JPH03133384A - アスペルギラスのアシルトランスフェラーゼ活性をコードしているｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクター - Google Patents
アスペルギラスのアシルトランスフェラーゼ活性をコードしているｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクターInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
本発明は、アスペルギラス・ニデユランスのイソペニン
リンＮニアシルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性を
コードしているＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ化合物、該
ＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクターおよび組換
え宿主細胞、ならびに該ＤＮＡ配列を用いて有用な抗生
物質を製造する方法に関する。
リンＮニアシルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性を
コードしているＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ化合物、該
ＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクターおよび組換
え宿主細胞、ならびに該ＤＮＡ配列を用いて有用な抗生
物質を製造する方法に関する。
イオウ含有のβ−ラクタム系抗生物質は臨床的に最も重
要な抗生物質であり、フレミング（Ｆｌｅｍｉｎｇ）に
よるペニシリン類の発見以来、６０年近く、新規なβ−
ラクタム系化合物の単離が続けられている。ペニシリン
類とセファロスポリン類（セファマイシン類を含む）の
共通の構造的特徴はβ−ラクタム環である。 これらの抗生物質は種々の原核生物および低級真核生物
によって産生される。化合物ペニシリンＧ（ベンジルペ
ニシリン）またはペニシリンＶｌｌとするペニシリン類
は、糸状菌、特にペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕ＋ｎ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）によっ
て産生される。また、低級真核生物セファロスポリウム
・アクレモニウム（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａ
ｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）［アクレモニウム・クリソゲナム
（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）と
同義］からの産物として初めて単離されたセファロスポ
リン類は、セファマイノン類やその他のβ−ラクタム類
［例えば、オ牛ンベナム類（クラプラン酸）やカルバペ
ネム類（チェナマイシン）など］をも産生ずる多数の原
核生物、特にストレプトマイセス・クラブリゲラス（Ｓ
ｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅ？ｕｓ）
、Ｓ、リプマニー（Ｓ、 ｌｉｐｍａｎｉｉ）およびＳ
、カトレヤ（Ｓ、 ｃａｔｔｌｅｙａ）の中間代謝物で
もある。 β−ラクタム産生生物からの細胞不含の系の開発は、イ
オウ含有のβ−ラクタム類（ベニ７リン類およびセファ
ロスポリン類）の経路における生合成工程の樹立を可能
にした。 原核および低級真核の両生物によって産生されるセファ
ロスポリン類および糸状菌（例えば、Ｐクリソゲナム）
におけるペニシリン類の生成の最初の段階は同一である
。ＡＣＶシンテターゼが、アミノ酸前駆体Ｌ−α−アミ
ノアジペート、Ｌ−／スティンおよびＬ−バリンのトリ
ペプチドＬＬＤＡＣＶへの縮合を触媒する。次の段階で
、トリペプチドの環状化によって経路中に最初のβ−ラ
クタムが形成され、ペニシリン類、セファロスポリン類
およびセファマイシン類の全ての前駆体であるイソペニ
ンリンＮ（Ｉ ＰＮ）が得られる。 ＩＰＮの合成後、セファロスポリン類およびペニシリン
類への経路は分かれる。例えば、ペニシリウム・クリソ
ゲナムでは、ＩＰＮのα−アミノアジピル側鎖を、対応
するアシルＣｏＡから導かれる多数の銖水性側鎖（現在
では、およそ１００）の１つに交換することができる。 最もよ（知られた例の１つは、フェニルアセチルＣｏＡ
とＩＰＮからのペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）の
生成である。しかし、菌Ｃ，アクレモニウムでは、α−
アミノアジピル側鎖は異性化されてペニシリンＮが得ら
れる。次いで、ペニシリンの５員のチアゾリジン環は、
セファロスポリン類の特徴である６員のジヒドロチアジ
ン環に「拡張」される。この反応はデアセトキ／セファ
ロスポリンＣシンテターゼ（ＤＡＯＣ５）によって触媒
され、経路における最初のセファロスポリンであるデア
セトキシセフ１０スポリンＣ（ＤＡＯＣ）を生成する。 セファロスポリウム・アクレモニウムならびにグラム陽
性細菌ストレプトマイセス・クラブリゲラスおよびＳ、
ラクタマデュランス（Ｓ、 ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ
）由来のＤＡＯＣ３活性はその特徴が厳密に調べられて
いるが、この経路の残りの段階はよ（わかっていない。 本発明は、イソペニシリンベニアシルＣｏＡアシルトラ
ンスフェラーゼと呼ばれる、ペニシリン類の産生に関与
しているｌまたはそれ以上の活性をコードしている遺伝
子を提供するものである。 また、この活性はアシルトランスフェラーゼとしても知
られている。本発明は、過剰産生されうるβ−ラクタム
生合成酵素のレパートリ−を広げるものである。この能
力は、増加した遺伝子量による菌株の改良および基質類
似体の新規β−ラクタム類への生物変換を容易にする。 本発明は、２機能性の酵素イソペニシリンＮ；アシルＣ
ｏＡアシルトランスフェラーゼ（アシルトランスフェラ
ーゼ）をコードしているＤＮＡ配列を包含するものであ
る。この酵素をコードしている遺伝子はｐｅｎＤＥと命
名されている〔インボリアおよびクイーナ−（Ｉｎｇｏ
ｌｉａ、Ｔ、Ｄ、 ａｎｄ Ｑｕｅｅｎｅｒ、Ｓ。 １、 、 Ｍｅｄ、 ＣｈｅＩＩｌ、 Ｒｅｖ、 ９
： ２４５−２６４（１９８９））］。この２２機能は
、フェニルアセチルＣｏＡと６−アミツペニンラン酸ま
たはイソペニシリンＮのいずれかからのペニシリンＧの
生成を触媒するこの酵素の能力によっている。この反応
は重要な抗生物質ペニシリンＧの生合成における必須の
工程である。 この経路を第１図に示す。 本発明のＤＮＡ化合物はアシルトランスフェラーセ酵素
をコードしている。アシルトランスフェラーゼ活性をコ
ードしているＤＮＡ化合物は、アスペルギラス・ニデユ
ランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ１ｄｕｌａｎｓ）
のゲノムＤＮＡから単離した。このクローンしたアシル
トランスフェラーゼ遺伝子は、アスペルギラスまたはペ
ニンリウム中でペニシリンＧの収量を増加させるのに、
特にアシルトランスフェラーゼによって触媒される反応
が律速段階であるときに有用である。これは、遺伝子の
量を増加させることによって、および／または強力なプ
ロモーターの後ろに暗号領域を配置することによって達
成される。クローンした遺伝子（修飾を加えた形Ｑ！
）の別の用途は、組換えまたはアンチセンスＲＮＡの使
用によってアスペルギラス・ニデユランスのアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を不活性化して、エピメラーゼ（
ｃｅｒＤ）およびエクスパンダーゼ／ヒドロキンラーゼ
（ｃｅｒＥＦ）が細ｎ包中に導入されて同時に発現され
るときにセファロスポリン化合物を産生させることであ
る。 同じような使用を、ペニシリウム・クリソゲナムのアシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を用いて行うことができる
。アスペルギラス・ニデユランスのアシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子をハイブリダイゼーションプローブとして
用い、当業者には普通の方法によってペニシリウム・ク
リソゲナムのアシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離す
る。アシルトランスフェラーゼ遺伝子の不活性化と酵素
エピメラーゼ（ラセマーゼ）およびエクスパンダーゼを
コードしている遺伝子の追加によって、ベニ／リウム中
で大収量のセファロスポリン類を得ることができる。ア
シルトランスフェラーゼ遺伝子の不活性化は、例えば抗
生物質耐性遺伝子が挿入されたクローン化遺伝子による
遺伝子置換によって行うことができる。 アシルトランスフェラーゼ活性をコードしているＤＮＡ
化合物をアスペルギラス・ニデユランスのゲノムＤＮΔ
から単離し、これを用いて組換えＤＮＡ発現ベクターを
構築することができる。３種類のこれら発現ベクターが
特に有用である：即ち、第１のものは大腸菌（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）において、第２のものはペニシリウムにおいて、
そして第３のものはアスペルギラスにおいてアシルトラ
ンスフェラーゼタンパク質の高レベルの発現を導く。 以下、本発明をさらに詳しく説明する。本明細書中に開
示した発明を明瞭にし、その理解を助けるため、以下の
用語を定義する。 アシルトランスフェラーゼ活性ニアシルＣｏＡと６−ア
ミツペニ／ラン酸またはイソベニ７リンＮのいずれかか
らのペニシリン類の生成を触媒する酵素活性。 ａＴ ＰＮＳ ：アスペルギラス・ニデユランス由来の
イソペニシリンＮシンテターゼあるいはイソペニシリン
ＮシンテターゼをコードしているＤＮ八へ ａｍｄ Ｓ アセトアミダーゼ遺伝子；アスペルギラ
ス・ニデユランスのアセトアミダーゼ遺伝子を示すため
に図面中での用いられている。 ａｍｄｓ ｐ ： ａｍｄｓ遺伝子のプロモーターＡｍ
Ｒ・アンビンリン耐性を付与する遺伝子アンビンリン耐
性の表現型を示すためにも用いられる。 抗生物質：微生物によって産生される物質であって、天
然に、または限定された修飾によって、他の原核または
真核細胞の増殖を抑制するか、または死滅させる物質。 抗生物質生合成遺伝子ニー次中間代謝物を抗生物質に変
換するか、またはある抗生物質化合物を別の抗生物質化
合物に変換する過程における酵素反応に必要な活性をコ
ードしているＤＮＡセグメント。 抗生物質産生生物、抗生物質を産生ずるか、または発現
したときには抗生物質を産生ずるであろう遺伝子を含有
しているあらゆる生物であって、アスペルギラス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、
フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
、モノスポラ（Ｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、セファロスポリ
ウム（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｆｆｌ）、ペンロマ
イセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ボドスボラ（Ｐ
ｏｄｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（ｐＨｉＣｉｌｌｉ
ｔ＋ｎ＋）、およびノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）を
含むが、これらに限定はされない。 抗生物質耐性を付与する遺伝子：抗生物質に対する耐性
を付与する活性をコードしているＤＮＡセグメント。 ＡｐＲ・アンピンリン耐性を付与する遺伝子：アンビン
リン耐性の表現型を示すためにも用いられる。 ＡＴ・アシルトランスフェラーゼ遺伝子。 ｂＩ）：２本鎖ＤＮＡの塩基対。 ｃ＋ｓ５７：λｐＬプロモーターの温度感受性リブレ、
サーをコードしている遺伝子。 クローニンク二組換えＤＮＡクローニングベクターにＤ
ＮＡセグメントを導入する過程。 暗号配列：遺伝子中のＤＮＡ配列であって、該遺伝子に
よって発現されるタンパク質のアミノ酸残基配列、また
はｒＲＮＡもしくはｔＲＮＡ遺伝子の場合には該遺伝子
によって発現されるｒＲＮＡもしくはｔＲＮＡのＲＮＡ
配列のどちらかをコードしている配列。 フスミド：ブラスミドと同じ方法で宿主細胞中で？９製
することができるが、ファージのパ、ケージング機序を
も利用することができる組換えＤＮＡクローニングベク
ター 遺伝子：遺伝子産物、即ちタンパク質（従って、必然的
にｍＲＮＡ）、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡのいずれかを発
現させるように配置されたプロモーター翻訳活性化配列
、暗号配列、および３゛調節配列を含有するＤＮＡセグ
メント。 ゲノムライブラリ−・実質的に特定の生物の全ゲノムに
相当するＤＮＡセグメントがクローニングされた一群の
組換えＤＮＡクローニングベクタハイブリダイゼーショ
ン：２つの１本鎖ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ分子をア
ニーリングして２本鎖の分子を形成させる過程；この分
子は完全な塩基り４となっていてもよいし、なっていな
くてもよい。 ＩＰＳまたはｌ ＰＮＳ ：イソペニシリンＮシンテタ
ーゼ。 イソペニシリンＮ：以下の構造を有する化合物：Ｉ イソペニシリンＮシンテターゼ：δ−（Ｌ−α−アミノ
アジピル）−し−システイニル−Ｄ−バリンからのイソ
ペニシリンＮの生成を触媒する酵素であり、シクラーゼ
としても知られている。 単離したＤＮＡ化合物：構築されたか、または合成され
たあらゆるＤＮＡ配列であって、その配列が見い出され
る生物のゲノムＤＮＡとは位置的に異なっているＤＮＡ
配列。 Ｉａｃｌ・大腸菌の１ａｃｌ遺伝子。 １ａｃＺα：大腸菌のＩａｃオペロンから導かれるプロ
モーターおよびβ−ガラクトンダーゼ（ｌａｃＺ）αフ
ラグメント。 Ｍ１３０Ｒ１：ファージＭ１３の複製起源。 ＭＣ３：多重クローニング部位。 ｍＲＮＡ：メソセンジャーリボ核酸。 ＯＲＩニブラスミドまたはベクターの複製起源であり、
ＤＮＡポリメラーゼの付着または開始部位として働＜
ＤＮＡ配列。 ｐＡＴｐ：ベニシリウム・クリソゲナムアシルトランス
フェラーゼのプロモーター ＰｅｎＤＮＡ：べ二ンリウム・クリソゲナム由来のＤＮ
Ａ０ ペニシリンＧ：以下の構造を有する化合物・ペニシリン
Ｎ：以下の構造を有する化合物ｐｈｌＲ：フレオマイシ
ン耐性遺伝子。 ｐＬ；バクテリオファージλ由来の左側プロモーター プロモーター：転写を導くか、または開始させるＤＮＡ
配列。 組換えＤＮＡクローニングベクター−１またはそれ以上
の別のＤＮＡ分子を付加したかまたは付加することがで
きるＤＮＡ分子からなる、自律的に復製するかまたは組
込まれるあらゆる媒体であり、プラスミドを含むがこれ
に限定はされない。 組換えＤＮＡ発現ベクター：研究用ある０は産業上興味
あるポリペプチドまたはＩＩＩＡをコードしているＤＮ
Ａセグメントを発現させるように配置されたプロモータ
ーおよびその他の調節配列を含有する、自律的に複製す
るかまたは組込まＡするあらゆる媒体であり、プラスミ
ドを含むかこれ１こ限定はされない。 組換えｌ’）ＮＡベクター；あらゆる組換えＤＮＡクロ
ーニングベクターまたは発現ベクター制限フラグメント
・１またはそれ以上の酵素の作用によって生成したあら
ゆる直線状のＤＮＡ分子。 ｒ ＲＮＡ 、”Ｊボソームリホ核酸。 感受性宿主細胞：ある抗生物質に対する耐性を付与する
ＤＮＡセグメントなしでは、その抗生物質の存在下で増
殖することができないか、または増殖が抑制される宿主
細胞。 ＴｃＲ：テトラサイクリン耐性を付与する遺伝子：テト
ラサイクリン耐性の表現型を示すためにも用いる。 転写ターミネータ−・ＲＮＡポリメラーゼによるＤ Ｎ
Ａ転写の終止を合図するＤＮＡ配列。 トランスフエクタント：ファージ粒子中にバクケーンン
グされたＤＮＡによる、またはファージＤＮＡによる形
質転換を受けた受容宿主細胞。 形質転換体、形質転換を受けた受容宿主細胞。 形質転換：遺伝子型を変化させ、受容細胞が変化するこ
とになる、受容宿主細胞中へのＤＮＡの導入。 翻訳活性化配列：ｍＲＮＡに転写されたときにｍＲＮＡ
のタンパク質への翻訳を促進する調節ＤＮＡ配列。 ＬＲＮＡ：転移リボ核酸。 添付した図面に示されている制限部位および機能地図は
、本明細書中に記載の組換えＤＮＡベクターの概要を示
すものである。制限部位の情報は全てを示すものではな
い。従って、この地図に実際に示されている制限部位よ
り多数のある型の制限部位がベクター上に存在すること
もある。 第１図は、アシルトランスフェラーゼの反応を示す模式
図であり、 第２図は、β−ラクタム生合成経路を示す模式第３図は
、プラスミドｐＯＧＯ４の制限部位および機能地図の模
式図であり、 第４図は、プラスミドｐＵＴ７１５の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第５図は、プラスミド１）ＬＣ２の制限部位および機能
地図の模式図であり、 第６図は、プラスミドｐＫＣ７８７の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第７図は、プラスミドｐＲＨ５の制限部位および機能地
図の模式図であり、 第８図は、プラスミドｐＯＷ１０６１の制限部位および
機能地図の模式図であり、 第９図は、プラスミドｐＯＷ１０６２の制限部位および
機能地図の模式図であり、 第１．０図は、プラスミドｐＯＷ１０６３の制限部位お
よび機能地図の模式図であり、 第１１図は、プラスミドｐＯＷ１０６４の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１２図は、プラスミドｐＯＷ］０６５の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１３図は、プラスミドｐＰＳ９５の制限部位および機
能地図の模式図である。 本発明は、アスペルギラス・ニデユランスのイソベニ７
リンＮ：アシルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性を
コードしているＤＮＡ配列を含有する単離したＤＮＡ化
合物を含んでいる。また、本発明は、アスペルギラス・
ニデユランスのアシルトランスフェラーゼ活性をコード
しているＤＮＡ化合物ならびに組換えＤＮＡクローニン
グベクターおよび発現ベクターをも含んでいる。アスペ
ルギラス・ニデユランスのアシルトランスフェラーゼを
コードしているＤＮＡの配列を、Ａ、ニデユランスゲノ
ム中の暗号領域の５′および３゛末端と境界を接してい
るＤＮＡの一部と共に以下に示す。 この配列においては、２本鎖ＤＮＡ分子の解読鎖だけを
示し、５゛→３゛の方向で左から右にＤＮＡを示した。 ヌクレオチド配列には数を付した（数はＤＮＡ配列の左
側に付した）。 ４５１ ＣＴＴＧＣＣＡＡＧＧ ＴＡＣＣＣＣＣＴ
ＣＣＧＡＡＧＴＡＡＧＴＣＣＡτＡＣＣＣＧＡＡ ＴＧ
ＴＡＴＡＴＴｒＧ５０１ ＣＣＣＡＴＡｍＡ ＡＣＧ
ＣＣＴＡＴＡＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧ ＧＣＴＡＴＣＡ
ＣＣＡ ＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴ６５１ ＴＧＧＡＧＣ
ＡＧＧＴ ＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧ ＣＧＣＴＧＧＣＣＧ
Ａ ＧＡＴＡＣＴＡＴＧＡ ＧＧｋＡＡＴＣ”ｒＧＣ７
０１ＧＧＴＡＴＧＴｒＴＡ ＣＣＴＡＣＧｎＣＴ ｎＡ
ＣＴＴＧＣＴＧ ＡＡＴＣＡＣＣＣＣＧ ＴＴＧＡＣＧ
ＧＡＡＴ９５１ ＡＡＣＣ（ｉｃｃＡＴｒ ＣＣＧＧ
ＣＡＧＴＴＣＴｒＣＡＣＣＧＣＡＡ ＣＣＡＡＡＧＡＡ
ＡＡ ＣＴｍ；ＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＡＣＴ Ａ
ＣＡＣＣＴＡＣＡＴ ＧＧＣＣＴＣＣＧＴＣＣＣＡＣＴ
ＧＧＣＣＴ ＣＣＣＣＴＣＧＣＡＴＣＴＣＧＣＧＣＴＧ
ＣＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴ ＣＧＡＡＡＧＴＡＣＡ ＴＣ
ＴＣＣＧＴＣＴＧ ＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴ
ＣＧＴＣＴＣＧＣＡＡＧＧＧＧ ＧＣＡＴＧＧＣＧＧＣ
ＴＡＧＣＧＣＣＴｒＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＡＡＣ
ＧＣＡＣＡ ＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＣＴＡＧＡＧ
Ｔ ＴＣＴＣＧＣＣＣＡＴ ＣＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＡ
ＧＣＡＡＧＴＴＧ ＣＴＧＡＣＡＣＣＡＡ ＴＧＧＧＣ
ＧＧＡＴＡ ＧＴＧＣＡＴＡＣＧＡ ＡＣＣＡＣＴＧＣ
ＣＴＣＣＴＣＭＣＣＡＴ ＧＧＧＣＣＡτＣＧＧ ＣＧ
ＣＡＡＧＡＧＣＴ ＴＡＡＴＣＣＣＣＴＧ ＣＣＧＧＡ
ＣＴＣＧＴＧＧＡＧＣＣにＣＣＡ ＣＧＧＧＣＧＧＡＴ
Ｇ ＧＡＡＣＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴｒＴ ＴＧ
ＡＣＧＧＣＡＣＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＴ ＴｒＧＣＧＡ
ＡＧＴＴ ＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴ
ＡＣＣＣＴＣＴＣＴＣＧＡＴＣＴＧＣＣＧＧ ＧＣＡ
ＴＡＴＡＡＧＧ ＡＡＧＧＧＡＡＡＡＧ ＴＡＧＡＧＧ
ＣＴＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＴＣＴｒ
ＣＧＡＴＣＡＴＧＴＧ ＧＧＣＣＣ，ＧＡＡＧＧ ＣＡ
ＡＣＡＧＴＧＣＧ ＧＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＡＡＴ
ＭＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＣｍＧＴＣＡＴＧ ＡＣＣ
ｍＡＧＣＡ ＡＴＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣ
Ｇ ＡＴＣＣＡＡＩＩ；ＣＣＡ ＡＣＡＴＩＴＧＡＣＣ
ＡＡＴＡＴＣＴＣＴｒ ＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＧＣＣＴ
ｒＣＴＧＣＡ ＧＴＣＴｒＣＴＣＣＡ ＧＣＣＡＴＡＧ
ＣＧＴ ＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴ ＧＡＡＣＡＣＴＴＣＴ
ＡＴＧＴＡＴＣＴｒＧ ＡＣＡＡＣＴＡＧＡＴ ＡＣＡ
ＡＧＴＣＡＡＡ ＡＧＧＣＧＡＡＴＣＡ ＡＡＴＡＡＡ
ＧＴＣＧＣＡＴＧ’ｆｆｒＧＧＧ ＡＧＭＴＧＣＡＣＧ
ＣＣＡＧＡＧＴＧＡＡ ＡＴＧＣＴＧＡＡＴＣＣＴＧ
ＴＴＧＧＣＴｒＴＣＡＣＭＣＣＡＧ ＧＴＧＣＣＴＡＡ
ＡＧ ＴＡＴＡＧＣＭＴＧ ＣＡＡＣＧＭＧＧＣＡＴＧ
ＣＣＴＡＧＴＣＴＡｃｃＴＴｃＴＴｒ ＣＣＣＴＡＡＡ
ＣＡＴ ＧＣＴｒＴＡＡＡＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＧＡ
ＡＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＣＡＴＴＣＣＡＧＡ ＡＣＴＡ
ＣＴＡＣＴＡ ＡＣＴｒＣＣＴＡＴＴ ＡＣＣＣＴＧＧ
ＡＧＴ ＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧ
ＡＣＣＴＣＴＣＡＡＴ ＣＣＴＴＣＣＴＡＡＣＣＴＴＧ
ＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡ、ＡＧＣ２０５１ ＴＣ
ＴＧＣＡＡＴＣＴ ＴＧＴｒＴＡＡＣＣＴ ＡＣＣＴＡ
ＧＧＡＣＴ ＣＡＣＧＡＡＧＡＣＴ ＣＣＣＴＣＡＧＴ
ＡＴ２１０１ ＧＡＡＧＴＴＧＡＴＡ ＡＡＧＧＴＴ
ＣＴｒＴ ＧＴＧＣＴＣＣＧＡＧ ＣＣＣＧＣＡＡＧＧ
Ｇ ＡＡＡＴＣＡＧＴＧＣｌＣＴＧＣＡＧＡＡ ２５５１ ＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧ ＧＴｒＴＴＴＴＧ
ＡＡ ＴＡＴＴ１’ＣＡＡＴＴ ＧＧＣｍＣＣＡＣＣＡ
ＴＡＡＴＡＴＡＴ２６０１ ＧＡＴｒＡＴＡＧＴＴ
ＡＣＴＡＡＴＴＡＧＡ ＣＴＡＣＴｒＣＴＡＴ ＡＧＣ
ＡＡＡＧＣＴＴ［配列中、Ａはデオ牛ンアデニル残基、
Ｇはデオキングアニル残基、Ｃはデオキ７／チジル残基
、そしてＴはチミジル残基であるコ。 以下の配列は、先に挙げたＤＮＡ配列によってコードさ
れているアミノ酸配列である。位置４３８のメチオニ／
コドンの前のＤＮＡ配列は５°非非翻訳化列である。最
初のエクソンは塩基４３８−４７３で構成され、第２は
５２７−７０１で、第３は７５７−９０８で、そして第
４は９６８−１６７５で構成される。１６７６から末端
までの配列は３゛非翻訳化領域である。各イントロンの
最初と最後の塩基には星印を付けた。 ＧｌｙＳｅ ｒＡｌａＡｌａＬｙｓ ＧｌｙＧｌｕＩ
１ ｅＡｌａ Ｌｙ ｓＡｌ ａ Ｉ １ｅＡｓｐＰｈ
ｅＡ １ａＴｈ ｒＧｌｙＬｅｕＩ １ｅＨｉ ５９ｏ
ＩＡＣＴＧＧＧＡＣＧＴＡＧＧＴＴＡＴｒＡＧＡＴＣＣ
ＡＣＧＧＴＣＴＧＣＴＡＴＣＴＡｒｐＡｓｐ ．６８＋、ＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴ
ＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴ
ＡＧＣＧＴＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴ ｌ、４゜、 ７４ｉ
、ＧＡＡＣＡＣＴＴＣＴＡＴＧＴＡＴＣＴＴＧＡＣＡＡ
ＣＴＡＧＡＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡＴＣ
ＡＡＡＴＡＡＡＧＴＣＧ 、８ｏ。 、８ｏ、ＣＡＴＧＴＴＴＧＧＧＡＧＡＡＴＧＣＡＣＧＣ
ＣＡＧＡＧＴＧＡｋＡＴＧＣＴＧＡＡ
、８６゜、８６．ＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＩ
Ｉ：ＣＡＡＴＧＣＡＡＣＧＡＡＧＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧ
ＴＣＴＡＧＣＴｒＣＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡＣＡＴ 、９
２゜、９２．ＧＣＴＴ丁ＡＡＡＴＣＴＡ、ＡＴＡＣＧＡ
ＧＡＡＴ丁ＡＴＴＴＡＡＡにＣＡＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴ
ＡＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＣＴＡＴＴ １９ｓ。 ［配列中、Ａｌａはアラニン残基、Ａｒｇはアルギニン
残基、Ａｓｎはアスパラギン残基、Ａｓｐはアスパラギ
ン酸残基、Ｃｙｓは／スティン残基、Ｇｌｎはグルタミ
ン残基、Ｇｌｕはグルタミン酸残基、ＧＩＹはグリンノ
残基、Ｈｉｓはヒスチンン残基、Ｉｌｅはイソロイシン
残基ど、ｅｕはロイノン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｍ
ｅｔハメチオニン残基、Ｐｈｅはフェニルアラニン残基
、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒ
はトレオニン残基、Ｔｒｐはトリプトファン残基、Ｔｙ
ｒはチロシン残基、そしてＶａｔはバリン残基である］
。 上記のＤＮＡ配列が本発明の重要な部分であることは当
業者の認めるところであろう。上記の配列は、通常、完
全に保護されたデオキシリボヌクレオチド ビルディン
グブロノクを用い、改良ホスホトリエステル法によって
合成することができる。このような合成法は当分野でよ
く知られており、実質的にイタクラ等［１ｔａｋｕｒａ
ｅｔ ａｔ、、 １９７７Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋９８：
１０５６コおよびフレア等［Ｃｒｅａ ｅｔ ａｔ。 １９７ｇ＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、＾ｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳ＾７５：５７６５］の方法に従って行うこと
ができる。さらに、特に好ましい方法は、シン等［Ｈｓ
ｉｕｎｇ ｅｔ ａｌ、、１９８３．Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １１：３２２７］および
ナラング等［Ｎａｒａｎｇｅｔ ａｔ、、 １９８０．
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：
９０］が開示している。上に挙げたマニュアルの方法に
加えて、 Ａ、Ｂ Ｓ ［＾ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ＋８．５ＯＬｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒ
ｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ、ＣＡ
９４４０４コ３８０Ａ ＤＮＡ合成機などの目動
ＤＮＡ合成機を用いてＤＮＡ配列を合成することができ
る。また、このＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応によ
って調製することもできるし例えば、米国特許Ｎｏ、４
．８００１５９および４．６８３．２０２、および欧州
特許公開Ｎ ｏ、 ０２５８０１７（１９８７年３月２
日公開）を繋照］。 上に示したア／ルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸残
基配列は、アミノ酸残基のほとんどが１以上のＤＮＡ
トリプレットによってコードされるので、多数の別のＤ
ＮＡ配列によってコードされうる。これらの別のＤＮＡ
配列は同一の本発明のアミノ酸残基配列をコードしてい
るので、本発明はこれら別の配列をも包含するものであ
る。 本発明は、アスペルギラス・ニデユランスのアシルトラ
ンスフェラーゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物なら
びに組換えＤＮＡクローニンクベクターおよび発現ベク
ターを包含している。本発明のアノルトランスフエラー
ゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物は、Ａ ニデユラ
ンスの株から単離した。Ａ、ニデユランス株の全ゲノム
ＤＮＡのゲノムライブラリーを作成し、デオキ／ツボオ
リゴヌクレオチドプローブに相同な配列の存在について
試験した。このプローブは、ペニシリウム・クリソゲナ
ムのアシルトランスフェラーゼのアミ／末端アミノ酸配
列について得られている情報および遺伝コードの知識に
従って作成した。ＤＮＡの配列決定によって、Δ、ニデ
ュランスアアシトランスフエラーゼのオーブン・リーデ
ィング・フレームが明らかになった。 アスペルギラス・ニデユランスのアシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子は、ノーイン・リージョナル・リサーチ・ラ
ボラトリーズ［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｌ？ｅｇｉｏｎａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎ Ｒ
ＲＬ ）、 Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ ６１
６０４］に受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８１７１のちと
で寄託されている大腸菌に１２ ＪＭ１０９中のプラ
スミドｐＯＧＯ４から〜２．１ｋｂのＰ ｖｕ ＩＳ
ｐｈ Ｉフラグメントとして単離することができる。プ
ラスミドｐＯＧＯ４の制限部位および機能地図を添付の
第３図に示す。 プラスミドｐＯＧｏ４は、本発明の池の発現ベクターの
構築のだめの有用な出発物質となる。これらのベクター
は、紹換え宿主細胞中でア／ルトランスフェラーゼ活性
を産生させる方法であって、（１） （ａ）プロモータ
ーおよび翻訳活性化配列、および（ｂ）ア／ルトランス
フェラーゼ活性をコードしているＤＮＡ配列でありて該
プロモーターおよび翻訳活性化配列から発現されるよう
に設置されているＤＮＡ配列、を含有する組換えＤＮＡ
発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、そして（２）上
程（１）で形質転換した宿主細胞を該ア／ルトランスフ
ェラーゼ活性を発現させる条件下で培徨する ことからなる方法において特に有用である。 プラスミドｐｏｃ○４は、大腸菌ＫＩ２ＪＭＩ０９／ｐ
ＯＧＯ４から、実施例Ｉに記載した方法によって単離す
ることができる。プラスミドｐ。 ＧＯｌｌは無傷のアスペルギラス・ニデユランスのアシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を含有しており、こ１ｔを
、例えばこのプラスミドから〜２．ＩｋｂのＰνｕｌ−
３ｐｈｌ制限フラグメントとして単離することができる
。 本発明のアシルトランスフェラーゼ発現ベクターは特定
の選択マーカーに限定されない。多数の選択マーカーが
アシルトランスフェラーゼ発現ベクターに用いるのに適
していることは当業者の認めるところである。このよう
な選択マーカーには、１ケはば、カナマイシン耐性を付
与する遺伝子、クロラムフェニコール耐性を付与する遺
伝子、またはその他の抗生物質耐性を付与する遺伝子が
含まれる。アスペルギラスおよびペニシリウムにおいて
有用なマーカーは、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ
）およびフレオマイ／ン耐性遺伝子（ｐｈｌＲ）である
。アンピシリン耐性遺伝子を含有する発現ベクターは、
この遺伝子が発現時に反応生成物を分解するであろうβ
−ラクタマーゼをコードしているので、有用性が少ない
。 原核生物の系においては、発現のために必要なら部位特
異的な突然変異誘発および制限酵素消化法を用いて、遺
伝子のイントロン（上記のＤＮＡ配列に示されている）
を除去することができる。 また、この遺伝子をハイブリダイゼーションプローブと
して用いて、必ずしもイントロンを含んでおらず、従っ
て原核生物中で発現させることができるｃＤＮＡクロー
ンを単離することもできる。 このように並んでいるベクターおよび形質転換微生物を
得るのに必要な方法の全ては当業者には周知である。こ
のような態様の全ては本発明の範囲内にある。 本発明は本明細書中に例示した特定のベクターに限定さ
れるものではない。本発明は、アスペルギラス・ニデユ
ランスのアシルトランスフェラーゼ活性をコードしてい
るＤＮＡ化合物を包含するものである。本発明のＤＮＡ
化合物を用いて、発現ベクターが復製するかまたはｘ■
込まれ、そしてプロモーターおよび翻訳活性化配列が機
能する任意の宿主細胞中でアシルトランスフェラーゼ活
性を発現させる発現ベクターを構築することができる。 従って、本発明は、大腸菌中でアシルトランスフェラー
ゼタンパク質を発現させる任意の大腸菌発現プラスミド
またはベクターを包含するものである。即ち、本発明は
、大腸菌中で機能するレプリコン、例えばｐＢ Ｒ３２
２、ｐＡｃＹｃ１８４、Ｆ、Ｃｏ１Ｖ−に９４、Ｒ１、
Ｒ６−５、あるいはＲ１００などのプラスミド由来のレ
プリコンを利用し、そしてアシルトランスフェラーゼタ
ンパク質を発現させる発現ベクターを包含している。 また、本発明は、もっばらプラスミドベクターに限定さ
れるものでもなく、組込みあるいはウィルス′ｆ製を利
用して宿主細胞中で１９製および維持され、モしてアシ
ルトランスフェラーゼタンパク質を発現する発現ベクタ
ーをも含んでいる。 本発明はア／ルトラ／スフエラーゼ遺伝子を発現させる
特定のプロモーターおよび翻訳活性化配列に限定される
ものではない。本発明は大腸菌中て機能するあらゆるプ
ロモーターおよび翻訳活性化配列を用いることを包含す
るものであり、これらを大腸菌中でアシルトランスフェ
ラーゼタンパク質を発現させるために用いる。大腸菌中
で機能する多数のプロモーターおよび翻訳活性化配列か
知られており、大腸菌中でアシルトランスフェラーゼタ
ンパク質を発現させるのに適している。 このような転写および翻訳活性化配列には、１ＰｐｓＩ
ａｃ、 ｔｒｐ、 Ｌａｃ、λｐＬ、およびλｐＲプロ
モーターおよび翻訳活性化配列が含まれるが、これらに
限定はされない。 さらに、他の生物由来の転写および翻訳活性化配列を本
発明のアシルトランスフェラーゼ活性をコードしている
Ｄ Ｎ Ａ化合物に連結して、活性化配列が機能する宿
主細胞中でアシルトランスフェラーゼ活性を発現させる
発現ベクターを得ることができる。大腸菌以外の宿主細
胞中でアシルトランスフェラーゼ活性を発現させるベク
ターも、特に、ある生物の抗生物質の産生能力および効
率を増大させる目的のためには有用である。 多種の生物がβ−ラクタム系抗生物質を産生ずる。以下
の第１表はβ−ラクタム系抗生物質を産生ずる生物を挙
げるものであるが、これらに限定はされない。 （以下、余白） ＾ｒａｃｈｎｏｍｙｃｅｓ ＋１１１ｎ１ｍＬｌｓ ＾ｎ１ｘｉｏｐｓｔｓ ｐｅｒｕｖｉａｎａ ＾ｓｐｅｒｇｉｌ Ｉｕｓ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎ＋ｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ ｐｏｌｙａｌｅｕｒｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ｃｕｒｔｉｐｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌｏｐｓｉｓ ｔｅｒｒｉｃｏｌａ ｆｆｌｌｎｌｌｌｌａ ｓｙｎｎｅｍａｔｉｃｏｌａ ｌａｂｒａ ｍｉｒａｂｉ ｌｉｓ ペニシリン類および セファロスポリン類 ペニシリン類および セファロスポリン類 ペニシリン類 ペニシリン類および セファロスポリン類 種々のβ ラクタム類 ペニシリン類および セファロスポリン類 第１表（続き） 生 物 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｌａｃｔａｍａｄｕｒａｎｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ Ｐａｅｃ ｉ Ｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｎｅｕｓ ｐｅｒｓｉｃｉｎｕｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌ＋ｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ Ｓｅｒｒａｊ＋ａ Ｓｐｉｒｏｉｄｉｕｍ ｕｓｃｕｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ ｃａｔｔｌｅｙａ ｃｈａｒｔｒｅｕｓ＋ｓ 抗生物質 種々のβ−ラクタム類 種々のβ−ラクタム類 セファマイシンＣ ノカルジシン ペニシリン類および セファロスポリン類 種々のペニシリン類 および他のβ−ラクタム類 種々のβ−ラクタム類 ペニシリン類および セファロスポリン類 クラプラン酸 アスバレ／マイシンＡ１ ＭＭ ４５５０、およびＭＭ ［９０２チエナマイ／ン ＳＦ １６２３および セファマイシンＡおよびＢ 第１表（続き） ＳｔｒｅｐｔｏＩＩｌｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ ｃｌａｖｕｌ ｉｇｅｒｕｓ ｆ ＋ｍｂｒｉａｔｕｓ ｒ ｌ ａｖｏｖ ｉ ｒｅｎｓ ｌａｖｕｓ ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ ｇｒ＋ｓｅｕｓ ｈａｌｓＬｅｄｉ ｈｅＬｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ＋ｃｕｓ Ｉｉｐｍａｎｉｉ セファマイシンＡおよびＢ ＰＡ−３２４１３−１、セファマイシンＣ１＾１６８８
６＾、ペニシリン類、セファロスポリン類、クラプラン
酸、 およびその他のフラバム類 セファマイシンＡおよびＢ ＭＭ ４５５０およびＭＶ １３９０２ＭＭ ４５５０
およびＭ！Ａ １３９（１２ＭＭ ４５５ＧおよびＭＭ
１３９０２セフアマイシンＡおよびＢ１ ならびにカルペチマイ／ン ＡおよびＢ セファマイシンＡおよびＢ Ｃ２Ｑ＆ｌＸ、および セファマイシンＡおよびＢ デアセトキ／−セファロス ポリンＣ セファマイシン、ペニシリンＮ１ ７−ノドキンセファロスボリンＣ１ 可士未（続き） ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｎａｙｅｎｓＩｓ ｐｌｕｒａｃｉｄｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓｏｃｈｅｉ ＳＩＯＹａｅｎＳＩＳ Ｒ０Ａ−６１２９ Ｆｌｉ ＫＣ−６６４３ ｔｏｋｕｎｏｍｅｎｓ＋ｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ エビチェナマイ／ンＦ１ ＭＭ４５５０、およびＭＭ１３９０２ Ｃ２０８１Ｘおよび セファマイシンΔおよびＢ ブルラノドマインノＡ セファマイシンＡおよびＢ ！１１Ｍ４５５０およびＭＭＨ９０２ ０＾−６１２９人 カルペチマイシンＡ アスバレノマイ／ンｌ＼ セファマイノン八およびＢ 上記のβ−ラクタム系抗生物質を産生ずる生物の一部は
、抗生物質の製造を目的とする医薬工業で用いられる。 これら生物の抗生物質産生能力は、発酵中に抗生物質生
合成酵素の細胞内４変を増ＩｎＩＩさせることによって
増大させ、そしてさらに効率良くすることができる。本
光明のア／ルトラ／スフェラーゼ活性をコードしている
Ｄ Ｎ Ａ化合物を用いることによって、適当な宿主細
胞に導入したときに形質転換宿主細胞のアシルトランス
フェラーゼ活性の細胞内濃度を増加させ、それによって
この細胞の抗生物質産生能力および効率を増大させる発
現ベクターを構築することができる（この宿主細胞が、
アシルトランスフェラーゼ活性が関与している中間反応
によってβ−ラクタム系抗生物質を産生ずるとき）。 ベクターが導入されるある宿主細胞のアシルトランスフ
ェラーゼ活性の細胞内肩ＦＫを増加させるであろうベク
ターは、次の要素を必要とする：ｌ）本発明のアシルト
ランスフェラーゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物、
および２）形質転換しようとする宿主細胞中で機能する
だけでなく、正しい配向および位置に配置されていてア
シルトランスフェラーゼ活性をコードしているＤＮＡを
発現させる、プロモーターおよび翻訳活性化配列。ベク
ターが染色体外要素として、またはゲノムＤＮＡに組込
まれて宿主細胞中で′ＦＭ製したときにだけ安定な形質
転換体を得ることができるのは勿論のことである。即ち
、好ましいベクターは、宿主細胞中でベクターを特異的
に？ｕｌさせるか、または組込ませる配列を含有する。 しかし、ＤＮＡが宿主細胞に導入されたときに非特異的
な組込みが起こることもあるので、そのような特異的な
複製または組込み配列の存在は絶対に必要なものではな
い。また、アシルトランスフェラーゼ発現ベクターは、
このベクターを含有している宿主細胞を選択するための
手段を与える抗生物質耐性付与遺伝子あるいはその他の
要素を含むこともできるが、このような選択しうる要素
は、ベクターが宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組込まれる
ときには必要でもないし、また望ましくもないであろう
。 アスペルギラス・ニデユランスのアシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子の暗号配列を提供することによって、本発明
は形質転換に感受性である任意の生物のためのアシルト
ランスフェラーゼ発現ベクターを提供するものである。 上記の大腸菌アシルトランスフェラーゼ発現ベクターは
、多種多様の本発明の発現ベクターを例示するものであ
る。しかし、本発明の多数の好ましいベクターを設計し
て、β−ラクタム系抗生物質（ペニシリン類およびセフ
ァロスポリン類を含む）を産生ずる細胞においてアシル
トランスフェラーゼを発現させる。 本発明のベニンリウムベクターは、そのようなβ−ラク
タム系抗生物質を産生する細胞からの抗生物質の収量を
増加させるために、あるいは、アシルトラノスフェラー
ゼの産生を中止させるために用いるベクターの場合には
、この細胞によって通常は産生される抗生物質を変える
ために使用しうる本発明提供のベクターの例示である。 アセトアミダーゼ遺伝子またはフレオマイノン耐性遺伝
子を含有しているアシルトランスフェラーゼ発現ベクタ
ーは、唯一の窒素供給源としてのアセトアミドのもとで
、またはフレオマイ／ンのび注下でＰ、クリソゲナムが
天然には増殖することができないことから栄養要求変異
種などの特別の受容菌株を：Ａラシすることが必要では
ないので、ベニ／リウム・クリソゲナム中に遺伝子を挿
入するためのベクターとして特に宵用である。形質転換
用プラスミド中の遺伝子による栄養要求変異種マーカー
の補足に基づく形質転換系はこの利点を有していない。 多面発現の突然変異は、ペニシリン産生を高度に発展さ
せたＰ、クリソゲナム株中に栄養要求変異種マーカーを
導入することに関係していることが多い。通常、このよ
うな突然変異は比較的少ないペニシリン産生の結果にな
る［マクドナルド等（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ
、 、 １９６３． Ｊ、 Ｇｅｎ！ｌ！１ｃｒｏｂｉ
ｏ１．３３ ： ３６５−３７４）ｌ。上記および実施
例中のベクターは、本発明によって提供される多種多様
のアシルトランスフェラーゼ発現ベクターの例示にすぎ
ない。 本発明のアシルトランスフェラーゼ発現ベクターは、多
くの細胞、特にβ−ラクタム系抗生物質を産生ずる細胞
においてアシルトランスフェラーゼ活性の細胞内濃度を
増加させるのにイ１用である。 プラスミドｐＯＧＯ４はアスペルギラス・ニデユランス
のア／ルトランスフエラーセ遺伝子の暗号配列を含有し
ている。プラスミドｐＯＧ０４由来のフラグメントを用
いて、ア／ルトランスフェラ−ゼ遺伝子のコピー数を増
加させ、従ってこの酵素の細胞内濃度を増加させるため
のベクターを構築することができる。本発明のアシルト
ランスフェラーゼ暗号配列はアスペルギラス宿主細胞か
ら単離されたので、このアシルトランスフェラーゼ暗号
配列は、アスペルギラス宿主細胞においてアシルトラン
スフェラーゼ活性を高レベルで発現するように設計した
発現ベクターで使用するのに特に適している。さらに、
多くのアスペルギラス遺伝子をペニシリウム中で発現さ
せるのは容易であるので、アスペルギラスのアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の高レベルの発現はペニシリウム
においても可能であろう。 また、本発明のアスペルギラス・ニデユランスのアシル
トランスフェラーゼ暗号配列をペニシリウムの菌株なら
びにセファロスポリウムの菌株、あるいは他の任意の宿
主細胞由来の転写および翻訳活性化配列の支配下に置い
て、これらの生物中で用いるための組換えアシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を構築することもできる。 アシルトランスフ、エラーゼ遺伝子の好ましい用途は、
エピメラーゼ（ラセマーゼ）およびエクスパンダーゼ酵
素をコードしている遺伝子を追加すると共にアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を破壊または移動させることによ
って、アスペルギラスおよびペニシリウム中で有用なセ
ファロスポリン類を生成させることである。アスペルギ
ラスにおいて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーが挿
入されたクローン化遺伝子との単一または二重乗換えに
よって、アスペルギラスゲノムのア／ルトランスフェラ
ーゼ遺伝子を破壊する。次いで、この細り包を、エクス
パンダーゼ［プラスミドｐＯＷ３８０（ＮＲＲＬ Ｂ
−１８２６４）から単離される〜３゜Ｏｋｂｔ７１Ｂ
ａＩＩＩＨｌ制限フラグメントとして入手できる］およ
びエピメラーゼ［プラスミドｐＯＷ３９０（ＮＲＲＬ
Ｂ−１８４３１，）から単離される〜３６ｋｂのＫ
ｐｎ ｌ制限フラグメントとして入手できる〕遺伝子を
含有するベクター（群）で形質転換する。これら遺伝子
に関する詳細な開示については、米国特許出願Ｎ ｏ、
０７／１９２．２７３（１９８８年５月９日出願）お
よび０７／２８８．７６０（１９８８年１２月２２日出
願）を参照。実施例はこの方法を説明している。 同様の方法が、ペニシリウムにおいて大量のセファロス
ポリン類を生成させるのに有用である。 ペニシリウムは、それが極めて大量のβ−ラクタム核を
産生ずるように修飾されており、それによってセファロ
スポリン類への変換のための大量の基質を与えるので、
使用するに特に好ましい生物である。ペニシリウム・ク
リソゲナムのア／ルトランスフェラーゼ遺伝子は、本発
明のアスペルギラスＤＮへ配列をハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いて単離することかできる。この遺
伝子は、八ＴＣＣ］、０２３８［アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレク／ヨン（八ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕ１Ｌｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、ＭＤ ２０８５２）から入手可能］なとの
、だれでも人手できるペニシリウム・クリソゲナムの株
から単離することができる。 ア／ルトランスフェラーゼ遺（云子の不活性化ハ遺伝子
の破壊または遺伝子の移動によって行うことができるが
、この２つの方法はア／ルトラ／スフェラーセ遺伝子の
コピーを１つだけ含有している宿主生物において最ち効
率的である。アシルトランスフェラーゼ遺伝子のコピー
を複数含有している生物については、アノルトランスフ
ェラーセｍＲＮＡにｔ［］？ｉｆｉ性のアンチセンスＲ
Ｎ Ａの発現かアシルトランスフェラーゼ活性を実質的
に減少させるであろう。 本発明は、ペニシリンＧ産生菌をセファロスボッ／産生
菌に変換する方法であって、 （＋）アシルトランスフェラーゼ遺伝子から導いたＤＮ
Ａ配列を含有する組換えＤＮΔヘクターでペニシリンＧ
産生菌細胞を形質転換し；＜ ２ ＞該ｔａ 細胞にお
けるアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を削除し、
そして （３）行程（２）の菌細胞を、エクスパンダーセおよび
エピメラーゼ酵素活性の発現をコードしている遺伝子を
含有する１またはそれ以上のベクターでＩＦニ”ｆｆｉ
中云杼Ｓす る ことを特徴とする方法を提供するものである。 セファロスポリン類は、得られた菌株をセファロスポリ
ンの産生に適した条件下で培養することによって得るこ
とができる。米国特許Ｎ ｏ、 ３．８４７゜７４２お
よび４．７６２．７８６、ならびに米国特許出願Ｎ。 Ｏ６／８０１．５２３（この出願は既に認可され、特許
