PL188190B1

PL188190B1 - Sposób wytwarzania polipeptydu

Info

Publication number: PL188190B1
Application number: PL96360440A
Authority: PL
Inventors: Linden Gledhill; Philip Andrew Greaves; John Patrick Griffin
Original assignee: Smithkline Beecham Plc
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2004-12-31
Also published as: PT835316E; DE69627856T2; EP0835316A1; JPH11508450A; CN1145699C; GB9513403D0; CN1194002A; KR100455054B1; PL186765B1; SI0835316T1; KR19990028533A; PL324225A1; WO1997002349A1; JP3819429B2; US6245524B1; ES2198493T3; AU6417396A; HK1010213A1; DK0835316T3; MX9800212A

Abstract

Sposób wytwarzania polipeptydu posiadajacego aktywnosc ligazy PAA-CoA, obej- mujacy hodowle gatunku Penicillium, obróbke tej hodowli i odzyskiwanie produktu kon- cowego, znam ienny tym, ze hoduje sie gatunek Penicillium, korzystnie Penicillum chry- sogenum, grzybnie zbiera, przeprowadza sie nadzwiekowienie grzybni, usuwa resztki komórek, frakcjonuje sie produkt nadzwiekowienia metoda chromatografii anionowymien nej, a nastepnie chromatografii oddzialywan hydrofobowych, chromatografii jonowo- asocjacyjnej z eluowaniem substratu i chromatografii saczenia przez zel, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne sa wykrywane przy uzyciu oznaczenia zaleznego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A. PL PL PL

Description

Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami:

Przykład 1- Fermentacja P. chrysogenum

Zarodnikami Penicillium chrysogenum (SmithKline Beecham BW 1901) zaszczepiono 15 ml pożywki PVS (35 g/l wyciągu z kukurydzy, 15 g/l glukozy, 5 g/l CaCO₃, 8 ml/l oleju rzepakowego, pH doprowadzone do 5,9 przy użyciu NaOH) w kolbie Erlenmeyera 100 ml. Kulturę hodowano przez 48 h w temperaturze 26°C wytrząsając ruchem orbitalnym (230 obr./min) przed pobraniem 1ml całej brzeczki i przeniesieniem do 10 ml pożywki C5 (35 g/l wyciągu z kukurydzy, 85 g/l laktozy, 10 g/l CaCO₃, 10 g/l NaH₂POą, 8 g/l (NH^SO4, 4 g/l MgSO4 • 7H₂O, 4 g/l Na₂SO4, 6 ml/l oleju rzepakowego, pH doprowadzone do 6,0 przy użyciu NaOH) w kolbie Erlenmeyera 100 ml. Następnie kulturę hodowano przez 55 h w temperaturze 26°C wytrząsając ruchem orbitalnym (230 obr./min) przed zebraniem grzybni.

Przykład 2 - Wytwarzanie ekstraktów protein z P. chrysogenum do oznaczenia, oczyszczenia i blottingu metodą Western ligazy PAA-CoA.

Grzybnie z kolby Erlenmeyera 55 h C% hodowane jak opisano w przykładzie 1 zebrano metodą sączenia przez sączki z mikrowłókien szklanych (Whatman GF/A). Matę grzybni przemyto 300 ml roztworu 0,9% (wag./obj.) chlorku sodowego (4°C), a następnie zdrapano z sączka i umieszczono w 10 ml buforu do oznaczania ligazy (30 mM Tris-HCl pH 9,0,1 mM ditiotreitolu, 100 pg/ml Prefabloc™ w 50% glicerolu). Następnie grzybnię nadźwiękowiono na łaźni lodowej (rozrywanie 3 x 15 s przy użyciu generatora ultradźwięków Ultrasonics model W-385, nastawienie mocy 5, tempo cyklu 5 s, 50% cyklu roboczego), a następnie resztki grzybni sprasowano w pastylkę metodą odwirowania (18000 x g, 4°C, 30 min). Supernatant zamrożono w -70°C do przechowywania albo stosowano natychmiast do oznaczania ligazy PAA-CoA, oczyszczania lub blottingu metodą Western (przykład 7).

Przykład 3 - Oznaczanie ligazy PAA-CoA in vitro.

W celu wykazania obecności aktywności ligazy PAA-CoA w ekstraktach lub frakcjach z chromatografii kolumnowej mieszano 20 pl z roztworem 0,1 M kwasu fenylooctowego w 50 mM Tris-HCl pH 7,5 (20 pl), 0,1 M soli sodowej ATP (10 pl), 0,2 M chlorku magnezowego 10 pl, 0,02 M soli sodowej koenzymu A (10 pl) i 0,015 M ditiotreitolu (10 pl) w plastikowych probówkach Eppendorfa. Probówki mieszano ruchem wirowym (5 s), a następnie umieszczano w łaźni wodnej o temperaturze 30°C na 15 minut. Następnie do mieszaniny dodawano metanol (100 pl) i probówki odwirowywano (14K, 1 min) w celu wytrącenia protein. Frakcje supernatantu analizowano na obecność PAA-CoA metodą HPLC (przykład 4). W każdej serii oznaczeń razem z wzorcem PAA-CoA jako próbę kontrolną dodatnią oznaczano ekstrakt protein wytworzony z fermentacji w kolbie P chrysogenum (przykład 1).

Przykład 4 - Analiza HPLC supernatantów z oznaczenia.

Próbki supernatantów z oznaczeń ligazy PAA-CoA (przykład 3) analizowano na obecność PAA-CoA używając układu HPLC Waters LCM1. Próbki (100 pl) wstrzykiwano na kolumnę sprężającą Radial Pak C18 w temperaturze pokojowej przy szybkości przepływu 2,5 ml/min, używając fazy ruchomej 0,2 M fosforanu sodowego pH 5,4 (Bufor A) izokratycznie od 0-4 min. Następnie stosowano liniowy gradient do 100% Bufora B zawierającego 0,16 M

188 190 fosforan sodowy o pH 5,4 w 40% acetonitrylu (4-10 min). Przez dalsze 2 min utrzymywano 100% Bufora B, a następnie układ ponownie doprowadzano do równowagi przygotowując do następnego wstrzyknięcia przy użyciu liniowego gradientu z powrotem do 100% A (12-13 min). Piki wykrywano przy 260 nm, zaś PAA-CoA miał czas retencji 12 min. Za próbki dodatnie uznawano te, które miały piki współeluujące się ze wzorcem PAA-CoA i wykazywały takie same jak wzorzec widma absorpcyjne UV określone na spektrometrze z zespołem fotodiod.

Przykład 5 - Oczyszczanie ligazy PAA-CoA.

Wymagana była staranność, ponieważ stwierdzono skrajnie labilną aktywność enzymu. Nieskuteczne były próby strącania enzymu siarczanem amonowym, ponieważ w otrzymanym materiale nie można było stwierdzić żadnej aktywności. To samo przez się odróżnia niniejszy enzym od opisanego w WO 96/10085 (Gist-Brocades).

O ile nie stwierdzono inaczej, to następującą u^rocedurę prowadzono zo temp etaturzc 4°C stosując bufor C zawierający 30 mM Tris-HCl, 4 mM DtT, 4 mM EDTA, 5 mM MgCh i 20% glicerolu (obj.) przy pH 9,0. Rozdziały uzyskiwano stosując układ Phacmaoia HiLoad™. Ekstrakt bez komórek (500 ml), wytworzony jak w przykładzie 1, rozmrażano powoli w temperaturze 4°C. Następnie ekstrakt uadtowjono na pH 9,0 stosując 5 M NaOH przy mieszaniu na łaźni lodowej. Do tego mieszanego ekstraktu dodano 275 g żywicy jonowymiennej Q-Ssdhjcose Fast Flow (Pharmacia), którą uprzednio przemyto 3 1 wody, a następnie 1 1 buforu C. Tę mieszaninę mieszano przez 1,5 h na łaźni lodowej. Następnie zawiesinę przesączono przez dalsze 50 g przemytej żywicy Q-Sepharese na spiekanym sączku szklanym pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie żywicę przemyto kolejnymi 100 ml bufora C, a następnie zostawiono aż odciekła do sucha, otrzymując 600 ml klarownego ekstraktu zawierającego ligazę PAA-CoA. Następnie dodano siarczan amonowy (92,4 g, tj. ilość mniejsza niż do strącania) i roztwór mieszano na łaźni lodowej przez 1 h, po czym przesączono (sączek 0,45 pm, Millipere, typ HA).

