　１５．０　１２．９トリプトフアン　４　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ分子量（ ＫＤ）　３２　３２．８　３７．６　３２等電点　９．９　９．５　９．５　９ ．８ａ）　ンンシ・エイチ等、１９８３から得たデータｂ）　クロー等、１９９ １から β−１，３−グルカナーゼの５ＤＳ−ＰＡＧＥｌｏ−１５％勾配５ＤＳ−ゲル（ ファスト−システム、ファルマシア）上で測定したβ−１，３−グルカナーゼ３ 及び４の見掛けの分子量は、それぞれ３３及び３８ＫＤａであった。等電点は９ ．５に等しいかより大であった。薄層クロマトグラフィにより分析すると、２つ のβ−１，３−グルカナーゼイソ酵素３及び４とのインキュベーションの２４時 間後、ラミナリンから放出された主要反応生成物は二量体、ラミナリビオーゼで あった。これは、β−１，３−グルカナーゼ３及び４イソ酵素がエンドグルカナ ーゼであることを強く示唆する。

β−１，３−グルカナーゼ３及び４のアミノ酸配列決定精製したβ−１，３−グ ルカナーゼ３及び４は、上記「材料及び方法」に記載した方法を用いトリプンン 消化に付し、選択したペプチドを「材料及び方法」に及び上記実施例３に記載し たようにさらに精製し、配列を決定した。ペプチドは、キチナーゼ４のトリプン ンペプチドの選択に関し用いたもの（実施例３参照）と同じ基準を基に選択した 。ペプチドのアミノ酸配列は表■に示す。

表■ ’＜フチト３−１７　（Ａ）−Ｇ−Ａ−Ｐ−Ｎ−Ｖ−Ｐ−Ｉ−Ｖ−Ｖ−３−Ｅ− ３−Ｇ−Ｗ−Ｐ−３−Ａ−Ｇ−Ｇペプチド３−１．６　Ｌ−Ｑ−Ｇ−に−Ｖ−Ｓ ペプチド４−２５．Ｉ　Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｌ−Ｐ−３−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｖ−Ｖ−３ −Ｌ−Ｙペプチド４−２６．３　Ｌ−Ｄ−Ｙ−＾−Ｌ−Ｆペプチド４−２７．Ｉ 　Ｙ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｎ−Ｅ−Ｉ−Ｍ−Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ａ−Ｅ−Ａ−Ｇ−３−Ｉ −Ｖ−Ｐ−Ａ−Ｍ−Ｑ−Ｎ−Ｖ（Ｑ）−（Ｑ）−（＾）−（Ｐ）−（Ｒ）ペプチ ド４−２８．２　ｆＪ−Ｑ−Ｎ−Ｎ−Ｖ−Ｖ−Ｐ−Ｙペプチ）’４４０．１　Ｇ −Ａ−Ｐ−Ｎ−Ｖ−Ｐ−Ｉ−Ｖ−Ｖ−３−Ｅ−３−Ｇ−Ｘ−Ｐ−３−Ａ−Ｇ−Ｇ −Ｎ−Ａ−Ａ−３−ＦヘフチＦ３−１５：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：３３１：示 すヘフチＦ３−１７：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：３４１．１．示すヘフチＦ３− １６：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：３５ｉ：示すペプチド４−２５゜１：　ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ，＋１０（７）アミノ酸Ｎｏ、　３７−５１からなるヘ−＃　）’ ４−２６．３：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：１０＋７１アミノ酸Ｎｏ、　２１１− ２１６からなるヘ−＃　）’４−２７．１：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：１０（７ １アミノ酸Ｎｏ、　１１５−１３９からなるヘフチ）’４−２８．２：　ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ，：１０ノアミノ酸Ｎｏ、　１０１−１０９からなるペブチ）’４ ．４０．１＋　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　＋１０ノア　ミ／　酸ＮＯ，２４９−２ ７２力ラナ６実施例９ β−１，３−グルカナーゼ３及び４についてのｃＤＮＡの分離及び特性表示ＳＥ に関し上記したと同様の方法でβ−１，３−グルカナーゼ３及び４ポリペプチド からのペプチドに対応するオリゴヌクレオチドプローブを合成した。５゛プライ マーとして、β−１，３−グルカナーゼ４の分離のためのＰＣＨの最初の過程で 次の２配列を用いた。

ペプチド３−１５：　ｗ、ｖ、Ｑ、　Ｎ、　Ｎ、　（Ｖ）−。

（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：３６１：示す）ＰＣＲの第２ｉ程で以下の配列をｓＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ、：１０（７）７ミ／ｕＮｏ。

１２０−１２５から成る５′プライマーペプチド４−２７．１として用いた。

（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：３７１１：示す）ライブラリィ（フィシャー、＋９８ ６）及びタバコ（シンシ等、１．９８８）のβ−１，３−グルカナーゼからのア ミノ酸配列を比較することにより、コンセンサス配列を得、以下のコンセンサス を有する３′プライマーの構築に用いた。

ペプチド配列：　Ｆ、　Ａ、　Ｍ、　Ｆ、　Ｄ／Ｎ、　Ｅ。

（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：３８に示す）この配列は第二ＰＣＲ過程で用い、これ に対しＳＨのクローン化に用いた２７０プライマーを最初の過程で用いた。１． ３−グルカナーゼ３クローンを分離するため、ペプチド４−２８．２＝ペプチド ３−１５（実施例βの表■参照）であるので、ＴＧ−１プライマーを用いた。こ のプライマーは両ＰＣＲ反応の５°プライマーとして用いた。３°プライマーと して、ＴＧ３及び２７０ヌクレオチドをそれぞれＰＣＲの第−及び第二過程に用 いた。

得られるＰＣＲ生成物を上記テンサイｃＤＮＡλ−ＺＡＰをスクリーンするのに 用い、β−１，３−グルカナーゼ３及び４をそれぞれ暗号化するｃＤＮＡを含む クローンを分離した。β−１，３−グルカナーゼ４のｃＤＮＡ配列及び推定アミ ノＩｆ＋配列を＋れぞｈＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：１９及びＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、 ：１０１：示ｔ。

実施例１０ テンサイキチナーゼ２及び４の血清学的特性表示キチナーゼ２及び４の間の血清 学的関係をイムノブロッティングにより分析した。キチナーゼ２（ＮＷ３２ｋＤ ａ）及び４（ＭＷ２６ｋＤａ）を含んでいる蛋白試料をイムノブロッティング前 に５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離すると、以下の結果を観察した（図１０参照）。

キチナーゼ４抗体は約２６ｋＤａ蛋白（キチナーゼ４）のみを検出し、３２ｋＤ ａ（＋チナーゼ２アイソザイム）は、それも同じニトロセルロース膜上に存在す るのに検出しなかった。対称的にキチナーゼ２抗体は３２ｋＤ蛋白（キチナーゼ ２）のみを認識し、２６ｋＤのキチナーゼ４を認識しない。これはキチナーゼの ２つの異なる血清学的グループの存在を強く示す。この観察は純粋のキチナーゼ ２及び４抗体のイムノブロッティング分析でさらに立証される。キチナーゼ４に 対する抗体はキチナーゼ４のみを検出し、これに対しキチナーゼ２に向けられた 抗体はキチナーゼ２のみを認識し交叉反応性は全く観察されなかった。上の結果 は、テンサイの２つの異なるクラスの塩基性キチナーゼを含むことを示唆する。

この観察は、又、塩基性キチナーゼ２及び４のアミノ酸配列決定及びアミノ酸組 成（上記実施例３の表■参照）から得られる情報により支持される。違いは、キ チナーゼ２及び４をコードする遺伝子が２つの異なる遺伝子ファミリイを構成す ることを示す。

本発明者等の知る限り、２つの異なるクラスのテンサイキチナーゼの存在は、こ れまで文献に報告されていない。

テンサイキチナーゼ２クラスの定義 テンサイキチナーゼ２のＮ−末端アミノ酸配列をマメ、タバコ、エントウＡ１、 エントウＡ２、エントウＢ（バド等、１９９１）、オオムギＴ（ヤコブソン等、 １９９０）及びオオムギＫ（クラ−等、１９９０）からの以下のキチナーゼと連 合させると、これらの塩基性キチナーゼ間の強い類似性を観察した（表■参照） 。

これは、これらのキチナーゼが同じキチナーゼクラスに属することを示唆する。

これは、テンサイキチナーゼ２に向けられた抗体で実施した血清学的交叉反応性 によりさらに立証された。この抗体は、テンサイキチナーゼ２だけでなく、さら にタバコからのキチナーゼＰ　（２７，５ｋＤ）　、Ｑ　（２８，５ｋＤ）　、 ｃｈ、３２及びｃｈ、３４、オオムギからのキチナーゼＴ、Ｋ及びＣ並びにエン トウからのキチナーゼＡｌ、Ａ２及びＢをも認識した。オオムキキチナーゼＫ又 はコムギ胚芽キチナーゼに向けられた抗体を用いると、同様の血清学的交叉反応 性を観察した。それゆえ上記のキチナーゼは、テンサイキチナーゼ２に血清学的 に関連するキチナーゼクラス、例えばテンサイキチナーゼ２クラスキチナーゼに 属すると定義した。

表■ テンサイキチナーゼ２クラスに属するキチナーゼアイソザイムのＮ−末端アミノ 酸配列 キチナーゼ２　ＥＬＣＧＮＱＡＧＧＡＬＣＰＮＧＬＣＣ３ＱＹＧＩＩＣＧＮＴＮ ＰＹＣＧＮ７　メＥＱＣＧＲＱＡＧＧＡＬＣＰＧＧＮＣＣ３ＱＦＧｆＣＧＳＴＴ ＤＹＣＧＰタバコ　ＥＱＣＧＳＱＡＧＧＡＲＣＡＳＧＬＣＣＳＫＦＧｆエントウ Ｂ　ＥＱＣＧＲＱＡＧＧＡＴＣＰＮＮＬＣＣ３ＱＹＧＹエントウＡ　Ｉ　ＥＱＣ ＧＮＱＡＧＧＸＶＰＰＮＧエントウＡ　２　ＥＱＣＧＴＱＡＧＧＡＬＣＰＧＧＬ オオムギＫ　ＥＱＸＧＳＱＡＧＧＡＴＣＰＮＸＬＣＣ３ＲＦＧオオムキＴ　ＸＱ ＱｃＳＱＡＧＧＡＴＣＰＮｘＬＣＣ３ＸＦＧｆキチナーゼ２　：　ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ、　：２７に示すマメ：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：２５のアミノ酸Ｎｏ、 　１−３３より成るタバ：Ｉ　：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：２６のアミノ酸Ｎｏ 、　１−２３より成るエントウＢ・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：４１に示すエントウ Ａ　１　：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　：４２に示すエントウＡ　２　：　ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ、　：４３に示すオオムギＫ　：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　：４４ に示すオオムギＴ　：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・４５に示すテンサイキチナーゼ４ クラスの定義 テンサイキチナーゼ４に向けられた抗体を用いた場合、上記キチナーゼ２クラス からのキチナーゼは認識できなかった。テンサイからのキチナーゼ４はかくして 、テンサイ以外の他の植物種に検出されない点で新しいキチナーゼクラスに属す る。しかしながら、最近の研究は、同じ新しいクラスに属しているキチナーゼが アブラナ種子にあることを示した。即ち、テンサイキチナーゼについて上で概説 したのと同様の方法により得たアブラナ種子の蛋白抽出物は、テンサイからのキ チナーゼ４に向けられた上述のポリクローナル抗体と反応することを示した（ラ スムラセン等、１９９２参照）。

実施例１１゜ ハイブリダイゼーション技術を用いるキチナーゼ４ｃＤＮＡと他のキチナーゼと の類似性の試験 成熟酵素間の類似性を試験する傍ら、キチナーゼ４酵素を暗号化するｃＤＮＡと 他のキチナーゼ酵素を暗号化するＤＮＡとの間の類似性を表題「キチナーゼ４遺 伝子群に属するＤＮＡの同定」の下に上記「材料及び方法」に記載されるハイブ リダイゼーション技術を用い試験した。

図１１から、テンサイキチナーゼ４酵素を暗号化しているｃＤＮＡと他の植物、 例えばエントウ、タバコ及びマメからのキチナーゼを暗号化しているＤＮＡ並び にキチナーゼ１及びＳＥ酵素を暗号化しているテンサイからのＤＮＡとの間に５ ５℃で試験して非常に低度の類似性があることが明らかである。従って、これら の結果は、さらに、キチナーゼ４酵素が新しいクラスのキチナーゼに属すること を示す。