料が支払われている）を参照。そのような条件は当業者
には周知である。 本発明は、ペニシリンＧ産生菌をセファロスポリン産生
菌に変換する別の方法であって、ベニ７リンＧ産生菌細
胞を、酵素エクスパンダーゼおよびエピメラーゼをコー
ドしている遺伝子、ならびに転写されてアシルトランス
フェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡに相補性であるＲＮＡ分子
を生成させうるＤ Ｎ Ａ配列を含有する１またはそれ
以上の組換えＤＮＡベクターで形質転換することを特徴
とする方法を提供するものである。 セファロスポリン類は、得られた菌株を、転写によって
ア／ルトランスフエラーゼのアンチセンスＲＮＡが産生
される条件下、および上記のようなセファロスポリンの
産生に適した条件下で培養することによって得ることが
できる。そのような条件は当業者には周知である。 また、本発明を利用して、化学的に製造することが難し
い化合物であるペニシリンＮを大量に製造することもて
きる。これは、始めにベニンリンＧ産生菌のアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の発現を組換えまたはアンチセン
スＲＮ Ａのいずれかによって削除し、次にこのような
菌にエピメラーゼ遺伝子を導入することによって行われ
る。即ち、本発明は、ペニシリンＧ産生菌をベニ／’）
７Ｎ産生菌に変換する２種類の方法を提供するものであ
って、その第１の方法は、ベニ７リンＧ産生菌細胞を、
酵素エピメラーゼをコードしている遺伝子、ならびに転
写されてアシルトランスフェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡに
ｔ目補性であるＲＮＡ分子を生成させうるＤＮＡ配列を
含有するｌまたはそれ以上の組換えＤＮＡベクターで形
質転換することを特徴とする。 ぺ二ノリンＮは、得られた菌細胞を、そのようなアシル
トランスフェラーゼ相補性のＲＮ Ａ分子が転写によっ
て産生される条件下、および上記のような抗生物質の産
生に適した条件下で培養することによって得ることがで
きる。そのような方法は当業者には周知である。 ペニシリン（４生菌をペニンリンＮ産生菌に変換する第
２の方法は、 （１）アンルトランスフェラーゼ遺伝子カラ導イたｔｌ
ＪＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクターでペニシリン
Ｇ産生菌細胞を形質転換し く２）該菌細胞におけるアシルトランスフェラーゼ遺伝
子の発現を削除し：そして （３）丁（呈（２）の菌細胞を、エピメラーゼ酵素活性
をコードしている遺伝子をａＮするベクターで形質転換
する： ことを特徴とする。 ペニシリンＮは、得られた菌細胞を上記のような抗生物
質の産生に適した条件下で培養することによってｉする
ことができる。そのような条件は当朶箭には周知である
。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものてはない。 実池例１ アスペルギラス・アシルトランスフェラーゼ
遺伝子の供給源 八 大腸菌Ｋ１２ＪＭＩ０９／ｐＯＧ０．４の培養大腸
菌に１２Ｊ〜１１０９／ｐＯＧｏｌＩの凍結乾燥品は、
ノーザノ・リーンヨナル・リサーチ・ラボラトリーズＩ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ１．ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎ ＲＲＬ ）、 Ｒ
ｅｏｒｉａ、 ＩＬ ６１６０４〕から取得番号ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１８１７１（寄託日：１９８７年２月６０）
のらとで入手でき、以下に記載の方法における１１培養
物」として直ちに使用することができる。 １００μｇ／ ｙｒＱのアンビンリンを含有するＴＹブ
ロス（ＩＱ当たりトリプトン８？、ＮａＣ１！５ｇ、酵
Ｉユ抽出物５ｇ）１りに大腸菌Ｋ１２ＪＭＩ０９／ｐＯ
Ｇ０．１の培養物を接種し、通気しなから３７°Ｃて−
ｆν（１５〜１８時間）インキュベートした。得られた
培養物をプラスミドｐｏｃｏ・１（第３［初）の供給、
原として（重用した。 Ｉ３ プラスミドｐＯＧＯ４の申離 実施例ＩＡて調・シソした培養物を、５ｏｒｖａｌｌ
Ｇ５ＡＯ−夕−（Ｄｕｐｏｎｔ、 Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、 Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ ０６４７０）中
、５２００ｒｐｍ、 ４°Ｃで１０分間遠心して細胞を
ベレット化した。得られる上清は捨てた。この細胞ベレ
ットを、２５％スクロースおよび５０ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の溶液２８峠に再懸濁した。５
０％グリセロールおよび０．２５Ｍトリス−ＨＣｆｌ［
トリス（ヒドロキンメチル）アミノメタンヒドロクロリ
ド、ｐＨ８，Ｏ］中の２０１１？／１１１２リソチーム
溶液（ｐＨ８，０）約１１１１ＣならびにＱ、５ＭＥＤ
ＴＡｖ］１．５＃ｌ！を、コノ細胞！！４濁液に加え、
混合した。得られた混合物を氷上で１５分間インキュベ
ートした。このリソチーム処理した細胞に溶菌溶液［１
０％トリトンＸ−１００（３肩ｆり：Ｏ２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ、 ｐｔ−１＝８．０（７５ＲＱ’） ：および水（
７屏のを混合して調製１３次Ｑを穏やかに撹拌しながら
加えた。得られた溶液を水上でさらに１５分間インキュ
ベートした。 Ｓ ｏｒｖａｌｌ Ｓ Ｓ ３４０−ター（Ｄｕｐｏｎ
Ｌ、 ｌｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｎｅｖｔｏｖｎ
、ＣＴ ０６４７０）中、４°Ｃ１１７０００ｒｐｍで
約４５分間遠心することにより、溶液から細胞の残骸を
除いた。 上ｉＲ〜３０ｘＱにＣ５ＣＱ約２８６９および５ ｍｔ
ｉ／ ｍ（１の臭化エチジウム溶液〜ＩＲＱを加えた。 次いで水で容量を４０ｘＣに調節し、この溶液を超遠心
管中にデカンチー７ヨンした。この管を密封し、溶液を
Ｔｉ７ｏｃ＋−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ、 ７３６０ Ｎ
、 Ｌｉｎｃｏｌｎ Ａｖｅｎｕｅ、 Ｌｉｎｃｏｌｎ
ｗｏｏｄ、 ＩＬ ６０６４６）中、４９５０ Ｏｒｐ
ｍて〜１８時間遠心した。紫外光で見えるようにし、得
られたプラスミドのバンドを単離し、臭化エチジウムを
除くためＣ５ＣＱ飽和したイソプロパノールで抽出し、
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣ（。 ｐＨ７，５、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）〜２０容量で３
回透析した。透析物を集め、次いでエタノール２容量と
３Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．０５容量を加えた。このエ
タノール混合物を一２０°Ｃに冷却し、５ｓ３４０−タ
ー中、−１０’ｃ、Ｉ ０００Ｏｒｐｍで３０分間遠心
することによりプラスミドＤＮＡをベレット化した。得
られたベレットをＴＥ緩衝液〜１ＭＱに再懸濁し、次い
で等容量のフェノール クロロホルム混合液（１：ｌ、
容量／容量）で抽出した。３Ｍ酢酸ナトリウム０１容量
およびエタノール２容量を加え、続いて、−２０℃で〜
３Ｃ１ｔｌンキュヘーションＬ、５Ｓ３４０一ター中１
５００Ｑｒｐｍで２０分間遠心することにより、水層中
のＤ Ｎ Ａを回収した。得られたＤＮ八へレ、トをま
ず７０％エタノールで、次１こ１００％エタノールで洗
浄し、乾燥した。 この方法で得られたプラスミドｐＯＧＯ４ＤＮＡ〜ｌ
５！ｇをＯ，］ＸＴＥ緩衝液１．５ｆｆｃ中に懸Ｃれ
１−５−２０℃で（呆存した。プラスミドｐｏ Ｇ ０
４の制限部位および機能地図を添付の第３図に示す。 大−旋回ｔ−中間体プラスミドｐＲＨ５）ｆｇ築フレオ
マインンはＣａｙｌａ、Ａｖｅｎｕｅ Ｄｅ Ｌａｒｒ
ｉｅｕ、 ３１０９４ Ｔ Ｏ［ｌｌ０ＬＩＳ１３．
Ｃｅｄｅｘ、 Ｆ ｒａｎｃｅよりｌＧ＋？入した。 アスペルギラス・ニデユランスｔ ｒｐＣ遺１’ｉＥ＝
子（Ｄ ３！、Ｊ 節Ｄ Ｎ Ａ配列に並んてストレ
プトアロティクスヒンダスタヌスのフレオマイ／ン耐性
遺伝子を含むプラスミドｐＵＴ７ １ ５ ｔｙｃａｙ
ｌａより入手した。 ｐＵＴ７］５の制限地図および機能地図を添付の第４図
に示す。 Ｂ ベニツリウム・クリソゲナムｌ ＰＮＳプロモータ
ーの供給源 ｌＰＮｓｊｆｌ（ｉ子のプロモーターは、プラスミドｐ
Ｌｃ２中、ベニツリウム・クリソゲナムＩＰ＼Ｓ遺伝子
のすく上流はぼ０．９ｋｂ以内に位置し、１；ｔｌ ｌ
；ｌｉ部位ＥｃｏＲ１およびＮｃｏｌに囲まれている［
Ｃ ａｒｒ等（Ｇｅｎｅ ４８ ： ２５７−２６６（
１９８６））のｐｘ Ｌ ２″．。 プラスミドｐＬｃ２は、アメリカン・タイプ・リルチャ
ー・コレク／：ｌ ７ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ｉｌ
Ｄ ２０８５２）から取１５；番号ΔＴＣＣ ５３３
３４（寄託口 １９８５年１１７１２０日）のもとて人
手でき、実施例１と実質的に同様の方法て１１ 離する
ことかてきる。プラスミドｐＬｃ２の制限地図および機
能地図を添付の第５図に示す。ｌ ＰＮＳプロモーター
を念む０．９ｋｂ ＥｃｏＲ ｌ−Ｎｃｏｌ制限フラグ
メントを以下に紀１１・λのごとくプラスミドｐＬＣ２
から単離した。 以下のようにＥｃｏＲＩおよびＮｃｏｌを用いてプラス
ミドｐＬＣ２を完全に消化した。上記のように調製した
プラスミドｐＬＣ２ＤＮＡ５μＱ（〜５μｇ）を、Ｈ＝
、０３８μＣ１１０ＸＥｃｏＲ１およびＮｃｏ＋制限緩
衝液［：５００ｍＭｈリスーＨＣｆ！（ｐＨ８，０）、
ｌ ＯＯｍＭ ＭｇＣ（１，、および１ＭＮａｃＩ２］
５μＱ、ならびに制限酵素ＥｃｏＲ１およびＮｃｏ＋各
々１μＱ（′８単位； Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、 、
Ｐ、 Ｏ，ＢＯＸ ５７７、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ、 ＭＤ ２０７６０）と混合する。反応混合物を３
７℃で２時間インキユヘートした。次いで消化生成物を
１％アガロースゲル上で電気泳動して、所望の〜０．９
ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏ＋制限フラグメントを他の消化
生成物と明確に分離した。ゲルを臭化エチジウムの希釈
溶液（０，５μｇ＃ｉり中で染色し、染色されたゲルを
長波長ＵＶ光に当てることにより、電気泳動されたＤＮ
Ａが見えるようになった。このフラグメントの位置を確
認した後、ゲル中〜０．９ｋｂフラグメントの前に小さ
な隙間を作り、この隙間に７ユライヒヤー （Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ）および’／ｘエル（Ｓｃｈｕｅｌ １）
（Ｋｅｅｎｅ、 Ｎｌｌ ０３４３１）のＤＥＡＥｖ１
枚を入れた。さらに電気泳動するとＤ Ｎ ＡはＤＥＡ
［Ｅ膜に非共有結合した。所望の７ラグメントがＤＥＡ
Ｅ膜に結合した後、膜をはずして低塩緩衝液（＋００ｍ
Ｍ ＮａＣＱ： Ｏ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ；および２０
ｍＭトリス−ＨＣρ、ｐＨ８）で洗浄した。次にこの膜
を小管に入れ、高塩緩衝液（１ＭＮａｃｆ！；Ｏ１ｍＭ
Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ：および２０ｍＭｈリスーＨＣＣ
１ｐＨ８）中に浸漬し、次いで６５°Ｃで１０分間イン
キュベートしてＤ Ｅ Ａ Ｅ紙からＤ Ｎ Ａをはず
した。 この６５℃のインキュベーション後、インキュベーショ
ン緩衝液を集め、膜を高堵緩衝液で洗浄した。洗浄溶液
は、所望のＤＮＡフラグメントを集める前に、インキュ
ベーション鏝衝液と共にプールした。 高塩ＤＮＡ溶液の容量をＮａＣＱ濃度か０．２５Ｍとな
るように調節し、次いでこの溶液に冷無水エタ／−ル３
容量を加えた。得られた溶液をｌ見合し、水上にｌＯ〜
２０分間置いた装次いてこの溶液を５Ｓ３４ＣＩ−ター
中、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。再度沈澱化
して残留する塩を除去した後、このＤＮＡベレットを７
０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥ緩衝液２０μρ
中に再懸濁した。これが所望の制限フラグメントを構成
していた。 ＣプラスミドｐＫＣ７８７の供給源 プラスミドｐＫＣ７８７は、大腸菌における形質転換体
の選択のためのアブラマイシン耐性遺伝子および最終的
な構築のための大腸菌のＤ Ｎ Ａ ＩＱ製起点を提供
した。プラスミドｐＫＣ７８７を持つ大腸菌株はＮＲＲ
Ｌより取得番号ＮＲＲ１，，Ｂ１８５１６（寄託日用９
８９年６月３０日）のちとて入手でき、このプラスミド
は実施例１の教示と実質的に同様にして単離することか
できる。プラスミドｐＫＣ７８７の制限地図および機能
地図を添付の第６図に示す。 Ｄ プラスミドｐｒ＜＋］５の構築 制限酵素Ｎｃｏ）の代わりにＢａｍ１（Ｉを（史用する
池は実施例２Ｂの教示と実質的に同様の方法により、プ
ラスミドｐＫＣ７８７およそ５μ９を制限酵素ＥｃｏＲ
１およびＢａｍＨｌて完全に切断した。ＥｃｏＲｌの代
わりに制限酵素ＢｇＱＩＴを使用する曲は実施例２Ｂの
教示と実質的に同様の方法により、プラスミドｐＵＴ７
１５ およそ５μ９を制限酵素ＮｃｏｌおよびＢｇｆ！
ＩＩで完全に切断した。これら反応に関与した制限酵素
を、フェノールおよびクロ四十ルムによる抽出、それに
続くエタノール化ＩＱによって不活性化した。Ｅ ｃｏ
Ｒｌ ／ Ｂ ａｍｔｌ ｌ切１ｔｊｉのｐＫＣ７８７
ＤＮＡおよそ０．２ ｕｑ、ＮＣ０Ｉ／１３ｇｏ、ｌｌ
切断のｐＵＴ７１５１）ＮＡ〜０．２ｔ１ｇ、およびプ
ラスミドｐＬＣ２由来のベニ／リウト・りｊノゲナムｔ
ＰＮＳプロモーターをａむ０．９ｋｂのＥｃｏＲｌか
らＮｃｏｌに至るフラグメント（この７ラグメ／トの積
装は上記Ｂ項に記４戊した）〜０２ ノｉ ｇヲ混Ｑ
シ、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ ’Ｊ ｉｆ−ゼ（１）ｒ７在
下で連結（ライゲート）シた。この連結混合物は、（〕
＼△フラグメント、１０Ｘリガーセ緩街液Ｅ０５Ｘ１ト
リス−ＨＣ（！（ｐＨ７，５）お、上びｌ ＯＯａＭ
’：ｖｆＣｓ、３＋ｏμＣ，０，１蒔１アデノノン三リ
ノ酸（ＡＴＰ） １． ＯｕＱ、 Ｏ，］ Ｍ ＤＴＴ
Ｉ ＯｕＱ、Ｔ４Ｄ凡ΔリガーゼｌμρＥ１単（ｉ、
ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍ ａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ（Ｂ Ｍ Ｂ ）、 ７９４１ Ｃａｓｔｌｅ
ｗａｙ Ｄｒｉｖｅ、 Ｐ。 ０、 ＢＯＸ ５０８１６．１ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
、 ＩＮ ４６２５０］および全量を１００μＱとする
に充分な水を含む。この混合物を１４°Ｃで一皮インキ
ニベートした。この連結混合物を以下のように大腸菌Ｋ
１２ＪＭ１０９に導入し、形質転換した。コンピテント
な大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９［［エピキュリアン・コーラ
イＪ（Ｅｐｉｃｕｒｅａｎ Ｃｏ１１”）コをストレイ
トジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、３３７０ Ｔａｎ５
ｙ ５ｔｒｅｅＬ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１
２１）より購入し、プラスミドｐＲＨ５を含む連結反応
混合物で形質転換した。連結したＤＮＡをコンピテント
なＪＭ１０９細胞１００μＱと混合し、水上で１時間イ
ンキュベートし、次いで４２°Ｃで１分間インキュベー
トし、次に新鮮なＴＹブロス２ＲＱで希釈し、３７８Ｃ
で１時間インキュベートした。等分した形質転換混合物
を、アブラマインン１００ｔｔ９ｈＱを含宵するＴＹ−
寒天プレートに蒔いた。 アブラマイ／ン耐性形質転換体をアンピンリン感受性に
ついてスクリーニングした。アブラマイノン耐性アンピ
ンリン感受性形質転換体を、ｐＫＣ７８７のほぼ２．８
ｋｂ ＥｃｏＲｌ −ＢａｍＨＩ制限フラグメント、ス
トレプトアロティクス・ヒンダスタヌスのフレオマイシ
ンＷ 性遺伝子ヲａ ｔ； ｐ ＵＴ７１５由来のほぼ
１．３ｋｂ Ｎｃｏｌ−ＢｇＱＵフラグメントのすぐ上
流にあるＩ ＰＮＳプロモーターを含む０．９ｋｂ Ｅ
ｃｏＲＩ−Ｎｃｏｆ制限フラグメント、およびアスペル
ギラス・ニデユランス由来のｔｒｐｃ ３ 調節領域、
を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。 記載したプラスミドを保持する形質転換体を単離し、こ
のプラスミドをｐＲＨ５と命名した。プラスミドｐＲＨ
５の制限部位および機能地図を添付の第７図に示す。 実施例３ プラスミドｐＲＨ５Ｃ実施例２て構築）は、実施（に自
と同様の方法により大腸菌Ｋ Ｉ ２ Ｊ Ｍ Ｉ Ｑ
９／ｐＲＨ５から単離することができる。プラスミド
ｐＲＨ５およそ５μ９を以下のようにして制限酵素Ｐｖ
ｕｌおよびＨｉｎｄｌＩＩで完全に切断する。ブラスミ
ドｐＲＨ５５μｍ２（５μｇ）をＩＯＸ Ｐｖｕｌ
緩）ｉ、１支［５００ｍＭ）リス−ＨＣ１！（ｐＨ８，
０）、１０Ｑ ｍ’ｖＩ ＶＩｇＣ（ｈ、５００ｍＭ
ＮａＣ（！、および５００ｍＭ ＫＣＣＦ５μＣ，Ｐｖ
ｕｌ（６単位、ＢＲＬ）１μＱおよびｔ１２０３９μＱ
と混合する。反応物を３７°Ｃて１時間インキュベート
後エタノール沈、殿させる。このペレントをＨ，０３９
μｅ中にｍ％％濁する。これに、ｌ Ｑ Ｘ Ｈ１ｎ
ｄｌｌＨ＄衝液ｆ５００ｍＭトリス−＋（ｃ９（ｐｌ−
１８、０）、ｌ ００ｍＭ ＭｇＣρ７、および５００
ｍＭ ＮａＣ＋！３５ｕＱおよびｌ＋１ｎｄｌＪＩ（８
ｆ１１（妖ＢＲＬ）ｌμＱを加える。実権例２Ｂと実質
的に同様の方法により、所望の〜４．８ｋｂＰｖｕｌ／
′ｌ ｌ ｉ ｎｄ Ｉｌｌ ｉｌ’ｌ限フラグメント
を分離しアガロースケル電気泳動によって単離する。次
いて精シ；ツされたフラグメントをＴＥ緩衝液約１００
μＱに溶解し、１糸の（重用のためにＯ′Ｃで（呆ａす
る。 Ｂ プラスミドｐｏ Ｇ Ｏ４からの〜２． Ｉ ｋｂ
Ｐｖｕ／５ｐｈｌフラグメントの単離 プラスミドｐＯＧ○４は、実施例１と実質的に同様の方
法によって、大腸菌に１２ＪＭ１０９／ｐＯＧＯ４から
単離することができる。プラスミドｐＯＧＯ４およそ５
μ９を以下のごと（制限酵素１）ｖｕｌおよびＳ ｐｈ
ｌをもって完全に切断する。プラスミドｐＯＧＯ４５
μＱ（〜５μ９）を、ｌ０ＸＳｐｈｌ緩衝１ｆｆｌ［５
００ＴＩＭ ＋−リス−ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）、６０
ｍＭ ＭｇＣ’：ｈ、 ５００ｍＭ ＫＣＱ、および５
００ ｍＭ Ｎ ａ ＣＱコ５ｕＱ、Ｈ，０３９μＣ
および５ｐｈ１（６単位、Ｂ Ｒｌ−月μＱと混合する
。反応物を３７°Ｃで１時間インキュベートし、次いで
エタノール化、すさせる。このベレットをＨ，０３９μ
ジにｍ 懸！ＹＡする。ここにｌ Ｑ Ｘ Ｐ ｖｕ
ｌ緩衝１夜［５００ｍＭ） リ ス −ＨＣＱ（ｐ
ｌ（８）、 １． ＯＯｍＭ Ｍ ｇＣＱ２．５
００ ｍＭ Ｎ ａ（：、 Ｑ、および５００ｍＭ Ｋ
Ｃ＆ｉ５μ＋！およびＰ ｖｕ ｌ （６Ｑ’位、ＢＲ
Ｌ）１μＣをり■える。反応物を３７°Ｃで１時間イン
キュベートする。アスベルキラス・ニデユランスのアン
ルトランスフ℃ラーセ遺伝子および調節要素を含む所望
の〜２１ｋｂ Ｐｖｕｌ／５ｐｈｌ制限フラグメントを
、実屯例２Ｂと実質的に同様の方法により、アガロース
ゲル電気泳動によって分離し、単離する。次いで、精製
されたフラグメントをＴＥｒ８ｉ液約１００μＱ中に再
懸濁し、後に使用するために０°Ｃで保存する。 Ｃ，５ｐｈｌ／ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡリンカ−の構築所
望のリンカ−は以下の配列を有する：５“ ＣＧ
ＧＡＴＣＣＡ ３３″ ＧＴＡＣＧＣＣＴＡＧＧ
ＴＴＣＣ八 ５′これはイタクラ等［１ｔａｋｕｒａ
ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６（１
９７７）］およびクフレア［Ｃｒｅａ ｅｔ ａｌ、
＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ ７５ ： ５７６５（１９７ｇ）コの教示するとこ
ろと実質的に同様の方法により、改良ホスホト」エステ
ル法によって常套的に合成することができる。 実施例４ プラスミドＩ）ＯＷ１０６にの最終的組な構
築 実施例３Ｃで作られた合成り Ｎ Ａりンカー約２０ピ
コモルを、プラスミドｐＯＧＯ４から単離した〜２．ｌ
ｋｂ Ｐｖｕｌ／５ｐｈｌフラグメント〜Ｏ５μ９に連
結する。この連結は実質上実施例２Ｄの教示するところ
と同様に行なう。次いで得られたフラグメントを実施例
３Ａと実質的に同様にしてＨｉｎｄｌＩＩにより消化し
、得られたＰ ｖｕ ｒ ／ Ｈ１ｎｄＩｎフラグメン
トを常法により分離し、ゲル濾過によって単離する。最
終ｌ霞度０．２Ｍとなるよう３Ｍ酢酸ナトリウムを添加
した後、ＤＮＡを１００％エタノール３容量で沈澱させ
る。所望の〜２．１ｋｂＰ ｖｕ ｌ ／ Ｈ１ｎｄＩ
ＩＩフラグメントをＴＥ緩衝を夜１００μρ中に再懸濁
し、後の使用のためにＯ′Ｃで保存する。 プラスミドｐＯＷ１０６１の最終的な構築は、プラスミ
ドｐＲＨ５から単離した〜４．８ｋｂ Ｐｖｕｌ ／
Ｈ１ｎｄｌ１１フラグメントを前段に記載した〜２１
ｋｂ ＰＶＩＩＩ ／ Ｈｉｎｄ■フラグメントに連結
することによって行う。〜４．８ｋｂ Ｐｖｕｌ／１（
ｉｎｄＩＩＩフラグメント約１μ９および〜２．ｌｋｂ
Ｐｖｕｌ／Ｈｉｎｄ■フラグメント〜０，５μ９を連
結し、得られるプラスミドを大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９の
形質転換に使用する。この連結および形質転換は、実質
的に実施例２Ｄと同様にして行なう。アガロースゲル電
気泳動および他の試験により示されるように、得られた
形質転換体の幾分かは所望の〜６．８ｋｂｐＯＷ］０６
１プラスミドのみを含んでいる（第８図に示す）。本明
細書中で大腸菌に１２Ｊ〜１１０９／ｐＯＷ］ ０６１
と称するこの形質転換体を選択し、アブラマインン１０
０μｇ／ｙ（ｌを含何するＴＹ寒天（ＴＹブロス＋１５
１／ρ寒天）上に蒔き、次いて通常の微生物学的手法を
用いて培養する。得られる形質転換体を実施例１に記載
したようにプラスミドｐＯＷＩ０６１の単離用に使用す
る。 ＸＦｆｆｌｆ１５ 遺伝子追加による、アスペルギラス
・ニデユランスにおけるペニシリンＧ生産およびア／ル
トランスフェラーゼ酵素レベルの上昇Ａ、プラスミドｐ
ＯＷ１０６１によるアスペルギラスの形質転換 プラスミドｐＯＷＩ０６１は、アスペルギラス宿主中て
使用するために構築したアンル／ラノスフェラーセ発現
ベクターである。アスペルギラス・ニデユランスにおけ
るア／ルトランスフエラーゼ活性の細胞内濃度は、プラ
スミドｐ○〜Ｖ１０６１によって提供されるような追加
のアシルトランスフェラーゼ遺伝子の存在により増加さ
せることができる。さらに、複数のア／ルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を含むアスペルギラス形質転換体は、ｊ、
を質１４３度を限定しない場合、ベニ／す７Ｇの収量増
加を示し得る。このような方法は、ペニシリンＧを生産
し、そしてイソペニシリンＮを蓄積するアスペルギラス
宿主菌株を選択することにより、最も良く達成されるで
あろう。 アスペルギラスプロトブラストの調製、およびプラスミ
ドｐＯＷ１０６］を用いたＡＴ ＣＣ２８９０１のごと
きアスペルギラス・ニデユランス１゛へ株の形質転換は
、イニルｊ・ン等［Ｙｅｌｔｏｎ ｅｊ ａＰｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ｌ！Ｉ
： １４７０（１９８４）コの方法と実質的に同様にし
て、以下に記載のごとく達成することができる。 最少ｊ１１地４００１および４ ｍＭのフィルター滅菌
したＩ７−トリプトファンを入れたンリコン処理のＩＱ
フラスコに分生子８１０８を接１’ｆｉＬ、室ｌ、情で
１８時間振盪する。最少培地ＣＩＱ当り）は以下の通り
である（ｐＨは６５とする） 貯蔵塩溶１ｆｆｌ ２００１ｉ
Ｑ２０％グルフース溶液 ５０スＱ２６％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ，０４ＲＱ 貯蔵塩溶液は以下の通りである（ＩＱ当り）：ＮａＮ０
ｚ ６０９ＫＣ（１５，２
９ ＫＨ，ＰＯ４１５，２８ 微量元素溶液 １０ＲＱ微量元素
溶液は以下の通りである（１００ｘＱ当り）：Ｆｅ５０
．・７Ｈ，００，１９ ＺｎＳＯ，・７Ｈ，ＯＯ，８Ｂ９ ＣｕＳＯ４・５Ｈ，ＯＯ，０４９ Ｍｎ５Ｏ，・４Ｈ２ＯＯ，０１５ｇ ＮａｙＢ、Ｃ）７・ｌ ０ＨｔＯＯ，０１ｇ（ＮＨ４）
ｖＭｏ７０＋・４ ＨｔＯＯ，００５ｇチーズクロスで
濾過することにより菌糸体を収穫し、０．６Ｍ Ｍｇ５
Ｏ，で洗浄し、紙タオルでしぼり、吸い取らせて過剰の
液体を除いた。この細胞を、激しく撹拌することにより
フィルター滅菌した浸透性培地（１、２Ｍ ＭｇＳ Ｏ
４／ １０ ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５，８； ５
＊Ｑ／９菌糸体）中に懸濁し、２５０ｘｉ！フラスコに
移し、水上に置く。フィルター滅菌したβ−グルクロニ