Następnie ekstrakt ligazy PAA-CoA (700 ml) podano z szybkością 1 ml/min na kolumnę Phenylsepharese 6 Fast Flow o niskim podstawieniu (Pharmacia, 12 cm x 2,6 cm średnicy) uprzednio potraktowaną 1 1 bufora D (jak bufor C ze 140 g/l siarczanu amonowego). Następnie napełnioną kolumnę przemyto 230 ml bufora D z szybkością 0,8 ml/min, a potem sluowαno liniowym gradientem od 100% bufora D do 100% bufora C przez 238 ml z szybkością 0,8 ml/min. Zbierano frakcje po 5,5 ml i testowano na obecność aktywności ligazy PAA-CeA, jak podano w przykładzie 3. Frakcje aktywne, od 41 do 49, zlano razem otrzymując 50 ml, które podano z szybkością 0,5 ml/min na 5 ml kolumnę HiTrap™ Blue do chromatografii dowinowactwa (Pharmacia), uprzednio przemytą 50 ml bufora C. Napełnioną kolumnę przemyto 15 ml bufora C, a następnie eluowauo stosując liniowy gradient od 100% bufora C do 100% bufora E w ciągu 25 ml z szybkością 0,5 ml/min. Bufor E był taki jak bufor C, z dodatkiem kwasu fenylooctowego do otrzymania końcowego stężenia 0,5 M, który donownis nastawiono na pH 9,0 przy pomocy stałego NaOH. Eluowanie z kolumny dowiuowaotwa przy pomocy naturalnego substratu zastosowano dla zwiększenia selektywności oczyszczania i dla umożliwienia pomiaru aktywności enzymu w powstałych frakcjach. Eluowanie NaCl okazało się nieskuteczne, ponieważ ta sól hamowała aktywność enzymu. W przeciwieństwie do tego enzym opisany w WO 96/10085 okazał się stabilny przy eluowaniu w KC1.

Frakcje aktywne 21, 22 i 23 zlano razem otrzymując 6 ml, które następnie rozdzielano przy szybkości przepływu 0,25 ml/min na wysokosprawner kolumnie z wykluczaniem wielkości Ssdhaoryl S-200 (Pharmacia, 64 cm x 2,6 cm średnicy), którą uprzednio równoważono w buforze F (jak bufor C, z nastawieniem na pH 7,5 przy użyciu 5 M HC1). Frakcje aktywne, 54 do 65, zlano razem otrzymując 11 ml, które zatężono do 60 μ1 metodą ułtrαsąozeuia wirówkowego (Centcioou, odcinanie przy ciężarze cząsteczkowym 10000, Amicon Inc.). Analiza frakcji z kolumny wykluczania wielkości metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowymSDS (przykład 6) wykazała proteinę o ciężarze 63 000, której intensywność korelowała z aktywnością ligazy PAA-CoA. Do zakończenia oczyszczania i do umożliwienia sekwsuojeuowania aminokwasów N-terminalnych ligazy PAA-CoA zastosowano Blottmg metodą Western (przykład 6).

188 190

Przykład 6 - Blotting metodą Western proteiny ligazy PAA-CoA.

W celu uzyskania materiału do sekwencjonowania aminokwasów N-terminalnych oczyszczoną proteinę (60 gl, przykład 5) zmieszano z równą objętością bufora próbki SDSPaGe zawierającego 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (10 ml), dodecylosiarczan sodowy (2 g, ultraczysty), 2-merkaptoetanol (1 ml), glicerol (10 ml), destylowaną wodę demineralizowaną (7 ml) i błękit bromochlorofenolowy 0,1% (2 ml). Tę mieszaninę gotowano przez 10 min i zostawiono do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Próbki (5, 15 i 20 gl) załadowano na wylany żel poliakryloamidowy 10% (żel spiętrzający 4%) w kuwecie do elektroforezy Bio-Rad Mini Protean II, przygotowany przy zastosowaniu procedury producenta. Elektroforezę prowadzono w buforze elektrodowym zawierającym 0,025 M Tris, 0,192 M glicyny i 0,1% wag./obj. dodecylosiarczanu sodowego (ultra-czystego) przy 200 V przez 45 min, po czym żel poliakryloamidowy umieszczono w buforze do elektroblottingu (10 mM kwasu 3-[cykloheksyloamino]-1propanosulfonowego, pH 11 w 10% metanolu) na 5 min. Proteiny w żelu poliakryloamidowym przeniesiono na membranę unieruchamiającą Applied Biosystems ProBlott™ przy użyciu kuwety do przenoszenia elektroforetycznego Bio-Rad Mini Trans-Blot zgodnie z procedurą Applied Biosystems. Na zakończenie blottingu membranę zabarwiono błękitem Coomassie R-250 stosując sposób barwienia w procedurze Applied Biosystems. Z membrany wycięto pasmo protein przy 63 kDa i ten materiał zastosowano do ustalania sekwencji aminokwasów N-terminalnych (przykład 7).

Przykład 7 - Ustalanie sekwencji aminokwasów N-terminalnych.

Sekwencję aminokwasów N-terminalnych uzyskano z proteiny po blottingu (przykład 6) stosując Applied Biosystems (ABI) 477A Pulsed Liquid Seąuencer. Sekwencję uzyskano stosując normalną chemię Edmana z rozpoznawaniem uwolnionych aminokwasów znaczonych PTH przy pomocy chromatografii wąskokanałowej ABI 120A. Analiza oczyszczonej proteiny ligazy PAA-CoA dała następujące przypisanie sekwencji: V-F-P-P-K-E-S-G-Q-L-D-P

Przykład 8 - Synteza peptydu N-terminalnego ligazy PAA-CoA.

Sekwencję aminokwasów N-terminalnych określoną z proteiny 63 000 PAA-CoA (przykład 7) zastosowano do syntezy peptydu. Został on zsyntetyzowany przez Peptide and Protein Research Consultants (Washington Singer Laboratories, University of Exeter, Perry Road, Exeter, Devon EX4 4QG, UK) jako 50 mg wolnych peptydów. 12 mg skoniugowano z BSA (albuminą z osocza wołowego) aktywowaną maleimidem przy zastosowaniu SMCC (4-(Nmaleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylanu sukcynoimidylu), a 2,5 mg skoniugowano z OVA (owalbuminą) aktywowaną maleimidem przy zastosowaniu MBS (estrem N-hydroksysukcynoimidowym m-maleimidobenzoilu).

Przykład 9 - Wytworzenie przeciwciał poliklonalnych wobec peptydu pochodzącego z N-końca proteiny 63 kDa ligazy PAA-CoA.

Peptyd sprzężony z BSA (przykład 8) wykorzystano do otrzymania przeciwciał poliklonalnych królika specyficznych wobec proteiny ligazy PAA-CoA. Koniugat peptyd-BSA (375 gg/l) wysterylizowano metodą sączenia (sączek 0,2 gm) i 1 ml sterylnego roztworu starannie zmieszano z 2 ml nie-wrzodziejącego kompletnego adjuwantu Freundsa (Brian Morris International, Guilford, Wielka Brytania). Całkowitą ilość 0,8 ml tej mieszaniny (100 gg koniugatu peptydu-BSA) podano podskórnie nowozelandzkim białym królikom (w przybliżeniu dziesięciotygodniowym) w czterech różnych miejscach iniekcji. Dalsze immunizacje podano w 28 i 58 dniu po początkowej immunizacji jak opisano wyżej, z tym wyjątkiem, ze zastosowano nie-wrzodziejący niekompletny adjuwant Freundsa. Próbki krwi do testów pobrano z brzeżnej żyły ucha w 42 i 72 dniu po początkowej immunizacji dla oceny miana przeciwciał i specyficzności przy użyciu oznaczenia ELISA (oznaczenia immunosorbentu związanego z enzymem) (przykład 10).

Przykład 10 - Oznaczenie immunosorbentu związanego z enzymem (ELISA) do określenia miana przeciwciał i specyficzności wobec ligazy 63 kDa PAA-CoA.

