RU2136754C1 - Рекомбинантная плазмидная днк pgsdei, кодирующая белок e вируса клещевого энцефалита и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка e вируса клещевого энцефалита - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная днк pgsdei, кодирующая белок e вируса клещевого энцефалита и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка e вируса клещевого энцефалита Download PDFInfo
- Publication number
- RU2136754C1 RU2136754C1 RU97114729A RU97114729A RU2136754C1 RU 2136754 C1 RU2136754 C1 RU 2136754C1 RU 97114729 A RU97114729 A RU 97114729A RU 97114729 A RU97114729 A RU 97114729A RU 2136754 C1 RU2136754 C1 RU 2136754C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tick
- encephalitis virus
- borne encephalitis
- bglii
- fragment
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может найти применение в микробиологической промышленности и медицине для разработки высокоэффективных профилактических и диагностических средств борьбы против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Изобретение предусматривает создание рекомбинантной плазмидной ДНК pGSDE1, кодирующей белок оболочки E ВКЭ и штамма Escherichia coli - продуцента белка E. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGSDE1 сконструирована на основе HindIII-ScaI-фрагмента плазмиды pEZZT318, размером 1165 п.о., ScaI-SacI-фрагмента плазмиды pGEMI, размером 1б40 п.о. SacI-BglII-синтетического фрагмента, размером 12 п.о. и BglII-HindIII - фрагмента, полученного методом полимеразной цепной реакции, размером 1250 п.о., содержащего стартующий ATG-кодон, кодирующую часть гена E ВКЭ, а также терминирующий TAA-кодон. Штамм Escherichia coli GSDE - продуцент белка E ВКЭ получен в результате трансформации плазмидной ДНК pGSEM1, несущей ген E ВКЭ. Рекомбинантный белок может быть использован в качестве антигена в диагностических тест-системах. 2 с.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может найти применение в микробиологической промышленности и медицине для разработки высокоэффективных профилактических и диагностических средств борьбы против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).
По данным российских и зарубежных эпидемиологов клещевой энцефалит (КЗ) - наиболее распространенная в северном полушарии природно-очаговая инфекция. С начала 90-х годов наблюдается беспрецендентное повышение уровня заболеваемости населения этой инфекцией, отмечаемое как на территории России, так и в большинстве европейских и североамериканских стран.
В связи с этим очевидна актуальность разработки совершенных тест-систем к вирусу клещевого энцефалита.
Патентный поиск и анализ литературных данных выявил, что в известных в настоящее время технических решениях, относящихся к тест-системам на вирус КЭ, в качестве антигена используются вирусные лизаты. Используемые антигены отличаются способами очистки вируса, способами культивирования либо применением различных штаммов ВКЭ (А.С. СССР NN 646992, 691135, 1378112, 1562857, 1597726).
Использование вирусных лизатов в качестве антигенов в тест-системах к ВКЭ имеет ряд крупных недостатков:
- высокая патогенность вируса;
- проблема инактивации вируса. При инактивации вируса активность антигена падает на несколько порядков, кроме того, процесс инактивации плохо контролируется, что приводит к невоспроизводимости результатов, резко ухудшает качество препарата антигена, и, как следствие, снижается чувствительность тест-системы;
- очистка природного антигена крайне трудоемкий и неэффективный процесс. Основной антиген ВКЭ-белок E не выдерживает нейтральных значений pH, сильно денатурируется, что приводит к усложнению схемы анализа проб.
- высокая патогенность вируса;
- проблема инактивации вируса. При инактивации вируса активность антигена падает на несколько порядков, кроме того, процесс инактивации плохо контролируется, что приводит к невоспроизводимости результатов, резко ухудшает качество препарата антигена, и, как следствие, снижается чувствительность тест-системы;
- очистка природного антигена крайне трудоемкий и неэффективный процесс. Основной антиген ВКЭ-белок E не выдерживает нейтральных значений pH, сильно денатурируется, что приводит к усложнению схемы анализа проб.