高度のＤＮＡハイブリダイゼーションにより示される、キチナーゼ４酵素を暗号 化しているｃＤＮＡとアブラナ種子キチナーゼからのキチナーゼを暗号化してい るＤＮＡとの間の高度の類似性は、さらにテンサイ中のキチナーゼ４を暗号化し ている遺伝子とアブラナ種子中のキチナーゼを暗号化している遺伝子が有意に類 似であり、従って、同じ遺伝子クラスに属することを示す。これは、二つの植物 からの成熟酵素間の高度の血清学的類似性を示す実施例１０に記載される結果に より支持される。

実施例１２゜ 細菌細胞の形質転換 アグロバクテリウム・ツメファシェンス（ＬＢＡ・４４０４株、オームズ等、１ ９８２）を植物形質転換ベクター、ｐＢＫＬ４に４、その調製は、アン等（１９ ８８）により記載されるように、実質的に凍結／解凍法を用い、実施例１８に記 載される、で形質転換した。凍結／解凍法用に形質転換すべき細菌をＬＢ培地、 ｐＨ７，４に２８℃で一晩２８Ｏｒｐｍで培養した。翌日、細菌を３９ｍ１のＬ Ｂ培地、ｐＨ７，４で継代培養し、’ＯＤ６００　（ＯＤｓ。。）まで約４時間 の成育物は０．５−１．０であった。培養物を氷上で冷却し、４℃、１０．００ ０ｘｇで５分間遠心した。上清を除去し、細菌を１ｍｌの水冷２０ｍＭＣａＣ１ ＊に注意して懸濁し、０．１ｍＡ’の細菌懸濁液を水冷凍結（ｃｒｙｏ）管にピ ペットで取り、細菌を液体窒素中で凍結し、−８０℃に保持した。

細菌の形質転換のために、先ず１μｇのプラスミドＤＮＡを凍結細菌を含む凍結 管に加えた。細菌を３７℃水溶中で５分間インキュベートした。１ｍｌのＬＢ培 地、ｐＨ７，４を凍結管に加え、混合物をゆるやかに撹拌しながら（撹拌板１０ １００Ｘｒｐ室温で４時間インキュベートした。凍結管を１０．０００Ｘｇ。

４℃で３０秒間遠心した。上清を除去して細菌を０．１ｍ／のＬＢ培地、ｐＨ７ ゜４に再び懸濁した。細菌を５０ｍｇ／ｌカナマイシンと共にＹＭＢ皿上にプレ ートし、２８℃で２ないし４日間、コロニーが現れ、るまでインキュベートした 。細菌中、固有（ｐｒｏｐｅｒ）プラスミドの存在は、植物の形質転換での細菌 の使用前、抽出プラスミドの制限分析により証明する。

同様の方法で、本発明の他の遺伝構造物との細菌形質転換は、例えば図１７゜１ ８．１９及び２２に示すように実施し、そして実施例１８に説明しうる。

実施例１３゜ 遺伝的に形質転換されたタバコにコチアナ・ペンタミアナ及びエフ、カバクム） 植物の調製 植物材料 遺伝的に形質転換すべき植物葉をインビトロ又はインビボで成育した植物から得 た。後者の場合、葉は形質転換前に滅菌した。滅菌はｌ当り０．１ｍｌツイーン ８０を含む５％次亜塩素酸Ｃａの溶液中に２０分間葉を置（ことにより実施し、 その後、無菌水で５回洗浄した。インビトロ葉をコンテナ中１／２シュート誘発 培地（ｓｈｏｏｔ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ）　（１／　２Ｍ５）上で 生育した（ムラシゲ及びスクーグ、１９６２）。

葉は１４ｃｍペトリ皿に１度に一つ置いた。次いでそれらを約１ｃｍ”の四角に 切り、全４辺はカットされた組織から成る。次亜塩素酸塩滅菌により漂白した全 ての切断組織は除去した。

細菌の培養 形質転換２４時間前、上記のように形質転換したアゲロバクチリアの懸濁液は形 質転換したアゲロバクチリアを含み、適当な抗生物質を含む２−３ｍ１培地をイ ンキュベートすることにより開始した。細菌は撹拌しながら（３００Ｘｒｐｍ） ２８℃で生育する。

形質転換 植物の形質転換は実質的にアールビー、ホーシュ等（１９８６）により記載され るように行った。細菌培養物を形質転換直前に１／１０Ｍ５で５０×希釈した。

約１０ｍ１の希釈細菌懸濁液を９ｃｍペトリ皿に空け、葉片をこの懸濁液に約１ ５分間浸漬した。次いで葉片を除去し、過剰の細菌懸濁液を無菌フィルターペー パーで除去した。

共生培養 形質転換前日、１／１０Ｍ５培地を含む共生培養ペトリ皿をアセトシリンボン（ ２００μＭ）で被覆した。形質転換の日に、一枚の無菌フィルターペーパーを共 生培養皿上に置き、細菌懸濁液に浸漬した葉片をフィルターペーパー上に逆さま に置いた。葉片を生育室中、弱い光で、例えば１２時の光と１２時の闇、２−３ 日間インキュベートした。

選択／再生 葉片を、３００ｍｇ／ｌのカナマイシン及び８００ｍｇ／Ａ’のカルベニシリン を含むシュート誘発ＭＳ培地を含んでいるペトリ皿に移し、毎４週同じ培地に共 竺培養した。

シュート誘発ＭＳ培地３００に／ｃ置皿上現れる発芽を１／２Ｍ５Ｏ３００に／ ｃを有するコンテナーに移した。発芽を必要時に共生培養した。約２週間後、Ｇ ＵＳ・検定（「材料及び方法」参照）を用いるβ−グルコロニダーゼの発現を緑 シュートの葉端で実施した。

移植 根を形成した遺伝的に形質転換したシュート及びＧＵＳ陽性である得られる植物 を生育室中、水浸透堆肥に移植した。次いでそれらをプラスチックバッグで覆い 、約１週間生育し、その後、プラスチックバッグの２つの角を切り取った。さら に１週間後、プラスチックバッグを除去した。

実施例１４゜ 細胞との形質転換による遺伝的に形質転換したテンサイ植物の調製形質転換を、 以下に記載するように子葉外植片を用い実施した。種子を、０゜７ｇ／ｌのアガ ロース及び２　ｇ、／Ｊのシュクロースを含む基質上、暗所で４日間発芽させた 。次いで、芽ばえを１／２ＸＭＳ基質を含むタンクコンテナーに移し、３日間明 所で培養した。子葉を芽ばえから除去し、次いで子葉、外植片は、実施−例１２ において上記したように形質転換したアルボバクテリウムの懸濁液（ＯＤ６６０ ＝１．０）を含んでいる小ブラシで柄上をブラシ掛けした。次いで子葉を１／１ ０Ｍ５基質を含む基質で４日間共生培養した。形質転換外植片を、０．２５ｍｇ ／ｌのＢＡＰ、４００ｍｇ／７のカナマイシン、８００ｍｇ／／のカルベニシリ ン及び５００ｍｇ／ｍ／のセフォタキシムを加えたＭＳ基質に移し、外植片をこ の基質上で１４日間インキュベートした。次いで再生シュートを基質として０． ２５ｍｇ／ＩのＢＡＰ、４００ｍｇ／ｊ’のカナマイシン及び８００ｍｇ／ｌの カルベニシリンを含むＭＳを含むコンテナーに移した。分離したシュートを選択 及び増殖のために４適間隔で新しい基質に移した。選択したシュートを１ｍｇ／ １ＩＢＡを含む１／２ＭＳ基質上で根づかせた。

タバコの組織をキチナーゼ１、キチナーゼ４、キチナーゼ７６及び酸性キチナー ゼＳＥのいずれかと選択的標識、ＮＰＴ−ＩＩ及びＧＵＳを含む遺伝構造物と形 質転換した。カナマイシンによるカルス及びシュートの選択は、得られた組織が ＧＵＳｗｌ識を発現すること、従って、形質転換が起きたことを証明した。

実施例１５゜ 遺伝子導入植物のキチナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼの分析キチナーゼ及 びβ−１，３−グルカナーゼイソ酵素についての発現レベルは、２つの放射化学 検定による総酵素活性を測定すること、生物学的方法Ｉ　−ｍを用い抗真菌活性 を測定すること又は特異抗体を用いるイムノブロッティングによる異なるイソ酵 素のレベルを測定することのいずれかにより評価でき、いずれの方法も「材料及 び方法」に記載される。得られる遺伝子導入植物の最終試験は、「材料及び方法 」に記載される感染系を用いる植物生病原生物真菌への耐性のそれらの程度の分 析である。

生物学的方法ｌ−ｎ１を用い、遺伝子的に形質転換した植物の酵素の抗真菌活性 を測定できる。真菌菌糸の遅滞生育は、形質転換の結果、植物が改良された耐性 、例えば非形質転換植物に比べ植物生病原生物真菌に対する増大した抗真菌活性 を有することを示す。

放射化学検定では、３Ｈ−キチン又はｓＨ−ラミナリンを、それぞれキチナーゼ 又はβ−１，３−グルカナーゼへの基質として用いる。生成物形成対酵素量の標 準曲線を用い、粗植物抽出物中のキチナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼの活 性を測定できる。これは、さらにキチナーゼ（図１２ａ上部）又はβ−１，３− グルカナーゼ（図１２ｂ下部）のレベルがシー、ベティコラによる感染後、特定 時間間隔でテンサイ葉中に示される時間経過実験で示される。キチナーゼ及びβ −１，３−グルカナーゼの両酵素レベルは対称植物中で非常に低いが、非常に感 受性の高い放射化学技術により容易に測定できる。感染植物中で、両酵素の増加 生成を真菌病原体による感染後８−９日に初めて観察した。

これらの技術で、遺伝子導入植物のキチナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼの 構造的レベルは容易に記録できる。

しかしながら、これらの技術は、種々のキチナーゼ及びβ−１，３−グルカナー ゼアイソザイム間を区別しない。総酵素は、全キチナーゼ又は全β−１，３−グ ルカナーゼアイソザイムについての総酵素活性を測定するだけである。しかしな がら、種々のキチナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼイソ酵素ムの存在は、５ Ｏ３−ＰＡＧＥによる分離後、イムノブロッティングにより粗蛋白抽出物を分析 することによって容易に別々に検出できる。

β−１，３−グルカナーゼ３に対する抗体はセルコスポラ感染葉材料中唯−の単 一蛋白を認識した（図１３）。これに対し、抗原は対照葉に検出されなかった。

これは放射化学検定を用いるβ−１，３−グルカナーゼについて対照植物中に観 察される低構成レベルの発現と一致する。キチナーゼ２又は４のいずれかに向け られた抗体を用いた場合、２つの主な蛋白バンドが感染葉組織に誘発した。キチ ナーゼ２抗体は２６及び３２ｋＤａバンドを検出するが、２９及び２６ｋＤａの 分子量を有する２つの蛋白が、キチナーゼ４抗体と共に観察された。精製キチナ ーゼを５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングにより分析すると、キチナー ゼ２抗体により認識される蛋白は、それぞれキチナーゼ１　（２６ｋＤａ）及び キチナーゼ２　（３２ｋＤａ）であった。同様に、キチナーゼ４に対する抗体は 標準キチナーゼ抗原（２６ｋＤａ）を検出したが、加えてＳＥ抗原（２９ｋＤａ ）も検出した。これは、キチナーゼ４とＳＥとの間にアミノ酸配列類似性が観察 されなかったことカラ、思イモヨラナカッタ（Ｓ　ＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、　：　 ２及ヒＳ　ＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、　：　８参照）。ニトロセルロース膜上のキチ ナーゼ４及びＳＥのｒ３−ＤＪ槽構造、十分なエピトープ認識を作り得、ＳＥ抗 原とキチナーゼ４抗体との間の抗原・抗体相互反応を行わせる。ＳＥ抗原とキチ ナーゼ４抗体との反応は、抗体溶液が１・１００又は１２００に希釈した場合に 報告されただけである。抗体を１５０００又は１：１０．ＯＯＯに希釈した場合 、もっと弱い反応を観察した。

遺伝子導入タバコ植物にニコチアナ・タバクム及び／又はエフ、ペンタミアナ） を、キチナーゼ４、キチナーゼ７６、酸性キチナーゼ又はキチナーゼ４＋酸性キ チナーゼで形質転換した。カナマイシンでの選択及び再生後、形質転換した植物 を１）ＧＵＳ活性、Ｕ）キチナーゼ遺伝子の発現、及びｔｈ）ソー。ニコチアナ 又はアール、ソラニに対する抵抗性の程度に関し試験した。遺伝子導入植物は可 変量でＧｔＪＳ−活性を発現した。高ＧｔＪＳ−活性の植物のみをさらに分析に 付した。