Oznaczenie miana przeciwciał

Płytkę do mikromianowania o 96 zagłębieniach płaskodennych (Nunc MaxiSorp™) pokryto koniugatem peptydu-OVA ligazy PAA-CoA (200 gl na zagłębienie, 0-10 gg/ml) w roztworze fizjologicznym buforowanym fosforanami pH 7,2 (8 g/l chlorku sodowego, 0,2 g/l

188 190 chlorku potasowego, 1,44 g/l diwodoroortofosforanu sodowego, 0,24 g/l diwodoroortofosforanu potasowego, pH 7,2). Pokrytą płytkę do mikromianowania inkubowano w 4°C przez w przybliżeniu 18 h, po czym płytkę przemyto cztery razy buforem do przemywania (10 mM Tris, 0,15 M chlorku sodowego, 0,02% azydku sodowego, 0,05% Tween 20, pH 7,2) przy użyciu urządzenia do przemywania płytek Dynatech MRW. Ten sposób przemywania stosowano w pozostałej części procedury, o ile nie podano inaczej. Do płytki dodano bufor blokujący (1,56 g/l diwodoroortofosforanu sodowego, 0,5% gamma-globuliny wołowej z Sigma, pH 7,4, 200 pl na zagłębienie) i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze Dynatech Varishaker przez 1 h. Wszystkie kolejne inkubacje w 37 °C wykonywano tym sposobem. Płytkę przemyto cztery razy, a następnie do płytki dodano przeciwciało poliklonalne królika (100 pl na zagłębienie, rozcieńczenie 0-1:500000), rozcieńczone w buforze do oznaczenia (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodowego, 1 mM chlorku magnezowego, 0,5% BSA, 0,25% gamma-globuliny wołowej, 0,02% azydku sodowego, pH 7,4), i inkubowano w temperaturze 37°C. Po przemyciu płytki, do płytki dodawano biotynylowane przeciwciało antykrólicze IgG z Amersham (100 pl na zagłębienie, rozcieńczenie 1:5000 w buforze do oznaczenia), i inkubowano w temperaturze 37°C.

Płytkę przemyto i dodano do płytki koniugat streptawidyny z fosfatazą alkaliczną z Amersham (100 pl na zagłębienie, rozcieńczenie 1:2000 w buforze do oznaczenia), i inkubowano w temperaturze 37°C. Po przemyciu płytki dodano do płytki (100 pl na zagłębienie) fosforan p-nitrofenylu (Sigma, 1 mg/ml) rozpuszczony w buforze zawierającym 0,1 M glicyny, (7,51 g/l glicyny, 203 mg/l chlorku magnezowego, 136 mg/l chlorku cynkowego, pH 10,4), i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 min. Następnie dodano do płytki wodorotlenek sodowy (2 M, 50 pl na zagłębienie) i zmierzono absorbancję każdego zagłębienia przy 405 nm stosując czytnik płytek Anthos Labtec. Otrzymano miana przeciwciał pomiędzy 1:500000 i 1:1000000.

Oznaczanie specyficzności przeciwciała

Dla wykazania, że przeciwciała monoklonalne królika mogą reagować z nieskoniugowanym peptydem ligazy PAA-CoA wykonano oznaczenie ELISA jak opisano wyżej, ze zmianą na etapie inkubacji, który wykorzystywał przeciwciała poliklonalne królika. Przeciwciała rozcieńczono 1:100000-1:400000 w buforze do oznaczenia i 50 pl rozcieńczonego przeciwciała dodano do zagłębień zawierających 50 pl nieskoniugowanego peptydu (0-20 pg/ml) przygotowanego w buforze do oznaczenia zawierającym 2-merkaptoetanol (0,01% obj.). Przy stężeniu nieskoniugowanego peptydu w przybliżeniu 2 pg/ml osiągnięto 50% inhibicji reaktywności przeciwciała z koniugatem peptydu-OVA.

Przykład 11- Oznaczenie specyficzności przeciwciała na biotach uzyskanych metodą Western na ligazę PAA-CoA w ekstraktach z Penicillium chrysogenum, E. coli i na oczyszczonych próbkach proteiny.

Ekstrakty wytworzone z hodowli w kolbach Penicillium chrysogenum (BW 1901 i BW 1900A - szczep pochodzący z projektu przypadkowej mutacji), z E. coli JM 109 i z próbek oczyszczonej proteiny ligazy PAA-CoA blottingowano metodą Western jak opisano w przykładzie 6, z tym że nie barwiono membrany błękitem Coomassie. Membrany po blottingu umieszczono w buforze blokującym (1,56 g/l diwodoroortofosforanu sodowego, 8,8 g/l chlorku sodowego, 0,2 g/l ficoll 400, 0,2 g/l poliwinylopirolidonu, 0,5% gamma-globuliny wołowej, pH 7,4) i inkubowano przez około 18 h w 4°C. Następnie membranę przemyto cztery razy buforem do przemywania (10 mM Tris, 0,15 M chlorku sodowego, 0,05% Tween 20, pH 7,2) przed inkubacją (temperatura pokojowa, 60 min) z przeciwciałami poliklonalnymi królika wytworzonymi jak podano w przykładzie 9 i uprzednio rozcieńczonymi 1:100 w buforze do oznaczania (50 mM Tris, 150 mM chlorku sodowego, 1 mM chlorku magnezowego, 0,5% BSA, 0,25% gamma-globuliny wołowej pH 7,4). Po czterech dalszych przemywaniach w buforze do przemywania membranę inkubowano z koniugatem oślej przeciwkróliczej IgG z peroksydazą chrzanu (Bio-Rad, 1:2000 w buforze do oznaczania, 60 min, temperatura pokojowa), a następnie czterokrotnie przemyto buforem do przemywania. Następnie membranę inkubowano z S^ł^:^^^^tem peroksydazy (Bio-Rad Horseradish Peroxidase Conjugate Substrate Kit) przez 10 min w temperaturze pokojowej przed zatrzymaniem reakcji metodą przemycia

188 190 biotu przy pięciu zmianach destylowanej wody zdemineralizowanej. Za wyniki pozytywne uznano te próbki proteiny ligazy PAA-CoA, które miały pasmo przy około 63 000, które współmigrowało z pasmem oczyszczonej ligazy PAA-CoA. W ekstrakcie protein E. coli JM 109 nie wykryto pozytywnego pasma przy 63 Οθ0.

Przykład 12 - Konstrukcja banku cDNA Penicillium chrysogenum.

Bank cDNA Penicillium chrysogenum (szczep SmithKline Beecham BW 1901) skonstruowano według podręcznika do ZAP Express™ cDNA Synthesis Kit z Stratagene. RNA wydzielono ze szczepu BW 1901 jak następuje. Szczep BW 1901 hodowano jak podano w przykładzie 1 przez 40 h przed zebraniem grzybni metodą sączenia przez dwa sączki z mikrowłókna szklanego Whatman GF/A 9,0 cm. Grzybnię przemyto 100 ml DEPC (dietylopirokarbanianu) potraktowanego wodą destylowaną. Następnie grzybnię roztarto w ciekłym azocie stosując moździerz i tłuczek potraktowane DEPC. Zamrożoną sproszkowaną grzybnię przeniesiono do probówki do wirówki 50 ml, zawierającej 10 ml roztworu G (4 M tiocyjanianu guanidyniowego, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA). Proszek zawieszono w roztworze G i zostawiono na łaźni lodowej na 15 min. Resztki grzybni tabletkowano przy 17500 x g w temperaturze 4°C przez 20 min. Supernatant zebrano w innej probówce do wirówki 50 ml i RNA ekstrahowano jak opisali Chomczynski i Sacchi (1987) Analytical Biochemistry 162, 156-159. Z całkowitej ilości RNA wydzielono poliA+ RNA stosując zestaw wirującej kolumny z celulozą CP Laboratories Mini-Oligo (DT) zgodnie z instrukcją producenta. PoliA+ RNA analizowano metodą elektroforezy żelowej jak opisali Sambrook i in. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (wydanie drugie). Pobrano próbki poliA⁴RNA(5 pg) i wykorzystano do syntezy cDNA o podwójnym łańcuchu flankowanego przez miejsce restrykcji EcoRI na końcu 5' i miejsce restrykcji Xhol na końcu 3' cDNA, zgodnie z protokołem syntezy cDNA ZAP Express™ Stratagene. Tak zsyntetyzowane cDNA frakcjonowano zależnie od wielkości przepuszczając przez kolumny wirujące Sephacryl S-400 Stratagene dostarczone z zestawem do syntezy cDNA zgodnie z instrukcją producenta. Frakcjonowane cDNA ligowano do ramion XhoI i EcoRI ZZAP Express zgodnie z podręcznikiem Stratagene. Następnie ligowane ZDNA pakietowano stosując zestaw Gigapack II Gold Packaging Stratagene według procedury z podręcznika. Powstałe bakteriofagi cDNA wzmocniono przez posiewanie na pożywce stałej, inkubując przez 8 godzin. Otrzymano ponad 250000 niezależnych klonów i bakteriofagi eluowano w 20 ml pożywki SM (0,1 M NaCl, 0,01 M MgSOą, 0,05 M Tris-HCl pH 7,5, 0,01% żelatyny) na szalkę Nunc, podzielono i przechowywano jak opisali Sambrook i in. (1989).

Przykład 13 -Badania immunoprzesiewowe banku cDNA.