ダーゼ（０，２ｚ（／９菌糸体； Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ、、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ １４５０８，５
ｔＬｏｕｉｓ、Ｍｏ ６３１７８）および／ボザイム２
３４（浸透培地中２０Ｒ９／ｘＱ ； １ ｍＱ／９菌
糸体； Ｎｏｖｏ １ｎｄｕｓｔｒｉＡ／Ｂ Ｂａｇｓ
ｖａｅｒｄ、 Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、この細胞を水
上で５分間インキュベートする。フィルター滅菌したつ
／血清アルブミン溶液（浸透培地中１２３！９／ｘＱ：
０．５＊Ｑ／９菌糸体； Ｓｉｇｍａ）を加え、この細
胞懸濁液を８ Ｑ ｒｐｍ、 ３０′Ｃで９０分間振盪
する。 このせ濁液を遠心管に移し、ＳＴ緩衝液［ｏ、６Ｍソル
ビトール（Ｓｉｇｍａ）／ ｌ ＯＯｍＭ ｌ−リス
−ＨＣ（！（ｐＨ７，０）］１０ｚＱを積層し、スウィ
ンギング・バケット・ローター中、４０００Ｘ９．４°
Ｃで１５分間遠心する。緩衝液界面のプロトプラストを
曲がったバストウールピペットを用いて採取し、水上に
置く。残存するＳＴ緩衝液を除き、菌糸体ベレットを再
懸濁し、新鮮なＳＴ緩衝液を前述のように加え、プロト
プラストを遠心沈降により再開バンド化する。このプロ
トプラストをプールし、ＳＴＣ緩衝液［１２Ｍソルビト
ール、ｌ０ｍＭト１スーＨＣＱ（ｐＨ７，５）、１０
ｍＭ ＣａＣＱｔ］２容量で希釈し、８０００Ｘｙ、４
°Ｃで５分間遠心することによりペレツト化する。次い
でこれを５ＴＣ（ｐ術液１０１Ｃと共に遠心することに
より２回洗浄し、ＳＴＣ緩衝液の１／１０００？刀朋培
養容量中にｉＴＴ懸濁する。 ｓ ′ｒ ｃ 緩衝液２５μｅ中に溶解したプラスミド
ｐＯＷ＋０６１ＤＮＡを、使い捨てプラス千ｌり遠心管
中のプロトプラスト１００μＱと’ｔＲＤし、室温で２
５分間インキユヘートする。次いでＸＱｍＭトリス−Ｈ
（ｊ！（ｐＨ７，５）およびｌ Ｑ ｍＭ Ｃａ、ＣＱ
ｒ中の６０％ポリエチレングリコール４０００（０２ｍ
Ｑ）を如え、管を手で枦、やかに揺り動かす。続、１で
ポリエチレングリコール溶液の２回目（０２ｊＩＱ）お
よび３回目（０，８５ｚのの添１１目を行ない、各７、
・のｒＫ １１０の後に隠やかに撹拌する。このプロト
プラストを室温で２０分間インキユヘートシ、８０００
ｘ９．４°Ｃで５分間ベレット化する。上清をデカンテ
ーションし、管に付着している溶液の小滴を綿棒で除去
する。このプロトプラストを０５％酵母抽出液２，５ス
σ、２．０％グルコース、および１．２Ｍソルビトール
中に懸濁し、回転振盪機−に、Ｉ ５０ ｒｐｍ、３７
°Ｃで２時間インキユヘートする。次いでこれを８００
０ｘｙ、４°Ｃで５分間ベレット化し、上清をデカンチ
ー７：Ｉンし、管に付着している培地の小滴を綿棒で除
去する。このプロトプラストを最後に５ＴＣ１４衝液０
． ｌ ５ｚり中に懸濁し、同緩衝液中で適当に希釈す
る。 形質転換後、プロトプラストを非選択培地（トノブチカ
ーゼ大豆寒天、ＢＢＬ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ、ＢｅｃＬｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａ
ｎｄ Ｃｏ、、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、〜（Ｄ２＋
０３０）上に蒔き、１５℃で一皮インキユベートしてフ
レオマイ／ン耐性遺伝子を発現させる。次いでフレオマ
イシンを含有する軟寒天（０４％寒天、Ｇｉｂｃｏ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ ５
３７１３） １ｘＱの！４層をこのＩＩＩに対して行な
う。フレオマイ／ンの最終的な皿の濃度は約１ ｔｌ？
ＩＲＱとすべきである。その後３０’Ｃでインキュベー
／ヨンすると４〜７０のうちに形質転換体が生成する。 Ｂ アスペルギラス形質転換体の分析およびペニシリン
Ｇの検出 続いて、安定なフレオマイシン耐性を示すアスペルギラ
ス形質転換体を選び、新鮮な非選択的トノブチカーセ大
豆寒天に移すことができる。３００Ｃで７〜１０日間生
長させた後、ドララフおよびイエ−［Ｄｏｔｚｌａｆ、
Ｊ、 Ｅ、 ａｎｄ Ｙｅｈ、 Ｗ、 −に、 、
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。 １６９ ： １６１１（１９８６）］の方法に従って細
胞抽出物を調製し、不ウス等［Ｎｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ
、、Ｊ、＾ｎｔｉｂｉｏｔ、 ３５： ５８０（１９８
２月が記載しているようにペニシリンＧ生産の検定を行
なうことかできる。 （以下、余白） 実施例６ アスペルギラス・ニデユランスのア／ルト
ランスフエラーゼ遺伝子を用いた遺伝子追加による、ペ
ニシリウム・クリソゲナムにおけるペニシリンＧ生産の
増加 プラスミドｐＯＷ１０６１（実施例４において構築）は
またペニシリウム・クリソゲナムにおけるアシルトラン
スフェラーゼ酵素レベルおよびベニノリンＧ生産を増加
させるためにも使用できる。 ペニシリウム・クリソゲナムは、へテロローガス彩質転
換実験において、アスペルギラス調節因子を利用するこ
と、そしてイントロンスプライス部位を認識することが
示されている［Ｂｅ口、 Ｒ，Ｊ、 、 ａｎｄＴｕｒ
ｎｅｒ、Ｇ、、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、 Ｉｔ ：
６３９（１９８７）］。アスペルギラス宿主の場合と同
様に、ペニシリンＧを産生し且つイ゛ノペニンリンＮを
蓄積するペニシリウム宿主を選択するのが有利である。 クローン化したアスペルギラスのアシルトラ／スフェラ
ーセ遺伝子を含むペニシリウム形質転換体は、基質濃度
を限定しない場合、親菌株より高いレベルのペニシリン
Ｇを生産することかできた。ペニシリウム・クリソゲナ
ムの形質転換は以下に記載のごと〈実施することができ
る。 実施例７ ペニシリウムの遺伝子的形質転換Ａ、ベニン
リウム・クリ′／ゲナム菌株形質転換用のペニシリウム
菌株を、取得番号ＡＴＣＣ９４８０のもとでアメリカン
・タイプ・カルチャー−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ ｆｅａｔ ｉｏ
ｎ、 Ｒｏｃｋｖｉ Ｉ ｌｅ、 ＭＤ ２０８５２）
から入手する。 ペニシリンＧまたはペニシリンＶの生産改潜の目的のた
めの変異、選択、もしくは遺伝的育種によってＡＴＣＣ
９４８０から誘導されるあらゆる市販菌株または他のペ
ニシリウム・クリソゲナム菌株もまた本発明のベクター
およびプラスミドを何する形質転換体調Ｍの際の使用に
好適である。 Ｂ 細胞培養のための均一接種物の調製ペニシリウム・
クリソゲナム細胞を効率的に形質転換させるためには、
細胞壁を除いて安定なプロ［・ブラストを形成させるこ
とが必要である。このようなプロトプラストの調製にお
いては、均一な接種物から始めるのが有ｆりである。さ
もなげれば、培養中の細胞の生成に再現性がなくなり、
不適当または不充分な量の細胞がらＰ、クリソゲナムを
調製しようとする試みによって時間が消費されることに
なる。 凍結乾燥された、または液体窒素保存中から取り出し室
温で溶かした１アンプルの栄養細胞［貯蔵溶媒（５％乳
糖、１０％グリセロ−〕呟および０．１％）ライ−７８
０）ｌｚｌｉ中〜ｌＯ９コロニｊし成ｑｉ位コを、滅菌
生理食塩水１ 、０ ａＱにて希釈する。この懸濁成約
０．ＩｉＩ！を、およそ２ｏスラント（斜面培養）の胞
子形成培地（乳糖１５．０ｇ／ｉ７、とうもろこしあ１
夜２．５ｇ／Ｌ、ペプトン５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣＱ ４
．Ｏｇ／Ｌ、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，００，５ｇ／Ｌ、Ｋ
Ｈｔ Ｐ Ｏ−０、６ｇ／ ｌ−１Ｆｅｃρ３・６Ｎ、
０ ０．００５ｇ／Ｌ、Ｃｕ５Ｏ，・５Ｈ２００００２
８／Ｉ７、ｐＨ＝７．０に調節、寒天３０．０ｇ／Ｌ、
そして１２０ｐｓｉで２０分間オートクレーフにか；す
る）の各々に接種するのに使用する。 各スラント（１５ｃ＋ｎＸ ２．５ｃｍ）は固化培地２
５契Ｃか入っている。寒天斜面培養の表面に均一にっｔ
付した接種物を、菌糸体の融合性菌叢が存在し抱子形成
するまで２５°Ｃで生長させる（殆どの菌株で１週間）
。斜面培養１個からの成長物を滅菌水性培養培地１０ａ
＆中に懸濁し、この懸濁液を水性培養培地１０６１１ｆ
ｆに移す。この懸濁細胞を入れたフラスコを旋回振盪機
上に取り付け、２５℃、２３５ ｒｐｍ、振幅１インチ
にて１８時間インキュベートする。 水性培養培地は以下のように調製した 溶液Ａ（スクロ
ース３６ｇ／Ｌ、し−アスパラギン７．５ｇ／Ｉ１、Ｋ
Ｉ−Ｉ ｔ Ｐ Ｏ−１ｖ ｇ／ ｌ−１Ｋ、ＨＰｏ
、２１ｇ／Ｌ、Ｎａ５Ｏ−０，７５ｇ／Ｌ１ＭｇＳＯ４
・７Ｈｒ００、Ｉ８ｇ／Ｌ、ＣａＣ（１２０，０６ｇ／
ｌ−１食塩溶液１ｘＣ／Ｌ、自然のｐｔ（）ｌＯＯＲσ
を５００匁ρの振盪フラスコに分注する：このフラスコ
を市販の栓でおれい、１２ピＣで２０分間オートクレー
フにかける。次いで溶液Ｂ（グルコース１０８ｇ／Ｌ）
２Ｒ０および溶液Ｃ［スクロース２５ ｇ／ Ｌ、とう
もろこし浸漬液（４％ｗ／ｖ窒素分）＋ ２．５７！ジ
、酢酸アンモニウム５．５ｇ／Ｌ、ＣａＣ○３５ｇ／Ｌ
、に０１−（でｐＨ６，５に調節、そして１２１°Ｃで
２０分間オートクレーブ処理する］４１ｅを溶液へに加
え、水性培養培地を調製する。 Ｃベニツリウムのプロトプラストの調製２４時間培養の
細胞を吸引濾過（ファツトマン＃旨慮紙、ブフナー届斗
中）により収穫し、緩衝ｌ夜（００ＩＭトリス、Ｏ，Ｏ
ＬＭ ＭｇＳＯ４，０゜０１Ｍジチオトレイトール、１
．ＯＯＭ ＫＣＣ。 ＨＣＱにてｐＨ−７，０とする）中に懸濁する。充分な
緩衝液を加えて最終細胞濃度が緩衝液５Ｍ当り細胞塊１
９となるようにする。この細胞懸濁液を２５０屑ａ振盪
フラスコに入れ、旋回水浴振盪機に取り付け、２９〜３
０°Ｃ１］ ４０ ｒｐｍ、振幅１インチで１０分間イ
ンキュベートする。ジチオトレイトール処理した細胞を
遠心によって集め、次いて２５０ｘ０．振盪フラスコ中
の酵素溶液［］、０．７ｇ／ｌＱノボザイム２３４ （
Ｎｏｖｏ １ｎｄｕｓｔｒｉ Ａ／Ｂ Ｂａｇｓｖａｅ
ｒｄ、 Ｄｅｎｍａｒｋ）、０，０１Ｍトリス、０．
０１ＭＮ４ｇＳＯ，，０，０１Ｍジチオトレイトール、
１００Ｍ ＫＣＱ、ＨＣｌでｐＨ＝５．８とする１５０
ｘ（に再懸濁する。この細胞懸濁液を旋回水浴糸ｄ機に
取り付け、２９〜３０°Ｃ，１４０ｒｐｍ、振幅１イン
チで１５分間振盪する。酵素処理した細胞を１２４０ｘ
ｇで６分間遠心し、得られるベレットを＋’）ｊ ｆｔ
ｉ液ＣＯ，０１Ｍトリス（ヒドロキンメチル）アミノメ
タンヒドロクロリド０．ＯＩ Ｍ Ｍｇ５Ｏい １００
ＭＨＣり、ＫＣｇでｐＨ＝７．０とする］に再懸濁する
。この懸濁液をまず９５０ Ｘ９で６分間遠心する。得
られるベレットを同緩衝液に再！濁し、この懸濁液を７
００ｘｇで６分間遠心する。得られるベレットを同緩衝
液５Ｎ＋！に再１び濁する。この懸濁液は、主として大
きなプロトプラストおよび幾らかの細胞壁構造を保持す
る浸透的にこわれ易い細胞を含んでいる。上記方法によ
り除去された小さなプロトプラストに比較すると、細胞
壁を再生できるプロトプラストの割合および生存能力の
ある侵透的に安定な細胞の割合は、最終懸濁液中の大き
なプロトプラストおよび浸透的にこわれ易い？田月包１
こついてより高くなっている。このｉ′＠ｌＩ包の・び
濁液を〜２ＸＩＯ８１１ｎ胞／２Ｑの濃度まて緩げｉ液
で希釈する。 Ｄ 形質転換の方法 形質転換するプラスミドの各々について、浸透的にこわ
れ易いベニツリウム・クリソゲナムＩ［胞の懸濁液〜０
．１１σ（およそ２Ｘ１０’細瞼）に、５０ｍＭ Ｃａ
ＣＬ Ｉ ＯｕＱ、ＴＥ緩街液５〜１５μＱ中のプラ
スミドＤＮＡ２５１、および新たに溶解したポリエチレ
ングリコール４０００の溶液（Ｂａｋｅｒ ；浸透的に
安定な緩衝液中４０％重■／容量）０．９ｍＱを補う。 この溶液を撹拌し、室、晶で１０分間放置し、７００Ｘ
ｇで２分間遠心し、再び撹拌する。このプロトプラスト
を皿に蒔き、形質転換体を実旋例５に記載のようにアス
ペルギラス形質転換について分析することかできる。 害ａ＝ 例８ ベニツリウム・クリソゲナムのイソペニ
ンリンＮンンテターセプロモーターヲ有するアスペルキ
ラス・ニテユランスのア／ルトランスフェラーセ遺伝子
を用いるベニツリウム・クリソゲナムにおけるペニンリ
ンＧ生産の増大プラスミドｐＯＷＩ０６１は、ベニツリ
ウムに使用してア／ルトランスフエラーゼ酵素レベルお
よびペニシリンＧ生産を増加させることができるが、ベ
ニンｌ）ラム中でアスペルギラス・ニデユランスのア／
ルトランスフエラーゼの発現をより高レベルに行なうよ
う、さらに特異的に設計されたプラスミドを構築するの
か膏利であろう。本実施例においてｐＯＷ１０６２と記
載されるこのようなプラスミド（第９図を参照）は、ペ
ニシリウム中てアスペルギラス・ニデユランス由来のア
シルトランスフェラーゼ遺伝子の発現をより高めるため
に、ペニシリウム・クリソゲナムのイソペニシリンＮン
ンテターゼプロモーターを用いる。 −ターの単離 ペニシリウム・クリソゲナムｔ Ｐ Ｎ Ｓ 遺伝子の
すぐ上流のＤ Ｎ Ａを含む〜０．９ ｋｂ Ｈ１ｎｄ
Ｉ１１／ ＮｃＯＩフラグメントを、実施例２Ｂの教示
と実質的に同様にしてプラスミドｐＬＣ２から単離する
。 所望のリンカ−の配列は以下の通りである・５ ＣＡ
ＴＧＣＴＴＣＡＣＣＴＡＡＣＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＡＣ
３ＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＣＧＧＴＴにのリンカ−
は改良ホスホトリエステル法により、実施例３Ｃの教示
に実質的に従って合成する。 Ｃ〜０．９ｋｂ ｔ（ｉｎｄｆｆｌ／Ｋｐｎｌ ＤＮ
Ａフラグメントの作成 実施例８ ＢのＤＮＡリンカ−約２０ピコモルおよび実
施例８ΔにおいてプラスミドｐＬＣ２から単離した〜０
．９ｋｂ ｔ（ｉｎｄｎｌ／Ｎｃｏ［フラグメント〜０
５μ９を、実施例２Ｄと実質的に同様にして連結する。 次いて得られたフラグメントをＩＸＫｐｎｌｉＨｔｉ液
［２０ｍ〜１トリスーＨＣ９（ｐＨ７，４）、５ｍＭ〜
１ｇＣＬ、および５０ｍＭＫＣｌ中のＫｐｎ６単位を用
いて３７°Ｃて１時間、肖化し、得られたＩｔ １ｎｄ
ｌｌＴ／ Ｋ ｐｎ ｌフラグメントをゲル、慮過とそ
れに続くエタノール化１りによって常套的に単離する。 Ｄ プラスミドｐｏ Ｇ Ｏ４からの〜２．２ｋｂＫｐ
ｎ／ Ｈｉ ｎｄ Ｉｆｆフラグメントの単離プラスミ
ドｐＯＧ○４を、取得番号ＮＲＲＩ−Ｂ１８１７１のも
とてＮＲＲＬから入手可能な大［傷菌に１２ＪＭ１０９
／ρｏＧｏ４から実施例１の方法に従って単離する。プ
ラスミドｐＯＧＯ４およそ５μ７を上記０項のように制
限酵素Ｋｐｎｌで完全に切断し、続いて］ＸＨｉｎｄｌ
ｌｌ緩衝液［５０ｍ：ｖｌ ｌＪス−Ｈ（１！（ｐＨ８
，０）、］ ＱｍＭ ＭｇＣ１！−。 および５０ ｍＭ Ｎ ａＣ（！］中のＨｉｎｄ１１１
８単位により３７°Ｃで１時間消化し、所望の〜２．２
ｋｂＫｐｎｌ／ Ｈｉ ｎｄ ＩＩＩ制限フラグメント
を実施例２Ｂに従ってアガロースゲル電気泳動により（
１１離する。所望の〜２ 、２ ｋｂ Ｋ ｐｎ Ｉ
／ ｔ（ｉｎｄ［ＩＩフラグメントが他の消化生成物か
ら容易に分離しない場合は、Ｅｃ。 ＲＶによりさらに消化することが推奨される。次いて精
うシされた〜２．２ｋｂ Ｋｐｎｌ／）ｉｉｎｄｌｌフ
ラグメントをＴＥ緩衝液約１００μρに溶解し、後の（
重用のためにＯ′Ｃて保存する。 Ｅ プラスミドｐＲＨ５の〜５ ｋｂ Ｉｆ １ｎｄｆ
ｆｌフラグメントの作成 プラスミドｐＲＩＩ ５を実施例１に記載のように太陽
間ＫＩ２ＪＭ１０９／ｐＲＨ５（実施例２て作成）から
単離する。プラスミドＩ）ＲＨ５およそ５μ９を実施例
８Ｄのように制限酵素Ｈｉｎｄｌｌて消化し、１４られ
る〜５ｋｂｌ（ｉｎｎ旧制制限フラグメント実施例２Ｂ
のようにアガロースケル電気泳動によって１”；：’Ｌ
する。次いて精・装されたフラグメントを′Ｕｒ：緩（
憂ｉ成約１００μｅに溶解し、後の使用のために０°Ｃ
で保（ｊする。 Ｆ プラスミドｐｏＷＩ Ｏ６２の構築プラスミドｐＲ
Ｈ５からの〜５ ｋｂ Ｈ１ｎｄｌフラグメント約１μ
９、実施例８Ｃの〜０．９ ｋｂ Ｈ１ｎｄＩＩＩ ／
Ｋ ｐｎ ｌフラグメント杓０５μ９、およびプラス
ｉ ト’ ｐｏ Ｇ Ｏ４の〜２ 、２ ｋｂ Ｋ ｐ
ｎｌ／ ＩＩ ｉｎ旧■フラクメ７ ト１’７０．５
ｕ９を連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌Ｋ１
２ＪＭ１０９を形質転換し、１００μ９／ｚＱのアブラ
マイ／ンに対し耐性となるようにする。この連結および
形質転換は、実施例２Ｄの教示と実質的に同様にして行
なう。制限地図の作成ならひにアガロースゲル電気泳動
および池の試験により常套的に示されるように、（１ら
れた形質転換体の幾らかは、第９図に示すとおり〜８ｋ
ｂプラスミドのみを含む。本明細書中大腸菌Ｋ １．２
ＪＭ１０９／ｐＯＷ１０６１と称するこのような形質転
換体を選択し、アブラマインン１００μ９／スρを含有
するＴＹ寒寒天−蒔き、次いて通常の微生物学的方法を
用いて培養する。得られた形質転換体を実施例１に記載
のごとくプラスミドｐＯＷＩ０６２を単離するのに使用
する。 実施例９ アスペルキラス・ニデユランスにおけるア／
ルトランスフェラーセ遺伝子の遺伝子破壊 ペニシリンＧ”成ができず、代わりにイソペニシリンＮ
を蓄積するアスベルキラス・ニデユランス菌株は、ただ
ｌコピーのアンルトランスフエラーセ遺伝子しか含んで
いないことか知られるペニシリンＧ産生アスペルギラス
菌株から最も良くうν造される。所望のＡＴ欠損菌株は
、十目同な単一交差現象においてゲノム性ア／ルトラン
スフエラーセ遺伝子を非機能性ア／ルトランスフェラー
ゼ遺伝子で妨害することによって組立てられる。適当な
非機能性遺伝子は、該遺伝子の５゛および３゛両末端か
ら一部分を除くことにより組立てることができる。 メントの単離 プラスミドｐＲＨ５（実施例２で構築）を実施例１に記
載のようにして大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９／１）ＲＨ５か
ら単離する。プラスミドｐＲＨ５およそ５μ９を１ＸＥ
ｃｏＲ１緩衝液［５０ｍＭトリスート（ｃ１！（ｐＨ８
，０）、１０ ｍＭ ＭｇＣＱｔ、および０．ＩＭＮａ
Ｃｆｉ］中のＥｃｏＲｌ ８単位にて３７℃で１時間
完全に切断し、次いで得られた〜５ｋｂＥｃ。 Ｒ１フラグメントをＤＮＡ末端を平滑にするため以下の
ごとく大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）フレノウフラグメントて
処理する。ＥｃｏＲ１消化したプラスミドｐＲｌ（５５
ｕ（１（〜５ ｕ９）を、各ｄＮＴＰ ２ｍＭを含有
する溶液１μａ、ＩＯＸ緩衝液［０，５Ｍｈリスー１４
Ｃ（！（ｐＨ７，２）、０ 、 Ｉ Ｍ ＭｇＳ Ｏ４
、および１ｍ１ＶＩＤＴＴ］２．５μｆ！およびＨ，０
１６，５ｕＱと混合する。次いでフレノウフラグメント
２単位を加え、Ｕａ物を２２°Ｃで１５分間インキュベ
ートする。 次いで７０°Ｃで５分間処理することにより酵素を熱不
活性化する。得られた〜５ｋｂ毛滑末端ＤＮＡフラグメ
ントを実施例２Ｂのごとくゲル電気泳動により常套的に
単離しエタノール沈澱する。所望の〜５ｋｂ平滑末端フ
ラグメントはＴＥ緩衝液１００μＣに、容解し、後に使
用するためにＯ′Ｃで保存する。 プラスミドｐＯＧＯ４（ＮＲＲＬ Ｂ−］ ８ ］
７１）を実施例１に記載のように大腸菌Ｋ ｌ ２ Ｊ
Ｍ Ｉ Ｏ９／ｐＯＧＯ４から月１離する。ＥｃｏＲ
Ｉの代わりにＮ ｃｏ ｌを（φ用する他は実施例９１
Ａに記載のごとくしてプラスミドｐＯＧＯ４およそ５μ
９を制限酵素Ｎｃｏｌで完全に切断し、このＤＮＡ末端
を実施例９１Ａに記載のように充填する。先端を切った
ΔＴ遺伝子を含む〜０．８ｋｂ平滑末端フラグメントを
分離し、実施例２Ｂのごとくアガロースゲル電気泳動に
よって単離する。次いで精製された〜０．８ｋｂフラグ
メントをＴＥ緩１Ｔ液約１００μａに溶解し、後の使用
に備えてＯ′Ｃで保存する。 ＣプラスミドｐＯＷＩ０６３の構築 実施例９Ａにおいて組立てられた〜５ｋｂ平滑末々：１
４フラグメント約１ｕ９および実施例９Ｂにおいて♀１
１立てられた〜０．８ｋｂ平滑末端フラグメントＱ。 ５μ９を連結し、得られたプラスミドを大腸菌に１２
Ｊ Ｍ １．０９の形質転換に使用する。この連結およ
びＩＦニ質転換は実施例２Ｄと実質的に同様にして行な
う。アガロースゲル電気泳動および他の試験により常套
的に示されるように、形質転換体のうち幾らかは所望の
〜５．７ｋｂプラスミドのみを念むく第１０図）。本明
細書中大腸菌Ｋ １．２ Ｊ Ｍ Ｉ Ｏ９／ｐＯＷ１
０６３と弥するこのような形質転換体を選択し、アブラ
マイシン１００μ９／コシを含有するＴＹ寒天」二に蒔
き、次いて常套の微生物学的手法を用いて培養する。得
られた形質転換体を実施例１に記４戊のようにプラスミ
ドｐＯＷ］０６３のｄｉ離に使用する。 ■、プラスミドＩ）ＯＷ１０６３を用いるアスペルプラ
スミドｐｏＷ）０６３によるアスペルギラスの形質転換
アスペルギラスブロトブラストの調製およびプラスミド
ｐＯＷ１０６３を使用するＡＴＣＣ２８９０１のごとき
アスペルギラス・ニデユランス菌株の形質転換は、実施
例５の方法と実質的に同様にして達成することができる
。 アスベルキラス形質転換体を前記実施例５Ｂのようにし
て単離、成長させ、細胞抽出物を調製しペニシリンＧ生
産について検定した。形質転換体のうち幾らかは、ゲノ
ム性アシルトランスフェラーゼ遺（公子の妨害を含む十
目同な組換え現象のためこペニシリンＧの合成かできな
いであろう。このような形質転換体は２個の不完全な非
機能性Ａ Ｔ遺伝子を含んでいる。一方のＡＴは３″暗
号化配列を欠き、他方は５′暗号化領域の一部を欠いて
いる。この過程を以下の図式に示す。 この所望の形質転換体はβ−ラクタム生合成過程の最終
生成物としてイソベニ７リンＮを蓄積する。 二の形質転換体の常任的確認はケ７ムＤ Ｎ Ａの制限
酵素分析およびその池の試験を含む。プラスミドｐＯＷ
Ｉ０６１により形質転換することによって所望のアスペ
ルキラス形質転換体のペニシリンＧ生合成能が復元する
（実施例３を参照）。 実施例１０ アスペルギラス・ニデユランス中のアシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子置換ペニシリンＧ
を生産できないアスペルギラス菌株を作るもう１つの方
法は、遺伝子置換による方法である。ゲノムアシルトラ
ンスフェラーゼ遺（公子を、相同な二重交差現象に有ｆ
ｌｌなプロトコールによって非機能的アシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子に置換する。所望の非機能的遺伝子は、
プラスミドの持つアシルトランスフェラーゼ遺伝子を耐
性マーカーで妨害することにより組立てられる。 この場合ペニシリウムＩＰＮｓプロモーターを有するフ
レオマインン耐性遺伝子を用いる。 プラスミドｐＫＣ７８７（実施例２Ｃ）およそ５μ９を
実施例３Ａの教示と実質的に同様にして制限酵素Ｐｖｕ
［およびＨｉｎｄ［ｌで完全に切断し、所望の〜２．７
ｋｂ Ｐｖｕｌ／１（ｉｎｄＩＩｌフラグメントを実施
例２Ｂのようにアガロースゲル電気泳動によりキ離する
。次いで精製したフラグメントをＴＥ緩山液約１００μ
ρに溶解し、将来の使用のためにＯｏＣで保存する。 プラスミドｐＯＧ○４（ＮＲＲＬ ＋３−１８１７１
）を実施例１に記４戊のように大腸菌ＫＩ２ＪＭ１０９
／ｐＯＧ○４から得る。プラスミドｐｏｃｏ４約５μ７
を実施例３ＡのようにＨｉｎｄｌｌｌおよびＰ ｖｕ
１て消化し、次いてＡＴ遺伝子を含む所望の〜２８ ｋ
ｂ Ｈ１ｎｄｌｌｌ／ Ｐ ｖｕ ｌフラグメントを実
施例２Ｂのようにアガロースゲル電気泳動によって単離
する。精製したフラグメントをＴ Ｅ Ｈ術成約１００
μＱに溶解し、後の使用のため００ＣでＩｎする。 Ｃ，プラ１ ミドｐＯＷ１０６４の構築プラスミドｐＫ
Ｃ７８７山来の〜２．７ ｋｂ ｔ（１ｎｄＩＴＩ／Ｐ
ｖｕｌフラグメント約１μ９およびプラスミドｐｏｃｏ
４の〜２．８ｋｂ Ｈｉｎｄｌｌｌ／ Ｐｖｕｌフラグ
メント杓０５μ９を連結し、得られた連結反応物を用い
て大腸菌Ｋ１２ＪＭＩ０９／ｐＯＷＩ０６４を１し質や
置換し、了ブラマインン１． ＯＯμ９／肩σに対し耐
性とする。この連結および形質転換は実施例２Ｄの方法
と実質的に同様にして行なう。アガロースゲル電気泳動
およびその他の試験で示さ４するように、形質転換体の
うち幾らかは所望の〜５５ｋｂプラスミドのみを含んで
いる（添付の第１２図を参照）。本明細書中大腸菌に１
２ＪＭ１０９／ｐＯＷ１０６４と称するこうした形質転
換体を選択し、アブラマイシ７ ］ ００ ｕｇ／ｘＱ
を含有するＴＹ寒天上に蒔き、常套の微生物学的手法を
用（Ｘで培養する。得られた形質転換体を用（Ｘで実施
例１に記載のようにプラスミドｐＯＷＩ０６４を単離す
る。 プラスミドｐＯＷ１０６４（上記で構築）を実施例１に
記載のようにして大腸菌ＫＩ２ＪＭ１０９／ｐＯＷ］０
６４から単離する。実施例９１Ｂの教示と実質的に同様
にしてプラスミドｐＯＷｌ。 ６．１およそ５μ９をＮ ｃｏ Ｉで）肖化し、このフ
ラグメントの末端をフレノウ酵素を用いて平滑にする。 得られた〜４．７ ｋｂフラグメントをアガロースゲル
電気泳動により常套的に単離する。得られた〜４ 、７
ｋｂフラグメントをＴＥ緩衝液約１００μｇに溶解し
、後の使用に備えてＯ′Ｃで保存する。 プラスミドｐＲＨ５（実施例２で構築）を実施例１に記
１ｉのように大腸菌から単離する。プラスミドｐＲＨ５
約５μ９を、実施例９１Ａと実質的に同様にしてＥｃｏ
Ｒｌで、そして実施例８Ｄと実質的に同様にしてＨｉｎ
ｄｌＴＩで消化し、得られたフラグメントの末端を実施
例９［Ｂと実質的に同様にしてフレナラ酵素で充填する
。得られたフラグメントのうち１個は、アガロースゲル
電気泳動により常套的に単離される〜２．ｌｋｂ平滑末
端制限フラグメントである。所望の〜２゜ｌｋｂ平滑末
端フラグメントをＴ Ｅｌｌ液液１００μｇに溶解し、