Одним из наиболее перспективных путей совершенствования диагностических тест-систем является использование в качестве антигена рекомбинантных белков ВКЭ, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование рекомбинантных белков в качестве антигенов обеспечивает следующие преимущества в отличие от использования вирусных лизатов:
- обеспечивается возможность получения недорогого, безопасного в работе и стабильного антигена;
- при клиническом использовании диагностикумов исключается работа с вирусными препаратами.
- обеспечивается возможность получения недорогого, безопасного в работе и стабильного антигена;
- при клиническом использовании диагностикумов исключается работа с вирусными препаратами.
Для вируса клещевого энцефалита известно два основных антигена - белок оболочки E и высокоиммуногенный неструктурный гликопротеин NS1 (Int. 3. Med Microbiol. 1990, 272(4), p. 277 - 284; Cesk. Epidem. Microbiol.Immun.,1991, 40 (4 - 5), 209 - 220; Вопросы вирусол. 1990, 35 (6) 471 - 474). Экспрессия белка NS1 была осуществлена в E.coli и показано, что продукт экспрессии реагирует с положительными сыворотками к ВКЭ (А.С. СССР 1822202, С 12 N 15/33 1996; патент РФ 1679798, С 12 N 15/33, 15/52, 1/21, 1995).
На наш взгляд, наиболее перспективно в качестве антигена использовать белок оболочки E, так как именно этот белок определяет основные биологические функции вируса: тропизм, вирулентность, иммуногенность и несет вируснейтрализующие и протективные эпитопы (Pathobiology of the flaviviruses-Plenum Press. New-York-London, 1986,p. 375 - 440; Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика. -Л.Медицина, 1986 ). В то же время к настоящему времени из литературных данных неизвестны подходы к получению рекомбинантного белка E ВКЭ. Скорее всего, это объясняется проблемами эффективной экспрессии столь сложно устроенного белка.
Таким образом, экспрессия белка E в полноразмерном виде и его использование для создания современных эффективных тест-систем для диагностики клещевого энцефалита до сих пор является нерешенной задачей.
Технической задачей изобретения является создание рекомбинантной плазмиды pGSDEl, кодирующей белок E ВКЭ и штамма E. coli GSDE1-продуцента белка E ВКЭ.
Техническая задача решается тем, что получена плазмидная ДНК-pGSDEl, кодирующая ген белка E ВКЭ, которая имеет размер 4067 п.о. и состоит из следующих элементов:
HindIII-ScaI - фрагмента плазмиды pEZZT318 (Biochemistry, 1987, 26, 5239 - 5244 ), размером 1165 п.о., содержащий ρ-независимый терминатор транскрипции триптофанового оперона E.coli(trpT) вместе с N-концевым фрагментом гена устойчивости к ампициллину(bla);
Scal-SacI - фрагмента плазмиды pGEM1 /Promega, USA/, размером 1640 п.о., включающим Т7-промотор, C-концевую часть гена bla, а также точку начала репликации;
SacI-BglII - синтетический фрагмент длиной 12 п.о., содержащий сайт связывания с рибосомами;
BglII-HindIII - фрагмент, полученный методом ПЦР, размером 1250 п.о., содержащий стартующий ATG-кодон, кодирующую часть гена E ВКЭ без гидрофобного якоря, а также терминирующий кодон TAA;
один участок расщепления рестриктазы BglII; один участок расщепления рестриктазы HindIII, расположенный на расстоянии 1250 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке;
один участок расщепления рестриктазы SeaI, расположенный на расстоянии 2897 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке.
HindIII-ScaI - фрагмента плазмиды pEZZT318 (Biochemistry, 1987, 26, 5239 - 5244 ), размером 1165 п.о., содержащий ρ-независимый терминатор транскрипции триптофанового оперона E.coli(trpT) вместе с N-концевым фрагментом гена устойчивости к ампициллину(bla);
Scal-SacI - фрагмента плазмиды pGEM1 /Promega, USA/, размером 1640 п.о., включающим Т7-промотор, C-концевую часть гена bla, а также точку начала репликации;
SacI-BglII - синтетический фрагмент длиной 12 п.о., содержащий сайт связывания с рибосомами;
BglII-HindIII - фрагмент, полученный методом ПЦР, размером 1250 п.о., содержащий стартующий ATG-кодон, кодирующую часть гена E ВКЭ без гидрофобного якоря, а также терминирующий кодон TAA;
один участок расщепления рестриктазы BglII; один участок расщепления рестриктазы HindIII, расположенный на расстоянии 1250 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке;
один участок расщепления рестриктазы SeaI, расположенный на расстоянии 2897 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке.