Bank ZZAP Express cDNA z przykładu 12 badano przesiewowe na klony, które wyrażały proteinę ligazy PAA-CoA 65 kDa, stosując przeciwciała wytworzone jak podano w przykładzie 9. Bank cDNA przesiewano jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże. Bankiem λΖ AP Express w odpowiednim rozcieńczeniu zakazono E. coli szczep XLI Blue MRF'. Zakażone bakterie hodowano przez 4 h na agarozie Luria zawierającej 10 mM MgSOą, 0,2% maltozy i 5 mM IPTG (w celu wzbudzenia ekspresji wstawki cDNA) w temperaturze 37°C przed nałożeniem nitrocelulozy (Hybond-C, Amersham) i inkubowaniem przez noc w temperaturze 37°C. Następnie sączki poddano badaniom immunoprzesiewowym stosując pierwotne przeciwciała królika (przykład 9) w rozcieńczeniach 1/1000, podczas gdy wtórne przeciwciało, kozie przeciwciało przeciwkrólicze skoniugowane z fosfatazą alkaliczną (produkt Sigma A8025) zastosowano w rozcieńczeniach 1/2000. Lokalizację klonów pozytywnych przeprowadzono stosując tabletki BCIP/NBT (fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilu/nitrobłękit tetrazoliowy) zakupione od Sigma (produkt B-5655) zgodnie z instrukcją producenta. Zidentyfikowano i wybrano dwadzieścia cztery klony pozytywne, zawieszono ponownie w buforze SM (5,8 g/l NaCl, 2 g/l MgSOą · 7H₂O, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,01% żelatyny) i powtórnie badano przesiewowe przy niższej gęstości plamek aż do zidentyfikowania sygnału pozytywnego dla jednej plamki.

Przykład 14 - Subklonowanie klonów pozytywnych

Pozytywne klony ZZAP Express cDNA zidentyfikowane w badaniach immunoprzesiewowych (przykład 13) zostały wycięte jako plazmidowe pochodne pBKCMV przy zastoso188 190 waniu bakteriofaga pomocniczego ExAssist i procedury wycinania dostarczonej przez Stratagene. Następnie klony plazmidowe były hodowane (selekcja kanamycyną) i „minipreparowane” jak podali Sambrook i in. (1989) tamże. Następnie otrzymane plazmidy analizowano podwójnymi wyciągami Xbal/Sstl w celu scharakteryzowania wielkości wstawki cDNA klonów. Wstawki cDNA miały wielkość w zakresie od 700 bp (par zasad) do 2,8 kbp, przy największej grupie (12 klonów) posiadających wstawkę o wielkości 2,0 kbp. Plazmidy były również trawione przez Sau3 A (odcinający 4 pary zasad) dla potwierdzenia grup klonów na podstawie podobnych wzorów restrykcji. W ten sposób klony podzielono na 6 grup na podstawie wspólnych wzorów trawienia restrykcyjnego. Następnie reprezentatywne klony z każdej grupy testowano na produkcję proteiny 63 000 ligazy PAA-CoA metodą analizy Western i na aktywność enzymu.

Przykład 15 - Wykazanie pozytywnych klonów cDNA przy użyciu blottingu metodą Western.

Ekstrakty protein z reprezentatywnych wyciętych klonów pozytywnych w teście immunoprzesiewowym wytworzono biorąc hodowlę klonów E. coli hodowanych przez noc w bulionie Luria i kanamycynie (50 pg/ml, IPTG (5 mM) w temperaturze 25°C i dodając równą objętość buforu próbki SDS-PAGE, gotując i poddając elektroforezie jak w przykładzie 6. Następnie proteiny poddano blottingowi metodą Western dla oznaczenia obecności proteiny ligazy PAA-CoA 63 000 (przykład 11). Immunobarwienie membrany wykonano jak w przykładzie 11, z tym że zastosowano koniugat przeciwkróliczej IgG z fosfatazą alkaliczną (rozcieńczenie 1:2000 w buforze do oznaczania), a Substratem fosfatazy był BCIP/NBT w postaci tabletek (Sigma) stosowany zgodnie z instrukcją producenta. Jedną grupę klonów (wielkość wstawki cDNA 2,0 kb) zidentyfikowano jako mającą proteinę 63 kDa (wspólmigrującą z próbą kontrolną BW 1901).

Przykład 16 - Oznaczenie klonów E. coli na aktywność ligazy.

Bulion zawierający komórki E. coli (wyhodowane jak w przykładzie 15) wirowano w chłodzonej wirówce Denley przy 4000 x g w temperaturze 4°C przez 7 min w celu pastylkowania komórek. Supematant odrzucono, a komórki zawieszono ponownie w buforze do oznaczania ligazy (przykład 2) w połowie pierwotnej objętości bulionu. Następnie komórki oziębiono na łaźni lodowej przed nadźwiękowieniem w celu rozerwania komórek. Warunki nadźwiękowienia: Apollo Electronisc Sonicator, nastawienie mocy 5, 50% cyklu roboczego, po 30 s rozrywania przez 7 min na łaźni lodowej. Ekstrakty albo stosowano natychmiast albo przechowywano do użycia w temperaturze -80°C. Aktywność ligazy PAA-CoA wykazano stosując procedurę oznaczania opisaną w przykładzie 3, z tym wyjątkiem że stosowano 40 pl ekstraktu, a mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 60 min w temperaturze 30°C. Obecność PAA-CoA w supematantach oznaczenia wykazano stosując HPLC jak opisano w przykładzie 4 przy uzupełnieniu o detektor zespołu fotodiod Waters 996 do analizy spektralnej. Aktywność ligazy PAA-CoA wykryto w klonie 6,6 (reprezentatywnym dla grupy ze wstawką cDNA o wielkości 2,0 kb) i potwierdzono wytworzenie PAA-CoA przez analizę zespołem diod wobec wzorca PAA-CoA.

Przykład 17 - Sekwencja 5' DNA klonów ligazy PAA-CoA.

Klon 6,6 (= pPEN09) „maksi-preparowano” i DNA oczyszczono gradientami CsCl jak opisali Sambrook i in. (1989). Przygotowano mapę restrykcji pPEN09 wykonując pojedyncze i podwójne trawienie enzymami (fig. 2). Następnie ten klon sekwencjonowano używając startera (5' -ACAGGAAACAGCTAfGAClCTTGG') zakupionego od Cruachem i stosując zestaw Pharmacia T7 według instrukcji producenta. Sekwencja końca 5' wstawki cDNA, pokazana poniżej, pozwoliła sprawdzić, że przetłumaczona sekwencja aminokwasów na N-końcu cDNA odpowiadała sekwencji peptydów otrzymanej poprzednio (przykład 6), z wyjątkiem początkowej metioniny (brakującej z sekwencji peptydów).

18fi 190

TCTAAACCCCGAGATCACCTCAGTTTCCTGCACTTTGGAGACCTGCCC	26
CTATATrrACCCCGAGGATTTGGGAAA	ATG	GTT TTT	TTA CCT	15
				M	V	F	L P	5
CCA AAG	GAG TCC	GGT CAA	TTG	GAC	CCA	ATT	CCC	48
P K	E S	G Q	L	D	P	I	P	16
GAC AAT	ATT CCA	ATC AGC	GAG	TTT	ATG	CTC	AAT	81
D N	I P	I S	E	F	M	L	N	27

Pozostałość pPEN09 sekwencjonowano stosując normalne reakcje terminacji dinukleotydów zawierających 7-deaza dGTP. Jako znacznik stosowano [³⁵S]dATP Reakcje sekwencji analizowano na klinowych żelach poliakryloamidowych 6% zawierających 8 M mocznik [Sanger i in. (1977) PNAS 74, 5463-5467; Chen i Seeburg (1985) DNA 4, 165-170]. Zagnieżdżone delecje tworzono zarówno z końców T7 i T3 stosując nukleazę ExoIII i SI [Henikoff (1984) Gene 24, 351-359]. Klony delecji selekcjonowano wielkością do sekwencjono wania DNA metodą elektroforezy na żelach agarozowych. Wybrane klony sekwencjonowano jak pPEN09. W miarę potrzeb syntetyzowało wewnętrzne startery sekwencjonowania. Kompletną sekwencję wstawki cDNA pokazano na fig. 3. Przetłumaczoną sekwencję protein pokazano na fig. 1.