将来の使用のためにＯ′Ｃて保存する。 実施例１０ｎＡの〜４ 、７ ｋｂ平滑末端フラグメン
ト約１μ９および実施例１０１１Ｂの〜２．＋ｋｂ平滑
末端フラグメント約０５μ９を連結し、得られたプラス
ミドを用いて大腸菌Ｋ ｌ ２ Ｊ Ｍ ｌ ０９を形
質転換し、アプラマイ／ン１００μ９／ｍＱに対し耐性
とする。この連結および形質転換は実施例２Ｄと実質的
に同様にして行なう。アガロースゲル電気泳動および他
の試験で常套的に示されるように、この形質転換体のう
ち幾らかは〜６．８ｋｂプラスミドのみを含んでいる（
添付の第１３図に示す）。本明細書中大腸菌Ｋ］２ＪＭ
Ｉ０９／ｐＯＷ１０６５と称するこのような形質転換体
を選択し、アブラマインンＩ ＯＯｕｇ／ ｍＱを含有
するＴＹ寒天」−に蒔き、次いて常套の微生物学的手法
を用いて培養する。得られた形質転換体を実施例１に記
載のごとくプラスミドｐＯＷ］０６５の単離に使用する
。 アスペルギラスブロトブラストの調製およびプラスミド
ｐＯＷＩ０６５を使用するＡＴＣＣ２８９０＋のごとき
アスペルキラス・ニデユランス菌株の形質転換を実施例
５に従って達成する。形質転換前にプラスミドを直線化
すると所望の相間二重交差を含む形質転換体を取得てき
る可能性か増す。これは形質転換に先立ちプラスミドｐ
ＯＷ１０６５をＨｉｎｄＩＩｌ消化することによって行
う。 アスペルギラス形質転換体を前記実施例５Ｂのように単
離および成長させ、細胞抽出物を調うνしペニシリンＧ
生産について検定する。形質転換体の幾らかは、二重交
差を含む相同組換え現象のためにペニシリンＧ合成かで
きない。このような現象において、機能的ゲノムア／ル
トランスフェラーセ遺伝子はケノムから失われ、下記に
示すプラスミドｐＯＷ１０６５の持つ変異体である非機
能的アシルトランスフェラーゼ遺伝子かとって代わるで
あろう。さらに所望の形質転換体はインベニンリノＮを
痰積するであろう。このような形質転挟体のさらなる確
認は、サイン・ハイブリダイゼー／３ン分析と組合わせ
たアスペルギラスゲノムＤＮＡの制限酵素分析を含んで
よい。プラスミドｐＯＷ１０６１を用いたＡＴ欠損菌株
の形質転換（実施例３を参μ、α）は、この菌株のベニ
／リノＧ生合成能を回復するであろうし、かくして所望
の二重交差現象が起こったということを決定するもう１
つの手段をも提供するものである。 実施例１１ アスペルギラスＡＴ欠損閑におけるセファ
ロスポリン類の生産 実施例９および１０で作られるアスペルギラスへＴ欠損
株を、デアセトキンセファロスポリンＣ／ンテターゼ（
エクスパンダーゼ）およびインペニシリンＮエピメラー
ゼ（エビメラーセ）をコードする遺伝子を本菌株中に導
入することにより、アスペルキラス中で有用なセファロ
スポリン類を生産するよう活用する。このような遺伝子
は、宿主生物中で機能する転写および翻訳支配領域の支
配下にある限り、どんな遺伝子も好適である。 特に好ましいエクスパンダーゼおよびエピメラーゼ遺伝
子の組はストレプトマイセス・クラブリゲラスから導か
れる。Ｓ、クラブリゲラスのエクスパンダーセ遺伝子は
、取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６４のもとてＮＲＲ
Ｌから入手可能な大腸菌に１２菌株ＲＲＩ△〜ｉ１５中
のプラスミドｐＯＷ３８０から誘導することができる。 Ｓ クラブリケラスのエピメラーゼ遺伝子は、取得計号
ＮＲＲＬＢ−１８４３１のもとてＮＲＲＬから入手でき
る大腸菌Ｋ １２ＲＲＩ△ＭＩ５中のプラスミドｐＯＷ
３９０から人手できる。次いてこれらの遺伝子は、米国
特許出願第０６／８０１５２３号に記載されプラスミド
ｐＬＣ２（ＡＴＣＣ５３３３４）から入毛可能なベニツ
リウムのイソペニシリンＮ／／テターゼプロモーターの
ようなアスペルギラス中て機能する周知のプロモーター
のいずれかの支配下に置かねばならない。 次いでエクスパンダーゼおよびエピメラーゼ遺伝子を含
むベクターを実施例５の方法によってアスペルギラスＡ
Ｔ欠損株中に導入する。形質転換体を選択し、３０’Ｃ
で７〜１０日間成長させ、セファロスポリン生産につい
て常套的に検定する。 大嶺例１２ アシルトランスフェラーゼの非転写（アン
チセンス）ＲＮＡを使用するペニシリンＧ生産菌におけ
るセファロスポリン類の生産プラスミドｐＬＣ２（ＡＴ
ＣＣ５３３３４）より入手できるベニ７リウム・クリソ
ゲナムイソベニンリンＮ／ンテターゼプロモーターはア
スペルギラスおよびベニツリウムの両者において機能的
である。本実施例にはアスペルギラス中でアスベルキラ
スア／ルトランスフェラーゼ遺伝子を１史用する方法を
記載するが、ペニシリウムア／ルトランスフェラーセ遺
伝子を用いたベニツリウムにおける頑似の方法を実施す
ることもできる。単に本明細書中のアスペルギラスの代
わりにベニ／リウムＡＴ暗号化領域で置きかえる必要が
あるだけである。ベニツリウムＡ Ｔ 漬（Ｅ子は、一
般に入手可能なペニシリウム菌株からのゲ７ムＤ Ｎ
Ａのライブラリーから本発明に係るＡＴ遺伝子をハイブ
リダイゼ−７ヨンプローブとして使用して単離すること
ができる。 実施例１に記載のように単離されるプラスミドｐ＋、、
Ｃ２からの二本鎖ＤＮＡフラグメントを増幅するため
にポリメラーセ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。このフ
ラグメントはアシルトランスフェラーセ遺伝子の５゛調
節領域を含んでいる。反応（装置および試薬はＰｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、 １４０Ｑ ５３ｒｄ
Ｓｔ、 、 Ｅｍｅｒｙｖｉ ｌ Ｉｅ、 ＣＡ ９４
６０８から入手可能）は下記の一本鎖プライマーを用い
て実施する。反応成分は、ＩＸ緩ｔｉ液中のｄＮＴＰ各
々２００μＭ、プライマー各１μＭ、鋳型（テンプレー
ト）Ｉｎｇ、およびアンプリタフ（ＡｍｐｌｉＬａｑ”
、’）ＤＮＡポリメラーセ２５ｔ１１位（総量１００μ
のである。この反応物を９・１°Ｃて１分間、５０〜６
０°Ｃで１分間、そして７２℃で１分間、２５サイクル
の間インキュベートする。最終サイクルの後７２°Ｃて
のインキュベーションを７分間継続し、全ての鎖の重合
を完成させねばならない。ＤＮＡブライマーはイタクラ
等［１ｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 （１９７７） ５
ｃｉｅｎｃｅ １９８ ： １０５６］、フレア等［Ｃ
ｒｅａ ｅｔ ａｌ、（１９７８） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７５ ： ５７６５］
、スン等［１１ｓｕｉｎｇ ｅｔ ａｌ、 （１９８３
） Ｎｕｃ、Ａｃｄ、 Ｒｅｓ、 ＩＩ ： ３２２７
］、またはナラング等［Ｎａｒａｎｇ ｅｔａｔ、 （
１９８０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ ６８ ： ９０］の方法により手法で合成してよ
い。このブライマーはＡ Ｂ Ｓ （Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ、８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃ
ｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ、Ｃ
Ａ ９４４０４）３８０ Ａ Ｄ Ｎ Ａ合成装置の
ごとき自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成してもよい。最
初のブライマーはこのフラグメント中にＨｉｎｄｌ１１
部位を組み込んでいる。このブライマーの配列は Ｈｉｎｄｌｌｌ ５’ −ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴｒＣＡＧＧＣＡＡＣＣＴ
第２のブライマーはフラグメント中にＮｃｏｌサイトを
組み込んでおり、翻訳開始サイトから２０塩基対下流で
ブライミングを開始する。 Ｎｃ。 ＰＣＲ反応の生成物は長さ４８８塩基対のＤＮＡフラグ
メントである。ＨｉｎｄｌＩＩ制限部位は５゛末端から
４塩基対のところに位置する。Ｎｃｏ＋制限部位は３°
末瑞から４塩基対のところに位置する。 増幅されたＤＮＡをフェノールで２回、クロロホルムで
２回抽出し、エタノール沈澱し、水に再懸濁する。次い
でこのフラグメントを、ＥｃｏＲＩの代わりにＮｃｏｌ
を使用する他は実施例９１Ａと実質上同様にして制限酵
素Ｎｃｏｌによって、そして実施例８Ｄと実質上同様に
して制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩによって完全に切断し、フ
ェノール抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱
し、水２５μＱに再懸濁する。この時点でフラグメント
は約４７８塩Ｊλ対の長さである。 上記Ａ項に示すように、ＰＣＲ反応は５′末端でＨｉｎ
ｄＩ［Ｉ制限部位と、そして３”末端でＮｃｏｌ制限部
位と境界を接するアシルトランスフェラーゼ遺伝子を含
む多数のＤＮＡフラグメントを産み出すのに用いられる
。ＰＣＲ反応の鋳型は実施例１に記載の通り単離された
プラスミドｐＯＧＯ４である。この反応のためのブライ
マーは以下のように表わされる： このブライマーはＡＴオープン・リーディング・フレー
ムの５′末端から２０塩基対の所でブライミングを開始
する。 第２のブライマーはＡＴオーブン・リーディング・フレ
ームの３′末端付近から２０塩基対の所でブライミング
を開始する： 増幅したＤ Ｎ Ａフラグメントを２回フェノール抽出
し、２回クロロホルム抽出し、エタノール沈澱し、ｌ−
１，０に再懸濁し、Ｈｉｎｄ［ＩＩおよびＮｃｏｌて切
断し、フェノール、続いてクロロホルム抽出し、エタノ
ール沈澱し、水に再懸濁する。生成したＤＮ Ａフラグ
メントは長さ１２９０塩基対である。 制限酵素切断の後、これは約１２８０塩基対の長さであ
る。 Ａ項で得たＤＮＡフラグメントおよび」項て得たＤＮＡ
フラグメントの当モル■を混合し、実施例２ Ｄに従っ
て連結する。リガーセをフェノール、次いでクロロホル
ムによる抽出によって不活性化する。このＤＮＡを次い
でエタノール沈澱し、水にｉ′ｆ丁懸濁する。次に連結
した物質を制限酵素ＨｉｎｄｌＩＩで切断し、次いてこ
の酵素を上記のごとく不活性化する。生成したＤＮＡフ
ラグメントをＨｌＯｌ、：再懸濁する。 所望の生成物を次のように表すことができる１１ｉｎｄ
ｌｌｌ Ｎｃｏｌ ｔ
ｔｉｎｄｌｌ、＼Ｔプロモーター リバースＡＴ遺
伝子Ｄ、 ＨｉｎｄＩ［Ｉ切断したｐＲＨ５プラスミ
ドＤＮＡの票習 プラスミドｐＲＨ５（実施例２）を制限酵素Ｈｉｎｄ■
で完全に切断する。反応混合物はフェノール、次いでク
ロロホルム抽出し、エタノール沈澱シ、Ｈ，Ｏに再懸濁
する。 Ｅ、プラスミドｐｐ Ｓ ９５の最終的な構築０項で得
たＤＮＡフラグメントを、Ｄ項で得たＨｉｎｄｌｌｌ切
断プラスミドｐＲＨ５ＤＮＡに連結して所望のプラスミ
ドｐＰＳ９５を作る。所望のプラスミドｐＰＳ９５を含
む連結混合物をコンピテントな大腸菌に１２ＪＭ１０９
細胞中に導入して形質転換させる。この連結および形質
転換は実施例２Ｄと実質上同様にして行なう。形質転換
反応物の一部をアブラマイシンｌ ＯＯｕ９／ ｘ（ｌ
を含有するし寒天上に蒔く。アブラマイシン耐性形質転
換体をゲル電気泳動によってｐＲ）（５への挿入につい
てスクリーニングする。ｐＲＨ５中のＨｉｎｄＩ［Ｉフ
ラグメントは２つの配向のうちの一方となるであろう。 フラグメントが所望の配向を持つプラスミドをｐＰ Ｓ
９５と定め、制限酵素分析により常套的に同定する。 プラスミドｐＰ Ｓ ９５の構造および機能地図を第１
５図に示す。 ＡＴ非転写プラスミドｐＰ Ｓ ９５を含むアスペルギ
ラス菌株を用いて実施例１１に記載のようにセファロス
ポリン類を生産する。
要な抗生物質であり、フレミング（Ｆｌｅｍｉｎｇ）に
よるペニシリン類の発見以来、６０年近く、新規なβ−
ラクタム系化合物の単離が続けられている。ペニシリン
類とセファロスポリン類（セファマイシン類を含む）の
共通の構造的特徴はβ−ラクタム環である。 これらの抗生物質は種々の原核生物および低級真核生物
によって産生される。化合物ペニシリンＧ（ベンジルペ
ニシリン）またはペニシリンＶｌｌとするペニシリン類
は、糸状菌、特にペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕ＋ｎ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）によっ
て産生される。また、低級真核生物セファロスポリウム
・アクレモニウム（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａ
ｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）［アクレモニウム・クリソゲナム
（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）と
同義］からの産物として初めて単離されたセファロスポ
リン類は、セファマイノン類やその他のβ−ラクタム類
［例えば、オ牛ンベナム類（クラプラン酸）やカルバペ
ネム類（チェナマイシン）など］をも産生ずる多数の原
核生物、特にストレプトマイセス・クラブリゲラス（Ｓ
ｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅ？ｕｓ）
、Ｓ、リプマニー（Ｓ、 ｌｉｐｍａｎｉｉ）およびＳ
、カトレヤ（Ｓ、 ｃａｔｔｌｅｙａ）の中間代謝物で
もある。 β−ラクタム産生生物からの細胞不含の系の開発は、イ
オウ含有のβ−ラクタム類（ベニ７リン類およびセファ
ロスポリン類）の経路における生合成工程の樹立を可能
にした。 原核および低級真核の両生物によって産生されるセファ
ロスポリン類および糸状菌（例えば、Ｐクリソゲナム）
におけるペニシリン類の生成の最初の段階は同一である
。ＡＣＶシンテターゼが、アミノ酸前駆体Ｌ−α−アミ
ノアジペート、Ｌ−／スティンおよびＬ−バリンのトリ
ペプチドＬＬＤＡＣＶへの縮合を触媒する。次の段階で
、トリペプチドの環状化によって経路中に最初のβ−ラ
クタムが形成され、ペニシリン類、セファロスポリン類
およびセファマイシン類の全ての前駆体であるイソペニ
ンリンＮ（Ｉ ＰＮ）が得られる。 ＩＰＮの合成後、セファロスポリン類およびペニシリン
類への経路は分かれる。例えば、ペニシリウム・クリソ
ゲナムでは、ＩＰＮのα−アミノアジピル側鎖を、対応
するアシルＣｏＡから導かれる多数の銖水性側鎖（現在
では、およそ１００）の１つに交換することができる。 最もよ（知られた例の１つは、フェニルアセチルＣｏＡ
とＩＰＮからのペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）の
生成である。しかし、菌Ｃ，アクレモニウムでは、α−
アミノアジピル側鎖は異性化されてペニシリンＮが得ら
れる。次いで、ペニシリンの５員のチアゾリジン環は、
セファロスポリン類の特徴である６員のジヒドロチアジ
ン環に「拡張」される。この反応はデアセトキ／セファ
ロスポリンＣシンテターゼ（ＤＡＯＣ５）によって触媒
され、経路における最初のセファロスポリンであるデア
セトキシセフ１０スポリンＣ（ＤＡＯＣ）を生成する。 セファロスポリウム・アクレモニウムならびにグラム陽
性細菌ストレプトマイセス・クラブリゲラスおよびＳ、
ラクタマデュランス（Ｓ、 ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ
）由来のＤＡＯＣ３活性はその特徴が厳密に調べられて
いるが、この経路の残りの段階はよ（わかっていない。 本発明は、イソペニシリンベニアシルＣｏＡアシルトラ
ンスフェラーゼと呼ばれる、ペニシリン類の産生に関与
しているｌまたはそれ以上の活性をコードしている遺伝
子を提供するものである。 また、この活性はアシルトランスフェラーゼとしても知
られている。本発明は、過剰産生されうるβ−ラクタム
生合成酵素のレパートリ−を広げるものである。この能
力は、増加した遺伝子量による菌株の改良および基質類
似体の新規β−ラクタム類への生物変換を容易にする。 本発明は、２機能性の酵素イソペニシリンＮ；アシルＣ
ｏＡアシルトランスフェラーゼ（アシルトランスフェラ
ーゼ）をコードしているＤＮＡ配列を包含するものであ
る。この酵素をコードしている遺伝子はｐｅｎＤＥと命
名されている〔インボリアおよびクイーナ−（Ｉｎｇｏ
ｌｉａ、Ｔ、Ｄ、 ａｎｄ Ｑｕｅｅｎｅｒ、Ｓ。 １、 、 Ｍｅｄ、 ＣｈｅＩＩｌ、 Ｒｅｖ、 ９
： ２４５−２６４（１９８９））］。この２２機能は
、フェニルアセチルＣｏＡと６−アミツペニンラン酸ま
たはイソペニシリンＮのいずれかからのペニシリンＧの
生成を触媒するこの酵素の能力によっている。この反応
は重要な抗生物質ペニシリンＧの生合成における必須の
工程である。 この経路を第１図に示す。 本発明のＤＮＡ化合物はアシルトランスフェラーセ酵素
をコードしている。アシルトランスフェラーゼ活性をコ
ードしているＤＮＡ化合物は、アスペルギラス・ニデユ
ランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ１ｄｕｌａｎｓ）
のゲノムＤＮＡから単離した。このクローンしたアシル
トランスフェラーゼ遺伝子は、アスペルギラスまたはペ
ニンリウム中でペニシリンＧの収量を増加させるのに、
特にアシルトランスフェラーゼによって触媒される反応
が律速段階であるときに有用である。これは、遺伝子の
量を増加させることによって、および／または強力なプ
ロモーターの後ろに暗号領域を配置することによって達
成される。クローンした遺伝子（修飾を加えた形Ｑ！
）の別の用途は、組換えまたはアンチセンスＲＮＡの使
用によってアスペルギラス・ニデユランスのアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を不活性化して、エピメラーゼ（
ｃｅｒＤ）およびエクスパンダーゼ／ヒドロキンラーゼ
（ｃｅｒＥＦ）が細ｎ包中に導入されて同時に発現され
るときにセファロスポリン化合物を産生させることであ
る。 同じような使用を、ペニシリウム・クリソゲナムのアシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を用いて行うことができる
。アスペルギラス・ニデユランスのアシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子をハイブリダイゼーションプローブとして
用い、当業者には普通の方法によってペニシリウム・ク
リソゲナムのアシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離す
る。アシルトランスフェラーゼ遺伝子の不活性化と酵素
エピメラーゼ（ラセマーゼ）およびエクスパンダーゼを
コードしている遺伝子の追加によって、ベニ／リウム中
で大収量のセファロスポリン類を得ることができる。ア
シルトランスフェラーゼ遺伝子の不活性化は、例えば抗
生物質耐性遺伝子が挿入されたクローン化遺伝子による
遺伝子置換によって行うことができる。 アシルトランスフェラーゼ活性をコードしているＤＮＡ
化合物をアスペルギラス・ニデユランスのゲノムＤＮΔ
から単離し、これを用いて組換えＤＮＡ発現ベクターを
構築することができる。３種類のこれら発現ベクターが
特に有用である：即ち、第１のものは大腸菌（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）において、第２のものはペニシリウムにおいて、
そして第３のものはアスペルギラスにおいてアシルトラ
ンスフェラーゼタンパク質の高レベルの発現を導く。 以下、本発明をさらに詳しく説明する。本明細書中に開
示した発明を明瞭にし、その理解を助けるため、以下の
用語を定義する。 アシルトランスフェラーゼ活性ニアシルＣｏＡと６−ア
ミツペニ／ラン酸またはイソベニ７リンＮのいずれかか
らのペニシリン類の生成を触媒する酵素活性。 ａＴ ＰＮＳ ：アスペルギラス・ニデユランス由来の
イソペニシリンＮシンテターゼあるいはイソペニシリン
ＮシンテターゼをコードしているＤＮ八へ ａｍｄ Ｓ アセトアミダーゼ遺伝子；アスペルギラ
ス・ニデユランスのアセトアミダーゼ遺伝子を示すため
に図面中での用いられている。 ａｍｄｓ ｐ ： ａｍｄｓ遺伝子のプロモーターＡｍ
Ｒ・アンビンリン耐性を付与する遺伝子アンビンリン耐
性の表現型を示すためにも用いられる。 抗生物質：微生物によって産生される物質であって、天
然に、または限定された修飾によって、他の原核または
真核細胞の増殖を抑制するか、または死滅させる物質。 抗生物質生合成遺伝子ニー次中間代謝物を抗生物質に変
換するか、またはある抗生物質化合物を別の抗生物質化
合物に変換する過程における酵素反応に必要な活性をコ
ードしているＤＮＡセグメント。 抗生物質産生生物、抗生物質を産生ずるか、または発現
したときには抗生物質を産生ずるであろう遺伝子を含有
しているあらゆる生物であって、アスペルギラス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、
フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
、モノスポラ（Ｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、セファロスポリ
ウム（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｆｆｌ）、ペンロマ
イセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ボドスボラ（Ｐ
ｏｄｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（ｐＨｉＣｉｌｌｉ
ｔ＋ｎ＋）、およびノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）を
含むが、これらに限定はされない。 抗生物質耐性を付与する遺伝子：抗生物質に対する耐性
を付与する活性をコードしているＤＮＡセグメント。 ＡｐＲ・アンピンリン耐性を付与する遺伝子：アンビン
リン耐性の表現型を示すためにも用いられる。 ＡＴ・アシルトランスフェラーゼ遺伝子。 ｂＩ）：２本鎖ＤＮＡの塩基対。 ｃ＋ｓ５７：λｐＬプロモーターの温度感受性リブレ、
サーをコードしている遺伝子。 クローニンク二組換えＤＮＡクローニングベクターにＤ
ＮＡセグメントを導入する過程。 暗号配列：遺伝子中のＤＮＡ配列であって、該遺伝子に
よって発現されるタンパク質のアミノ酸残基配列、また
はｒＲＮＡもしくはｔＲＮＡ遺伝子の場合には該遺伝子
によって発現されるｒＲＮＡもしくはｔＲＮＡのＲＮＡ
配列のどちらかをコードしている配列。 フスミド：ブラスミドと同じ方法で宿主細胞中で？９製
することができるが、ファージのパ、ケージング機序を
も利用することができる組換えＤＮＡクローニングベク
ター 遺伝子：遺伝子産物、即ちタンパク質（従って、必然的
にｍＲＮＡ）、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡのいずれかを発
現させるように配置されたプロモーター翻訳活性化配列
、暗号配列、および３゛調節配列を含有するＤＮＡセグ
メント。 ゲノムライブラリ−・実質的に特定の生物の全ゲノムに
相当するＤＮＡセグメントがクローニングされた一群の
組換えＤＮＡクローニングベクタハイブリダイゼーショ
ン：２つの１本鎖ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ分子をア
ニーリングして２本鎖の分子を形成させる過程；この分
子は完全な塩基り４となっていてもよいし、なっていな
くてもよい。 ＩＰＳまたはｌ ＰＮＳ ：イソペニシリンＮシンテタ
ーゼ。 イソペニシリンＮ：以下の構造を有する化合物：Ｉ イソペニシリンＮシンテターゼ：δ−（Ｌ−α−アミノ
アジピル）−し−システイニル−Ｄ−バリンからのイソ
ペニシリンＮの生成を触媒する酵素であり、シクラーゼ
としても知られている。 単離したＤＮＡ化合物：構築されたか、または合成され
たあらゆるＤＮＡ配列であって、その配列が見い出され
る生物のゲノムＤＮＡとは位置的に異なっているＤＮＡ
配列。 Ｉａｃｌ・大腸菌の１ａｃｌ遺伝子。 １ａｃＺα：大腸菌のＩａｃオペロンから導かれるプロ
モーターおよびβ−ガラクトンダーゼ（ｌａｃＺ）αフ
ラグメント。 Ｍ１３０Ｒ１：ファージＭ１３の複製起源。 ＭＣ３：多重クローニング部位。 ｍＲＮＡ：メソセンジャーリボ核酸。 ＯＲＩニブラスミドまたはベクターの複製起源であり、
ＤＮＡポリメラーゼの付着または開始部位として働＜
ＤＮＡ配列。 ｐＡＴｐ：ベニシリウム・クリソゲナムアシルトランス
フェラーゼのプロモーター ＰｅｎＤＮＡ：べ二ンリウム・クリソゲナム由来のＤＮ
Ａ０ ペニシリンＧ：以下の構造を有する化合物・ペニシリン
Ｎ：以下の構造を有する化合物ｐｈｌＲ：フレオマイシ
ン耐性遺伝子。 ｐＬ；バクテリオファージλ由来の左側プロモーター プロモーター：転写を導くか、または開始させるＤＮＡ
配列。 組換えＤＮＡクローニングベクター−１またはそれ以上
の別のＤＮＡ分子を付加したかまたは付加することがで
きるＤＮＡ分子からなる、自律的に復製するかまたは組
込まれるあらゆる媒体であり、プラスミドを含むがこれ
に限定はされない。 組換えＤＮＡ発現ベクター：研究用ある０は産業上興味
あるポリペプチドまたはＩＩＩＡをコードしているＤＮ
Ａセグメントを発現させるように配置されたプロモータ
ーおよびその他の調節配列を含有する、自律的に複製す
るかまたは組込まＡするあらゆる媒体であり、プラスミ
ドを含むかこれ１こ限定はされない。 組換えｌ’）ＮＡベクター；あらゆる組換えＤＮＡクロ
ーニングベクターまたは発現ベクター制限フラグメント
・１またはそれ以上の酵素の作用によって生成したあら
ゆる直線状のＤＮＡ分子。 ｒ ＲＮＡ 、”Ｊボソームリホ核酸。 感受性宿主細胞：ある抗生物質に対する耐性を付与する
ＤＮＡセグメントなしでは、その抗生物質の存在下で増
殖することができないか、または増殖が抑制される宿主
細胞。 ＴｃＲ：テトラサイクリン耐性を付与する遺伝子：テト