Фрагменты содержат следующие гены и регуляторные участки:
bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от 1027 до 1887 п.о. вправо от BglII сайта;
промотор Т7 РНК-полимеразы, расположенный на 16 п.о. левее BglII-сайта (позиции 4055 - 4039 п.о.);
ген E ВКЭ, расположенный на участке от 9 до 1259 п.о. по часовой стрелке от BglII сайта и имеющий собственный бактериальный участок связывания с рибосомами, инициирующий ATG-кодон, и стоп кодон TAA.
bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от 1027 до 1887 п.о. вправо от BglII сайта;
промотор Т7 РНК-полимеразы, расположенный на 16 п.о. левее BglII-сайта (позиции 4055 - 4039 п.о.);
ген E ВКЭ, расположенный на участке от 9 до 1259 п.о. по часовой стрелке от BglII сайта и имеющий собственный бактериальный участок связывания с рибосомами, инициирующий ATG-кодон, и стоп кодон TAA.
Молекулярная масса рекомбинантной плазмидной ДНК равна 2,4МД.
Задача также решается созданием штамма-продуцента E.coli, который характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, содержащих 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37oC колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 10 до 37oC при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага Т7 проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30 - 37oC. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при добавлении ИПТГ до концентрации 0,6 мМ при температуре 30 - 37oC. Продуктивность штамма составляет около 120 мг рекомбинантного белка на 1 литр клеточной суспензии. Белок стабилен при температуре 4oC в течение 5 - 6 месяцев. Препарат рекомбинантного белка взаимодействует в ИФА и иммуноблотинге с антисыворотками к ВКЭ.
Полученный штамм депонирован в НИИ Коллекция культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" под номером В 699.
Предложенные рекомбинантная плазмидная ДНК pGSD1 и штамм-продуцент рекомбинантного белка E вируса клещевого энцефалита впервые получены авторами, неизвестны из литературных источников, что позволяет говорить о их соответствии критериям "новизна" и "изобретательский уровень".
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pGSDEl.
20 мкг плазмидной ДНК pEZZT318 расщепляют последовательно сначала рестриктазой SeaI в реакционной смеси, содержащей 33 мМ Трис- Ac,pH 7,9, 10 мМ MgAc, 66 мМ KAc, 1 мМ ДТТ, 40 ед.рестриктазы SeaI, а затем рестриктазой HindIII в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCI, pH 8,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCI, 1 мМ ДТТ, 40 ед.рестриктазы HindIII в объеме 200 мкл при 37oC в течение 1 час. Фрагмент ДНК размером 1165 п.о., включающий ρ-независимый терминатор транскрипции триптофанового оперона E.coli(trpT) вместе с N-концевым фрагментом гена устойчивости к ампициллину (bla), выделяют после электрофореза в ПААГ методом электроэлюции из геля.
20 мкг плазмидной ДНК pGEM1 расщепляют последовательно рестриктазами SeaI и HindIII в условиях, описанных выше. Фрагмент ДНК размером 1640 п.о. выделяют после электрофореза в ПААГ методом электроэлюции.
1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества фрагментов HindIII - SeaI (1165 п.о.) и SeaI - HindIII (1640 п.н) обрабатывали ДНК-лигазой фага Т4 в реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCI, pH 8,0, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР, 10 ед. активности ДНК-лигазы фага Т4 в объеме 20 мкл при 4oC в течение 12 час. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli XL-1 blue, приготовленные методом обработки CaCl2, по стандартной методике/Молекулярное клонирование: методы генетической инженерии. М. Мир, 1984 /.
Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37oC. Клоны, содержащие целевую плазмиду pGT, отбирают при помощи рестрикционного анализа.