Porównanie wydedukowanej sekwencji aminokwasów proteiny ligazy PAA-CoA z bazą danych sekwencji protein Narodowej Biomedycznej Fundacji Badawczej (NBRF-PIR) i bankiem danych sekwencji protein SWISS-PROT oprogramowaniem DNASTAR najlepsze dopasowanie dało dla ligazy 4-kumaryniano-CoA ziemniaka. Stosując program DNASTAR megalign (metoda skupisk) ułożono obok siebie proteinę ligazy PAA-CoA i ligazę 4-kumarynianoCoA ziemniaka. Analiza odstępów sekwencji ujawniła 25% podobieństwa aminokwasów pomiędzy dwiema proteinami. Podobne porównanie z syntazami acetylo-CoA grzybów (Penicillium, Aspergillus, Neurospora i drożdży) wykazało tylko 15% podobieństwa.

Ostatnie trzy aminokwasy proteiny ligazy PAA-CoA to seryna-lizyna-izoleucyna. Ta sekwencja aminokwasów odpowiada zgodności do C-terminalnego sygnału kierującego mikrociało (CMTS) i te same aminokwasy są uważane za zasadniczo istotne dla kierowania proteiny katalazy Hansenula polymorpha do mikrociał (Didion i Roggenkamp (1992) FEBS Lett. 303 (2-3), 113-116). Tripeptyd C-terminalny SKI może również kierować proteiny do mikrociał Neurospora crassa (de Zoysa i Connerton (1994) Cum Genet. 26, 430-437). Ostatni etap biosyntezy penicyliny wykonywany przez proteinę ACTF (stosujący PAA-CoA - produkt ligazy PAA-CoA) zlokalizowano w mikrociałach w P. chrysogenum (Muller i in. (1991) EMBO J. 10 (2), 489-495). Proteina ACTF również ma CMTS, który potrzebny jest do kierowania do mikrociała (EP 0488 180 A2). To, że proteina ligazy PAA-CoA ma CMTS, jest spójne z jej rolą w biosyntezie penicyliny.

Przykład 18 - Hybrydyzacja genomowego DNA z sondą cDNA ligazy PAA-CoA.

Genomowe DNA z szeregu szczepów, w tym z Penicillium chrysogenum typu naturalnego NRRL1951, BW1900A, BW1901, wydzielono jak następuje. Szczepy hodowano jak w przykładzie 1 i zebrano po 40 h metodą sączenia przez sączki z mikrowłókien szklanych Whatman GF/A. Grzybnię przepłukano w 0,9 M NaCl przed zamrożeniem w ciekłym azocie. Grzybnię roztarto na drobny proszek w ciekłym azocie i proszek ponownie zawieszono w roztworze G (przykład 12), pozostawiając na łaźni lodowej na 15 min. Resztki grzybni pastylkowano przy 17500 x g w temperaturze 4°C przez 20 min. Supematant zebrano w innej probówce do wirówki 50 ml i DNA ekstrahowano fenolem/chloroformem pH 8,0, ekstrahowano chloroformem i strącano etanolem jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Kwas nukleinowy ponownie zawieszono w 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA i usunięto RNA działaniem RNAzy jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Genomowe DNA trawiono BamHI, a produkty trawienia elektroforezowano, blottingowano na membranę Hybond N (Amersham) jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Membranę hybrydyzowano wstawką cDNA z pPEN09 jak następuje: Membranę pre-hybrydyzowano w 6 x SSC, 1% SDS, 6% PEG 6000, 100 pg/ml zdenaturowanego, fragmentowanego DNA nasienia śledzia w 60°C przez 6 h. Potem do roztworu hybrydyzującego dodano znaczony, zdenaturowany fragment cDNA (stosując zestaw Megaprime Amersham i ³²P-dCTP według instrukcji producenta) i hybrydyzację kontynuowano przez noc w 60°C. Następnie membrany przemywano w 65°C

188 190 w 2 x SSC, 01% SDS przez 30 min (dwukrotnie). Membrany audiografowano jak opisali Sambrook i in. (1987) tamże. Wyniki wykazały wspólny pojedynczy fragment 8 kb BamHI ze wszystkich szczepów Penicillium (w tym naturalnego typu NRRL 1951), który hybrydyzował z sondą cDNA.

Przykład 19 - Konstrukcja banku 9EMBL3.

Hodowlę w kolbie P chrysogenum szczepu SmithKline Beecham BW1900A przygotowano szczepiąc jedną ezą zarodników 50 ml pożywki ACM (20 g/l wyciągu słodowego, 1 g/l baktopeptonu, 20 g/l glukozy) i inkubując z wytrząsaniem w temperaturze 25°C. Po 40 godzinach wzrostu, grzybnię zebrano metodą sączenia przez sączki z mikrowłókien szklanych Whatman GF/A i przepłukano w 0,9 M NaCl. Następnie grzybnię ponownie zawieszono w 0,9 M NaCl zawierającym 10 mg/ml Novozymu (Novo Biolabs, Novo Industri. Dania) i inkubowano w temperaturze 25°C przez 2 h. Protoplasty oczyszczono z resztek grzybni przepuszczając przez sączek bawełniany przed odwirowaniem przy 4000 x g przez 10 min w celu pastylkowania protoplastów'. Protoplasty dwukrotnie przepłukano w 0,9 M NaCl przed dodaniem tiocyjanianu guanidyniowego, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA dla rozpuszczenia protoplastów. Resztki usunięto metodą odwirowania, zaś supematant zawierający DNA chromosomowe dodano do równej objętości 8 M LiCl, łagodnie zmieszano i przechowywano w -20°C przez 30 min. Następnie proteiny i nieco RNA pastylkowano metodą odwirowania (10000 x g, 4°C, 10 min), a supematant zawierający dNa chromosomowe został strącony etanolem. DNA chromosomowe częściowo strawiono Sau3A i fragmentowane DNA chromosomowe frakcjonowano pod względem wielkości na gradiencie gęstości sacharozy, jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże. Frakcje zawierające fragmenty Sau3A większe niż 10 kb zlano razem i zastosowano do konstrukcji banku 9EMBL3. Fragmenty genomowe Sau3A ligowano do ramion 9EMBL3 BamHI otrzymanych z Promega. Następnie ligowane XDNA pakietowano stosując zestaw Packagene Promega. Następnie pakietowane XDNA wzmocniono zakażając komórki E. coli szczep LE392 i plamki odbito na podłożu bakteryjnym i inkubowano przez 8 h w temperaturze 37°C, jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże. Otrzymano w przybliżeniu 18000 niezależnych klonów. Bakteriofagi eluowano do buforu SM i przechowywano właściwie (jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże).

Przykład 20- Klonowanie genomowego DNA ligazy PAA-CoA.

Z klonu 6.6 cDNA fragment Sstl-Xbal zawierający wstawkę cDNA (fig. 2) wykorzystano do sondowania banku A.EMBL3 (wytworzonego w przykładzie 19) metodą hybrydyzacji plamek, jak opisali Sambrook i in. (1989) tamże (warunki takie same jak w przykładzie 18). W pierwotnym badaniu przesiewowym zidentyfikowano szereg pierwotnych wyników pozytywnych, które wybrano i zastosowano do wtórnego badania przesiewowego przy niższych rozcieńczeniach. Powtórzono hybrydyzację plamek i poszczególne plamki zidentyfikowano jako hybrydyzujące z sondą cDNA ligazy PAA-CoA. Te klony AEMBL wybrano i wzmocniono. Klony AEMBL trawiono jednym z enzymów BamHI, EcoRI albo Sall oraz wszystkimi kombinacjami ich par, wraz z pojedynczymi produktami trawienia genomowego DNA ze szczepu BW 1900A. Produkty trawienia poddano elektroforezie, blottingowi i charakteryzacji metodą hybrydyzacji Southema, i zidentyfikowano fragmenty restrykcyjne zawierające cały gen ligazy PAA-CoA. Fragment 6,5 kb EcoRI pobrano z niektórych klonów AEMBL (takie same fragmenty obserwowane w produktach trawienia DNA chromosomowego) i podstawiony pod pIJ2925 (G 30 R. Janssen i M. J. Bibb (1993) Gene 124 (1) 133-134). Mapę restrykcyjną genomowego DNA przedstawiono na fig. 4.

Przykład 21- Transformacja P. chrysogenum szczep BW 1901 ligazą PAA-CoA.

Subklon 6,5 kb EcoRI w pI2925 (przykład 20, = paMX131) razem z liniowym fragmentem amdS z p3SR2 (Hynes i in. (1983) Mol. Celi. Biol. 3, 1430-1439) zastosowano do współtransformowania protoplastów P. chrysogenum szczep BW 1901 (sposób, jak opisali Tilbum i in. (1984) Gene 26, 205-221). Transformanty wybrano pod względem zdolności do wykorzystywania acetamidu. Następnie transformanty badano przesiewowo na miano PenV. Szereg transformantów miał wyższe poziomy PenV w porównaniu z próbą kontrolną BW 1901 (do 111% przy powtórnych testach), sugerując możliwe scalenie obu plazmidów. Taki wynik może poprzeć rolę tego klonu w biosyntezie penicyliny.