キチナーゼ遺伝子生成物の発現を「材料及び方法」に記載されるＥＣＬ−システ ム及びキチナーゼ４に向けられた抗体を用いるイムノブロッティングにより分析 した。ＮＰＴ及びＧＵＳのみで形質転換したエフ、ペンタミアナからの葉抽出物 では、蛋白バンドはこの抗体によって検出しなかった（図２３．レーンｒＣＪ参 照）。構成物、酸性キチナーゼ、ゲノムキチナーゼ７６、キチナーゼ４及び二重 遺伝子構成物キチナーゼ４＋酸性キチナーゼを含む遺伝子導入植物は強い陽性反 応を示した（それぞれレーンＳＥ、に７６、Ｋ４、Ｋ４＋ＳＥ参照）。発現のレ ベルを評価するため、テンサイから分離したキチナーゼ４のＬｏｌｌ）ｇを含め た。

図２３のレーンＳ　ｔｄｏ ブロードな蛋白バンドをキチナーゼ４又はキチナーゼ７６遺伝子構成物を有する 遺伝子導入植物からの抽出物に観察した。少量の蛋白を５ＤＳ−ＰＡＧＥの種々 のレーンに適用すると、このバンドはそれぞれ２９．２６及び２５ｋＤの分子量 を有する３つの明らかな蛋白バンドに分析できた。３重バンドについての理由は 現時点では判らない。しかしながら、キチナーゼ４はｉ）単一ペプチド＝２９ｋ Ｄバンドを保持している蛋白のもとである処理を受けなかった。１ｉ）２６ｋＤ 蛋白バンドのもとであるキチナーゼ４のアミノ酸配列Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＸＩａｌ 　Ａｌａ−ＧｌｕＡｓｎ　Ｃｙｓ　（ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、　：　２のアミノ 酸位置２３−２４）の正常プロセシング部位で切断した。モして漁）第二推定プ ロセシング部位はアミノ酸配列Ａ１ａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　５ｅｒ−Ｃｙｓ　Ａｌ ａ　（ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ、　：　２の位置８５−８６）に位置することを意 図する。この切断部位は２５ｋＤポリペプチドバンドを与えつる。

遺伝子導入タバコのテンサイキチナーゼ４の機能不全プロセシングに加えて、キ チナーゼ４の転位を阻害した。テンサイにおいて、この塩基性キチナーゼ４は細 胞外余白に沈積した。遺伝子導入タバコにおいて細胞化学分析は、テンサイキチ ナーゼ４が細胞内に位置することを明らかに示す。

Ｒソラニ及びＣ，ニコチアナに対する遺伝子導入タバコ植物の抵抗の程度を試す する予備的実験を実施した。キチナーゼ４（１０植物）及びキチナーゼ４＋酸性 キチナーゼ（４植物）による遺伝子導入植物は、少しの疾病症状を示したが、Ｇ ＵＳ及びＮＰＴ遺伝子を含む対照植物（１０植物）はＣ，ニコチアナにひどく感 染した。

キチナーゼ４遺伝子構造物を含むＮ、タバクムの種子をＲ，ソラニ感染土壌中で 発芽させると、非遺伝子導入植物からの種子に比べ、生存及び成育が改良された 。

実施例１６゜ 位置指定突然変異導入法によるテンサイキチナーゼ４の修飾テンサイキチナーゼ ４を暗号化しているＤＮＡ、例えばキチナーゼ４遺伝子での位置指定突然変異導 入法は、各位置指定突然変異導入法について特異的３′及び５′プライマーを用 いる（見出し「本発明の遺伝構造物の構成で、又、クローン化されたＤＮＡ鋳型 を基とする位置指定突然変異導入法で用いたＰＣＲＪの下に「材料及び方法」に 記載された）ＰＣＲ反応の使用により実施しつる。用いられるべき特異的３′及 び５′プライマーの選択は、修飾を実施すべきＤＮＡ配列での位置に依る。

典型的には、置換、除去又は挿入のいずれかにより修飾されるべき適当なアミノ 酸は、所望により酵素３−Ｄ構造の分析と組合せて成熟キチナーゼ４酵素のアミ ノ酸配列の分析を基に選択する。特に、酵素の又はそのエピトープの活性部位の アミノ酸形成部分並びに基質特異性及び基質結合に重要なアミノ酸はこの関係に 興味がある。

テンサイキチナーゼ４の活性部位 キチナーゼ４の活性部位に含まれる必須アミノ酸残基の位置は、以下の観察によ り仮に確認した。第一に、オオムギキチナーゼによる最近の研究は、カルボジイ ミドとＮ−ブロモコハク酸イミド（ＮＢＳ）による化学修飾が酵素活性を完全に 阻害することを示した（結果は示さず）。アスペルギルス、ニが−からのグルコ アミラーゼ（シーアク等、１９９０）により実施した同様の実験は、カルボジイ ミド及びＮＢＳがこの酵素を不活性化する作用のモードを明らかにした。カルポ ジイミドは、グルコアミラーゼの触媒部位を構成している３つの必須酸基（グル タミン酸及びアスパラギン酸残基）に共有結合する。ＮＢＳは、触媒のトランジ ション状態中間体を安定化するのに重要なＴｒｐ残基又は、触媒部位から離れて 結合している基質に含まれるＴｒｐ残基を酸化する。キチナーゼＣによる実験は 、３つの酸性残基及びこの２つのＴｒｐ残基がこの活性部位の非常に重要な構造 物であることを示す。第二に上記したグルコアミラーゼを含むオリゴ糖鎖を加水 分解する他の酵素の活性部位との比較により、キチナーゼ４の活性部位は（ゲノ ムキチナーゼ４アミノ酸配列により暗号化されたアミノ酸配列中のアミノ酸残基 １８４及び１９０に対応する、カッコ中以下に示す数は、ゲノムキチナーゼ４に より暗号化された対応するアミノ酸配列からのアミノ酸の数を示す）ＳＥＱＩＤ ＮＯｌ：１のアミノ酸残基１８３　（Ａｓｐ）及び１８９（Ｇｌｕ）により構成 されることを意図する。これに対し、オオムギからのキチナーゼＣ及び同じ血清 学的クラスの他の全ての植物キチナーゼ（テンサイキチナーゼ２クラス）は、活 性部位中（それぞれ１８４．１９０及び１９５）（キチナーゼ４　（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ。

２）のアミノ酸残基１８３．１８９及び１９４に対応する）３つのアスパラギン 酸残基を有する。キチナーゼＣの活性部位に含まれる２つの重要なＴｒｐ残基の 位置は明らかでなかった。キチナーゼ４はわずか３Ｔｒｐ残基を含み、これに対 しキチナーゼＣには６存在するので、重要なＴｒｐ残基はキチナーゼ４でより容 易に確認しうる。

キチナーゼ４の活性部位を形成する５ＥＱＩＤＮ○　６２（それぞれ１８４及び １９０）の２つの酸性残基１８３Ａｓｐ及び１８９Ｇ１ｕは、ペプチド４−２２ Ｓ　ＩＧＦＤＧＬＮＡＰＥＴＶＡＮＮＡＶＴＡＦＲに含まれる。活性部位の重要 なＴｒｐ−残基はペプチド４−１９．３　：ＧＰＬＱＩＴＷ及びペプチド４−２ ６：ＴＡＦＷＦＷＭＮＮＶＨ５ＶＩＶＮＧ　ＱＧＦＧＡＳＩに含まれうる。

キチナーゼ４の活性部位は他の植物キチナーゼ、例えばタバコの活性部位と異な り、それはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：　４６に示される以下の対応するアミノ酸残 基ＡＩＧＶＤＬＬＮＮＰＤＬＶＡＴＤＰＶ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：４７に示さ れるＧＰＩＱＩＳＨ及びＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：４８に示されるＳＡＬＷＦＷＭ ＴＰＱＳＰ　（シンシ等、１９８７）を有し、そして、活性部位についてさらに 情報を得るため、又、多分、修飾酵素の改良された性質となる適当な修飾を確認 するため、タバコの対応するアミノ酸残基と異なるキチナーゼ４の特異的アミノ 酸残基を調べることは興味があるであろう。酸性アミノ酸残基及びＴｒｐ残基は 特にこの問題に興味を起こさせることを意図する。

従って、興味ある修飾は、位置１８９　（１９０）のグルタミン酸をアスパラギ ンで置換し、及び／又は位置１８３　（１８４）のアスパラギン酸をグルタミン で置換したものである。キチナーゼ４のカルボキシル基Ａｓｐ１８３　（１８４ ）をＡｓｎに、又、Ｇｌｕ１８９　（１９０）をＧｌｕに変更することは、それ 自体、酵素活性への負の影響を与えることが予測されるが、キチナーゼ４酵素の 作用のモードのさらなる知識となることを意図する。

位置１６９．２０４及び２０６のＴｒｐ（それぞれ１７０，２０５及び２０７） のＴｙｒへの置換は、基質（キチン）の触媒部位への結合そして恐らく基質特異 性を変えつる。上で与えられた計画された置換は実施例として示すだけで、数の 変更は、より有効な抗真菌キチナーゼに達すると推定される。これは、位置指定 突然変異導入法、例えば以下に概約を説明した方法を用い達成しつる。

位置指定突然変異導入法 本明細書で示唆された全てのＰＣＲ反応用に、プライマーは制限部位を含んでい るか又は制限部位の近（に位置するものを、ＰＣＲ生成物を遺伝子中の対応する 配列と交換する可能性を生じる方法で、制限酵素消化、次いで適切な断片の連結 により選ぶ。

以下の実施例で用いられる５′プライマーはＳＤＯと呼ぶ（図４参照）。カッコ 内の数字はゲノムキチナーゼ４　ＤＮＡ配列により暗号化された対応するアミノ 酸残基の数を示す。

キチナーゼ４アミノ酸配列のＴｒｐｌ　６９　（１７０）をアミノ酸Ｔｙｒによ り置換する場合、以下の操作を実施しつる。

ＰＣＲ反応に３′プライマーＳＤＩを用いる（図１参照）。

得られるＰＣＲ生成物（ｂｐ３０１から５３８まで）をＢａｍＨＩ及びＰｖｕＩ ［で消化し、慣用方法（サムプルツク等、１９９０）によりキチナーゼ４遺伝子 の対応する断片と交換する。

Ｇ１ｕ１８９　（１９０）をアミノ酸Ｇｌｎで置換する場合、３′ブライｖ−Ｓ Ｄ２を用いる（図１４）。

Ａｓｐ１８３　（１８４）をアミノ酸Ａｓｎで置換する場合、３′ブライ７−３ Ｄ３を用いる（図１４）。

ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＢａｐＭｎで消化し、Ｔｒｐ１６９　（１７０） の交換について上記したと同様の方法でキチナーゼ４遺伝子のＢａｍＨＩ−Ｂｓ ｐＭＩＩと交Ｔｒｐ２０６　（２０７）をアミノ酸Ｔｙｒで置換する場合、３′ ブライ？−８Ｄ４−を用いる（図１４）。

ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ及びＢａ１ｌで消化し、上記したようにキチナーゼ４ 遺伝子のＢａｍＨＩ−ＢａｌＩと交換する。

同様の方法で、他の望ましい修飾を実施しうる。

実施例１７ 適当なＣ−末端延長部による遺伝構造物の構築種々の植物キチナーゼ及びグルカ ナーゼに関して見い出されるＣ−末端アミノ酸配列は、明細書中で例証され、抗 真菌酵素を空砲に移動させるようにＣ−末端延長部を含まない本発明の遺伝構造 物により暗号化された１又はそれ以上の抗真菌酵素の修飾に有用であることを証 明すると確信する。

Ｃ−末端延長部は、適当な技術、例えばＰＣＲにより本発明の抗真菌蛋白の１又 はそれ以上を暗号化しているＤＮＡ配列に導入しうる。

図１５８は、図中、下線したタバコＣ−末端延長部を伴うテンサイβ−１，３− グルカナーゼｃＤＮＡを示す。

図１５ｂは、停止コドンを変更し、Ｃ−末端延長部の一部を導入するのに使用で きるＰＣＲプライマーを示し、ＤｒａＩ部位は３′末端に生じる。

図１５ｃは、Ｃ−末端延長部の最終部分、停止コドン、ＳｍａＩ部位及びＥｃｏ Ｒ１部位を含んでいる４アニ一ル化合成オリゴヌクレオチドを示す。

Ｃ−末端延長部は、慣用方法（マムブルック等、１９９０）を用い、β−１゜３ −グルカナーゼ遺伝子中のＸｂａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片を、ＸｂａＩ及びＤｒ ａＩで消化したＰＣＲ生成物並びにＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩで消化したアニール 化合成オリゴヌクレオチドと交換することにより導入することができる。