10 мкг плазмидной ДНК pGT расщепляют последовательно рестриктазами SacI и XbaI в реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCI, pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCI, 1 мМ ДТТ, 20 ед.активности рестриктазы SacI, а затем рестриктазой XbaI в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCI, pH 7,6, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCI, 1 мМ ДТТ, 20 ед. активности рестриктазы XbaI в объеме 100 мкл при 37oC в течение 1 час. Обработанную таким образом ДНК очищают в ПААГ.
Для введения сайта связывания с рибосомами (последовательность Щайн-Дальгарно) используют синтетический фрагмент ДНК, имеющий следующую структуру:
5' CAGGAGGAGAT
3' TGGAGTCCTCCTCTAGCAC
1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества плазмидной ДНК pGT, гидролизованной рестриктазами SacI и XbaI и синтетического фрагмента ДНК, содержащий сайт связывания с рибосомами, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в условиях, описанных выше, лигазной смесью трансформируют клетки E. coli XL-1 blue
Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина в течение ночи при 37oC. Клоны анализируют при помощи рестрикционного анализа и отбирают плазмиду pGSDI.
5' CAGGAGGAGAT
3' TGGAGTCCTCCTCTAGCAC
1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества плазмидной ДНК pGT, гидролизованной рестриктазами SacI и XbaI и синтетического фрагмента ДНК, содержащий сайт связывания с рибосомами, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в условиях, описанных выше, лигазной смесью трансформируют клетки E. coli XL-1 blue
Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина в течение ночи при 37oC. Клоны анализируют при помощи рестрикционного анализа и отбирают плазмиду pGSDI.
10 мкг плазмидной ДНК pGSDI расщепляют последовательно сначала рестриктазой BglII в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCI, pH 7,6, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCI, 1 мМ ДТТ, 20 ед.активности рестриктазы BglII, в объеме 100 мкл при 37oC в течение 1 час., а затем рестриктазой HindIII, в условиях, описанных выше. Обработанную таким образом ДНК очищают в ПААГ.
Фрагмент ДНК размером 1250 п.о., кодирующий ген E ВКЭ без гидрофобного C-конца получают методом полимеразной цепной реакции. Для этого составляют реакционную смесь, содержащую 60 мМ Трис-HCl, pH 8,3, 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 1 мM ДТТ, смесь dNTP в концентрации 0,2 мМ,праймер N1 5' CTGAGATCTATGTATGCCTCACGATGCAC и праймер N2 5' CCCAAGCTTATATGCCTTCCTGGTTT (в конечной концентрации 40 рМ) ДНК-матрицу, представляющую плазмидную ДНК pBR327, со встроенным геном E ВКЭ штамма 205 /Мол. Генетика, микробиол. и вирус., 1991, N 3, 23 - 29 / (конечная концентрация 0,001 рМ) 5 ед.активности Tte-полимеразы.
Реакционную смесь инкубируют при 94oC 5 мин., а затем проводят цикл амплификации со следующими параметрами: 1 мин при 55oC (гибридизация праймеров), 2 мин при 72oC (элонгация праймеров), 1 мин при 94oC (денатурация ДНК). Цикл амплификации повторяют 25 раз. После последнего цикла амплификации реакционную смесь инкубируют при 72oC 10 мин.
5 мкг фрагмента ДНК размером 1250 п. о., полученного методом ПЦР обрабатывают последовательно рестриктазами BglII, а затем HindIII в условиях, описанных выше. Обработанную таким образом ДНК очищают в ПААГ.
1 мкг суммарной ДНК, состоящей из эквимолярного количества фрагмента BglII - HindIII размером 1250 п.о., содержащего ген E ВКЭ и векторной плазмиды pGSDI, обработанной рестриктазами BglII и HindIII, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в условиях, описанных выше. Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli BL-21(DE3).
Трансформанты выращивают на чашках Петри, содержащих 50 мг/л ампициллина, в течение ночи при 37oC. Клоны, содержащие плазмиду pGSDEl отбирают при помощи рестрикционного анализа.
Пример 2. Экспрессия белка E ВКЭ в клетках E.coli
Штамм E. coli, содержащий плазмиду pGSDEl, выращивают в 100 мл LB-среды при 37oC в присутствии ампициллина( 50 мг/л) до оптической плотности 0,6 о. е. при 650 нм, а затем индуцируют Т7 промотор добавлением в среду изопропил-β-тиогалактопиранозида(ИПТГ) до 0,6 мМ, продолжают инкубацию еще 4 часа. Клетки собирают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (ЕМВО Д., 1984,3,1429).