188 190

MVELPPKESGQLDPIPDNIPISEFMLNERYGRVRHASSRDPYTCGrTGKSYSSKEVANR

VDSLARSLSKEFGWAPNEGSEWDKTLAVEALNTIDSLPLFWAVHRLGGVLTPANASY

SAAELTHQLLDSKAKALVTCVPLLSISLEAAAKAGLPKNRIYLLDVPEQLLGGVKPPA

GYKSVSELTQAGKSLPPVDELRWSAGEGARRTAFVCYSSGTSGLPKGVMISHRNVIA

NTLQIKAFEQNYRDGGGTKPASTEVALGLLPQSHIYALWIGHAGAYRGDQ-nVLPiCF

ELKSYLNAIQQYKISALFLVPPIHHMLGTQDVCSKYDLSSVTSLFTGAAPLGMETAAD

FLKLYPNŁIRQGYGLTETCTVVSSTHPHDrWLGSSGALLPGVEARJVTPENKEITTYD

SPGELWRSPSWLGYLNNEKATAETFVDGWMRTGDEAVIRRSPKGIEHVTTVDRIKE

LKVKGLQVAPAELEAHILAHPDVSDCAVIAIPDDRAGEVPKAIWKSASAGSDESVS

QALVKYVEDHKARHECWLKGGIRFVDAIPKSPSGKILRRLIRDQEKEARRKAGSKI

FIG. 1 r~l <

O u

CL <

ca υ

C

O

J*

H

C

N υ

UJ¹

-M •H

O

CL iud^

IFUIg

PID

Pqx ιθςχ m§a ΛΉ033 F3 _ u

c

JJ

Φ >

£ o

>1 o

+J

W

Cl

M e

CL (β £

psj PID IPS pms .SP £

»4

C

N υ

rf «Μ •4 o

CL ra°03 [7 npraa

IPS psj

P^SS

188 190 gaattcggcacgagtctaaaccccgagatcacctcagtttcctgcactttggaga

CCTGCCCCTATATTACCCCGAGGATTTGGGAAAATGGTTTTTTTACCTCCAAAGGA

GTCCGGTCAATTGGACCCAATTCCCGACAATATTCCAATCAGCGAGTTTATGCTCA

ATGAGAGATATGGACGAGTGCGACACGCCAGCTCCCGGGACCCATACACCTGTGG taitaccgggaagtcatactcgtcgaaagaggtagccaatcgcgtcgactcgctg

GCTCGTAGTCTATCAAAGGAATTTGGTTGGGCGCCGAATGAAGGGTCAGAATGGG

ATAAGACATTGGCCGTGTTTGCęCTCAACACTATCGATTCCTTACCCCTATTCTGG

GCCGTTCACAGACTGGGCGGTGTTCTCACTCCCGCCAACGCATCATACTCCGCCG ccgagctgacgcatcagctgcttgattccaaggccaaggcccttgtgacttgtgt tcctctcctctccatctcactggaagctgcagccaaagctggtctcccgaagaaca

GAATCTACTT ACTC GATGT AC CTGAGC AGGTTCTTGGCGGAGTC AAGG CTC C AGG aggatacaagtccgtttccgaactgacccaggctgggaagtctctcccgccagtg

GATGAATTGCGATGGAGCGCGGGTGAAGGTGCCCGGCGAACAGCATTTGTGTGCT

ACTCAAGTGGAACGTCTGGATTGCCGAAAGGAGTCATGATCTCACACCGCAACGT

GATCGGCAATACCCTTCAGATCAAGGCGTTTGAGCAGAACTACCGGGATGGTGGG

GGCACAAAGCCTGCGAGTACTGAGGTTGCTCTTGGTCTCCTTCCGCAGAGCCATA

TCTATGCTCTTGTGGTCATTGGCCATGCTGGGGCATACCGAGGCGACCAAACAAT

CGTTCTCCCCAAATTCGAATTGAAATCCTACCTGAACGCCATCCAACAGTACAAG

ATCAGTGCGGTGTTCCTGGTACCTCCGATCATCATTCACATGCTGGGCACTCAAGA

CGTGTGCTCCAAGTATGACCTGAGTTCCGTGACGTCTCTGTTCACGGGAGCGGCA

CCCCTGGGTATGGAGACAGCTGCCGATTTCCTCAAACTCTACCCGAACATTTTGAT

CCGCCAAGGATACGGTCTGACAGAGACATGCACGGTCGTAAGCTCGACCCACCCG

CACGATATCTGGCTAGGTTCATCCGGCGCTTTGCTCCCTGGAGTCGAGGCACGAA

TTGTGACGCCTGAAAACAAGGAAATCACAACGTACGACTCACCGGGCGAATTGGT

GGTCCGAAGCCCAAGCGTCGTCCTGGGCTATTTGAACAACGAAAAACCCACCGCA

GAGACATTTGTGGACGGATGGATGCGTACGGGAGACGAGGCTGTCATCCGTAGA

AGCCCGAAGGGCATCGAGCACGTGTTTATTGTCGATCGGATCAAGGAGTTGATCA

AGGTCAAGGGTCTGCAAGTCGCGCCTGCCGAACTCGAAGCCCATATCCTCGCCCA

CCCCGATGTCTCGGACTGTGCTGTCATCGCTATTCCGGATGATCGTGCAGGAGAA

GTACCCAAGGCCATTGTTGTGAAGTCCGCCAGCGCAGGATCGGACGAATCTGTCT cccaggctctcgtgaagtatgttgaggaccacaaggctcgtcacaagtggttgaa gggaggtatcagatttgtggatgccattcccaagagcccgagtggtaagattctt cgtcggttgatccgtgaccaagagaaggaggcacggagaaaggctggtagcaag atctaaaaatgtcgggggtagctttgattagaacttggtctgggaaacttggaaa ccgataaccattgttggcttgaactagaagtatatatgtaaatacgtgataaaca aggcatctcatctgctgttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcgag

Claims

Sposób wytwarzania polipeptydu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA, obejmujący hodowlę gatunku Penicillium, obróbkę tej hodowli i odzyskiwanie produktu końcowego, znamienny tym, że hoduje się gatunek Penicillium, korzystnie Penicillum chrysogenum, grzybnię zbiera, przeprowadza się nadźwiękowienie grzybni, usuwa resztki komórek, frakcjonuje się produkt nadźwiękowienia metodą chromatografii anionowymiennej, a następnie chromatografii oddziaływań hydrofobowych, chromatografii jonowo-asocjacyjnej z eluowaniem substratu i chromatografii sączenia przez żel, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne są wykrywane przy użyciu oznaczenia zależnego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA. Enzym posiadający aktywność ligazy fenyloacetylokoenzymu A (PAA-CoA) jest użyteczny w syntezie penicylin z produktów pośrednich uczestniczących w biosyntezie penicyliny.

Droga przemian biochemicznych do penicyliny G jest ujawniona w literaturze (Queener (1990) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34 (6), 943-948; Martin (1992) J. Industrial Microbiol. 9, 73-90; Luengo (1995) J. Antibiotics 48 (11), 1195-1212). Droga przemian była przedmiotem znacznych badań mających na uwadze wzrost wydajności (miana) w procesach fermentacji.

U Penicillium chrysogenum (pędzlaka złociejącego) fenylooctan (PAA) i fenoksyoctan (POA) zostają aktywowane do odpowiednich tioestrów CoA enzymem ligazą (np. ligazą PAA-CoA). Te tioestry następnie zostają wykorzystane do biosyntezy penicyliny G w przypadku PAA oraz penicyliny V w przypadku POA. Dlatego ligazę PAA-CoA uważa się za niezbędną w biosyntezie tych ważnych handlowo antybiotyków leczniczych.

Enzym mający aktywność ligazy PAA-CoA (J. Biol. Chem. 267 (12), 7084-7090 (1990)) wydzielono z Pseudomonas putida metodą oczyszczania obejmującą strącanie siarczanem amonowym i wymywanie chlorkiem potasowym z kolumny DEAE-Sephacel. Enzym ma masę cząsteczkową 48 000 +/- 1 000, optimum pH 8,2, i jest zaangażowany w katabolizm paA.