図１６ａは、タバコＣ−末端延長部（図中の下線した配列）を伴うキチナーゼ４ 遺伝子を示す。

図１６ｂは、キチナーゼ４遺伝子中停止コドン近（のＳｍａｒ部位を導入するの に使用できるＰＣＲプライマーを示す。

図１６ｃは、Ｃ−末端延長部、変化した停止コドン、ＳｍａＩ部位及びＥｃｏＲ １部位についての配列を含んでいる４つのアニール化合成オリゴヌクレオチドを 示す。

Ｃ−末端延長部は、同様に慣用方法を用い、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、Ｂ ａｍＨｌ及びＳｍａｌで消化したＰＣＲ生成物並びにＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩで 消化したアニール化合成オリゴヌクレオチドと交換することにより導入できる。

同様に、明細書中に例証されるもののような他のＣ−末端配列をキチナーゼ７６ 、キチナーゼ４、ＳＥ及びβ−１，３−グルカナーゼ配列に付加することができ る。Ｎ−末端配列は、同様の方法で、他のＮ−末端配列と交換しつる。特に興味 があるのは、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：１２に示されるキチナーゼ１のＮ−末端配 列、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、・８に示される酸性キチナーゼＳＥのＮ−末端配列、 ５ＥＱＩＤＮＯ，：２に示されるキチナーゼ４のＮ−末端配列、５ＥＱＩＤＮｏ 、：６に示されるキチナーゼ７６のＮ−末端配列、及び５ＥＱＩＤＮＯ，：１０ に示されるβ−１，３−グルカナーゼのＮ−末端配列でありうる。成熟蛋白の他 の興味あるＮ−末端配列は、表■又は表■に示すもの或いはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 。

１に示されるテンサイキチナーゼ１からのプロリンリッチ部分でありうる。

実施例１８゜ 遺伝構成物 キチナーゼ４ｃＤＮＡ遺伝子（Ｂ１５キチナーゼ４）を含んでいる切断された組 換えｐＢ１ｕｅスクリプトを、遺伝子に増進３５Ｓプロモーター及び３５Ｓター ミネータ−を供給するため、サブクローンした。この構成物は、ＮＰＴｎ及びＧ ＵＳ遺伝子を含んでいる植物形質転換ベクターｐＢＫＬ４に移転した。ｐＢＫＬ ４は、その中で左と右ボーダー間の遺伝子を以下の遺伝子、１）ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター及びツバリン・シンターゼ・ターミネータ−（ＮＯＳ）を備えたＥ 、コリからのβ−グルコロリダーゼ（ＧＵＳ）及び２）ＣａＭＶ３５Ｓプロモー ター及びオクトビン・シンターゼ（ＯＣ３）ターミネータ−を備えたＥ、コリか らのネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）と置換したＡ、ツメフ ァシェンスＴｉ−プラスミドｐＢ１１２１（ベバン等、１９８４）の誘導体であ る。

より詳しくは、ＰＣＲ増幅反応は、ＡＴＧ部位、リポソーム結合部位及び２つの 制限部位（ＨｉｎｄｌＩ！及びＢｇｌＩＩ）　５’をｃＤＮＡ配列に導入するた めに実施した。

２つの制御部位、リポソーム結合部位ＡＴＧ　（下線せず）及びＢ　ｌ　５ｃｈ ｉｔ４クローンの初めの１５ヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチドＫＢ ３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，：　４９に示す）： （ヌクレオチド８及び１０は、ＫＢ３プライマーをｃｈｉｔ７６クローンにも用 いたことにより混合（Ｔ）ヌクレオチドであった）を５’ＰＣＲプライマー及び オリゴヌクレオチドＫＢ４として用いた。

オリゴヌクレオチドＫＢ４　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、：５０に示す）：を３′プ ライマーとして用いた（ヌクレオチド２５５及び２５６は第二ＮｈｅＩ部位を破 壊するために置き換えた）。

ＰＣＲ生成物をフェノームで２回とクロロホルムで２回抽出し、ＥｔＯＨ沈澱し た。Ｈ！Ｏに再懸濁後、ＤＮＡをＨｉｎｄｍ及びＮｈｅＩで消化した。ｐＢ１５ からのＨｉｎｄＩ［［−ＮｈｅＩ断片をＨｉｎｄｌｌ［−ＮｈｅＩ　ＰＣＲ断片 と交換した（図１７）。

構造物をＴ７配列決定プライマー（ｐＢ１ｕｅスクリプトＴ７プロモーターに対 応で配列を決め、総交換配列が正しいことを確認した。さらに５′配列で、元の ヌクレオチド８はＴでヌクレオチド１０はｐＢ　１５ｃｈｉｔ４クローンのよう にＣであり、そして位置２４５及び２５１の両ＮｈｅＩは依然として存在した。

構造物をＥｃｏＲＩで消化し、反応での充実はｄＡＴＰ及びＴＴＰの存在下、フ レノウ酵素でなしとげた。構造物はフレノウ酵素除去後、Ｂｇｌｍでさらに消化 した。総キチナーゼ４配列を含有しているＤＮＡ断片Ｂｇｌ　ＩＩ　−ＥｃｏＲ Ｉは、増強３５Ｓプロモーター及び３５Ｓターミネータ−を含んでいるベクター ｐＰＳ４８内にクローンした。キチナーゼ４遺伝子は、ｐｐ　Ｓ　４８ベクター をＢａｍＨ１−ＳｍａＩで消化することにより正しい定位に挿入した（図１７） 。増強３５Ｓプロモーター及び３５Ｓターミネータ−を伴うキチナーゼ４遺伝子 をＨｉｎｄｌ［Ｉ断片（図１７）として植物形質転換ベクターｐＢＫＬ４に移し た。Ｅ、コリＤＨ５α中に含まれた、得られるベクター、ｐＢＫＬ４に４はマン エロダー・ウェブ１　ｂ　−Ｄ−３３００ブラウンシユバイグ（ＤＳＭ）　ドイ ツチェ・シャルムング・フォノ　ミクロオルガニズメン・ラント・ゼルクルツー レンＧ＋ｃｂＨに１９９１年７月３０日、ブダペスト条約の規定に基づき、寄託 番号ＤＳＭ６６３５として寄託された。

次いでＳＥ遺伝子を構造物ｐＢＫＬ４に４に導入した（図１７）。無削除のＳＥ 遺伝子は、ｐｓｕｒｌクローンからの遺伝子（ＥｃｏＲＩ　−Ｋｐｎ　Ｉ　）の ５′末端をｐＳＥ２２からの遺伝子（Ｋｐｎ　ｌ−ＨｌｎｄｌＩ［）の残余と、 クローニングベクターｐＵＣ１９中結合することにより構築した（図１８）。Ｓ Ｅ遺伝子は、４つの全てのヌクレオチドの存在下、フレノウポリメラーゼで満た されたＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片としてｐＰＳ４８のＳｍａ１部位にサ ブクローンした。増強３５Ｓプロモーター及び３５Ｓターミネータ−に関連する 遺伝子の定位は、制限酵素分析１こより試験し、配列分析によりさらに確認した 。

増強３５Ｓプロモーター及び３５Ｓターミネータ−を伴うＳＥ遺伝子を、Ｈｉｎ ｄＩ［Ｉ−ＫｐｎＩアダプターの存在下、ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＢＫＬ４ に４のＫｐｎ１部位にクローンした（図１８）　。Ｈｉｎｄｍ断片はｐＢＫＬ４ のＨｉｎｄＩ［［部位１こさら１＝クローンした。

同様に、キチナーゼ４、キチナーゼ７６遺伝子をｐＢＫＬ４の中（こクローンし た（図１９）。

無削除（１）ｃＤＮＡ’ｙｏ−ン（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、＋　９）をＥｃｏＲＩ 及ヒＢｇｌＩＩて消化し、粘着末端を全ての４つのｄＮＴＰの存在下、クレノウ ポ１ツメラーゼで満たした。次いでグルカナーゼ遺伝子をｐｐ　Ｓ　４８Ｍｏｄ のＳｍａＩ部位（こサブクローンした。それぞれ、増強３５Ｓプロモーター及び ３５Ｓターミネータ−に関する遺伝子の定位は、制限酵素分析により試験し、配 列分析１こよりさら（二石ｒ認しうる。

増強３５Ｓプロモーター及び３５Ｓターミネータ−を伴うり゛ルカナーゼ遺伝子 は、ｐＢＫＬ４、ｐＢＫＬ４に４、ｐＢＫＬ４ＫＳＥＳｐＢＫＬ４に４ＳＥ＋７ ）ＥｃｏＲ１部位にクローンする。

配列一覧表 （１）総合的情報： （ｉ）出願人：　ダルガード・ミツケルセン、ジョエルンポイセン、キルステン ニールセン、クラウスＫ。

ベルグルンド、ラルス （ｉｉ）発明の名称−植物キチナーゼ遺伝子およびその用途（ｉｉｉ）配列の数 ：２１ （ｉｖ）通信先住所： （Ａ）受信人、プロラグマン・アンド・ピングトフト（Ｂ）町名：　サンクト・ アナエ・ブラズ１１（Ｃ）都市名：　コペンハーゲン （Ｅ）国名：　テンマーク （Ｆ）郵便番号：　ＤＫ−１０２１ （Ｖ）コンピューター読み取り形式： （Ａ）媒体タイプ・　フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター・　ＩＢＭ　Ｐ Ｃ互換性有り（Ｃ）オペレーティングンステム・　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア・　パテントイン・リリース＃ｌＯ、バージョン＃１２５（ ｖｉ）最新出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類・ （ｖｉｉｉ）代理人／エージェント情報：（Ａ）氏名：　プロラグマン、オリ （Ｃ）証明書／ドケット番号：　３２９７５１ＭＫＡ／５ＰＫ（ｉｘ）テレコミ ュニケーンヨン情報：（Ａ）電話＋　４５　３３　１１　０５　６６（Ｂ）テレ ファックス：　４５　３３　１１　１８　８７（Ｃ）テレックス：　１８３３３ （Ｄ）トポロジー・　直線 （Ａ）ライブラリー　テンサイラムダＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーＭ刀緑醐ｍ 品π膿ｍ品品品品島　９６６（２）配列番号２に関する情報。

（ｉ）配列特性。

（Ａ）長さ・　２６４アミノ酸 （Ｂ）タイプ、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　蛋白 （ｘｌ）配列内容　配列番号２ （２）配列番号３に関する情報： （ｉｆ）分子タイプ：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）本来の供給源： （Ａ）生物：　ベータ・ブルガリス （Ａ）ライブラリー：　テンサイＥＭＢＬ３ゲノムライブラリー（Ａ）名称／キ ー：　ＣＤ５ ＣＢ）ロケーノヨン：　３５６．．６９１ｎχαπに１ｃＩＩｌ；ＴＯＣ”にａ λンにλπＣλスαλ罫αｅ買にλ＝αゴゴ　６６０（Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ：　ＤＮＡ（ゲノム）（Ｂ）ロケーション、接合個所（４６ ９，，８７４，１２６３，，１６６０）ＧへへＴＴＧＴＩＩ；ＴＣＴＡＡＡＴＣ ｒＡＴＴ　ＡＴコＴＧＧ〜ｒＰゴＣＡＡＡＣＣＡＡ’Ｄ　ＡＴＡＴＴ（−〜ｍ　 ＡＱｒＡＴＭＴＧ　k：８０ ａ刃Ｍ倶π＾論αλ猜に込罰了詰ＡＡＴＴ７１１ＡＴ罠〜犠αχπｍ臥ａ丁罠ａ λπ　１１４０（ｘｉ）配列内容・　配列番号６： Ｍａｔ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｌｍ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｋ ｌａ　Ｌａｕ工１ｅ　Ａｌａ　ＶａＬ　Ａｌａ　Ｃｆ５１　５　ｎｏ　１５ Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓａｒしｙ　Ｖａ ｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｆｈｅ　ＰｈｅＡｓｎＧｌｙ　工１ｅ　Ｉｌｅ　 Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　５ａｒ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｃｙｓに、ａ　Ｇｌｙ　Ｌ ｙｓ　Ｓｉｒ　Ｆｈａ　ＴｙｒＴｈｒ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　論ユ Ｓａｒ　Ａｌａ　ｔａｕ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｒ＋　Ｐｈｅ 　Ｇｌｙｌｏｏ　１０５　１１０ Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　 Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ１１５　１２０　Ω ５ Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＫＬｓ　Ｐｈｉ　 Ｃｙｓ　輩ＫＬａ　ａｌｕ　Ｇｌｕ工１ａＡＬａ１３０　Ｌ３５　１４０ Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＬｙｓ　Ｇｉｎ　Ｔ ｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　ＩＩｓ　Ｔ ｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　ＡｓｎＴｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｉａ　Ｇｌ ｙ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｘ１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｉ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　し薊Ａｓｎ　 Ａｌａ　Ｆ’ｒ。

Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｐにｒ　ｖａｔ　工１ｅ　Ｎａ 　Ｐｈａ　ＬＹＳ　ＴｈｒにＬａ　Ｆｌｈａ　ＴｒｐＦｌｎｅ　Ｔｒｐ　Ｍａｔ 　Ａｓｒ＋　Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ｈｉｓ　Ｓａｒ　Ａｒｑ　Ｋｌｅ　Ｖａｌ　Ｓａ ｒ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐ■■ Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｉｌａ　Ａａｎ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＴｈｒ　Ｐｒｏ　Ａ ｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｒｑ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　’ Ｉｈｒ　Ｇｌｎ　Ｔ）τＣｙｓ　Ａｓｎ（２）配列番号７に関する情報： （１）配列特性・ （Ａ）長さ：　１１０６塩基対 （Ｂ）タイプ：　核酸 （Ｃ）鎖形態：　２本 （Ｄ）トポロジー、直線 （１１）分子タイプ：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）本来の供給源・ （Ａ）生物・　ベータ・ブルガリス （Ｂ）株　モノバ （Ｆ）組織タイプ・　葉 （ｖｉｉ）１！接供給源： （Ａ）ライブラリー、テンサイラムダＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリー（Ｂ）クロ ーン：　ｒｓＥＪｃＤＮＡクローン（ｉｘ）特徴。

（Ａ）名称／キー　ＣＤ５ （Ｂ）ロケーノヨン：　１８．．８９６（ｘｌ）配列内容　配列番号７ 二縣　１１０６ （２）配列番号８に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ　２９３アミノ酸 （Ｂ）タイプ・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （ｉｉ）分子タイプ　蛋白 （ｘｉ）配列内容・　配列番号８： ｍｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｉｌ＠ｖａｔ　ｓａｒ　Ｖａｔ　ＬｅｕＰｂｅ 　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓａｒ　Ｔｘｘ　Ｌｓｕ　工１ｅＦ’ｈ＠　ＡＸａ　ｋ　Ｐ ｈｉ　Ｇｌｕ　ｓａｒ　ｓｅｒ　Ｈｌｓ　ｃｌｙ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌａ　Ｖ ａｌ　Ｉｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈ１ｐ２０２５コ０ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｉｘｘ　 Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ：１５　４０　４５ Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｉｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　 Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＧｌｙＧｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐ ｒｏ　Ａｌａ　’Ｌｐｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓ■ Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓ４ｗＬｅｕ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　Ｔ ｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＩＬｅＥ１５　９０　９５ ＬＹＳ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　ｔａｕ　５ａｒＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ａ ＳｐＡ５Ｐ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　γＬａｕ　Ｔ ｒｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　’ｒｙｒ’Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　 Ｓａｒ　’Ｉｈｒ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ 　Ｌｅｕ　Ａ■■ ｌｌｏ　１３５　１４０ ＧＬｙ　Ｉｌａ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　工１ａ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　 Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｔｍ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ−Ａｌａ　ｋｑ　Ａ ｌａ　Ｌｍ　ＡＬａ　Ｇｕｙ　Ｈｌｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＬＹ Ｂ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＴｌτＬａｕ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＦＰｒｏ　Ｇｉ ｎ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｉｓａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｓａｒム町９「計Ａｌ ａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｍ　Ｆｈｅ　Ａｇｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ 　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｆ’ｎａ　）τＡｓｎＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐ！℃Ｃｙ ｓ　Ｇｉｎ　Ｔｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌａｕ 　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　５ａｒ２１０　２Ｌ５　２２０ Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　 Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｉｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐに１（２）配列番号９に関す る情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：　１２４９塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）鎖形態　２本 （Ｄ）トポロジｍ：　直線 （１１）分子タイプ　ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）本来の供給源： （Ａ）生物、ベータ・ブルガリス （Ｂ）株：　モノバ ＣＦ）ｍ織タイプ−葉 （ｖｉｉ）直接供給源。

（Ａ）ライブラリー・　テンサイラムダ−ＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラ１）−（Ｂ ）クローン・　ベーター１．３−グルカナーゼｃＤＮΔクローン（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー・　ＣＤ５ （Ｂ）ロケーンヨン：　３４．．１０４１（ｘｉ）配列内容：　配列番号９ ＣＡＡ　ｃ”ｚ　Ａ（スＣ６αｚＣＭｕταｔコαπＭＣαＣＸａＡ　Ｃ’ａα ＺＡＡＣ１５０Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕにｈ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　ｃｌｙ 　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａａｎ　Ｇｌｙ　ｋｑ　Ｌｅａ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ１８５　じ ０１９５ ＡＡＭＡＪｌｉＭ　１２４９ （２）配列番号１０に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：　３３６アミノ酸 （Ｂ）タイプ：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直線 （１１）分子タイプ：　蛋白 （ｘｉ）配列内容：　配列番号１０ Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｌｅａ　工ｌｌ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ入−Ｖａｌ に―Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　ム１ＰｈｅムシＬ　５　１０　１５ Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｉｌａ　ム凋帥Ｓａｒ　Ｉｌａ　Ｇｉｎ　レジＴｈｒ　Ｇｌｕ 　Ａｌａ　Ｇｉｎ　工Ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｖａ１Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｒｑ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　 ｐｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａ１Ｓａｒ　ＬｅｕＴｙｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ｐｘｑ　ＧＩ Ｙ　ｒｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　ＭｅセＡｒｑ　ＸＬ＠　Ｔ／ｒ　Ａｓｐ　ｐＨ’ ０Ａｓｎ　Ｇ１ｘ＋　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ｕａｘ　ＧＬｎ　Ａｌａ　ＶａＩＡｒｑ 　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ａａｎ工ｌｅ　Ｇｌｙ　ＩＪｕＪｕａＶａｌ　ｐｓｐ　Ｖａ ｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｒｑ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　ａｌ ｙ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　ｃｌｙＡｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＡｒｑＴｒｐ　 Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　附’ｒｙｒ　Ａｌａ　Ｓａ ｒ　Ａｓｎ１ｏｏ　１０５　１１０ 丁１ｅＡｒｇＴｙｒｆｌａＡｌａＶａｌＧｌｙＡｓｎＧｌｕ工１ａＭｅｔｐｒｏ ＡｇｎＡ５ｐＡｌａＧｌｕＡｌａ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　ｒｌｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ａｌａ　Ｍａｔ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｍｎ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａ ｒｑ１コｏ１コ５１４０ Ｓａｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　 Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ工１ａ　ＬＦ　５ｌｊｐｓｐ　ｕｓａ　Ｖａｌ 　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ 　Ｐｂｅ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　５ｉｒＳａｒ　Ｔｙｒ　Ｍａｔ　Ａｓｎ　Ｐｒｏｒ ｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ＰｈｅＬｅｕ　Ｌｙｓ　ｆｉａｘｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　 Ｓａｒ　Ｐｒ。

Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＩｊｕＧＬｎＴｙｒ　Ｇｉｎ　Ｉｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｈ ａ　Ａｓｐ　Ａｌａムｙ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＴｈｒＶａｌ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａ Ｌａし艮Ａｌａ　Ｌｙｓ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　 Ｐｒｏ　工１ａ　Ｖａ１ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｓｉｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｐ ｒｏ　ｅａｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｊｕａ　Ｓａｒ　Ｆ ｈａＳａｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　にｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌ ｙ　シ鴫工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｎＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐ ｒｏ　ｔａｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇ’Ｌｎ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　 Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｐｒ１ｇにムＭｅｔ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａａ ｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｒｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓ ｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ３０５３１０３１５コ２０ シジｈ計り鳩ｎ　Ｌｙｓ　Ｇ坊≧℃−乃τＧ止シ駄Ａｓｎ　Ｆｈａ　Ａｓ噴Ｍ１ ３２５３コ０３３５ （２）配列番号１１に関する情報； （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ　６３１３塩基対 （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）鎖形態：　２本 （Ｄ）トポロン−直線 （ｉｉ）分子タイプ＋　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説・　ノー （ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物　ベータ・ブルガリス （Ｂ）株・　モノバ （Ｆ）組織タイプ：　葉 （ｖｉｉ）＠接供給源・ （Ａ）ライブラリー、　テンサイＥＭＢＬ３ゲノムライブラリー（Ｂ）クローン ：　ゲノムキチナーゼ１クローン（１ｘ）特徴： （Ａ）名称／キー・　不確定 （Ｂ）ロケーション：　３２１４．．４２２７（Ｄ）他の情報：　／注＝「約１ ０００塩基対」（１ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー・　ＣＤ５ （Ｂ）ロケーション：　接合個所（１４２８，，２１７１，４６２１，，４７７ ６，５４０８、，５８２４） （ｘｉ）配列内容、配列番号１１： Ｇ工α羽なｘｕπｍπＱ工ａ儂功Ｘｕηπ℃美国０にπｍ奮ガλπ’；ｍＧ　１ ０Ｂ０τ轡論刀ｍＧＴひＭ父工ω品貫σ■田工品■工旭緑鳩詰ασには貰Ｇｒ　 １１４Ｑ貫口に℃国ＴｋｒｃＮＡｃ′ｒ工噛π）スπ国美品に■品に娼Ｍ執閣。

部品　２Ｂ８゜ＧＫ国に工ＱＱにＭ工にロ：フＱ１立η℃漬胃Ｃ−ワク１ＧＡＡ ＧＪ＾Ｃ℃論　４６８゜αα刀α；罠πλχり＾ユ＝ロ田ＧΩ工πコπにＮαα Ｃゴに心σπココχλＣ４７４０１１りＪａＩ７ｎコ’ｒ：ｈａズ；　６３ヱコ （２）配列番号１２に関する情報： （１）配列特性： （Ａ）長さ・　４３９アミノ酸 （Ｂ）タイプ、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー−＠線 （１１）分子タイプ：　蛋白 （ｖｌ）本来の供給源・ （Ａ）生物：　ベータ・ブルガリス （Ｆ）組織タイプ、葉 （ｘｌ）配列内容、配列番号１２： ８１セＬｙｍ　Ｉｌ＠　Ｌｙｓ丁ｈｒ　ｅａｒ　Ｐｒｏ　５ａｒ　け緯ムＩＬＬ 　Ｌａｕ　ＧＬｙムｙｘλ−Ｃｙｓ　Ｌａｕ５　ＬＯ１５ Ａｌａ　Ｌａｕ　ＶａｌｌＡｌｕ　Ｌ＃Ｊ−Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｕｙ　Ｖａｌ　 Ｇｉｎ　Ｃｙｍ　Ｇｌｙ　Ａｒ＋７　Ｇｉｎ　ｃｙｍＡｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｇｎ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｓｗ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｓｕｒ　Ｖ ａｎ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

コ５　４０　４５ Ｓａｒ　ｆｉｘｑ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ 　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＰｒB Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ｈＦ’ｒｏ　肋Ｐｒｏ　Ａ ｒｇ　Ｐｒ６　Ｐｒｏ　Ｔｔ＋ｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｘ′ｏｐ ｒｏ　’ｒｈｒ　ｐｒｏ　ｆｉＸｑ　ｈフＰｒｏ　ＰｒＱ　ｐｒｏ　Ａｒｇ　ｐ ｒｏ　Ｐ’ｒＯ１ｎπ゛Ｐｒ。

Ａｒｑ　イ℃Ｐｍ　ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　Ｐｒｏゝｋ　Ｐｒｏ　ｋｌＰｒｏ　Ｐｌ ’ＯＰＩ”ＯＰＩＯ＄　ｐＨＰｒ。

ｋＰｒｏＡｒｇＰｒｏＰｒｏＰｒｏＰｒｏＰｒｏ丁ｈｒＦ’ｒｏ八ｒｇＰｒｏＰ ｒｏｐｒｏＰｒｏＰｒ。

１１５へ　１２０　１２５ τｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

１コ０１１５１４０ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　 Ｓａｒ　Ｐｒｏ　ｈ℃Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｅ’ｒｏ　５ａｒｘ４５　１５０　１５ ５　Ｌ６゜ Ｗｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔ ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　丁１ｙＰｒ。

Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　ム閏Ｔｈｒ　〜や工１ｅ工ｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｕ　ＭａセＰｈａ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｐｈ５１８０　１１１５　Ｌ９０ １ＪＬＩ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　工ｉｓ　Ｇｉｎ　Ｐ’ｒｏ　Ａｒ９ＣＹＩ ！　ｐｒｏ　ＧｌｙＡ＋”９　Ｔｒｐ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　丁■■ Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ａｈａ　Ｐｈａ工１ａ　Ｔｈｒ　Ａｌａに（ａ　Ｇｌｕ　Ｔｈ ｒ　Ｆ’ｈ＊　Ｐｔｏ　Ｇｌｕ　Ｗｈｏ　Ｇｌｙ　ＡａｎＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ａａ ｎ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ｘ１ｍ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＧＬｕ工１０ムＡｌａ 　Ｐｈａ　Ｐｈａ　（Ｓｌｙ２２５　ｎｏ　２Ｍ　２４０ （２）配列番号１３に関する情報。

（Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　＠線 （ｉｔ）分子タイプ、ペプチド （ｘｉ）配列内容・　配列番号１３ Ａｓｎ　Ｌｓｕ　Ａｓｐ　ＣｙＳＴＹｒ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　ｋ　ｐｒｏ　Ｐｈｅ 　Ｑｌｙ　鳩ｋ　ｔａｕ　ｔａｕ　ＩＪｕＬ　５　１０　１５ ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｌｇｕ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　５ｅｒ　Ｇｉｎ（２）配列番号１４ に関する情報： （１）配列特性 （Ａ）長さ：　１９アミノ酸 （Ｂ）タイプ・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直線 （ｉｆ）分子タイプ　ペプチド （ｖ）フラグメントタイプ：Ｃ−末端 （Ａ）生物　ニコチアナ・タバクム （ｘｌ）配列内容　配列番号１４゜ Ａｓｎ　−Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｆｌｎ ｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　ＶａｌＬ　５　１０　１５ （２）配列番号１５に関する情報 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｃ）鎖形態・　１本 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （Ｖ）フラグメントタイプ、　Ｃ−末端（ｖｉ）本来の供給源： （Ａ）生物：　ニコチアナ・タノくクム（ｘｉ）配列内容、配列番号１５： Ａｓｎ　−Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｍｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　鳩Ｃｙｓ　Ｐｌｍ 　Ａｌａ　ｃ１ｙ（２）配列番号１６に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ−１１アミノ酸 （Ｂ）タイプ、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直線 （１１）分子タイプ：　ペプチド （Ｖ）フラグメントタイプ：　Ｃ−末端（ｖｉ）本来の供給源： （Ａ）生物・　ホルデウム・プルガレ （ｘｉ）配列内容　配列番号１６： 〜ｍＬａユＡＳＰＣ＞唱）τ５ａｒＧ迅綱イ℃昏迫に１１５１゜ （２）配列番号１７に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ・　２３アミノ酸 （Ｂ）タイプ：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、　直線 （ｉｉ）分子タイプ　ペプチド （ｖ）フラグメントタイプ；　Ｃ−末端（ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物二　ニコチアナ・タバクム （ｘｉ）配列内容：　配列番号１７゜ （２）配列番号１８に関する情報・ （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：　１６アミノ酸 （Ｂ）タイプ：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説二　ノー （ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物・　ベータ・ブルガリス （ｘｌ）配列内容　配列番号１８ （２）配列番号１９に関する情報＝ （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ・　１８アミノ酸 （Ｂ）タイプ、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説二　ノー （ｖｌ）本来の供給源。

（Ａ）生物・　ベータ・ブルガリス （＼］）配列内容　配列番号１９゜ （２）配列番号２０に関する情報・ （１）配列特性・ （Ａ）長さ　１０アミノ酸 （Ｂ）タイプ・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説　ノー （ｖｌ）本来の供給源： （、へ）生物：　ベータ・ブルガリス （ｘｌ）配列内容　配列番号２０ （２）配列番号２１に関する情報。

（１）配列特性 （、Ａ）長さ　７アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説　ノー （ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物・　ベータ・ブルガリス （ｘｉ）配列内容　配列番号２１゜ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｍ　Ｇｉｎ工１ｅフｗＴｒｐ（２）配列番号２２に関する情 報： （１）配列特性： （Ａ）長さ：　２２アミノ酸 （Ｂ）タイプ・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直線 （ｉｉ）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説二　ノー （ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物　ベータ・ブルガリス （ｘｌ）配列内容・　配列番号２２： （２）配列番号２３に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ・　４３アミノ酸 （Ｂ）タイプ、　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー。直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説二　ノー （ｉｖ）アンチセンス−ノー （Ｖ）フラグメントタイプ、　Ｎ−末端（ｖｉ）本来の供給源・ （Ａ）生物・　トリチクム・アエスティブム（ｘｉ）配列内容：　配列番号２３ ： （２）配列番号２４に関する情報： （ｉ）配列特性・ （Ａ）長さ＝　４３アミノ酸 （Ｂ）タイプ：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、直線 （１１）分子タイプ：　ペプチド （ｉｉｉ）仮説・　ノー （ｉｖ）アンチセンス二　ノー （Ｖ）フラグメントタイプ・　Ｎ−末端（ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物　へベア・ブラジリエンンス（ｘｉ）配列内容：　配列番号２４： （２）配列番号２５に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：　４１アミノ酸 （Ｂ）タイプ：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジｍ：　直線 （１１）分子タイプ：　ペプチド （ｉｉｉ）仮説−ノー （Ｖ）フラグメントタイプ二　Ｎ−末端（ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物：　ファセオルス・ブルガリス（ｘｉ）配列内容：　配列番号２５： （２）配列番号２６に関する情報： （１）配列特性・ （Ａ）長さ：　４２アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直線 （ｉｉ）分子タイプ；　ペプチド （ｉｉｉ）仮説　ノー （Ｖ）フラグメントタイプ　Ｎ−末端 （ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物　ニコチアナ・タバクム （ｘｌ）配列内容　配列番号２６： Ｃ，ｌｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｇｉｒｌ　Ｍａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ 　Ａｌａ　Ａｒｑ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅ■ ｌ　５　１０　１５ （２）配列番号２７に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ＝　３３アミノ酸 （Ｂ）タイプ、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直線 （ｉｉ）分子タイプ・　ペプチド （ｉｉｉ）仮説二　ノー （Ｖ）フラグメントタイプ、Ｎ−末端 （ｖｉ）本来の供給源】 （Ａ）生物：　ベータ・ブルガリス （ｘｉ）配列内容：　配列番号２７： Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａａｎ　Ｇｉｒｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ 　Ａｌａ　ｔａｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌａ■ ｌ　５　１０　１５ ０ｙ−ａ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　ＧＩＹ　ＴＱ　ｃｙｓ　ＧＩＹ　 Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＧＡＹ（２）配列番号２８ に関する情報・ （ｉ）配列特性・ （Ａ）長さ、　３２塩基対 （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）鎖形態：　１本 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉＤ仮説、　イエス （１ｖ）アンチセンス、　ノー （ｖｉ）本来の供給源 （Ａ）生物：　プライマー（ＫＢ−７）、ベータ・ブルガリスから構築（ｘｌ） 配列内容　配列番号２８ ＧへσにτＮン込ＡＹα５０コσＧ　ＹＣＡＲ１ｒＡＹＧ八Ｙ　ＡＣ１２（２） 配列番号２９に関する情報 （１）配列特性。

（Ａ）長さ−２６塩基対 （Ｂ）タイプ、核酸 （Ｃ）鎖形態・　１本 （Ｄ）トポロジー　直線 （４ｉ）分子タイプ　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説　イエス （ｉｖ）アンチセンス・　ノー （ｖｌ）本来の供給源 （Ａ）生物　プライマー（ＫＢ−９）、ベータ・ブルガリスから構築（ｘｌ）配 列内容、配列番号２９ ［Ｆ］烏＝島凄ＹＣＡ涌酊　２【 （２）配列番号３０に関する情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ　３４塩基対 （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）鎖形聾　１本 （Ｄ）トポロジー　直線 （１］）分子タイプ　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮説　イエス （ｖｌ）本来の供給源 （Ａ）生物　プライマー（２７０） （ｘｉ）配列内容　配列番号３０ （２）配列番号３１に関する情報 （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ、　２９２アミノ酸 （Ｂ）タイプ、アミノ酸 （ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物　ククミス・サティブス （ｘｉ）配列内容　配列番号３１゜ Ｔｈｐ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓａｗ　Ｌｙｓ　ｔａｕ　 Ｔｙｒ　ｈ比ＧＬｙ−コ８℃に五に−（２）配列番号３２に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：　３０２アミノ酸 （Ｂ）タイプ・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直線 （１１）分子タイプ・　ペプチド （ｉｉｉ）仮説・　ノー （１ｖ）アンチセンス二　ノー （ｖｉ）本来の供給源。

（Ａ）生物・　アラビドプシス・タリアナ（ｘｉ）配列内容：　配列番号３２ ＩＩｓ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　ｔａｕ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　 Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｓａｒ　ｋｑ　ＧＩＹ　ＧＩＹ　ｌ１ｅＰｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓ ｎ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ｒＡＪＡｓｎ　Ｌａｕ　Ａｌａ 　Ｇｌｙ　）ｕｓ　Ｃｙｓ　ＡｓｎＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ工１ａ　Ｇｌｙ　Ｓ ａｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａ ｓｐ　Ｔｙｒ１１５　１２０　ｕｓ （１）配列特性 （Ａ）長さ　９アミノ酸 （Ｂ）タイプ、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説二　ノー （ｖｌ）本来の供給源。

（Ａ）生物・　ベータ・ブルガリス （ｘｉ）配列内容、配列番号３３・ （２）配列番号３４に関する情報 （１）配列特性： （Ａ）長さ・　２０アミノ酸 （Ｂ）タイプ：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説　ノー （ｖｌ）本来の供給源 （Ａ）生物：　ベータ・ブルガリス （ｘｉ）配列内容　配列番号３４： Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐ！−ｏＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ工ｌｅ　Ｖａｌ　Ｖ ａｌ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｐｒ。

Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｇｕｙ　Ｇｌｙ （２）配列番号３５に関する情報 （ｉ）配列特性・ （Ａ）長さ・　６アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説　ノー （−１）本来の供給源・ （Ａ）生物　ベータ・ブルガリス （ｘｌ）配列内容、配列番号３５： ＩＪｌｕＧｌｒ＋　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓａｒ（２）配列番号３６に関す る情報・ （ｉ）配列特性。

（Ａ）長さ・　１７塩基対 （Ｂ）タイプ：　核酸 （Ｃ）鎖形態：　１本 （Ｄ）トポロジー：　直線 （ｉｔ）分子タイプ：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｆｉｔ）仮説：　イエス （ｖｉ）本来の供給源： （Ａ）生物：　プライマー（ＴＯ−１）、ベータ・ブルガリスから構築（ｘｌ） 配列内容・　配列番号３６゜ （２）配列番号３７に関する情報・ （ｉ）配列特性・ （Ａ）長さ、　１７塩基対 （Ｂ）タイプ：　核酸 （Ｃ）鎖形態：　１本 （Ｄ）トポロジｍ：　直線 （ｉｉ）分子タイプ・　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説　イエス （ｖｌ）本来の供給源： （Ａ）生物：　プライマー（ＴＧ−２）、ベータ・ブルガリスから構築（ｘｉ） 配列内容　配列番号３７ ＭＹＧＡＲｊの仏πα工込　１７ （２）配列番号３８に関する情報： （１）配列特性 （Ａ）長さ　１７塩基対 （Ｂ）タイプ・　核酸 （Ｃ）鎖形態・　１本 （Ｄ）トポロジｍ：　直線 （ｉｉ）分子タイプ：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説・　イエス （ｖｉ）本来の供給源： （Ａ）生物：　プライマー（ＴＧ−３）、ニコチアナ・タバクムおよびホルデウ ム・プルガレから構築 （ｘｉ）配列内容：　配列番号３８゜ ｍ　℃（ＣＰＡ　１７ （２）配列番号３９に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：　６アミノ酸 （Ｂ）タイプ、　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、　直線 （１１）分子タイプ：　ペプチド （ｉｉｉ）仮説、ノー （Ｖ）フラグメントタイプ　Ｎ−末端 （ｖｉ）本来の供給源 （Ａ）生物、ホルデウム・プルガレ （ｘｌ）配列内容　配列番号３９ （２）配列番号４０に関する情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ　６アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説　ノー （ｖｉ）本来の供給源： （Ａ）生物：　ニコチアナ・タバクム （ｘｉ）配列内容：　配列番号４ｏ： （２）配列番号４１に関する情報＝ （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：　２３アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジｍ：　直線 （ｉｉ）分子タイプ・　ペプチド （ｉｉｉ）仮説、ノー （Ｖ）フラグメントタイプ　Ｎ−末端 （ｖｉ）本来の供給源 （Ａ）生物・　ビスム・サティブム （ｘｌ）配列内容：　配列番号４１ （２）配列番号４２に関する情報： （１）配列特性、 （Ａ）長さ　１５アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説・　ノー （Ｖ）フラグメントタイプ：　Ｎ−末端（ｖｉ）本来の供給源 （Ａ）生物　ピスム・サティブム （Ｘｌ）配列内容：　配列番号４２ Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｘａａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ （２）配列番号４３に関する情報・ （１）配列特性・ （Ａ）長さ、　１６アミノ酸 （Ｂ）タイプ、　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ、ペプチド （ｉｉｉ）仮説　ノー （Ｖ）フラグメントタイプ、　Ｎ−末端（ｖｌ）本来の供給源 （Ａ）生物　ピスム・サティブム （ｘｉ）配列内容・　配列番号４３ （］）配列特性 （Ａ）長さ　２２アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｊ）仮説　ノー （＼・）フラグメントタイプ　Ｎ−末端（ｖｌ）本来の供給源。