Штамм E. coli, содержащий плазмиду pGSDEl, выращивают в 100 мл LB-среды при 37oC в присутствии ампициллина( 50 мг/л) до оптической плотности 0,6 о. е. при 650 нм, а затем индуцируют Т7 промотор добавлением в среду изопропил-β-тиогалактопиранозида(ИПТГ) до 0,6 мМ, продолжают инкубацию еще 4 часа. Клетки собирают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (ЕМВО Д., 1984,3,1429).
Выделенные белки анализируют в 10%-ном ПААГ по стандартному методу Лэммли (Nature, 227, 680 - 685,1970). В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E.coli, содержащий векторную плазмиду pGSD1. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E. coli, содержащий плазмиду pGSDEl, экспрессирует полипептид с молекулярной массой 45 кДа. Продуктивность штамма составляет около 120 мг рекомбинантного белка на 1 литр клеточной суспензии.
Пример 3. Использование рекомбинантного белка E ВКЭ в качестве антигена в тест-системе.
Рекомбинантный белок сорбируют на полистирольные планшеты в карбонатном буфере (0,2М,pH 9,6) при температуре 4 - 2oC в течение 16 час. в количестве 100 мкл (при концентрации 4 мкг\мл). После удаления содержимого из лунок добавляют по 200 мкл буфера, содержащего 0,4% БSA, 0,05% Tween 20, 0,16M NaCI, 0,02 M фосфат натрия при pH 7,4. После инкубации в течение 1 часа при температуре 20oC, троекратно промывают планшет буфером ФСБТ (0,15М NaCL, 0,02М Na-фосфат pH 7,4, Tween 20 - 0,05%) Далее в лунки наносят панели положительных антисывороток (24 сыворотки с титром в РТПГА не менее 1\20) и отрицательных антисывороток (24 сыворотки по РТПГА), предварительно разведенных в 100 раз буфером ФСБТ с 2% КБР.
Для проверки чувствительности титруют противоклещевой иммуноглобулин (титр 1:640). В качестве отрицательного контроля используют сыворотку человека, не содержащую антител к ВКЭ. После инкубации в течение 1 часа при 37oC и троекратной отмывки планшеты ФСБТ в лунки добавляют по 100 мкл раствора коньюгата моноклональных антител к иммуноглобулинам человека с пероксидазой хрена в буфере ФСБТ. После инкубации в течение 1 часа при 37oC и пятикратной отмывки ФСБТ, в лунки добавляют по 100 мкл раствора ОФД в ЦФРБ. Через 30 мин при комнатной температуре останавливают реакцию добавлением 50 мкл 2N H2SO4 и учитывают результаты на спектрофотометре при длине волны 492 нм.
Для оценки результатов анализа вычисляют критический уровень оптической плотности
ОПкрит = ОПк-•2
Результаты анализа считают положительными, если ОП исследуемого образца превышает или равна ОП крит.
ОПкрит = ОПк-•2
Результаты анализа считают положительными, если ОП исследуемого образца превышает или равна ОП крит.
Получают следующие результаты.
Титр иммуноглобулинов - 1/12800 (титр в реакции РТПГА - 1/640).
В панели положительных сывороток из 24 сработало 23 как положительные (чувствительность - 95,8% относительно РТПГА).
В панели отрицательных сывороток из 24 сработали как отрицательные все 24 сыворотки ( специфичность 100: относительно РТПГА).
Таким образом, получена плазмидная ДНК pGSDEl, кодирующая белок E ВКЭ и штамм Escherichia coli, продуцирующий белок E вируса клещевого энцефалита. Рекомбинантный белок может быть использован в качестве антигена в тест-системах к вирусу клещевого энцефалита.