Próby oznaczenia enzymu z P. chrysogenum mającego aktywność ligazy PAA-CoA metodą hydroksaminianową (oznaczanie kolorymetryczne wykrywające hydroksaminian fenyloacetylu lub hydroksaminian fenoksyacetylu przy 540 nm) opisali Kogekar i Deshpande (1983) Ind. J. Biochem. Biophys. 20, 208-212 oraz Brunner i Rohr (1975) Methods Enzymol. 43, 476-481; jednak inni badacze (Martinez-Blanco i in. (1992) J. Biol. Chem. 267 (8), 54745481) są zdania, że proteina nie została oczyszczona albo aktywność nie została szczegółowo scharakteryzowana. Ponadto ci ostatni autorzy nie zdołali znaleźć tego enzymu podaną procedurą.

WO 96/10085 (Gist Brocades, opublikowano 4 kwietnia 1996) podaje przegląd tych i innych prób wydzielenia ligazy PAA CoA, która działa na drodze przemian penicyliny. W WO 96/10085 opisano syntazę enzymu acylo-CoA jako otrzymaną ze szczepu Penicillium chrysogenum B10 przechowywanego w PanLabs (USA). Wśród właściwości przypisywanych enzymowi są następujące: ciężar cząsteczkowy około 50 000 (określono metodą sączenia w żelu), optymalne pH 8 do 8,5 (niska aktywność przy pH 7 lub poniżej), optymalna temperatura 40°C, pH ponad 7,25. Co ważne, enzym możną oczyszczać metodą strącania siarczanem amonowym. Ma on dość szeroką specyficzność (tj. jest w stanie katalizować tworzenie fenoksyacetylo-koenzymu A, fenyloacetylokoenzymu A, adypoilo-koenzymu A i heksanoilo-koenzymu A z Mg²⁺, ATP, CoASH, i odpo188 190 wiednio kwasu fenoksyoctowego, fenylooctowego, kwasu adypinowego lub kwasu heksanowego, ale nie wykazuje żadnej aktywności wobec kwasu octowego. Wykazano także, że enzym jest stabilizowany środkami redukującymi. Wysokie stężenie siarczanu amonowego lub glicerolu również stabilizuje enzym. Nie podano wskazań co do czystości dla aktywności enzymatycznej enzymu otrzymanego ujawnionymi sposobami, nie podano sekwencji ani też sekwencji N-terminalnej enzymu, jak również nie scharakteryzowano odpowiadającego mu DNA, ani nie podano jego sekwencji.

Mimo tych wszystkich wysiłków niewiele wiadomo o autentycznym enzymie ligazy PAA-CoA, który działa in vivo u gatunku Penicillium. Przypuszczano, że odpowiedzialny enzym może być zaangażowany w metabolizm pierwotny (Smith i in. (1990) Biotechnology 8, 39-41). Martinez-Blanco i in. (1992) tamże, wybrali jeden enzym jako możliwego kandydata, syntazę acetylo-CoA, i oczyścili go z P. chrysogenum na podstawie aktywności syntazy acetylo-CoA. Byli oni w stanie wykazać, że poza tworzeniem pochodnej CoA octanu syntaza acetylo-CoA mogła aktywować kilka kwasów tłuszczowych (C2-C8) i in vitro niektóre cząsteczki aromatyczne (w tym PAA).

Gen syntazy acetylo-CoA poddano sekwencjonowaniu (Międzynarodowy Opis Patentowy WO 92/07079, Gouka i in. (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 514-519, MartinezBlanco i in. (1993) Gene 130, 265-270) i wykazano, że jest homologiczny z innymi syntazami acetylo-CoA pochodzącymi z grzybów. Jednakże mutacje w tym genie wybrane kwasem fluorooctowym nie wydają się zmieniać poziomu wytwarzania penicyliny (Międzynarodowy Opis Patentowy WO 92/07079) sugerując, że w rzeczywistości za aktywację PAA odpowiedzialny jest inny enzym.

W niniejszym wynalazku opracowano bezpośrednie oznaczenie aktywności ligazy PAACoA w połączeniu z właściwą procedurą oczyszczania, co pozwoliło na oczyszczenie, a następnie klonowanie tego, co uważane jest za autentyczną ligazę PAA-CoA. Enzym wydzielony według niniejszego wynalazku ma N-terminalną sekwencję aminokwasów, różną od syntazy acetylo-CoA wymienionej wyżej i posiada szereg różnych właściwości (np. ciężar cząsteczkowy) wskazując, że wydzielono enzym inny niż wszystkie enzymy, którym dotąd przypisywano tę rolę. Właściwości charakterystyczne dla enzymu wydzielonego w niniejszym wynalazku obejmują bezwzględną zależność od CoASH jako substratu, podczas gdy enzym wydzielony przez Kogekara i Deshpande (1983), testowano w warunkach, w których pomijano CoASH. Ta i inne różnice między wydzielonymi proteinami (np. optymalne pH i inne właściwości charakterystyczne podane w przykładach poniżej) wykazują, ze enzym według niniejszego wynalazku jest różny od każdego z opisanych poprzednio. Uważa się, że niniejsze rozwiązanie stanowi pierwsze wydzielenie czystej postaci enzymu ligazy PAA CoA z gatunków Penicillium. W szczególności obecność C-terminalnego peptydu SKI jest zgodna z rzeczywistą rolą tego enzymu w biosyntezie penicyliny. Enzym według wynalazku różni się od enzymu opisanego w powyżej wspomnianej publikacji WO 96/10085 tym, że ma różny ciężar cząsteczkowy, i ze enzym według niniejszego wynalazku jest wrażliwy na strącanie siarczanem amonowym i solami chlorkowymi w odróżnieniu od enzymu opisanego w WO 96/10085.

Zgodnie z tym, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA, obejmujący hodowlę gatunku Penicillium, obróbkę tej hodowli i odzyskiwanie produktu końcowego, polegający na tym, że hoduje się gatunek Penicillium, korzystnie Penicillum chrysogenum, grzybnię zbiera, przeprowadza się nadźwiękowienie grzybni, usuwa resztki komórek, frakcjonuje się produkt nadźwiękowienia metodą chromatografii anionowymiennej, a następnie chromatografii oddziaływań hydrofobowych, chromatografii jonowo-asocjacyjnej z eluowaniem substratu i chromatografii sączenia przez żel, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne są wykrywane przy użyciu oznaczenia zależnego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A.

Otrzymany zgodnie ze sposobem według wynalazku polipeptyd kodowany jest przez sekwencję DNA przedstawioną na Fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2. Sekwencja ta koduje peptyd posiadający aktywność ligazy fenyloacetylokoenzymu A (PAA-CoA). Sekwencją DNA kodującą ten polipeptyd może być też sekwencja, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA oznaczoną jako SEQ ID nr 2.

188 190

Polipeptyd otrzymywany sposobem według wynalazku ma pozorny ciężar cząsteczkowy, oznaczony metodą SDS-PAGE wynoszący około 63 000.

Polipeptyd, ten korzytnie obejmuje sekwencją aminokwasów N-terminalnych: V-F-L-PP-K-E-S-G-Q-L-D-P, a zwłaszcza sekwencję aminokwasów pokazaną na fig. 1, oznaczoną jako sekwencja ID SEQ nr 1.

Wektor do ekspresji enzymu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA w odpowiednim organizmie gospodarza zawiera sekwencję DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawioną na fig. 3 oznaczoną jako SEQ ID nr 2, lub sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA SEQ ID nr 2.

Tą sekwencją DNA transformuje się organizm gospodarza w celu wytwarzania penicyliny.

Enzym posiadający aktywność ligazy PAA-CoA można zatem wytwarzać znanymi metodami inżynierii genetycznej które w swoich standardowych etapach obejmują transformację komórki gospodarza z gatunku Penicillium, hodowlę stransformowanej komórki gospodarza, obróbkę tej hodowli i odzyskiwanie produktu końcowego, a w przypadku realizacji niniejszej, hoduje się komórkę gospodarza, którą transformuje się wektorem zawierającym sekwencję DNA obejmującą sekwencję DNA przedstawiona na fig. 3 oznaczona jako sEQ ID nr 2, lub przez sekwencję DNA, która hybrydyzuje w ścisłych warunkach hybrydyzacji z sekwencją DNA SEQ ID nr 2, w celu ekspresji enzymu posiadającego aktywność ligazy PAA-CoA, w odpowienim organizmie gospodarza, następnie prowadzi się ekstrakcję i oczyszczanie, gdzie aktywne frakcje chromatograficzne są wykrywane przy użyciu oznaczenia zależnego od PAA (kwasu fenylooctowego) i koenzymu A, dając w przybliżeniu 1000-krotny wzrost czystości.

Enzym można stosować w biotransformacjach w in vitro. Np. do syntezy estru CoA albo do syntezy penicyliny mieszając z acylo-CoA : acylotransferazą 6-APA. Biotransformacje in vitro można prowadzić stosując całe komórki, ekstrakty bez komórek, komórki o zwiększonej przepuszczalności albo enzymy wydzielone z mikroorganizmów, albo którekolwiek z nich w postaci unieruchomionej.