ラサイクリン耐性の表現型を示すためにも用いる。 転写ターミネータ−・ＲＮＡポリメラーゼによるＤ Ｎ
Ａ転写の終止を合図するＤＮＡ配列。 トランスフエクタント：ファージ粒子中にバクケーンン
グされたＤＮＡによる、またはファージＤＮＡによる形
質転換を受けた受容宿主細胞。 形質転換体、形質転換を受けた受容宿主細胞。 形質転換：遺伝子型を変化させ、受容細胞が変化するこ
とになる、受容宿主細胞中へのＤＮＡの導入。 翻訳活性化配列：ｍＲＮＡに転写されたときにｍＲＮＡ
のタンパク質への翻訳を促進する調節ＤＮＡ配列。 ＬＲＮＡ：転移リボ核酸。 添付した図面に示されている制限部位および機能地図は
、本明細書中に記載の組換えＤＮＡベクターの概要を示
すものである。制限部位の情報は全てを示すものではな
い。従って、この地図に実際に示されている制限部位よ
り多数のある型の制限部位がベクター上に存在すること
もある。 第１図は、アシルトランスフェラーゼの反応を示す模式
図であり、 第２図は、β−ラクタム生合成経路を示す模式第３図は
、プラスミドｐＯＧＯ４の制限部位および機能地図の模
式図であり、 第４図は、プラスミドｐＵＴ７１５の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第５図は、プラスミド１）ＬＣ２の制限部位および機能
地図の模式図であり、 第６図は、プラスミドｐＫＣ７８７の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第７図は、プラスミドｐＲＨ５の制限部位および機能地
図の模式図であり、 第８図は、プラスミドｐＯＷ１０６１の制限部位および
機能地図の模式図であり、 第９図は、プラスミドｐＯＷ１０６２の制限部位および
機能地図の模式図であり、 第１．０図は、プラスミドｐＯＷ１０６３の制限部位お
よび機能地図の模式図であり、 第１１図は、プラスミドｐＯＷ１０６４の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１２図は、プラスミドｐＯＷ］０６５の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１３図は、プラスミドｐＰＳ９５の制限部位および機
能地図の模式図である。 本発明は、アスペルギラス・ニデユランスのイソベニ７
リンＮ：アシルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性を
コードしているＤＮＡ配列を含有する単離したＤＮＡ化
合物を含んでいる。また、本発明は、アスペルギラス・
ニデユランスのアシルトランスフェラーゼ活性をコード
しているＤＮＡ化合物ならびに組換えＤＮＡクローニン
グベクターおよび発現ベクターをも含んでいる。アスペ
ルギラス・ニデユランスのアシルトランスフェラーゼを
コードしているＤＮＡの配列を、Ａ、ニデユランスゲノ
ム中の暗号領域の５′および３゛末端と境界を接してい
るＤＮＡの一部と共に以下に示す。 この配列においては、２本鎖ＤＮＡ分子の解読鎖だけを
示し、５゛→３゛の方向で左から右にＤＮＡを示した。 ヌクレオチド配列には数を付した（数はＤＮＡ配列の左
側に付した）。 ４５１ ＣＴＴＧＣＣＡＡＧＧ ＴＡＣＣＣＣＣＴ
ＣＣＧＡＡＧＴＡＡＧＴＣＣＡτＡＣＣＣＧＡＡ ＴＧ
ＴＡＴＡＴＴｒＧ５０１ ＣＣＣＡＴＡｍＡ ＡＣＧ
ＣＣＴＡＴＡＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧ ＧＣＴＡＴＣＡ
ＣＣＡ ＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴ６５１ ＴＧＧＡＧＣ
ＡＧＧＴ ＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧ ＣＧＣＴＧＧＣＣＧ
Ａ ＧＡＴＡＣＴＡＴＧＡ ＧＧｋＡＡＴＣ”ｒＧＣ７
０１ＧＧＴＡＴＧＴｒＴＡ ＣＣＴＡＣＧｎＣＴ ｎＡ
ＣＴＴＧＣＴＧ ＡＡＴＣＡＣＣＣＣＧ ＴＴＧＡＣＧ
ＧＡＡＴ９５１ ＡＡＣＣ（ｉｃｃＡＴｒ ＣＣＧＧ
ＣＡＧＴＴＣＴｒＣＡＣＣＧＣＡＡ ＣＣＡＡＡＧＡＡ
ＡＡ ＣＴｍ；ＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＡＣＴ Ａ
ＣＡＣＣＴＡＣＡＴ ＧＧＣＣＴＣＣＧＴＣＣＣＡＣＴ
ＧＧＣＣＴ ＣＣＣＣＴＣＧＣＡＴＣＴＣＧＣＧＣＴＧ
ＣＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴ ＣＧＡＡＡＧＴＡＣＡ ＴＣ
ＴＣＣＧＴＣＴＧ ＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴ
ＣＧＴＣＴＣＧＣＡＡＧＧＧＧ ＧＣＡＴＧＧＣＧＧＣ
ＴＡＧＣＧＣＣＴｒＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＡＡＣ
ＧＣＡＣＡ ＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＣＴＡＧＡＧ
Ｔ ＴＣＴＣＧＣＣＣＡＴ ＣＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＡ
ＧＣＡＡＧＴＴＧ ＣＴＧＡＣＡＣＣＡＡ ＴＧＧＧＣ
ＧＧＡＴＡ ＧＴＧＣＡＴＡＣＧＡ ＡＣＣＡＣＴＧＣ
ＣＴＣＣＴＣＭＣＣＡＴ ＧＧＧＣＣＡτＣＧＧ ＣＧ
ＣＡＡＧＡＧＣＴ ＴＡＡＴＣＣＣＣＴＧ ＣＣＧＧＡ
ＣＴＣＧＴＧＧＡＧＣＣにＣＣＡ ＣＧＧＧＣＧＧＡＴ
Ｇ ＧＡＡＣＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴｒＴ ＴＧ
ＡＣＧＧＣＡＣＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＴ ＴｒＧＣＧＡ
ＡＧＴＴ ＧＴＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴ
ＡＣＣＣＴＣＴＣＴＣＧＡＴＣＴＧＣＣＧＧ ＧＣＡ
ＴＡＴＡＡＧＧ ＡＡＧＧＧＡＡＡＡＧ ＴＡＧＡＧＧ
ＣＴＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＴＣＴｒ
ＣＧＡＴＣＡＴＧＴＧ ＧＧＣＣＣ，ＧＡＡＧＧ ＣＡ
ＡＣＡＧＴＧＣＧ ＧＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＡＡＴ
ＭＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＣｍＧＴＣＡＴＧ ＡＣＣ
ｍＡＧＣＡ ＡＴＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣ
Ｇ ＡＴＣＣＡＡＩＩ；ＣＣＡ ＡＣＡＴＩＴＧＡＣＣ
ＡＡＴＡＴＣＴＣＴｒ ＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＧＣＣＴ
ｒＣＴＧＣＡ ＧＴＣＴｒＣＴＣＣＡ ＧＣＣＡＴＡＧ
ＣＧＴ ＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴ ＧＡＡＣＡＣＴＴＣＴ
ＡＴＧＴＡＴＣＴｒＧ ＡＣＡＡＣＴＡＧＡＴ ＡＣＡ
ＡＧＴＣＡＡＡ ＡＧＧＣＧＡＡＴＣＡ ＡＡＴＡＡＡ
ＧＴＣＧＣＡＴＧ’ｆｆｒＧＧＧ ＡＧＭＴＧＣＡＣＧ
ＣＣＡＧＡＧＴＧＡＡ ＡＴＧＣＴＧＡＡＴＣＣＴＧ
ＴＴＧＧＣＴｒＴＣＡＣＭＣＣＡＧ ＧＴＧＣＣＴＡＡ
ＡＧ ＴＡＴＡＧＣＭＴＧ ＣＡＡＣＧＭＧＧＣＡＴＧ
ＣＣＴＡＧＴＣＴＡｃｃＴＴｃＴＴｒ ＣＣＣＴＡＡＡ
ＣＡＴ ＧＣＴｒＴＡＡＡＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＧＡ
ＡＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＣＡＴＴＣＣＡＧＡ ＡＣＴＡ
ＣＴＡＣＴＡ ＡＣＴｒＣＣＴＡＴＴ ＡＣＣＣＴＧＧ
ＡＧＴ ＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧ
ＡＣＣＴＣＴＣＡＡＴ ＣＣＴＴＣＣＴＡＡＣＣＴＴＧ
ＴＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡ、ＡＧＣ２０５１ ＴＣ
ＴＧＣＡＡＴＣＴ ＴＧＴｒＴＡＡＣＣＴ ＡＣＣＴＡ
ＧＧＡＣＴ ＣＡＣＧＡＡＧＡＣＴ ＣＣＣＴＣＡＧＴ
ＡＴ２１０１ ＧＡＡＧＴＴＧＡＴＡ ＡＡＧＧＴＴ
ＣＴｒＴ ＧＴＧＣＴＣＣＧＡＧ ＣＣＣＧＣＡＡＧＧ
Ｇ ＡＡＡＴＣＡＧＴＧＣｌＣＴＧＣＡＧＡＡ ２５５１ ＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧ ＧＴｒＴＴＴＴＧ
ＡＡ ＴＡＴＴ１’ＣＡＡＴＴ ＧＧＣｍＣＣＡＣＣＡ
ＴＡＡＴＡＴＡＴ２６０１ ＧＡＴｒＡＴＡＧＴＴ
ＡＣＴＡＡＴＴＡＧＡ ＣＴＡＣＴｒＣＴＡＴ ＡＧＣ
ＡＡＡＧＣＴＴ［配列中、Ａはデオ牛ンアデニル残基、
Ｇはデオキングアニル残基、Ｃはデオキ７／チジル残基
、そしてＴはチミジル残基であるコ。 以下の配列は、先に挙げたＤＮＡ配列によってコードさ
れているアミノ酸配列である。位置４３８のメチオニ／
コドンの前のＤＮＡ配列は５°非非翻訳化列である。最
初のエクソンは塩基４３８−４７３で構成され、第２は
５２７−７０１で、第３は７５７−９０８で、そして第
４は９６８−１６７５で構成される。１６７６から末端
までの配列は３゛非翻訳化領域である。各イントロンの
最初と最後の塩基には星印を付けた。 ＧｌｙＳｅ ｒＡｌａＡｌａＬｙｓ ＧｌｙＧｌｕＩ
１ ｅＡｌａ Ｌｙ ｓＡｌ ａ Ｉ １ｅＡｓｐＰｈ
ｅＡ １ａＴｈ ｒＧｌｙＬｅｕＩ １ｅＨｉ ５９ｏ
ＩＡＣＴＧＧＧＡＣＧＴＡＧＧＴＴＡＴｒＡＧＡＴＣＣ
ＡＣＧＧＴＣＴＧＣＴＡＴＣＴＡｒｐＡｓｐ ．６８＋、ＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴ
ＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴ
ＡＧＣＧＴＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴ ｌ、４゜、 ７４ｉ
、ＧＡＡＣＡＣＴＴＣＴＡＴＧＴＡＴＣＴＴＧＡＣＡＡ
ＣＴＡＧＡＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡＴＣ
ＡＡＡＴＡＡＡＧＴＣＧ 、８ｏ。 、８ｏ、ＣＡＴＧＴＴＴＧＧＧＡＧＡＡＴＧＣＡＣＧＣ
ＣＡＧＡＧＴＧＡｋＡＴＧＣＴＧＡＡ
、８６゜、８６．ＧＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＩ
Ｉ：ＣＡＡＴＧＣＡＡＣＧＡＡＧＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧ
ＴＣＴＡＧＣＴｒＣＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡＣＡＴ 、９
２゜、９２．ＧＣＴＴ丁ＡＡＡＴＣＴＡ、ＡＴＡＣＧＡ
ＧＡＡＴ丁ＡＴＴＴＡＡＡにＣＡＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴ
ＡＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＣＴＡＴＴ １９ｓ。 ［配列中、Ａｌａはアラニン残基、Ａｒｇはアルギニン
残基、Ａｓｎはアスパラギン残基、Ａｓｐはアスパラギ
ン酸残基、Ｃｙｓは／スティン残基、Ｇｌｎはグルタミ
ン残基、Ｇｌｕはグルタミン酸残基、ＧＩＹはグリンノ
残基、Ｈｉｓはヒスチンン残基、Ｉｌｅはイソロイシン
残基ど、ｅｕはロイノン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｍ
ｅｔハメチオニン残基、Ｐｈｅはフェニルアラニン残基
、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒ
はトレオニン残基、Ｔｒｐはトリプトファン残基、Ｔｙ
ｒはチロシン残基、そしてＶａｔはバリン残基である］
。 上記のＤＮＡ配列が本発明の重要な部分であることは当
業者の認めるところであろう。上記の配列は、通常、完
全に保護されたデオキシリボヌクレオチド ビルディン
グブロノクを用い、改良ホスホトリエステル法によって
合成することができる。このような合成法は当分野でよ
く知られており、実質的にイタクラ等［１ｔａｋｕｒａ
ｅｔ ａｔ、、 １９７７Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋９８：
１０５６コおよびフレア等［Ｃｒｅａ ｅｔ ａｔ。 １９７ｇ＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、＾ｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳ＾７５：５７６５］の方法に従って行うこと
ができる。さらに、特に好ましい方法は、シン等［Ｈｓ
ｉｕｎｇ ｅｔ ａｌ、、１９８３．Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １１：３２２７］および
ナラング等［Ｎａｒａｎｇｅｔ ａｔ、、 １９８０．
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：
９０］が開示している。上に挙げたマニュアルの方法に
加えて、 Ａ、Ｂ Ｓ ［＾ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ＋８．５ＯＬｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒ
ｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ、ＣＡ
９４４０４コ３８０Ａ ＤＮＡ合成機などの目動
ＤＮＡ合成機を用いてＤＮＡ配列を合成することができ
る。また、このＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応によ
って調製することもできるし例えば、米国特許Ｎｏ、４
．８００１５９および４．６８３．２０２、および欧州
特許公開Ｎ ｏ、 ０２５８０１７（１９８７年３月２
日公開）を繋照］。 上に示したア／ルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸残
基配列は、アミノ酸残基のほとんどが１以上のＤＮＡ
トリプレットによってコードされるので、多数の別のＤ
ＮＡ配列によってコードされうる。これらの別のＤＮＡ
配列は同一の本発明のアミノ酸残基配列をコードしてい
るので、本発明はこれら別の配列をも包含するものであ
る。 本発明は、アスペルギラス・ニデユランスのアシルトラ
ンスフェラーゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物なら
びに組換えＤＮＡクローニンクベクターおよび発現ベク
ターを包含している。本発明のアノルトランスフエラー
ゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物は、Ａ ニデユラ
ンスの株から単離した。Ａ、ニデユランス株の全ゲノム
ＤＮＡのゲノムライブラリーを作成し、デオキ／ツボオ
リゴヌクレオチドプローブに相同な配列の存在について
試験した。このプローブは、ペニシリウム・クリソゲナ
ムのアシルトランスフェラーゼのアミ／末端アミノ酸配
列について得られている情報および遺伝コードの知識に
従って作成した。ＤＮＡの配列決定によって、Δ、ニデ
ュランスアアシトランスフエラーゼのオーブン・リーデ
ィング・フレームが明らかになった。 アスペルギラス・ニデユランスのアシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子は、ノーイン・リージョナル・リサーチ・ラ
ボラトリーズ［Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｌ？ｅｇｉｏｎａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎ Ｒ
ＲＬ ）、 Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ ６１
６０４］に受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８１７１のちと
で寄託されている大腸菌に１２ ＪＭ１０９中のプラ
スミドｐＯＧＯ４から〜２．１ｋｂのＰ ｖｕ ＩＳ
ｐｈ Ｉフラグメントとして単離することができる。プ
ラスミドｐＯＧＯ４の制限部位および機能地図を添付の
第３図に示す。 プラスミドｐＯＧｏ４は、本発明の池の発現ベクターの
構築のだめの有用な出発物質となる。これらのベクター
は、紹換え宿主細胞中でア／ルトランスフェラーゼ活性
を産生させる方法であって、（１） （ａ）プロモータ
ーおよび翻訳活性化配列、および（ｂ）ア／ルトランス
フェラーゼ活性をコードしているＤＮＡ配列でありて該
プロモーターおよび翻訳活性化配列から発現されるよう
に設置されているＤＮＡ配列、を含有する組換えＤＮＡ
発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、そして（２）上
程（１）で形質転換した宿主細胞を該ア／ルトランスフ
ェラーゼ活性を発現させる条件下で培徨する ことからなる方法において特に有用である。 プラスミドｐｏｃ○４は、大腸菌ＫＩ２ＪＭＩ０９／ｐ
ＯＧＯ４から、実施例Ｉに記載した方法によって単離す
ることができる。プラスミドｐ。 ＧＯｌｌは無傷のアスペルギラス・ニデユランスのアシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を含有しており、こ１ｔを
、例えばこのプラスミドから〜２．ＩｋｂのＰνｕｌ−
３ｐｈｌ制限フラグメントとして単離することができる
。 本発明のアシルトランスフェラーゼ発現ベクターは特定
の選択マーカーに限定されない。多数の選択マーカーが
アシルトランスフェラーゼ発現ベクターに用いるのに適
していることは当業者の認めるところである。このよう
な選択マーカーには、１ケはば、カナマイシン耐性を付
与する遺伝子、クロラムフェニコール耐性を付与する遺
伝子、またはその他の抗生物質耐性を付与する遺伝子が
含まれる。アスペルギラスおよびペニシリウムにおいて
有用なマーカーは、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ
）およびフレオマイ／ン耐性遺伝子（ｐｈｌＲ）である
。アンピシリン耐性遺伝子を含有する発現ベクターは、
この遺伝子が発現時に反応生成物を分解するであろうβ
−ラクタマーゼをコードしているので、有用性が少ない
。 原核生物の系においては、発現のために必要なら部位特
異的な突然変異誘発および制限酵素消化法を用いて、遺
伝子のイントロン（上記のＤＮＡ配列に示されている）
を除去することができる。 また、この遺伝子をハイブリダイゼーションプローブと
して用いて、必ずしもイントロンを含んでおらず、従っ
て原核生物中で発現させることができるｃＤＮＡクロー
ンを単離することもできる。 このように並んでいるベクターおよび形質転換微生物を
得るのに必要な方法の全ては当業者には周知である。こ
のような態様の全ては本発明の範囲内にある。 本発明は本明細書中に例示した特定のベクターに限定さ
れるものではない。本発明は、アスペルギラス・ニデユ
ランスのアシルトランスフェラーゼ活性をコードしてい
るＤＮＡ化合物を包含するものである。本発明のＤＮＡ
化合物を用いて、発現ベクターが復製するかまたはｘ■
込まれ、そしてプロモーターおよび翻訳活性化配列が機
能する任意の宿主細胞中でアシルトランスフェラーゼ活
性を発現させる発現ベクターを構築することができる。 従って、本発明は、大腸菌中でアシルトランスフェラー
ゼタンパク質を発現させる任意の大腸菌発現プラスミド
またはベクターを包含するものである。即ち、本発明は
、大腸菌中で機能するレプリコン、例えばｐＢ Ｒ３２
２、ｐＡｃＹｃ１８４、Ｆ、Ｃｏ１Ｖ−に９４、Ｒ１、
Ｒ６−５、あるいはＲ１００などのプラスミド由来のレ
プリコンを利用し、そしてアシルトランスフェラーゼタ
ンパク質を発現させる発現ベクターを包含している。 また、本発明は、もっばらプラスミドベクターに限定さ
れるものでもなく、組込みあるいはウィルス′ｆ製を利
用して宿主細胞中で１９製および維持され、モしてアシ
ルトランスフェラーゼタンパク質を発現する発現ベクタ
ーをも含んでいる。 本発明はア／ルトラ／スフエラーゼ遺伝子を発現させる
特定のプロモーターおよび翻訳活性化配列に限定される
ものではない。本発明は大腸菌中て機能するあらゆるプ
ロモーターおよび翻訳活性化配列を用いることを包含す
るものであり、これらを大腸菌中でアシルトランスフェ
ラーゼタンパク質を発現させるために用いる。大腸菌中
で機能する多数のプロモーターおよび翻訳活性化配列か
知られており、大腸菌中でアシルトランスフェラーゼタ
ンパク質を発現させるのに適している。 このような転写および翻訳活性化配列には、１ＰｐｓＩ
ａｃ、 ｔｒｐ、 Ｌａｃ、λｐＬ、およびλｐＲプロ
モーターおよび翻訳活性化配列が含まれるが、これらに
限定はされない。 さらに、他の生物由来の転写および翻訳活性化配列を本
発明のアシルトランスフェラーゼ活性をコードしている
Ｄ Ｎ Ａ化合物に連結して、活性化配列が機能する宿
主細胞中でアシルトランスフェラーゼ活性を発現させる
発現ベクターを得ることができる。大腸菌以外の宿主細
胞中でアシルトランスフェラーゼ活性を発現させるベク
ターも、特に、ある生物の抗生物質の産生能力および効
率を増大させる目的のためには有用である。 多種の生物がβ−ラクタム系抗生物質を産生ずる。以下
の第１表はβ−ラクタム系抗生物質を産生ずる生物を挙
げるものであるが、これらに限定はされない。 （以下、余白） ＾ｒａｃｈｎｏｍｙｃｅｓ ＋１１１ｎ１ｍＬｌｓ ＾ｎ１ｘｉｏｐｓｔｓ ｐｅｒｕｖｉａｎａ ＾ｓｐｅｒｇｉｌ Ｉｕｓ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎ＋ｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ ｐｏｌｙａｌｅｕｒｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ｃｕｒｔｉｐｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌｏｐｓｉｓ ｔｅｒｒｉｃｏｌａ ｆｆｌｌｎｌｌｌｌａ ｓｙｎｎｅｍａｔｉｃｏｌａ ｌａｂｒａ ｍｉｒａｂｉ ｌｉｓ ペニシリン類および セファロスポリン類 ペニシリン類および セファロスポリン類 ペニシリン類 ペニシリン類および セファロスポリン類 種々のβ ラクタム類 ペニシリン類および セファロスポリン類 第１表（続き） 生 物 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｌａｃｔａｍａｄｕｒａｎｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ Ｐａｅｃ ｉ Ｉｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｎｅｕｓ ｐｅｒｓｉｃｉｎｕｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌ＋ｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ Ｓｅｒｒａｊ＋ａ Ｓｐｉｒｏｉｄｉｕｍ ｕｓｃｕｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ ｃａｔｔｌｅｙａ ｃｈａｒｔｒｅｕｓ＋ｓ 抗生物質 種々のβ−ラクタム類 種々のβ−ラクタム類 セファマイシンＣ ノカルジシン ペニシリン類および セファロスポリン類 種々のペニシリン類 および他のβ−ラクタム類 種々のβ−ラクタム類 ペニシリン類および セファロスポリン類 クラプラン酸 アスバレ／マイシンＡ１ ＭＭ ４５５０、およびＭＭ ［９０２チエナマイ／ン ＳＦ １６２３および セファマイシンＡおよびＢ 第１表（続き） ＳｔｒｅｐｔｏＩＩｌｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ ｃｌａｖｕｌ ｉｇｅｒｕｓ ｆ ＋ｍｂｒｉａｔｕｓ ｒ ｌ ａｖｏｖ ｉ ｒｅｎｓ ｌａｖｕｓ ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ ｇｒ＋ｓｅｕｓ ｈａｌｓＬｅｄｉ ｈｅＬｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ＋ｃｕｓ Ｉｉｐｍａｎｉｉ セファマイシンＡおよびＢ ＰＡ−３２４１３−１、セファマイシンＣ１＾１６８８
６＾、ペニシリン類、セファロスポリン類、クラプラン
酸、 およびその他のフラバム類 セファマイシンＡおよびＢ ＭＭ ４５５０およびＭＶ １３９０２ＭＭ ４５５０
およびＭ！Ａ １３９（１２ＭＭ ４５５ＧおよびＭＭ
１３９０２セフアマイシンＡおよびＢ１ ならびにカルペチマイ／ン ＡおよびＢ セファマイシンＡおよびＢ Ｃ２Ｑ＆ｌＸ、および セファマイシンＡおよびＢ デアセトキ／−セファロス ポリンＣ セファマイシン、ペニシリンＮ１ ７−ノドキンセファロスボリンＣ１ 可士未（続き） ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｎａｙｅｎｓＩｓ ｐｌｕｒａｃｉｄｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓｏｃｈｅｉ ＳＩＯＹａｅｎＳＩＳ Ｒ０Ａ−６１２９ Ｆｌｉ ＫＣ−６６４３ ｔｏｋｕｎｏｍｅｎｓ＋ｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ エビチェナマイ／ンＦ１ ＭＭ４５５０、およびＭＭ１３９０２ Ｃ２０８１Ｘおよび セファマイシンΔおよびＢ ブルラノドマインノＡ セファマイシンＡおよびＢ ！１１Ｍ４５５０およびＭＭＨ９０２ ０＾−６１２９人 カルペチマイシンＡ アスバレノマイ／ンｌ＼ セファマイノン八およびＢ 上記のβ−ラクタム系抗生物質を産生ずる生物の一部は