Claims (1)
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGSDE1, кодирующая белок E вируса клещевого энцефалита с мол. м. 2,4 МД (4067 п.о.), содержащая: HindIII-Scal - фрагмент плазмиды pEZZT318 размером 1165 п.о., содержащий p-независимый терминатор транскрипции триптофанового оперона E.coli(trpT) вместе с N-концевым фрагментом гена устойчивости к ампициллину (BIa); ScaI-SacI - фрагмент плазмиды pGEM1, размером 1640 п.о., включающий T7-промотор, C-концевую часть гена BIa, а также точку начала репликации; Sacl-BglII - синтетический фрагмент длиной 12 п.о., содержащий сайт связывания с рибосомами; BglII-HindIII - фрагмент, полученный методом ПЦР, размером 1250 п.о., содержащий стартующий ATG-кодон, кодирующую часть гена E ВКЭ без гидрофобного якоря,
а также терминирующий кодон ТАА; один участок расщепления рестриктазы BglII; один участок расщепления рестриктазы HindIII, расположенный на расстоянии 1250 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке; один участок расщепления рестриктазы ScaI, расположенный на расстоянии 2897 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке; генетический маркер - Bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от 1027 до 1887 п.о. вправо от BglII сайта; промотор Т7 РНК-полимеразы, расположенный на 16 п.о. левее BglII сайта (позиции 4055 - 4039 п.о.); ген E ВКЭ, расположенный на участке от 9 до 1259 п.о. по часовой стрелке от BglII сайта и имеющий собственный бактериальный участок связывания с рибосомами и инициирующий ATG-кодон, а также стоп-кодон ТАА.
а также терминирующий кодон ТАА; один участок расщепления рестриктазы BglII; один участок расщепления рестриктазы HindIII, расположенный на расстоянии 1250 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке; один участок расщепления рестриктазы ScaI, расположенный на расстоянии 2897 п.о. от сайта BglII по часовой стрелке; генетический маркер - Bla-ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, расположенный в участке от 1027 до 1887 п.о. вправо от BglII сайта; промотор Т7 РНК-полимеразы, расположенный на 16 п.о. левее BglII сайта (позиции 4055 - 4039 п.о.); ген E ВКЭ, расположенный на участке от 9 до 1259 п.о. по часовой стрелке от BglII сайта и имеющий собственный бактериальный участок связывания с рибосомами и инициирующий ATG-кодон, а также стоп-кодон ТАА.
2 Штамм бактерий Escherichia coli GSDE1 - продуцент рекомбинантного белка E вируса клещевого энцефалита, предназначенного для определения антител к ВКЭ.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU97114729A RU2136754C1 (ru) | 1997-09-02 | 1997-09-02 | Рекомбинантная плазмидная днк pgsdei, кодирующая белок e вируса клещевого энцефалита и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка e вируса клещевого энцефалита |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU97114729A RU2136754C1 (ru) | 1997-09-02 | 1997-09-02 | Рекомбинантная плазмидная днк pgsdei, кодирующая белок e вируса клещевого энцефалита и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка e вируса клещевого энцефалита |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU97114729A RU97114729A (ru) | 1999-07-20 |
RU2136754C1 true RU2136754C1 (ru) | 1999-09-10 |
Family
ID=20196835
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU97114729A RU2136754C1 (ru) | 1997-09-02 | 1997-09-02 | Рекомбинантная плазмидная днк pgsdei, кодирующая белок e вируса клещевого энцефалита и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка e вируса клещевого энцефалита |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2136754C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2562841C2 (ru) * | 2013-12-30 | 2015-09-10 | ЗАО "МБС-Технология" | Способ подготовки тканей клеща для биологических исследований |
-
1997
- 1997-09-02 RU RU97114729A patent/RU2136754C1/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2562841C2 (ru) * | 2013-12-30 | 2015-09-10 | ЗАО "МБС-Технология" | Способ подготовки тканей клеща для биологических исследований |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bhatnagar et al. | Studies on the mutator gene, mutT of Escherichia coli. Molecular cloning of the gene, purification of the gene product, and identification of a novel nucleoside triphosphatase. | |
Kort et al. | The xanthopsins: a new family of eubacterial blue‐light photoreceptors. | |