Przy prowadzeniu biotransformacji przy użyciu całych komórek mikroorganizm może mieć postać rosnącej hodowli, odpoczywającej hodowli, przemytej grzybni, unieruchomionych komórek lub protoplastów.

Przy stosowaniu ekstraktów bez komórek przydatnie wytwarza się je przez ścinanie i/lub rozkład chemiczny lub enzymatyczny albo innymi sposobami rozrywania, korzystnie metodą nadźwiękowienia, i ewentualnie następnie usuwając resztki komórek, przy pozostawieniu aktywności enzymów w roztworze.

Enzym korzystnie wytwarza się zgodnie z poniższymi przykładami stosując dostępne w handlu szczepy P chrysogenum, w tym typ naturalny NRRL 1951. Inne przydatne szczepy P. chrysogenum obejmują szczepy wytwarzające wysokie ilości penicyliny, np. szczep BW1901 (EMBO J. 9 (3), 741-747 (1990) D. J. Smith i in.).

Enzym można wytwarzać hodując mikroorganizm w typowy sposób, szczególnie w warunkach aerobowych w przydatnej pożywce ciekłej lub półstałej. Warunki hodowli mogą być następujące: temperatura w zakresie 5-50°C, korzystnie 25-30°C, a pH w zakresie 3-9, korzystnie 6 - 8, najkorzystniej 7,2.

Enzym można wydzielić i stosować w postaci oczyszczonej, postaci częściowo oczyszczonej, w stanie zanieczyszczonym tak jak otrzymano, jako przesącz z preparatu rozerwanych komórek. Najdogodniej enzym zostaje np. co najmniej częściowo oczyszczony w celu usunięcia innych enzymów, które mogłyby również katalizować niszczenie materiałów początkowych lub enzymu.

Najdogodniej enzym unieruchamia się na nierozpuszczalnym podłożu tak, jak w procedurach dyskutowanych przez Powella (1990) w Microbial Enzymes and Biotechnology, red. Fogarty & Kelly, str. 369-394. Daje to również korzyść w postaci zwiększonej wydajności i przerobu.

Przy prowadzeniu biotransformacji przy użyciu całych komórek przydatną pożywkę do hodowli stanowi pożywka: KH2PO4 2 g, K2HPO4 1,5 g, KC1 0,2 g, MgCl₂ • 6H₂O 0,2 g,

188 190

Na2SO₄ · IOH2O 0,22 g, glukoza 1,0 g w 1 litrze wody dejonizowanej o pH 6,5 lub wodnym układzie z dopasowaniem pH.

Przy prowadzeniu biotransformacji przy użyciu ekstraktów bez komórek, pożywkę do hodowli stanowi odpowiedni bufor. Oprócz substratów enzymu, mieszanina reakcyjna może zawierać jeden lub więcej innych czynników, np. jonów metali lub stabilizatorów, np. tioli.

Biotransformację można przeprowadzić w środowisku wodnym, utrzymując przydatnie mieszaninę reakcyjną w zakresie pH 4-10, przydatniej od 6 do 10, korzystnie około 9,0. Korzystnie pH reguluje się buforami lub korzystnie metodą dodawania roztworu mianowanego kwaśnego lub zasadowego. Temperatura reakcji powinna ogólnie leżeć w zakresie 5-50°C, korzystnie 22-45°C, najkorzystniej 30-37°C. Alternatywnie, reakcję można prowadzić w rozpuszczalnikach organicznych albo w obecności rozpuszczalników organicznych np. acetonu, ketonu metylowo-izobutylowego (MIBK).

Czas reakcji zależy od takich czynników jak stężenie reagentów i czynników, temperatura i pH. Po zakończeniu reakcji produkt można wydzielić typowymi sposobami. Początkowe oczyszczanie dogodnie obejmuje etap chromatografii.

DNA genu kodującego ligazę PAA-CoA znajduje się wewnątrz fragmentu DNA pokazanego na fig. 2. W szczególności DNA stanowi zasadniczo sekwencja DNA na fig. 3 / ID SEQ 2.

Należy rozumieć, że to DNA nie jest w swoim stanie naturalnym, lecz w postaci wydzielonej lub zasadniczo czystej i dlatego może nie mieć dokładnej konfiguracji zilustrowanych miejsc restrykcji, jeśli to DNA wyprowadzono normalnymi technikami obejmującymi delecję, podstawienie, addycję lub inwersję nukleotydów z DNA zgodnie z dowolnym aspektem wyżej opisanego wynalazku.

DNA kodujące ligazę PAA-CoA może pochodzić z P chrysogenum. Jednak przydatne są także sekwencje DNA pochodzące z innych organizmów, zwłaszcza organizmów innych niż P. chrysogenum, które to sekwencje nie mają konfiguracji pokazanych miejsc restrykcji, lecz hybrydyzują, korzystnie w ścisłych warunkach hybrydyzacji, z DNA pokazanym na fig. 2 lub jego podfragmentem, i które kodują ligazę PAA-CoA lub enzym o aktywności ligazy PAA-CoA (ścisłe warunki hybrydyzacji podano np. w przykładzie 18).

Wektor obejmujący takie DNA, jest wektorem ekspresji do ekspresji ligazy PAA-CoA w przydatnym organizmie gospodarza. Specyficznym przykładem takiego wektora ekspresji jest pBK-CMV (zakupiony od Stratagene) i stosowany w tym wynalazku do ekspresji w E. coli. W tym wynalazku wstawka cDNA ligazy PAA-CoA (= pPEN09, fig. 2) jest korzystnym wektorem do ekspresji w E. coli.

DNA i zawierające je wektory mogą znaleźć zastosowanie w wielu dziedzinach działalności przemysłowej. Odnosi się to również do mikroorganizmów gospodarzy zmienionych tymi wektorami i wyrażanymi przez nie enzymami. Np. DNA można wykorzystać jako sondę hybrydyzacji do identyfikowania i wydzielania związanych lub pokrywających się genów obecnych w całkowitym DNA komórkowym P chrysogenum (NRRL 1951) i innych mikroorganizmów wytwarzających enzymy o podobnej strukturze i specyficzności.

Wektory rekombinowane zawierające to DNA po przeniesieniu do przydatnych gospodarzy mogą mieć znaczenie przy wytwarzaniu genetycznie zmienionych mikroorganizmów, które syntetyzują zwiększone ilości penicyliny.

Korzystnie jest zwiększyć ilość aktywności PAA-CoA w odpowiednim organizmie. Wektory rekombinowane można by również stosować przy wytwarzaniu nowych lub hybrydowych antybiotyków na drodze transferu genów (patrz np. D.A.Hopwood i in., Naturę, 1985, 341, 642-644). Enzymy kodowane przez DNA niniejszego wynalazku można stosować np. w układach bez komórek, zwłaszcza przy unieruchomieniu na przydatnych podłożach stałych, w celu wytwarzania znanych antybiotyków z naturalnych prekursorów albo nowych antybiotyków z „nienaturalnych” prekursorów otrzymanych np. metodą syntezy chemicznej.

DNA lub jego fragment (niekoniecznie zawierający nietknięty gen) można łączyć, albo technikami rekombinacji DNA albo metodą naturalnych procesów rekombinacji, z fragmentem genu zaangażowanym w biosyntezie w celu wytworzenia genu hybrydowego zdolnego do

188 190 kierowania syntezą hybrydowego enzymu. Takie enzymy można stosować do wytwarzania nowych antybiotyków sposobami analogicznymi do opisanych tu uprzednio.

DNA można również modyfikować znanymi technikami mutagenezy ukierunkowanej na miejsca enzymu (w sposób analogiczny do opisanego np. przez G. Wintera i in., Nature, 1982, 299. 756-758; albo przez Zollera i Smitha, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 64876500) z wytworzeniem DNA, w którym dokonano specyficznych mutacji i/lub delecji. Zmutowane DNA można zastosować do otrzymania zwiększonej wydajności (lub miana) penicyliny z przydatnego mikroorganizmu gospodarza.

Zmutowane DNA można również stosować do otrzymania nowych lub hybrydowych antybiotyków metodą przenoszenia genów, lub stosować do wytwarzania zmutowanych enzymów (mutein), które można stosować do wytwarzania nowych antybiotyków metodami analogicznymi do opisanych tu uprzednio. Zmutowane DNA można również stosować do zmieniania innych właściwości fermentacyjnych u przydatnych organizmów, np. tolerancję na PAA, zmienione substraty.