（Ａ）生物・　ホルデウム・プルガレ （ｘｉ）配列内容：　配列番号４４・ （２）配列番号４５に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ・　２３アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポコノ−。直線 （ｉｉ）分子タイプ：　ペプチド　− （ｉｉｉ）仮説：　ノー （Ｖ）フラグメントタイプ　Ｎ−末端 （ν１）本来の供給源・ （Ａ）生物　ホルデウム・プルガレ （ｘｌ）配列内容　配列番号４５ （２）配列番号４６に関する情報。

（ｉ）配列特性・ （Ａ）長さ　１８アミノ酸 （Ｂ）タイプ・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｊｉ）仮説　ノー （ｖｉ）本来の供給源 （Ａ）生物：　ニコチアナ・タパクム （ｘｌ）配列内容：　配列番号４６： Ｕａ　Ｉｌｅ　Ｓｌｙ　Ｖａｌ　ＡｓｐＬ＃ＬＩＬａｕ　Ａｓｎ　Ａｓｈ　Ｐｒ ｏ　Ａｓｐ　Ｌｓｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＡｓｐＬ　５　１０　１５ Ｐｒｏ　Ｖａｌ （２）配列番号４７に関する情報 （１）配列特性： （Ａ）長さ・　７アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ：　ペプチド （ｉｉｉ）仮説　ノー （ｖｌ）本来の供給源・ （Ａ）生物　ニコチアナ・タバクム （ｘｌ）配列内容　配列番号４７・ （２）配列番号４８に関する情報・ （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ　１２アミノ酸 （Ｂ）タイプ・　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線 （１１）分子タイプ　ペプチド （ｉｉｉ）仮説　ノー （ｖｉ）本来の供給源 （Ａ）生物　ニコチアナ・タバクム （ｘｌ）配列内容　配列番号４８ Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｆｈａ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　 Ｇｉｎ　ｆｅａｒ　Ｐｒ。

（２）配列番号４９に関する情報・ （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ、　４２塩基対 （Ｂ）タイプ・　核酸 （Ｃ）鎖形態・　１本 （Ｄ）トポロジー　直線 （ｉｉ）分子タイプ　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説　イエス （ｖｉ）本来の供給源。

（Ａ）生物　プライマー（ＫＢ−３）、ベータ・ブルガリスがら構築（ｘｌ）配 列内容・　配列番号４９ 扉瞭コＣ−ＡＴＣｒＡＡＡＣＡ　ＡＣＭＣＡＴＧｒＣＴＴＣＴ／ＴＹＧＣＡ　Ｃ Ｏ４２（２）配列番号５０に関する情報 （１）配列特性。

（Ａ）長さ　２１塩基対 （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）鎖形態　１本 （Ｄ）トポロジー＝ｌＩ線 （１１）分子タイプ　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：　イエス （ｉｖ）アンチセンス　イエス （ｖｉ）本来の供給源 （Ａ）生物　プライマー（Ｋ　Ｂ　−４）、ベータ・ブルガリスがら構築、キチ ナーゼ４ （ｘｌ）配列内容：　配列番号５０： に０α＆ωα緬σｍＧ （２）配列番号５１に関する情報。

（ｉ）配列特性 （Ａ）長さ・　１９塩基対 （Ｂ）タイプ・　核酸 （Ｃ）鎖形態・　１本 （Ｄ）トポロジー：ｉ［線 （１１）分子タイプ・　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説　イエス （１ｖ）アンチセンス　イエス （ｖｌ）本来の供給源 （Ａ）生物　プライマー、ベータ・ブルガリスから構築、キチナーゼ４（ｘｌ） 配列内容・　配列番号５１： ＣＡＴＩＩ；ＧＡＧＧＡ　ｒｃＯｃｒＡＣＣ１９時間（分） ａｂｃｄｅｆｇｈ ｃｐｍ ５００τ。

フ 時間（時） 時間（時） 時間（時） 時間（時） 緊デ Ｆｉｇ、　５Ａ ロ ロ く　口　Ｑ　− ロ ロ ロ ロ 言 巨 言 口 謬　寸 烟　で ｑコ 蛋白　（２８０ｎｍ） 時間（分） ・　・ 書 〒１ ζｑ １：感染 Ｃ１対照 ０−　←　（コ　ｌ　７ 〇−←　〔−コ　ｔＷ　＜　Ｉ　）Ｃ１（Ｊ　＜ＣＪ＜ｃＩ＋Ｑ−”ｐ−一＜ｘ 口 ｘ：Ｌｌ←−ロロ＞Ｃ：Ｊｕ　’ ＬＬ（１）ＬＥ−：（＜口２ −−Ｘ＆ｌ＋ＩＩ＋＋■■す 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (72)