、抗生物質の製造を目的とする医薬工業で用いられる。 これら生物の抗生物質産生能力は、発酵中に抗生物質生
合成酵素の細胞内４変を増ＩｎＩＩさせることによって
増大させ、そしてさらに効率良くすることができる。本
光明のア／ルトラ／スフェラーゼ活性をコードしている
Ｄ Ｎ Ａ化合物を用いることによって、適当な宿主細
胞に導入したときに形質転換宿主細胞のアシルトランス
フェラーゼ活性の細胞内濃度を増加させ、それによって
この細胞の抗生物質産生能力および効率を増大させる発
現ベクターを構築することができる（この宿主細胞が、
アシルトランスフェラーゼ活性が関与している中間反応
によってβ−ラクタム系抗生物質を産生ずるとき）。 ベクターが導入されるある宿主細胞のアシルトランスフ
ェラーゼ活性の細胞内肩ＦＫを増加させるであろうベク
ターは、次の要素を必要とする：ｌ）本発明のアシルト
ランスフェラーゼ活性をコードしているＤＮＡ化合物、
および２）形質転換しようとする宿主細胞中で機能する
だけでなく、正しい配向および位置に配置されていてア
シルトランスフェラーゼ活性をコードしているＤＮＡを
発現させる、プロモーターおよび翻訳活性化配列。ベク
ターが染色体外要素として、またはゲノムＤＮＡに組込
まれて宿主細胞中で′ＦＭ製したときにだけ安定な形質
転換体を得ることができるのは勿論のことである。即ち
、好ましいベクターは、宿主細胞中でベクターを特異的
に？ｕｌさせるか、または組込ませる配列を含有する。 しかし、ＤＮＡが宿主細胞に導入されたときに非特異的
な組込みが起こることもあるので、そのような特異的な
複製または組込み配列の存在は絶対に必要なものではな
い。また、アシルトランスフェラーゼ発現ベクターは、
このベクターを含有している宿主細胞を選択するための
手段を与える抗生物質耐性付与遺伝子あるいはその他の
要素を含むこともできるが、このような選択しうる要素
は、ベクターが宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組込まれる
ときには必要でもないし、また望ましくもないであろう
。 アスペルギラス・ニデユランスのアシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子の暗号配列を提供することによって、本発明
は形質転換に感受性である任意の生物のためのアシルト
ランスフェラーゼ発現ベクターを提供するものである。 上記の大腸菌アシルトランスフェラーゼ発現ベクターは
、多種多様の本発明の発現ベクターを例示するものであ
る。しかし、本発明の多数の好ましいベクターを設計し
て、β−ラクタム系抗生物質（ペニシリン類およびセフ
ァロスポリン類を含む）を産生ずる細胞においてアシル
トランスフェラーゼを発現させる。 本発明のベニンリウムベクターは、そのようなβ−ラク
タム系抗生物質を産生する細胞からの抗生物質の収量を
増加させるために、あるいは、アシルトラノスフェラー
ゼの産生を中止させるために用いるベクターの場合には
、この細胞によって通常は産生される抗生物質を変える
ために使用しうる本発明提供のベクターの例示である。 アセトアミダーゼ遺伝子またはフレオマイノン耐性遺伝
子を含有しているアシルトランスフェラーゼ発現ベクタ
ーは、唯一の窒素供給源としてのアセトアミドのもとで
、またはフレオマイ／ンのび注下でＰ、クリソゲナムが
天然には増殖することができないことから栄養要求変異
種などの特別の受容菌株を：Ａラシすることが必要では
ないので、ベニ／リウム・クリソゲナム中に遺伝子を挿
入するためのベクターとして特に宵用である。形質転換
用プラスミド中の遺伝子による栄養要求変異種マーカー
の補足に基づく形質転換系はこの利点を有していない。 多面発現の突然変異は、ペニシリン産生を高度に発展さ
せたＰ、クリソゲナム株中に栄養要求変異種マーカーを
導入することに関係していることが多い。通常、このよ
うな突然変異は比較的少ないペニシリン産生の結果にな
る［マクドナルド等（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ
、 、 １９６３． Ｊ、 Ｇｅｎ！ｌ！１ｃｒｏｂｉ
ｏ１．３３ ： ３６５−３７４）ｌ。上記および実施
例中のベクターは、本発明によって提供される多種多様
のアシルトランスフェラーゼ発現ベクターの例示にすぎ
ない。 本発明のアシルトランスフェラーゼ発現ベクターは、多
くの細胞、特にβ−ラクタム系抗生物質を産生ずる細胞
においてアシルトランスフェラーゼ活性の細胞内濃度を
増加させるのにイ１用である。 プラスミドｐＯＧＯ４はアスペルギラス・ニデユランス
のア／ルトランスフエラーセ遺伝子の暗号配列を含有し
ている。プラスミドｐＯＧ０４由来のフラグメントを用
いて、ア／ルトランスフェラ−ゼ遺伝子のコピー数を増
加させ、従ってこの酵素の細胞内濃度を増加させるため
のベクターを構築することができる。本発明のアシルト
ランスフェラーゼ暗号配列はアスペルギラス宿主細胞か
ら単離されたので、このアシルトランスフェラーゼ暗号
配列は、アスペルギラス宿主細胞においてアシルトラン
スフェラーゼ活性を高レベルで発現するように設計した
発現ベクターで使用するのに特に適している。さらに、
多くのアスペルギラス遺伝子をペニシリウム中で発現さ
せるのは容易であるので、アスペルギラスのアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の高レベルの発現はペニシリウム
においても可能であろう。 また、本発明のアスペルギラス・ニデユランスのアシル
トランスフェラーゼ暗号配列をペニシリウムの菌株なら
びにセファロスポリウムの菌株、あるいは他の任意の宿
主細胞由来の転写および翻訳活性化配列の支配下に置い
て、これらの生物中で用いるための組換えアシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を構築することもできる。 アシルトランスフ、エラーゼ遺伝子の好ましい用途は、
エピメラーゼ（ラセマーゼ）およびエクスパンダーゼ酵
素をコードしている遺伝子を追加すると共にアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を破壊または移動させることによ
って、アスペルギラスおよびペニシリウム中で有用なセ
ファロスポリン類を生成させることである。アスペルギ
ラスにおいて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーが挿
入されたクローン化遺伝子との単一または二重乗換えに
よって、アスペルギラスゲノムのア／ルトランスフェラ
ーゼ遺伝子を破壊する。次いで、この細り包を、エクス
パンダーゼ［プラスミドｐＯＷ３８０（ＮＲＲＬ Ｂ
−１８２６４）から単離される〜３゜Ｏｋｂｔ７１Ｂ
ａＩＩＩＨｌ制限フラグメントとして入手できる］およ
びエピメラーゼ［プラスミドｐＯＷ３９０（ＮＲＲＬ
Ｂ−１８４３１，）から単離される〜３６ｋｂのＫ
ｐｎ ｌ制限フラグメントとして入手できる〕遺伝子を
含有するベクター（群）で形質転換する。これら遺伝子
に関する詳細な開示については、米国特許出願Ｎ ｏ、
０７／１９２．２７３（１９８８年５月９日出願）お
よび０７／２８８．７６０（１９８８年１２月２２日出
願）を参照。実施例はこの方法を説明している。 同様の方法が、ペニシリウムにおいて大量のセファロス
ポリン類を生成させるのに有用である。 ペニシリウムは、それが極めて大量のβ−ラクタム核を
産生ずるように修飾されており、それによってセファロ
スポリン類への変換のための大量の基質を与えるので、
使用するに特に好ましい生物である。ペニシリウム・ク
リソゲナムのア／ルトランスフェラーゼ遺伝子は、本発
明のアスペルギラスＤＮへ配列をハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いて単離することかできる。この遺
伝子は、八ＴＣＣ］、０２３８［アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレク／ヨン（八ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕ１Ｌｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、ＭＤ ２０８５２）から入手可能］なとの
、だれでも人手できるペニシリウム・クリソゲナムの株
から単離することができる。 ア／ルトランスフェラーゼ遺（云子の不活性化ハ遺伝子
の破壊または遺伝子の移動によって行うことができるが
、この２つの方法はア／ルトラ／スフェラーセ遺伝子の
コピーを１つだけ含有している宿主生物において最ち効
率的である。アシルトランスフェラーゼ遺伝子のコピー
を複数含有している生物については、アノルトランスフ
ェラーセｍＲＮＡにｔ［］？ｉｆｉ性のアンチセンスＲ
Ｎ Ａの発現かアシルトランスフェラーゼ活性を実質的
に減少させるであろう。 本発明は、ペニシリンＧ産生菌をセファロスボッ／産生
菌に変換する方法であって、 （＋）アシルトランスフェラーゼ遺伝子から導いたＤＮ
Ａ配列を含有する組換えＤＮΔヘクターでペニシリンＧ
産生菌細胞を形質転換し；＜ ２ ＞該ｔａ 細胞にお
けるアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を削除し、
そして （３）行程（２）の菌細胞を、エクスパンダーセおよび
エピメラーゼ酵素活性の発現をコードしている遺伝子を
含有する１またはそれ以上のベクターでＩＦニ”ｆｆｉ
中云杼Ｓす る ことを特徴とする方法を提供するものである。 セファロスポリン類は、得られた菌株をセファロスポリ
ンの産生に適した条件下で培養することによって得るこ
とができる。米国特許Ｎ ｏ、 ３．８４７゜７４２お
よび４．７６２．７８６、ならびに米国特許出願Ｎ。 Ｏ６／８０１．５２３（この出願は既に認可され、特許
料が支払われている）を参照。そのような条件は当業者
には周知である。 本発明は、ペニシリンＧ産生菌をセファロスポリン産生
菌に変換する別の方法であって、ベニ７リンＧ産生菌細
胞を、酵素エクスパンダーゼおよびエピメラーゼをコー
ドしている遺伝子、ならびに転写されてアシルトランス
フェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡに相補性であるＲＮＡ分子
を生成させうるＤ Ｎ Ａ配列を含有する１またはそれ
以上の組換えＤＮＡベクターで形質転換することを特徴
とする方法を提供するものである。 セファロスポリン類は、得られた菌株を、転写によって
ア／ルトランスフエラーゼのアンチセンスＲＮＡが産生
される条件下、および上記のようなセファロスポリンの
産生に適した条件下で培養することによって得ることが
できる。そのような条件は当業者には周知である。 また、本発明を利用して、化学的に製造することが難し
い化合物であるペニシリンＮを大量に製造することもて
きる。これは、始めにベニンリンＧ産生菌のアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の発現を組換えまたはアンチセン
スＲＮ Ａのいずれかによって削除し、次にこのような
菌にエピメラーゼ遺伝子を導入することによって行われ
る。即ち、本発明は、ペニシリンＧ産生菌をベニ／’）
７Ｎ産生菌に変換する２種類の方法を提供するものであ
って、その第１の方法は、ベニ７リンＧ産生菌細胞を、
酵素エピメラーゼをコードしている遺伝子、ならびに転
写されてアシルトランスフェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡに
ｔ目補性であるＲＮＡ分子を生成させうるＤＮＡ配列を
含有するｌまたはそれ以上の組換えＤＮＡベクターで形
質転換することを特徴とする。 ぺ二ノリンＮは、得られた菌細胞を、そのようなアシル
トランスフェラーゼ相補性のＲＮ Ａ分子が転写によっ
て産生される条件下、および上記のような抗生物質の産
生に適した条件下で培養することによって得ることがで
きる。そのような方法は当業者には周知である。 ペニシリン（４生菌をペニンリンＮ産生菌に変換する第
２の方法は、 （１）アンルトランスフェラーゼ遺伝子カラ導イたｔｌ
ＪＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクターでペニシリン
Ｇ産生菌細胞を形質転換し く２）該菌細胞におけるアシルトランスフェラーゼ遺伝
子の発現を削除し：そして （３）丁（呈（２）の菌細胞を、エピメラーゼ酵素活性
をコードしている遺伝子をａＮするベクターで形質転換
する： ことを特徴とする。 ペニシリンＮは、得られた菌細胞を上記のような抗生物
質の産生に適した条件下で培養することによってｉする
ことができる。そのような条件は当朶箭には周知である
。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものてはない。 実池例１ アスペルギラス・アシルトランスフェラーゼ
遺伝子の供給源 八 大腸菌Ｋ１２ＪＭＩ０９／ｐＯＧ０．４の培養大腸
菌に１２Ｊ〜１１０９／ｐＯＧｏｌＩの凍結乾燥品は、
ノーザノ・リーンヨナル・リサーチ・ラボラトリーズＩ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ１．ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎ ＲＲＬ ）、 Ｒ
ｅｏｒｉａ、 ＩＬ ６１６０４〕から取得番号ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１８１７１（寄託日：１９８７年２月６０）
のらとで入手でき、以下に記載の方法における１１培養
物」として直ちに使用することができる。 １００μｇ／ ｙｒＱのアンビンリンを含有するＴＹブ
ロス（ＩＱ当たりトリプトン８？、ＮａＣ１！５ｇ、酵
Ｉユ抽出物５ｇ）１りに大腸菌Ｋ１２ＪＭＩ０９／ｐＯ
Ｇ０．１の培養物を接種し、通気しなから３７°Ｃて−
ｆν（１５〜１８時間）インキュベートした。得られた
培養物をプラスミドｐｏｃｏ・１（第３［初）の供給、
原として（重用した。 Ｉ３ プラスミドｐＯＧＯ４の申離 実施例ＩＡて調・シソした培養物を、５ｏｒｖａｌｌ
Ｇ５ＡＯ−夕−（Ｄｕｐｏｎｔ、 Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、 Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ ０６４７０）中
、５２００ｒｐｍ、 ４°Ｃで１０分間遠心して細胞を
ベレット化した。得られる上清は捨てた。この細胞ベレ
ットを、２５％スクロースおよび５０ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の溶液２８峠に再懸濁した。５
０％グリセロールおよび０．２５Ｍトリス−ＨＣｆｌ［
トリス（ヒドロキンメチル）アミノメタンヒドロクロリ
ド、ｐＨ８，Ｏ］中の２０１１？／１１１２リソチーム
溶液（ｐＨ８，０）約１１１１ＣならびにＱ、５ＭＥＤ
ＴＡｖ］１．５＃ｌ！を、コノ細胞！！４濁液に加え、
混合した。得られた混合物を氷上で１５分間インキュベ
ートした。このリソチーム処理した細胞に溶菌溶液［１
０％トリトンＸ−１００（３肩ｆり：Ｏ２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ、 ｐｔ−１＝８．０（７５ＲＱ’） ：および水（
７屏のを混合して調製１３次Ｑを穏やかに撹拌しながら
加えた。得られた溶液を水上でさらに１５分間インキュ
ベートした。 Ｓ ｏｒｖａｌｌ Ｓ Ｓ ３４０−ター（Ｄｕｐｏｎ
Ｌ、 ｌｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｎｅｖｔｏｖｎ
、ＣＴ ０６４７０）中、４°Ｃ１１７０００ｒｐｍで
約４５分間遠心することにより、溶液から細胞の残骸を
除いた。 上ｉＲ〜３０ｘＱにＣ５ＣＱ約２８６９および５ ｍｔ
ｉ／ ｍ（１の臭化エチジウム溶液〜ＩＲＱを加えた。 次いで水で容量を４０ｘＣに調節し、この溶液を超遠心
管中にデカンチー７ヨンした。この管を密封し、溶液を
Ｔｉ７ｏｃ＋−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ、 ７３６０ Ｎ
、 Ｌｉｎｃｏｌｎ Ａｖｅｎｕｅ、 Ｌｉｎｃｏｌｎ
ｗｏｏｄ、 ＩＬ ６０６４６）中、４９５０ Ｏｒｐ
ｍて〜１８時間遠心した。紫外光で見えるようにし、得
られたプラスミドのバンドを単離し、臭化エチジウムを
除くためＣ５ＣＱ飽和したイソプロパノールで抽出し、
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣ（。 ｐＨ７，５、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）〜２０容量で３
回透析した。透析物を集め、次いでエタノール２容量と
３Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．０５容量を加えた。このエ
タノール混合物を一２０°Ｃに冷却し、５ｓ３４０−タ
ー中、−１０’ｃ、Ｉ ０００Ｏｒｐｍで３０分間遠心
することによりプラスミドＤＮＡをベレット化した。得
られたベレットをＴＥ緩衝液〜１ＭＱに再懸濁し、次い
で等容量のフェノール クロロホルム混合液（１：ｌ、
容量／容量）で抽出した。３Ｍ酢酸ナトリウム０１容量
およびエタノール２容量を加え、続いて、−２０℃で〜
３Ｃ１ｔｌンキュヘーションＬ、５Ｓ３４０一ター中１
５００Ｑｒｐｍで２０分間遠心することにより、水層中
のＤ Ｎ Ａを回収した。得られたＤＮ八へレ、トをま
ず７０％エタノールで、次１こ１００％エタノールで洗
浄し、乾燥した。 この方法で得られたプラスミドｐＯＧＯ４ＤＮＡ〜ｌ
５！ｇをＯ，］ＸＴＥ緩衝液１．５ｆｆｃ中に懸Ｃれ
１−５−２０℃で（呆存した。プラスミドｐｏ Ｇ ０
４の制限部位および機能地図を添付の第３図に示す。 大−旋回ｔ−中間体プラスミドｐＲＨ５）ｆｇ築フレオ
マインンはＣａｙｌａ、Ａｖｅｎｕｅ Ｄｅ Ｌａｒｒ
ｉｅｕ、 ３１０９４ Ｔ Ｏ［ｌｌ０ＬＩＳ１３．
Ｃｅｄｅｘ、 Ｆ ｒａｎｃｅよりｌＧ＋？入した。 アスペルギラス・ニデユランスｔ ｒｐＣ遺１’ｉＥ＝
子（Ｄ ３！、Ｊ 節Ｄ Ｎ Ａ配列に並んてストレ
プトアロティクスヒンダスタヌスのフレオマイ／ン耐性
遺伝子を含むプラスミドｐＵＴ７ １ ５ ｔｙｃａｙ
ｌａより入手した。 ｐＵＴ７］５の制限地図および機能地図を添付の第４図
に示す。 Ｂ ベニツリウム・クリソゲナムｌ ＰＮＳプロモータ
ーの供給源 ｌＰＮｓｊｆｌ（ｉ子のプロモーターは、プラスミドｐ
Ｌｃ２中、ベニツリウム・クリソゲナムＩＰ＼Ｓ遺伝子
のすく上流はぼ０．９ｋｂ以内に位置し、１；ｔｌ ｌ
；ｌｉ部位ＥｃｏＲ１およびＮｃｏｌに囲まれている［
Ｃ ａｒｒ等（Ｇｅｎｅ ４８ ： ２５７−２６６（
１９８６））のｐｘ Ｌ ２″．。 プラスミドｐＬｃ２は、アメリカン・タイプ・リルチャ
ー・コレク／：ｌ ７ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ｉｌ
Ｄ ２０８５２）から取１５；番号ΔＴＣＣ ５３３
３４（寄託口 １９８５年１１７１２０日）のもとて人
手でき、実施例１と実質的に同様の方法て１１ 離する
ことかてきる。プラスミドｐＬｃ２の制限地図および機
能地図を添付の第５図に示す。ｌ ＰＮＳプロモーター
を念む０．９ｋｂ ＥｃｏＲ ｌ−Ｎｃｏｌ制限フラグ
メントを以下に紀１１・λのごとくプラスミドｐＬＣ２
から単離した。 以下のようにＥｃｏＲＩおよびＮｃｏｌを用いてプラス
ミドｐＬＣ２を完全に消化した。上記のように調製した
プラスミドｐＬＣ２ＤＮＡ５μＱ（〜５μｇ）を、Ｈ＝
、０３８μＣ１１０ＸＥｃｏＲ１およびＮｃｏ＋制限緩
衝液［：５００ｍＭｈリスーＨＣｆ！（ｐＨ８，０）、
ｌ ＯＯｍＭ ＭｇＣ（１，、および１ＭＮａｃＩ２］
５μＱ、ならびに制限酵素ＥｃｏＲ１およびＮｃｏ＋各
々１μＱ（′８単位； Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、 、
Ｐ、 Ｏ，ＢＯＸ ５７７、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ、 ＭＤ ２０７６０）と混合する。反応混合物を３
７℃で２時間インキユヘートした。次いで消化生成物を
１％アガロースゲル上で電気泳動して、所望の〜０．９
ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｎｃｏ＋制限フラグメントを他の消化
生成物と明確に分離した。ゲルを臭化エチジウムの希釈
溶液（０，５μｇ＃ｉり中で染色し、染色されたゲルを
長波長ＵＶ光に当てることにより、電気泳動されたＤＮ
Ａが見えるようになった。このフラグメントの位置を確
認した後、ゲル中〜０．９ｋｂフラグメントの前に小さ
な隙間を作り、この隙間に７ユライヒヤー （Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ）および’／ｘエル（Ｓｃｈｕｅｌ １）
（Ｋｅｅｎｅ、 Ｎｌｌ ０３４３１）のＤＥＡＥｖ１
枚を入れた。さらに電気泳動するとＤ Ｎ ＡはＤＥＡ
［Ｅ膜に非共有結合した。所望の７ラグメントがＤＥＡ
Ｅ膜に結合した後、膜をはずして低塩緩衝液（＋００ｍ
Ｍ ＮａＣＱ： Ｏ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ；および２０
ｍＭトリス−ＨＣρ、ｐＨ８）で洗浄した。次にこの膜
を小管に入れ、高塩緩衝液（１ＭＮａｃｆ！；Ｏ１ｍＭ
Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ：および２０ｍＭｈリスーＨＣＣ
１ｐＨ８）中に浸漬し、次いで６５°Ｃで１０分間イン
キュベートしてＤ Ｅ Ａ Ｅ紙からＤ Ｎ Ａをはず
した。 この６５℃のインキュベーション後、インキュベーショ
ン緩衝液を集め、膜を高堵緩衝液で洗浄した。洗浄溶液
は、所望のＤＮＡフラグメントを集める前に、インキュ
ベーション鏝衝液と共にプールした。 高塩ＤＮＡ溶液の容量をＮａＣＱ濃度か０．２５Ｍとな
るように調節し、次いでこの溶液に冷無水エタ／−ル３
容量を加えた。得られた溶液をｌ見合し、水上にｌＯ〜
２０分間置いた装次いてこの溶液を５Ｓ３４ＣＩ−ター
中、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。再度沈澱化
して残留する塩を除去した後、このＤＮＡベレットを７
０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥ緩衝液２０μρ
中に再懸濁した。これが所望の制限フラグメントを構成
していた。 ＣプラスミドｐＫＣ７８７の供給源 プラスミドｐＫＣ７８７は、大腸菌における形質転換体
の選択のためのアブラマイシン耐性遺伝子および最終的
な構築のための大腸菌のＤ Ｎ Ａ ＩＱ製起点を提供
した。プラスミドｐＫＣ７８７を持つ大腸菌株はＮＲＲ
Ｌより取得番号ＮＲＲ１，，Ｂ１８５１６（寄託日用９
８９年６月３０日）のちとて入手でき、このプラスミド
は実施例１の教示と実質的に同様にして単離することか
できる。プラスミドｐＫＣ７８７の制限地図および機能
地図を添付の第６図に示す。 Ｄ プラスミドｐｒ＜＋］５の構築 制限酵素Ｎｃｏ）の代わりにＢａｍ１（Ｉを（史用する
池は実施例２Ｂの教示と実質的に同様の方法により、プ
ラスミドｐＫＣ７８７およそ５μ９を制限酵素ＥｃｏＲ
１およびＢａｍＨｌて完全に切断した。ＥｃｏＲｌの代
わりに制限酵素ＢｇＱＩＴを使用する曲は実施例２Ｂの
教示と実質的に同様の方法により、プラスミドｐＵＴ７
１５ およそ５μ９を制限酵素ＮｃｏｌおよびＢｇｆ！
ＩＩで完全に切断した。これら反応に関与した制限酵素
を、フェノールおよびクロ四十ルムによる抽出、それに
続くエタノール化ＩＱによって不活性化した。Ｅ ｃｏ
Ｒｌ ／ Ｂ ａｍｔｌ ｌ切１ｔｊｉのｐＫＣ７８７
ＤＮＡおよそ０．２ ｕｑ、ＮＣ０Ｉ／１３ｇｏ、ｌｌ
切断のｐＵＴ７１５１）ＮＡ〜０．２ｔ１ｇ、およびプ
ラスミドｐＬＣ２由来のベニ／リウト・りｊノゲナムｔ
ＰＮＳプロモーターをａむ０．９ｋｂのＥｃｏＲｌか
らＮｃｏｌに至るフラグメント（この７ラグメ／トの積
装は上記Ｂ項に記４戊した）〜０２ ノｉ ｇヲ混Ｑ
シ、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ ’Ｊ ｉｆ−ゼ（１）ｒ７在
下で連結（ライゲート）シた。この連結混合物は、（〕
＼△フラグメント、１０Ｘリガーセ緩街液Ｅ０５Ｘ１ト
リス−ＨＣ（！（ｐＨ７，５）お、上びｌ ＯＯａＭ
’：ｖｆＣｓ、３＋ｏμＣ，０，１蒔１アデノノン三リ
ノ酸（ＡＴＰ） １． ＯｕＱ、 Ｏ，］ Ｍ ＤＴＴ
Ｉ ＯｕＱ、Ｔ４Ｄ凡ΔリガーゼｌμρＥ１単（ｉ、
ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍ ａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ（Ｂ Ｍ Ｂ ）、 ７９４１ Ｃａｓｔｌｅ
ｗａｙ Ｄｒｉｖｅ、 Ｐ。 ０、 ＢＯＸ ５０８１６．１ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
、 ＩＮ ４６２５０］および全量を１００μＱとする
に充分な水を含む。この混合物を１４°Ｃで一皮インキ
ニベートした。この連結混合物を以下のように大腸菌Ｋ
１２ＪＭ１０９に導入し、形質転換した。コンピテント
な大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９［［エピキュリアン・コーラ
イＪ（Ｅｐｉｃｕｒｅａｎ Ｃｏ１１”）コをストレイ
トジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、３３７０ Ｔａｎ５
ｙ ５ｔｒｅｅＬ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１
２１）より購入し、プラスミドｐＲＨ５を含む連結反応
混合物で形質転換した。連結したＤＮＡをコンピテント
なＪＭ１０９細胞１００μＱと混合し、水上で１時間イ