Hauser et al. | Nucleotide sequence of the streptococcal pyrogenic exotoxin type B gene and relationship between the toxin and the streptococcal proteinase precursor | |
Cole et al. | Nucleotide sequence and gene-polypeptide relationships of the glpABC operon encoding the anaerobic sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase of Escherichia coli K-12 | |
CA2413045C (en) | Expression system | |
Xu et al. | aldB, an RpoS-dependent gene in Escherichia coli encoding an aldehyde dehydrogenase that is repressed by Fis and activated by Crp | |
Donohue et al. | Cloning and expression of the Rhodobacter sphaeroides reaction center H gene | |
JP2006187286A (ja) | シュードモナス・アエルギノザの外部膜タンパク質f | |
US7824692B2 (en) | Ehrlichia disulfide bond formation proteins and uses thereof | |
JPS62500074A (ja) | バチルス スリンギエンシス 結晶タンパク質遺伝子毒素セグメント | |
JPH09173078A (ja) | 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法 | |
AU609725B2 (en) | Recombinant HTLV-III proteins and uses thereof | |
RU2136754C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pgsdei, кодирующая белок e вируса клещевого энцефалита и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка e вируса клещевого энцефалита | |
CN114213532B (zh) | 高亲和力的抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体的制备及其应用 | |
CN114214351A (zh) | 一种志贺氏菌多糖表达质粒及其用途 | |
RU2486243C1 (ru) | ПОЛИНУКЛЕОТИД, КОДИРУЮЩИЙ МУТАНТНУЮ РЕКОМБИНАНТНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ Neisseria meningitidis СЕРОГРУППЫ В, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ПОЛИНУКЛЕОТИД, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК, РЕКОМБИНАНТНАЯ IgA1 ПРОТЕАЗА Neisseria memingitidis СЕРОГРУППЫ В, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗРЕЛОЙ ФОРМЫ IgA1 ПРОТЕАЗЫ | |
Walker et al. | ToxR (RegA) activates Escherichia coli RNA polymerase to initiate transcription of Pseudomonas aeruginosa toxA | |
CA2507163C (en) | Streptococcus uberis adhesion molecule | |
RU2221868C2 (ru) | Ген l-аспарагиназы erwinia carotovora и штамм escherichia coli вкпм № в-8174 - продуцент l-аспарагиназы erwinia carotovora | |
RU2085586C1 (ru) | Полипептид 1106, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, фрагмент днк н 1106, кодирующий полипептид 1106, рекомбинантная плазмидная днк рн 1106, кодирующая полипептид 1106, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида 1106 | |
RU2453599C1 (ru) | НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНУЮ РЕКОМБИНАНТНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ B, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ АКТИВНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ, ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ, СОДЕРЖАЩИЙ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЗРЕЛУЮ ФОРМУ IgA1 ПРОТЕАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ Ig ПРОТЕАЗА NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ В, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗРЕЛОЙ ФОРМЫ IgA1 ПРОТЕАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ИММУНОГЕННЫМИ И ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ | |
RU2041949C1 (ru) | Фрагмент днк нс365, полипептид, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида, обладающего способностью связывать антитела к вирусу гепатита c | |
RU2073719C1 (ru) | Фрагмент днк нс 250, полученный с помощью химического синтеза, рекомбинантный полипептид нс 250 молекулярной массы 120 - 130 кда, обладающий способностью связывать антитела к продукту гена белка ns3 вируса гепатита с, полученный при культивировании штамма бактерий escherichia coli и штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного полипептида нс 250, обладающего способностью связывать антитела к продукту гена белка ns3 вируса гепатита с | |
RU2073718C1 (ru) | Фрагмент днк нс 280, полученный с помощью химического синтеза, рекомбинантный полипептид нс 280 молекулярной массы 120-130 кда, обладающий способностью связывать антитела к продукту гена белка ns4 вируса гепатита с, полученный при культивировании штамма бактерий escherichia coli - штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного полипептида нс 280, обладающего способностью связывать антитела к продукту гена белка ns4 вируса гепатита с | |
JPS60227681A (ja) | ジフテリア毒素のシグナルペプチドをコ−ドするヌクレオチド配列、このヌクレオチド配列を含有するベクタ−、これらによる微生物の形質転換およびこうして得られるペプチド組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070903 |