【特許請求の範囲】
1. （１）配列番号１に示されたテンサイキチナーゼ４ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列 またはその類縁体であって、前記類縁体が、上記テンサイキチナーゼ４の抗菌活 性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、ｉ）配列番号１に示さ れたＤＮＡ配列の特徴的部分であるか、またはｉｉ）「材料および方法」の項に おいて「キチナーゼ４遺伝子群に属するＤＮＡの同定」という標題で記載された 要領で、明記された条件下５５℃で配列番号１に示されたＤＮＡ配列とハイブリ ダイズするか、またはｉｉｉ）配列番号２に示されたテンサイキチナーゼ４のア ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするか、または ｉｖ）テンサイキチナーゼ４に対して産生した抗体との反応性を示すポリペプチ ドをコードする ものである、ＤＮＡ配列。
2. （２）配列番号１に示されたキチナーゼ４ＤＮＡ配列のヌクレオチド７１−７９ ３を含み、テンサイキチナーゼ４酵素のヘベインドメインおよび機能ドメインを コードする、請求項１記載のＤＮＡ配列または前記ＤＮＡ配列の類縁体。
3. （３）テンサイキチナーゼ４酵素の機能ドメインをコードする配列番号１に示さ れたキチナーゼ４ＤＮＡ配列のヌクレオチド１７５−７９３を含む、請求項１記 載のＤＮＡ配列または前記ＤＮＡ配列の類縁体。
4. （４）テンサイキチナーゼ４遺伝子を含むＤＮＡ配列。
5. （５）配列番号１のＤＮＡ配列によりコードされるテンサイキチナーゼ４酵素と の相同性が少なくとも６０％であり、配列番号１１に示されたＤＮＡ配列により コードされるテンサイキチナーゼ１との相同性が多くとも４０％であるキチナー ゼイソ酵素をコードするＤＮＡ配列。
6. （６）配列番号１のＤＮＡ配列によりコードされるテンサイキチナーゼ４酵素と 少なくとも６５％の相同性、例えば少なくとも７０％の相同性、例えば少なくと も７５％または好ましくは少なくとも８０％の相同性、および／または配列番号 １１のＤＮＡ配列によりコードされるテンサイキチナーゼ１と多くとも３８％、 例えば多くとも３５％の相同性を示す、キチナーゼイソ酵素をコードする、請求 項５記載のＤＮＡ配列。
7. （７）配列番号５に示されたゲノムキチナーゼ７６配列を含む、請求項５または ６記載のＤＮＡ配列。
8. （８）テンサイキチナーゼ４に対して産生する抗体とは反応するが、テンサイキ チナーゼ２に対して産生する抗体とは反応しないポリペプチドをコードする、請 求項１−７のいずれか１項記載のＤＮＡ配列。
9. （９）少なくとも１つのヌクレオチドが欠失、置換または修飾されているか、ま たは少なくとも１つの追加的ヌクレオチドが挿入されていることにより、テンサ イキチナーゼ４の抗菌活性が保持されているか、またはテンサイキチナーゼ４と 比べて高い抗菌活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１−８のいずれ か１項記載のＤＮＡ配列を含む修飾ＤＮＡ配列。
10. （１０）テンサイキチナーゼ４酵素の活性部位を含むポリペプチドをコードする ＤＮＡ配列、例えば下記ペプチド 【配列があります】 またはテンサイキチナーゼ４の活性部位に含まれるテンサイキチナーゼ４酵素の 一部を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、例えば活性部位に含まれるペ プチド 【配列があります】 またはペプチド 【配列があります】 をコードするＤＮＡ配列またはその類縁体（ただし、少なくとも１つのヌクレオ チドが欠失、置換または修飾されているか、または少なくとも１つの追加的ヌク レオチドが挿入されており、前記ペプチドの場合と同じ触媒および／または結合 活性を有する）を含む配列番号１のキチナーゼ４ＤＮＡ配列の部分配列。
11. （１１）テンサイキチナーゼ４酵素のヘベインドメインを含むポリペプチドをコ ードする配列番号１のキチナーゼ４ＤＮＡ配列の部分配列、または少なくとも１ つのヌクレオチドが欠失、置換または修飾されているか、または少なくとも１つ の追加的ヌクレオチドが挿入されている前記部分配列の類縁体であって、「キチ ンカラムの製造」という標題で「原材料および方法」に記載されている要領で製 造された再生キチンにおいてアフィニティー・カラムクロマトグラフィーにより 測定されたところではキチンに結合し得るポリペプチドをコードする部分配列。
12. （１２）キチナーゼ４の先導ペプチドをコードする配列番号１のキチナーゼ４Ｄ ＮＡ配列の部分配列または少なくとも１つのヌクレオチドが欠失、置換または修 飾されているか、または少なくとも１つの追加的ヌクレオチドが挿入されており 、融合した先導およびパッセンジャーポリペプチドが製造される細胞からそれが 融合しているパッセンジャー・ポリペプチドを指令して細胞外空間に堆積させ得 るその類縁体。
13. （１３）テンサイキチナーゼ４酵素の下記エピトープ：ペプチド１：【配列があ ります】 ペプチド２：【配列があります】 ペプチド３：【配列があります】 ペプチド４：【配列があります】 の１つまたはそれ以上をコードする配列番号１に示されたキチナーゼ４ＤＮＡ配 列の部分配列。
14. （１４）植物に由来するものである、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＤＮ Ａ配列。
15. （１５）シェノポディアセアエ、ソラナセアエ、アピアセアエ、ブラシカセアエ 、ククルビタセア工またはファバセアエ科の一員から誘導される、請求項１４記 載のＤＮＡ配列。
16. （１６）トウモロコシ、アルファルファ、カラス麦、小麦、ライ麦、米、大麦、 モロコシ、タバコ、綿、テンサイ、飼料ビート、ヒマワリ、ニンジン、インゲン マメ、シュニール、トマト、ジャガイモ、大豆、脂肪種子菜種、キャベツ、コシ ョウ、レタスおよびエンドウから誘導される、請求項１５記載のＤＮＡ配列。
17. （１７）請求項１〜１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列によりコードされるポ リペプチド。
18. （１８） １）機能し得るように結合したプロモーター、２）キチナーゼ４ＤＮＡ配列を含 む請求項１〜１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列またはその類縁体または部分 配列 ３）ＤＮＡ配列に機能し得るように結合した転写ターミネーターを含む遺伝子構 築物。
19. （１９）配列番号１に示されたキチナーゼ４ＤＮＡ配列を含む請求項１−１６の いずれか１項記載のＤＮＡ配列またはその類縁体または部分配列の１つまたはそ れ以上のコピー、 テンサイキチナーゼ４とは異なる第２キチナーゼの活性を有するポリペプチドを コードするＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上のコピー、および／またはβ−１， ３−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の１つまた はそれ以上のコピー を含み、ＤＮＡ配列の各々が、ＤＮＡ配列を機能的ポリペプチドに発現させ得る プロモーターおよび転写ターミネーターに機能し得るように結合されている、遺 伝子構築物。
20. （２０）第２キチナーゼをコードするＤＮＡ配列が、４．０に等しいかまたはそ れ未満のｐＩを有し、好ましくは３Ｈ−キチンを主としてキト６量体に開製し得 る酸性キチナーゼをコードする、および／またはβ−１，３−グルカナーゼをコ ードするＤＮＡ配列が、少なくとも９．０のｐＩを有し、好ましくは３Ｈ−ラミ ナリンを主としてβ−１，３−グルカンの２量体に開製し得る塩基性β−１，３ −グルカナーゼをコードする、請求項１９記載の遺伝子構築物。
21. （２１）第２キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼが植物起源のものであ る、請求項１９または２０のいずれか１項記載の遺伝子構築物。
22. （２２）酸性キチナーゼをコードするＤＮＡ配列が、配列番号８に示されたアミ ノ酸配列を有する酸性テンサイキチナーゼＳＥをコードする配列番号７のＤＮＡ 配列であるか、またはｐＩが多くとも４．０であり、３Ｈ−キチンを主として６ 量体に加水分解し得る酸性キチナーゼをコードする前記ＤＮＡ配列の類縁体であ る、および／または塩基性β−１，３−グルカナーゼをコードする配列番号９に 示されたＤＮＡ配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列を有する塩基性テ ンサイβ−１，３−グルカナーゼ４をコードするＤＮＡ配列、またはｐＩが少な くとも９．０であり、３Ｈ−ラミナリンを主としてβ−１，３−グルカンの２量 体に加水分解し得る塩基性β−１，３−グルカナーゼをコードするその類縁体で ある、請求項２１記載の遺伝子構築物。
23. （２３）プロモーターが構成的または調節可能なプロモーターである、請求項１ ８−２２のいずれか１項記載の遺伝子構築物。
24. （２４）構成的プロモーターが、植物プロモーター、細菌プロモーターまたは植 物ウイルスプロモーターから成る群から選択される、請求項２３記載の遺伝子構 築物。
25. （２５）プロモーターが、テンサイアセトヒドロキシ酸シンターゼプロモーター （ＡＨＡＳ）、テンサイキチナーゼ１プロモーター（この配列は配列番号１１か ら明らかである）から成る群から選ばれる、請求項２４記載の遺伝子構築物。
26. （２６）Ｎ−末端先導配列が、テンサイキチナーゼ１（この配列は配列番号１１ から明らかである）、テンサイキチナーゼ４（この配列は配列番号１から明らか である）、テンサイβ−１，３−グルカナーゼ（この配列は配列番号９から明ら かである）、テンサイキチナーゼ７６（この配列は配列番号５に示されている） およびテンサイ由来の酸性キチナーゼＳＥ（この配列は配列番号７から明らかで ある）の暗号化領域から成る群から選択される、請求項１８−２５のいずれか１ 項記載の遺伝子構築物。
27. （２７）プロリン濃厚領域をコードするテンサイキチナーゼ１由来のＤＮＡ部分 配列を含む、請求項１８−２６のいずれか１項記載の遺伝子構築物。
28. （２８）プロモーターが、アグロバクテリウムのオパインシンターゼ遺伝子のＮ ＯＳプロモーターおよびＯＣＳプロモーターから成る群から選択される、請求項 ２４記載の遺伝子構築物。
29. （２９）プロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモー ター、例えばＣａＭＶ１９ＳプロモーターまたはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、 ＭＡＳ／３５Ｓ、ＭＡＳ２重Ｔｒ１，２およびＴ−２ＤＮＡ遺伝子５プロモータ ーから成る群から選択される、請求項２４記載の遺伝子構築物。
30. （３０）調節可能なプロモーターが、成長因子、化学因子、生物学的因子および 物理的因子から成る群から選択される少なくとも１つの因子により調節され得る 、請求項２３記載の遺伝子構築物。
31. （３１）プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項２３記載の遺伝 子構築物。
32. （３２）転写ターミネーターが、植物転写ターミネーター配列、細菌転写ターミ ネーター配列、菌転写ターミネーターおよび植物ウイルスターミネーター配列か ら成る群から選択される、請求項１８−３１のいずれか１項記載の遺伝子構築物 。
33. （３３）転写ターミネーターが、アグロバクテリウムのオパインシンターゼ遺伝 子のＮＯＳおよびＯＣＳ転写ターミネーター配列、ＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネ ーター配列、ＤＮＡ遺伝子４へのＰＡＤＧ４転写ターミネーター、Ｔ−ＤＮＡ遺 伝子７へのＰＡＤＧ７転写ターミネーターから成る群から選択される、請求項３ ２記載の遺伝子構築物。
34. （３４）構築物のＤＮＡ配列の少なくとも１つが、ＤＮＡ配列（複数もあり得る ）の転写および発現の増加をもたらすエンハンサー配列へ機能し得るように結合 されている、請求項１８−３３のいずれか１項記載の遺伝子構築物。
35. （３５）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物であって、Ｄ ＮＡ配列が、配列番号１に示されたテンサイキチナーゼ４Ｎ−末端配列、配列番 号９に示されたテンサイβ−１，３−グルカナーゼＮ−末端配列、配列番号７に 示されたテンサイ酸性キチナーゼＳＥＮ−末端配列、および配列番号１１に示さ れたテンサイキチナーゼ１Ｎ−末端配列から成る群から選択されるＮ−末端先導 配列をコードするＤＮＡ部分配列に結合している、遺伝子構築物。
36. （３６）植物、特にテンサイ植物の形質転換に使用される、請求項３５記載の遺 伝子構築物。
37. （３７）プロリン濃厚ドメインをコードするテンサイキチナーゼ１からのＤＮＡ 部分配列を含む、請求項１８−３６のいずれか１項記載の遺伝子構築物。
38. （３８）宿主生物で複製し得、請求項１−１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列 または請求項１８−３７のいずれか１項記載の遺伝子構築物をもつベクター。
39. （３９）請求項３８記載のベクターをもつ宿主生物。
40. （４０）請求項１−１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列または請求項１８−３ ７のいずれか１項記載の遺伝子構築物を複製または発現し得る、請求項３９記載 の宿主生物。
41. （４１）ゲノム中に、請求項１−１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列または請 求項１８−３７のいずれか１項記載の遺伝子構築物をもち、ＤＮＡ配列または遺 伝子構築物を複製または発現し得る、宿主生物。
42. （４２）微生物、例えば細菌または酵母である、請求項３９−４１のいずれか１ 項記載の宿主生物。
43. （４３）植物細胞または原形質である、請求項３９−４１のいずれか１項記載の 宿主生物。
44. （４４）ゲノム中に請求項１８−３７のいずれか１項記載の遺伝子構築物を含む 、遺伝子形質転換植物。
45. （４５）トウモロコシ、カラス麦、小麦、米、大麦、ライ麦およびモロコシから 成る単子葉植物の群から選択される、請求項４４記載の遺伝子形質転換植物。
46. （４６）アルファルファ、タバコ、綿、テンサイ、飼料ビート、ヒマワリ、ニン ジン、シュニール、トマト、ジャガイモ、大豆、脂肪種子菜種、キャベツ、コシ ョウ、レタスおよびエンドウから成る双子葉植物の群から選択される、請求項４ ５記載の遺伝子形質転換植物。
47. （４７）請求項１８−３７のいずれか１項記載の遺伝子構築物をもたない植物と 比べてキチン含有植物病原体に対する高い耐性を有する、請求項４４−４６のい ずれか１項記載の遺伝子形質転換植物。
48. （４８）病原菌または線虫に対して高い耐性を有する、請求項４７記載の遺伝子 形質転換植物。
49. （４９）セルコスポラ、リゾクトニア、フサリウム、クラドスポリウム、フィト フトラ、フォーマ、スクレロトニア、アスコキータ、ピレノフォラ、ヘルミトス ポリウム、ウスティラゴ、プッシニア、ラムラリア、ボトリチスまたはベルティ シリウム属の病原菌に対して高い耐性を有する、請求項４７記載の遺伝子形質転 換植物。
50. （５０）リゾクトニア・ソラニ、セルコスポラ・ベティコラ、セルコスポラ・ニ コチアナエ、クラドスポリウム・ヘルバリウム、フィトフトラ・メガスペルマ、 スクレロトニア・スクレロチオルム、ラムラリア・ベティコラ、ボトリチス・シ ネレアおよびフォーマ・リンガムから成る群から選択される病原菌に対して高い 耐性を有する、請求項４９記載の遺伝子形質転換植物。
51. （５１）請求項４４−４９のいずれか１項記載の遺伝子形質転換植物を生長させ ることにより得られる種子、実生または植物の一部分。
52. （５２）請求項１８−３７のいずれか１項記載の遺伝子構築物をもち、遺伝子構 築物を植物のゲノムへ導入し得る少なくとも１つのベクターを含む形質転換系。
53. （５３）バイナリーまたは同時組み込み（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）ベクター 系を含む、請求項５２記載の形質転換系。
54. （５４）植物およびＴ−ＤＮＡ断片の少なくとも１つの境界部分の形質転換を行 わせ得るヴイルレンス機能を含み、前記境界部分が遺伝子構築物と同じプラスミ ドに位置するものである、請求項５２または５３記載の形質転換系。
55. （５５）アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉまたはアグロバクテリウム ・リゾゲネスＲｉプラスミドまたはその誘導体を含む、請求項５２−５４のいず れか１項記載の形質転換系。
56. （５６）植物に感染し、請求項５２−５５のいずれか１項記載の形質転換系をも ち得る徴生物。
57. （５７）アグロバクテリウム類である、請求項５６記載の徴生物。
58. （５８）天然植物の場合と比べてキチン含有植物病原体、例えば植物病原菌に対 する高い耐性を有する遺伝子形質転換植物の製造方法であって、請求項１８−３ ７のいずれか１項記載の遺伝子構築物を植物ゲノムへ移入することにより、前記 構築物を含む遺伝物質を得、続いて遺伝物質を遺伝子形質転換植物へ再生するこ とを含む方法。
59. （５９）遺伝子構築物が、請求項５６または５７記載の徴生物手段により植物へ 移入される、請求項５８記載の方法。
60. （６０）遺伝子構築物が、注射、音波処理またはエレクトロポレーションによる 裸のＤＮＡの直接導入により植物またはその一部へ移入される、請求項５８記載 の方法。
61. （６１）請求項１−１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列または請求項１８−３ ７のいずれか１項記載の遺伝子構築物によりコードされるポリペプチドおよび適 当な賦形剤を含む抗菌組成物。
62. （６２）菌類の治療的および／または予防的処置で常用されている化学物質、例 えば殺菌剤を含む、請求項６１記載の抗菌組成物。
63. （６３）請求項１−１６のいずれか１項記載のＤＮＡ配列によりコードされる１ つまたはそれ以上のポリペプチドまたは請求項１８−３７のいずれか１項記載の 遺伝子構築物を発現させる条件下、適当な培地中に請求項３９−４２記載の微生 物培養し、所望により、微生物を破裂させることによってそれらの発現されたポ リペプチド（複数もあり得る）の内容物を培地中へ放出させ、培地から細胞層を 除去し、所望により、ポリペプチド（複数もあり得る）を含む培地を凍結乾燥ま たは噴霧乾燥に付すことにより、前記ＤＮＡ配列または前記遺伝子構築物により コードされるポリペプチド（複数もあり得る）を含む抗菌組成物を得ることを含 む、抗菌組成物の製造方法。
64. （６４）抗菌性蛋白が培地へ排出され、所望により培地から精製される、請求項 ６３記載の方法。
65. （６５）植物におけるキチン含有植物病原体、例えば植物病原菌の発芽および／ または成長の阻止方法であって、 １）請求項１８−３７のいずれか１項記載の遺伝子構築物により植物またはその 一部を形質転換し、生成した形質転換植物または植物部分を遺伝子形質転換植物 に再生する、および／または ２）植物またはその一部、植物を増殖させる実生または種子、または植物が生育 されている培地を、請求項６１記載の組成物により処理することを含む方法。
66. （６６）請求項６１記載の組成物または請求項６２記載の方法により製造される 組成物を、水または植物に補充する栄養組成物に加えた、請求項６５記載の方法 。
67. （６７）物質に存在するキチン含有植物病原体、例えば植物病原菌の発芽および ／または成長を生物学的に制御する方法であって、微生物の培養物を処理される 物質においてそれ自体確立させ得る条件下、請求項３９−４２記載の徴生物の培 養物で物質を処理することを含む方法。
68. （６８）徴生物が、シュードモナス類またはストレプトマイシス類または生物学 的害虫制御に常用される別の微生物である、請求項６７記載の方法。
69. （６９）物質が植物である、請求項６６または６７記載の方法。
70. （７０）物質における菌類の発芽および／または成長の阻止方法であって、請求 項６１もしくは６２記載または請求項６３もしくは６４記載の方法により製造さ れた抗菌組成物で物質を処理することを含む方法。
71. （７１）処理される物質が、食品、例えばパン、飲料、食品成分、例えば穀類、 または食品、飲料または食品成分用容器の一部である、請求項７０記載の方法。
72. （７２）ブダペスト条約の規則のもと１９９１年７月３０日付けでドイチュ・サ ムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲゼル シャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハツシング（ＤＳＭ）にＤＳＭ６６３５ の受け入れ番号で寄託されたエシェリヒア・コリ株ＤＨ５αに組み込まれた植物 形質転換ベクターｐＢＫＬ４Ｋ４。