ンキュベートし、次いで４２°Ｃで１分間インキュベー
トし、次に新鮮なＴＹブロス２ＲＱで希釈し、３７８Ｃ
で１時間インキュベートした。等分した形質転換混合物
を、アブラマインン１００ｔｔ９ｈＱを含宵するＴＹ−
寒天プレートに蒔いた。 アブラマイ／ン耐性形質転換体をアンピンリン感受性に
ついてスクリーニングした。アブラマイノン耐性アンピ
ンリン感受性形質転換体を、ｐＫＣ７８７のほぼ２．８
ｋｂ ＥｃｏＲｌ −ＢａｍＨＩ制限フラグメント、ス
トレプトアロティクス・ヒンダスタヌスのフレオマイシ
ンＷ 性遺伝子ヲａ ｔ； ｐ ＵＴ７１５由来のほぼ
１．３ｋｂ Ｎｃｏｌ−ＢｇＱＵフラグメントのすぐ上
流にあるＩ ＰＮＳプロモーターを含む０．９ｋｂ Ｅ
ｃｏＲＩ−Ｎｃｏｆ制限フラグメント、およびアスペル
ギラス・ニデユランス由来のｔｒｐｃ ３ 調節領域、
を含むプラスミドの存在についてスクリーニングした。 記載したプラスミドを保持する形質転換体を単離し、こ
のプラスミドをｐＲＨ５と命名した。プラスミドｐＲＨ
５の制限部位および機能地図を添付の第７図に示す。 実施例３ プラスミドｐＲＨ５Ｃ実施例２て構築）は、実施（に自
と同様の方法により大腸菌Ｋ Ｉ ２ Ｊ Ｍ Ｉ Ｑ
９／ｐＲＨ５から単離することができる。プラスミド
ｐＲＨ５およそ５μ９を以下のようにして制限酵素Ｐｖ
ｕｌおよびＨｉｎｄｌＩＩで完全に切断する。ブラスミ
ドｐＲＨ５５μｍ２（５μｇ）をＩＯＸ Ｐｖｕｌ
緩）ｉ、１支［５００ｍＭ）リス−ＨＣ１！（ｐＨ８，
０）、１０Ｑ ｍ’ｖＩ ＶＩｇＣ（ｈ、５００ｍＭ
ＮａＣ（！、および５００ｍＭ ＫＣＣＦ５μＣ，Ｐｖ
ｕｌ（６単位、ＢＲＬ）１μＱおよびｔ１２０３９μＱ
と混合する。反応物を３７°Ｃて１時間インキュベート
後エタノール沈、殿させる。このペレントをＨ，０３９
μｅ中にｍ％％濁する。これに、ｌ Ｑ Ｘ Ｈ１ｎ
ｄｌｌＨ＄衝液ｆ５００ｍＭトリス−＋（ｃ９（ｐｌ−
１８、０）、ｌ ００ｍＭ ＭｇＣρ７、および５００
ｍＭ ＮａＣ＋！３５ｕＱおよびｌ＋１ｎｄｌＪＩ（８
ｆ１１（妖ＢＲＬ）ｌμＱを加える。実権例２Ｂと実質
的に同様の方法により、所望の〜４．８ｋｂＰｖｕｌ／
′ｌ ｌ ｉ ｎｄ Ｉｌｌ ｉｌ’ｌ限フラグメント
を分離しアガロースケル電気泳動によって単離する。次
いて精シ；ツされたフラグメントをＴＥ緩衝液約１００
μＱに溶解し、１糸の（重用のためにＯ′Ｃで（呆ａす
る。 Ｂ プラスミドｐｏ Ｇ Ｏ４からの〜２． Ｉ ｋｂ
Ｐｖｕ／５ｐｈｌフラグメントの単離 プラスミドｐＯＧ○４は、実施例１と実質的に同様の方
法によって、大腸菌に１２ＪＭ１０９／ｐＯＧＯ４から
単離することができる。プラスミドｐＯＧＯ４およそ５
μ９を以下のごと（制限酵素１）ｖｕｌおよびＳ ｐｈ
ｌをもって完全に切断する。プラスミドｐＯＧＯ４５
μＱ（〜５μ９）を、ｌ０ＸＳｐｈｌ緩衝１ｆｆｌ［５
００ＴＩＭ ＋−リス−ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）、６０
ｍＭ ＭｇＣ’：ｈ、 ５００ｍＭ ＫＣＱ、および５
００ ｍＭ Ｎ ａ ＣＱコ５ｕＱ、Ｈ，０３９μＣ
および５ｐｈ１（６単位、Ｂ Ｒｌ−月μＱと混合する
。反応物を３７°Ｃで１時間インキュベートし、次いで
エタノール化、すさせる。このベレットをＨ，０３９μ
ジにｍ 懸！ＹＡする。ここにｌ Ｑ Ｘ Ｐ ｖｕ
ｌ緩衝１夜［５００ｍＭ） リ ス −ＨＣＱ（ｐ
ｌ（８）、 １． ＯＯｍＭ Ｍ ｇＣＱ２．５
００ ｍＭ Ｎ ａ（：、 Ｑ、および５００ｍＭ Ｋ
Ｃ＆ｉ５μ＋！およびＰ ｖｕ ｌ （６Ｑ’位、ＢＲ
Ｌ）１μＣをり■える。反応物を３７°Ｃで１時間イン
キュベートする。アスベルキラス・ニデユランスのアン
ルトランスフ℃ラーセ遺伝子および調節要素を含む所望
の〜２１ｋｂ Ｐｖｕｌ／５ｐｈｌ制限フラグメントを
、実屯例２Ｂと実質的に同様の方法により、アガロース
ゲル電気泳動によって分離し、単離する。次いで、精製
されたフラグメントをＴＥｒ８ｉ液約１００μＱ中に再
懸濁し、後に使用するために０°Ｃで保存する。 Ｃ，５ｐｈｌ／ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡリンカ−の構築所
望のリンカ−は以下の配列を有する：５“ ＣＧ
ＧＡＴＣＣＡ ３３″ ＧＴＡＣＧＣＣＴＡＧＧ
ＴＴＣＣ八 ５′これはイタクラ等［１ｔａｋｕｒａ
ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６（１
９７７）］およびクフレア［Ｃｒｅａ ｅｔ ａｌ、
＋ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ ７５ ： ５７６５（１９７ｇ）コの教示するとこ
ろと実質的に同様の方法により、改良ホスホト」エステ
ル法によって常套的に合成することができる。 実施例４ プラスミドＩ）ＯＷ１０６にの最終的組な構
築 実施例３Ｃで作られた合成り Ｎ Ａりンカー約２０ピ
コモルを、プラスミドｐＯＧＯ４から単離した〜２．ｌ
ｋｂ Ｐｖｕｌ／５ｐｈｌフラグメント〜Ｏ５μ９に連
結する。この連結は実質上実施例２Ｄの教示するところ
と同様に行なう。次いで得られたフラグメントを実施例
３Ａと実質的に同様にしてＨｉｎｄｌＩＩにより消化し
、得られたＰ ｖｕ ｒ ／ Ｈ１ｎｄＩｎフラグメン
トを常法により分離し、ゲル濾過によって単離する。最
終ｌ霞度０．２Ｍとなるよう３Ｍ酢酸ナトリウムを添加
した後、ＤＮＡを１００％エタノール３容量で沈澱させ
る。所望の〜２．１ｋｂＰ ｖｕ ｌ ／ Ｈ１ｎｄＩ
ＩＩフラグメントをＴＥ緩衝を夜１００μρ中に再懸濁
し、後の使用のためにＯ′Ｃで保存する。 プラスミドｐＯＷ１０６１の最終的な構築は、プラスミ
ドｐＲＨ５から単離した〜４．８ｋｂ Ｐｖｕｌ ／
Ｈ１ｎｄｌ１１フラグメントを前段に記載した〜２１
ｋｂ ＰＶＩＩＩ ／ Ｈｉｎｄ■フラグメントに連結
することによって行う。〜４．８ｋｂ Ｐｖｕｌ／１（
ｉｎｄＩＩＩフラグメント約１μ９および〜２．ｌｋｂ
Ｐｖｕｌ／Ｈｉｎｄ■フラグメント〜０，５μ９を連
結し、得られるプラスミドを大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９の
形質転換に使用する。この連結および形質転換は、実質
的に実施例２Ｄと同様にして行なう。アガロースゲル電
気泳動および他の試験により示されるように、得られた
形質転換体の幾分かは所望の〜６．８ｋｂｐＯＷ］０６
１プラスミドのみを含んでいる（第８図に示す）。本明
細書中で大腸菌に１２Ｊ〜１１０９／ｐＯＷ］ ０６１
と称するこの形質転換体を選択し、アブラマインン１０
０μｇ／ｙ（ｌを含何するＴＹ寒天（ＴＹブロス＋１５
１／ρ寒天）上に蒔き、次いて通常の微生物学的手法を
用いて培養する。得られる形質転換体を実施例１に記載
したようにプラスミドｐＯＷＩ０６１の単離用に使用す
る。 ＸＦｆｆｌｆ１５ 遺伝子追加による、アスペルギラス
・ニデユランスにおけるペニシリンＧ生産およびア／ル
トランスフェラーゼ酵素レベルの上昇Ａ、プラスミドｐ
ＯＷ１０６１によるアスペルギラスの形質転換 プラスミドｐＯＷＩ０６１は、アスペルギラス宿主中て
使用するために構築したアンル／ラノスフェラーセ発現
ベクターである。アスペルギラス・ニデユランスにおけ
るア／ルトランスフエラーゼ活性の細胞内濃度は、プラ
スミドｐ○〜Ｖ１０６１によって提供されるような追加
のアシルトランスフェラーゼ遺伝子の存在により増加さ
せることができる。さらに、複数のア／ルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を含むアスペルギラス形質転換体は、ｊ、
を質１４３度を限定しない場合、ベニ／す７Ｇの収量増
加を示し得る。このような方法は、ペニシリンＧを生産
し、そしてイソペニシリンＮを蓄積するアスペルギラス
宿主菌株を選択することにより、最も良く達成されるで
あろう。 アスペルギラスプロトブラストの調製、およびプラスミ
ドｐＯＷ１０６］を用いたＡＴ ＣＣ２８９０１のごと
きアスペルギラス・ニデユランス１゛へ株の形質転換は
、イニルｊ・ン等［Ｙｅｌｔｏｎ ｅｊ ａＰｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ｌ！Ｉ
： １４７０（１９８４）コの方法と実質的に同様にし
て、以下に記載のごとく達成することができる。 最少ｊ１１地４００１および４ ｍＭのフィルター滅菌
したＩ７−トリプトファンを入れたンリコン処理のＩＱ
フラスコに分生子８１０８を接１’ｆｉＬ、室ｌ、情で
１８時間振盪する。最少培地ＣＩＱ当り）は以下の通り
である（ｐＨは６５とする） 貯蔵塩溶１ｆｆｌ ２００１ｉ
Ｑ２０％グルフース溶液 ５０スＱ２６％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ，０４ＲＱ 貯蔵塩溶液は以下の通りである（ＩＱ当り）：ＮａＮ０
ｚ ６０９ＫＣ（１５，２
９ ＫＨ，ＰＯ４１５，２８ 微量元素溶液 １０ＲＱ微量元素
溶液は以下の通りである（１００ｘＱ当り）：Ｆｅ５０
．・７Ｈ，００，１９ ＺｎＳＯ，・７Ｈ，ＯＯ，８Ｂ９ ＣｕＳＯ４・５Ｈ，ＯＯ，０４９ Ｍｎ５Ｏ，・４Ｈ２ＯＯ，０１５ｇ ＮａｙＢ、Ｃ）７・ｌ ０ＨｔＯＯ，０１ｇ（ＮＨ４）
ｖＭｏ７０＋・４ ＨｔＯＯ，００５ｇチーズクロスで
濾過することにより菌糸体を収穫し、０．６Ｍ Ｍｇ５
Ｏ，で洗浄し、紙タオルでしぼり、吸い取らせて過剰の
液体を除いた。この細胞を、激しく撹拌することにより
フィルター滅菌した浸透性培地（１、２Ｍ ＭｇＳ Ｏ
４／ １０ ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５，８； ５
＊Ｑ／９菌糸体）中に懸濁し、２５０ｘｉ！フラスコに
移し、水上に置く。フィルター滅菌したβ−グルクロニ
ダーゼ（０，２ｚ（／９菌糸体； Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ、、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ １４５０８，５
ｔＬｏｕｉｓ、Ｍｏ ６３１７８）および／ボザイム２
３４（浸透培地中２０Ｒ９／ｘＱ ； １ ｍＱ／９菌
糸体； Ｎｏｖｏ １ｎｄｕｓｔｒｉＡ／Ｂ Ｂａｇｓ
ｖａｅｒｄ、 Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、この細胞を水
上で５分間インキュベートする。フィルター滅菌したつ
／血清アルブミン溶液（浸透培地中１２３！９／ｘＱ：
０．５＊Ｑ／９菌糸体； Ｓｉｇｍａ）を加え、この細
胞懸濁液を８ Ｑ ｒｐｍ、 ３０′Ｃで９０分間振盪
する。 このせ濁液を遠心管に移し、ＳＴ緩衝液［ｏ、６Ｍソル
ビトール（Ｓｉｇｍａ）／ ｌ ＯＯｍＭ ｌ−リス
−ＨＣ（！（ｐＨ７，０）］１０ｚＱを積層し、スウィ
ンギング・バケット・ローター中、４０００Ｘ９．４°
Ｃで１５分間遠心する。緩衝液界面のプロトプラストを
曲がったバストウールピペットを用いて採取し、水上に
置く。残存するＳＴ緩衝液を除き、菌糸体ベレットを再
懸濁し、新鮮なＳＴ緩衝液を前述のように加え、プロト
プラストを遠心沈降により再開バンド化する。このプロ
トプラストをプールし、ＳＴＣ緩衝液［１２Ｍソルビト
ール、ｌ０ｍＭト１スーＨＣＱ（ｐＨ７，５）、１０
ｍＭ ＣａＣＱｔ］２容量で希釈し、８０００Ｘｙ、４
°Ｃで５分間遠心することによりペレツト化する。次い
でこれを５ＴＣ（ｐ術液１０１Ｃと共に遠心することに
より２回洗浄し、ＳＴＣ緩衝液の１／１０００？刀朋培
養容量中にｉＴＴ懸濁する。 ｓ ′ｒ ｃ 緩衝液２５μｅ中に溶解したプラスミド
ｐＯＷ＋０６１ＤＮＡを、使い捨てプラス千ｌり遠心管
中のプロトプラスト１００μＱと’ｔＲＤし、室温で２
５分間インキユヘートする。次いでＸＱｍＭトリス−Ｈ
（ｊ！（ｐＨ７，５）およびｌ Ｑ ｍＭ Ｃａ、ＣＱ
ｒ中の６０％ポリエチレングリコール４０００（０２ｍ
Ｑ）を如え、管を手で枦、やかに揺り動かす。続、１で
ポリエチレングリコール溶液の２回目（０２ｊＩＱ）お
よび３回目（０，８５ｚのの添１１目を行ない、各７、
・のｒＫ １１０の後に隠やかに撹拌する。このプロト
プラストを室温で２０分間インキユヘートシ、８０００
ｘ９．４°Ｃで５分間ベレット化する。上清をデカンテ
ーションし、管に付着している溶液の小滴を綿棒で除去
する。このプロトプラストを０５％酵母抽出液２，５ス
σ、２．０％グルコース、および１．２Ｍソルビトール
中に懸濁し、回転振盪機−に、Ｉ ５０ ｒｐｍ、３７
°Ｃで２時間インキユヘートする。次いでこれを８００
０ｘｙ、４°Ｃで５分間ベレット化し、上清をデカンチ
ー７：Ｉンし、管に付着している培地の小滴を綿棒で除
去する。このプロトプラストを最後に５ＴＣ１４衝液０
． ｌ ５ｚり中に懸濁し、同緩衝液中で適当に希釈す
る。 形質転換後、プロトプラストを非選択培地（トノブチカ
ーゼ大豆寒天、ＢＢＬ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ、ＢｅｃＬｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａ
ｎｄ Ｃｏ、、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、〜（Ｄ２＋
０３０）上に蒔き、１５℃で一皮インキユベートしてフ
レオマイ／ン耐性遺伝子を発現させる。次いでフレオマ
イシンを含有する軟寒天（０４％寒天、Ｇｉｂｃｏ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ ５
３７１３） １ｘＱの！４層をこのＩＩＩに対して行な
う。フレオマイ／ンの最終的な皿の濃度は約１ ｔｌ？
ＩＲＱとすべきである。その後３０’Ｃでインキュベー
／ヨンすると４〜７０のうちに形質転換体が生成する。 Ｂ アスペルギラス形質転換体の分析およびペニシリン
Ｇの検出 続いて、安定なフレオマイシン耐性を示すアスペルギラ
ス形質転換体を選び、新鮮な非選択的トノブチカーセ大
豆寒天に移すことができる。３００Ｃで７〜１０日間生
長させた後、ドララフおよびイエ−［Ｄｏｔｚｌａｆ、
Ｊ、 Ｅ、 ａｎｄ Ｙｅｈ、 Ｗ、 −に、 、
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。 １６９ ： １６１１（１９８６）］の方法に従って細
胞抽出物を調製し、不ウス等［Ｎｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ
、、Ｊ、＾ｎｔｉｂｉｏｔ、 ３５： ５８０（１９８
２月が記載しているようにペニシリンＧ生産の検定を行
なうことかできる。 （以下、余白） 実施例６ アスペルギラス・ニデユランスのア／ルト
ランスフエラーゼ遺伝子を用いた遺伝子追加による、ペ
ニシリウム・クリソゲナムにおけるペニシリンＧ生産の
増加 プラスミドｐＯＷ１０６１（実施例４において構築）は
またペニシリウム・クリソゲナムにおけるアシルトラン
スフェラーゼ酵素レベルおよびベニノリンＧ生産を増加
させるためにも使用できる。 ペニシリウム・クリソゲナムは、へテロローガス彩質転
換実験において、アスペルギラス調節因子を利用するこ
と、そしてイントロンスプライス部位を認識することが
示されている［Ｂｅ口、 Ｒ，Ｊ、 、 ａｎｄＴｕｒ
ｎｅｒ、Ｇ、、Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、 Ｉｔ ：
６３９（１９８７）］。アスペルギラス宿主の場合と同
様に、ペニシリンＧを産生し且つイ゛ノペニンリンＮを
蓄積するペニシリウム宿主を選択するのが有利である。 クローン化したアスペルギラスのアシルトラ／スフェラ
ーセ遺伝子を含むペニシリウム形質転換体は、基質濃度
を限定しない場合、親菌株より高いレベルのペニシリン
Ｇを生産することかできた。ペニシリウム・クリソゲナ
ムの形質転換は以下に記載のごと〈実施することができ
る。 実施例７ ペニシリウムの遺伝子的形質転換Ａ、ベニン
リウム・クリ′／ゲナム菌株形質転換用のペニシリウム
菌株を、取得番号ＡＴＣＣ９４８０のもとでアメリカン
・タイプ・カルチャー−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ ｆｅａｔ ｉｏ
ｎ、 Ｒｏｃｋｖｉ Ｉ ｌｅ、 ＭＤ ２０８５２）
から入手する。 ペニシリンＧまたはペニシリンＶの生産改潜の目的のた
めの変異、選択、もしくは遺伝的育種によってＡＴＣＣ
９４８０から誘導されるあらゆる市販菌株または他のペ
ニシリウム・クリソゲナム菌株もまた本発明のベクター
およびプラスミドを何する形質転換体調Ｍの際の使用に
好適である。 Ｂ 細胞培養のための均一接種物の調製ペニシリウム・
クリソゲナム細胞を効率的に形質転換させるためには、
細胞壁を除いて安定なプロ［・ブラストを形成させるこ
とが必要である。このようなプロトプラストの調製にお
いては、均一な接種物から始めるのが有ｆりである。さ
もなげれば、培養中の細胞の生成に再現性がなくなり、
不適当または不充分な量の細胞がらＰ、クリソゲナムを
調製しようとする試みによって時間が消費されることに
なる。 凍結乾燥された、または液体窒素保存中から取り出し室
温で溶かした１アンプルの栄養細胞［貯蔵溶媒（５％乳
糖、１０％グリセロ−〕呟および０．１％）ライ−７８
０）ｌｚｌｉ中〜ｌＯ９コロニｊし成ｑｉ位コを、滅菌
生理食塩水１ 、０ ａＱにて希釈する。この懸濁成約
０．ＩｉＩ！を、およそ２ｏスラント（斜面培養）の胞
子形成培地（乳糖１５．０ｇ／ｉ７、とうもろこしあ１
夜２．５ｇ／Ｌ、ペプトン５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣＱ ４
．Ｏｇ／Ｌ、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，００，５ｇ／Ｌ、Ｋ
Ｈｔ Ｐ Ｏ−０、６ｇ／ ｌ−１Ｆｅｃρ３・６Ｎ、
０ ０．００５ｇ／Ｌ、Ｃｕ５Ｏ，・５Ｈ２００００２
８／Ｉ７、ｐＨ＝７．０に調節、寒天３０．０ｇ／Ｌ、
そして１２０ｐｓｉで２０分間オートクレーフにか；す
る）の各々に接種するのに使用する。 各スラント（１５ｃ＋ｎＸ ２．５ｃｍ）は固化培地２
５契Ｃか入っている。寒天斜面培養の表面に均一にっｔ
付した接種物を、菌糸体の融合性菌叢が存在し抱子形成
するまで２５°Ｃで生長させる（殆どの菌株で１週間）
。斜面培養１個からの成長物を滅菌水性培養培地１０ａ
＆中に懸濁し、この懸濁液を水性培養培地１０６１１ｆ
ｆに移す。この懸濁細胞を入れたフラスコを旋回振盪機
上に取り付け、２５℃、２３５ ｒｐｍ、振幅１インチ
にて１８時間インキュベートする。 水性培養培地は以下のように調製した 溶液Ａ（スクロ
ース３６ｇ／Ｌ、し−アスパラギン７．５ｇ／Ｉ１、Ｋ
Ｉ−Ｉ ｔ Ｐ Ｏ−１ｖ ｇ／ ｌ−１Ｋ、ＨＰｏ
、２１ｇ／Ｌ、Ｎａ５Ｏ−０，７５ｇ／Ｌ１ＭｇＳＯ４
・７Ｈｒ００、Ｉ８ｇ／Ｌ、ＣａＣ（１２０，０６ｇ／
ｌ−１食塩溶液１ｘＣ／Ｌ、自然のｐｔ（）ｌＯＯＲσ
を５００匁ρの振盪フラスコに分注する：このフラスコ
を市販の栓でおれい、１２ピＣで２０分間オートクレー
フにかける。次いで溶液Ｂ（グルコース１０８ｇ／Ｌ）
２Ｒ０および溶液Ｃ［スクロース２５ ｇ／ Ｌ、とう
もろこし浸漬液（４％ｗ／ｖ窒素分）＋ ２．５７！ジ
、酢酸アンモニウム５．５ｇ／Ｌ、ＣａＣ○３５ｇ／Ｌ
、に０１−（でｐＨ６，５に調節、そして１２１°Ｃで
２０分間オートクレーブ処理する］４１ｅを溶液へに加
え、水性培養培地を調製する。 Ｃベニツリウムのプロトプラストの調製２４時間培養の
細胞を吸引濾過（ファツトマン＃旨慮紙、ブフナー届斗
中）により収穫し、緩衝ｌ夜（００ＩＭトリス、Ｏ，Ｏ
ＬＭ ＭｇＳＯ４，０゜０１Ｍジチオトレイトール、１
．ＯＯＭ ＫＣＣ。 ＨＣＱにてｐＨ−７，０とする）中に懸濁する。充分な
緩衝液を加えて最終細胞濃度が緩衝液５Ｍ当り細胞塊１
９となるようにする。この細胞懸濁液を２５０屑ａ振盪
フラスコに入れ、旋回水浴振盪機に取り付け、２９〜３
０°Ｃ１］ ４０ ｒｐｍ、振幅１インチで１０分間イ
ンキュベートする。ジチオトレイトール処理した細胞を
遠心によって集め、次いて２５０ｘ０．振盪フラスコ中
の酵素溶液［］、０．７ｇ／ｌＱノボザイム２３４ （
Ｎｏｖｏ １ｎｄｕｓｔｒｉ Ａ／Ｂ Ｂａｇｓｖａｅ
ｒｄ、 Ｄｅｎｍａｒｋ）、０，０１Ｍトリス、０．
０１ＭＮ４ｇＳＯ，，０，０１Ｍジチオトレイトール、
１００Ｍ ＫＣＱ、ＨＣｌでｐＨ＝５．８とする１５０
ｘ（に再懸濁する。この細胞懸濁液を旋回水浴糸ｄ機に
取り付け、２９〜３０°Ｃ，１４０ｒｐｍ、振幅１イン
チで１５分間振盪する。酵素処理した細胞を１２４０ｘ
ｇで６分間遠心し、得られるベレットを＋’）ｊ ｆｔ
ｉ液ＣＯ，０１Ｍトリス（ヒドロキンメチル）アミノメ
タンヒドロクロリド０．ＯＩ Ｍ Ｍｇ５Ｏい １００
ＭＨＣり、ＫＣｇでｐＨ＝７．０とする］に再懸濁する
。この懸濁液をまず９５０ Ｘ９で６分間遠心する。得
られるベレットを同緩衝液に再！濁し、この懸濁液を７
００ｘｇで６分間遠心する。得られるベレットを同緩衝
液５Ｎ＋！に再１び濁する。この懸濁液は、主として大
きなプロトプラストおよび幾らかの細胞壁構造を保持す
る浸透的にこわれ易い細胞を含んでいる。上記方法によ
り除去された小さなプロトプラストに比較すると、細胞
壁を再生できるプロトプラストの割合および生存能力の
ある侵透的に安定な細胞の割合は、最終懸濁液中の大き
なプロトプラストおよび浸透的にこわれ易い？田月包１
こついてより高くなっている。このｉ′＠ｌＩ包の・び
濁液を〜２ＸＩＯ８１１ｎ胞／２Ｑの濃度まて緩げｉ液
で希釈する。 Ｄ 形質転換の方法 形質転換するプラスミドの各々について、浸透的にこわ
れ易いベニツリウム・クリソゲナムＩ［胞の懸濁液〜０
．１１σ（およそ２Ｘ１０’細瞼）に、５０ｍＭ Ｃａ
ＣＬ Ｉ ＯｕＱ、ＴＥ緩街液５〜１５μＱ中のプラ
スミドＤＮＡ２５１、および新たに溶解したポリエチレ
ングリコール４０００の溶液（Ｂａｋｅｒ ；浸透的に
安定な緩衝液中４０％重■／容量）０．９ｍＱを補う。 この溶液を撹拌し、室、晶で１０分間放置し、７００Ｘ
ｇで２分間遠心し、再び撹拌する。このプロトプラスト
を皿に蒔き、形質転換体を実旋例５に記載のようにアス
ペルギラス形質転換について分析することかできる。 害ａ＝ 例８ ベニツリウム・クリソゲナムのイソペニ
ンリンＮンンテターセプロモーターヲ有するアスペルキ
ラス・ニテユランスのア／ルトランスフェラーセ遺伝子
を用いるベニツリウム・クリソゲナムにおけるペニンリ
ンＧ生産の増大プラスミドｐＯＷＩ０６１は、ベニツリ
ウムに使用してア／ルトランスフエラーゼ酵素レベルお
よびペニシリンＧ生産を増加させることができるが、ベ
ニンｌ）ラム中でアスペルギラス・ニデユランスのア／
ルトランスフエラーゼの発現をより高レベルに行なうよ
う、さらに特異的に設計されたプラスミドを構築するの
か膏利であろう。本実施例においてｐＯＷ１０６２と記
載されるこのようなプラスミド（第９図を参照）は、ペ
ニシリウム中てアスペルギラス・ニデユランス由来のア
シルトランスフェラーゼ遺伝子の発現をより高めるため
に、ペニシリウム・クリソゲナムのイソペニシリンＮン
ンテターゼプロモーターを用いる。 −ターの単離 ペニシリウム・クリソゲナムｔ Ｐ Ｎ Ｓ 遺伝子の
すぐ上流のＤ Ｎ Ａを含む〜０．９ ｋｂ Ｈ１ｎｄ
Ｉ１１／ ＮｃＯＩフラグメントを、実施例２Ｂの教示
と実質的に同様にしてプラスミドｐＬＣ２から単離する
。 所望のリンカ−の配列は以下の通りである・５ ＣＡ
ＴＧＣＴＴＣＡＣＣＴＡＡＣＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＡＣ
３ＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＣＧＧＴＴにのリンカ−
は改良ホスホトリエステル法により、実施例３Ｃの教示
に実質的に従って合成する。 Ｃ〜０．９ｋｂ ｔ（ｉｎｄｆｆｌ／Ｋｐｎｌ ＤＮ
Ａフラグメントの作成 実施例８ ＢのＤＮＡリンカ−約２０ピコモルおよび実
施例８ΔにおいてプラスミドｐＬＣ２から単離した〜０
．９ｋｂ ｔ（ｉｎｄｎｌ／Ｎｃｏ［フラグメント〜０
５μ９を、実施例２Ｄと実質的に同様にして連結する。 次いて得られたフラグメントをＩＸＫｐｎｌｉＨｔｉ液
［２０ｍ〜１トリスーＨＣ９（ｐＨ７，４）、５ｍＭ〜
１ｇＣＬ、および５０ｍＭＫＣｌ中のＫｐｎ６単位を用
いて３７°Ｃて１時間、肖化し、得られたＩｔ １ｎｄ
ｌｌＴ／ Ｋ ｐｎ ｌフラグメントをゲル、慮過とそ
れに続くエタノール化１りによって常套的に単離する。 Ｄ プラスミドｐｏ Ｇ Ｏ４からの〜２．２ｋｂＫｐ
ｎ／ Ｈｉ ｎｄ Ｉｆｆフラグメントの単離プラスミ
ドｐＯＧ○４を、取得番号ＮＲＲＩ−Ｂ１８１７１のも
とてＮＲＲＬから入手可能な大［傷菌に１２ＪＭ１０９
／ρｏＧｏ４から実施例１の方法に従って単離する。プ
ラスミドｐＯＧＯ４およそ５μ７を上記０項のように制
限酵素Ｋｐｎｌで完全に切断し、続いて］ＸＨｉｎｄｌ
ｌｌ緩衝液［５０ｍ：ｖｌ ｌＪス−Ｈ（１！（ｐＨ８
，０）、］ ＱｍＭ ＭｇＣ１！−。 および５０ ｍＭ Ｎ ａＣ（！］中のＨｉｎｄ１１１
８単位により３７°Ｃで１時間消化し、所望の〜２．２
ｋｂＫｐｎｌ／ Ｈｉ ｎｄ ＩＩＩ制限フラグメント
を実施例２Ｂに従ってアガロースゲル電気泳動により（
１１離する。所望の〜２ 、２ ｋｂ Ｋ ｐｎ Ｉ
／ ｔ（ｉｎｄ［ＩＩフラグメントが他の消化生成物か
ら容易に分離しない場合は、Ｅｃ。 ＲＶによりさらに消化することが推奨される。次いて精
うシされた〜２．２ｋｂ Ｋｐｎｌ／）ｉｉｎｄｌｌフ
ラグメントをＴＥ緩衝液約１００μρに溶解し、後の（
重用のためにＯ′Ｃて保存する。 Ｅ プラスミドｐＲＨ５の〜５ ｋｂ Ｉｆ １ｎｄｆ
ｆｌフラグメントの作成 プラスミドｐＲＩＩ ５を実施例１に記載のように太陽
間ＫＩ２ＪＭ１０９／ｐＲＨ５（実施例２て作成）から
単離する。プラスミドＩ）ＲＨ５およそ５μ９を実施例
８Ｄのように制限酵素Ｈｉｎｄｌｌて消化し、１４られ
る〜５ｋｂｌ（ｉｎｎ旧制制限フラグメント実施例２Ｂ
のようにアガロースケル電気泳動によって１”；：’Ｌ
する。次いて精・装されたフラグメントを′Ｕｒ：緩（
憂ｉ成約１００μｅに溶解し、後の使用のために０°Ｃ
で保（ｊする。 Ｆ プラスミドｐｏＷＩ Ｏ６２の構築プラスミドｐＲ
Ｈ５からの〜５ ｋｂ Ｈ１ｎｄｌフラグメント約１μ
９、実施例８Ｃの〜０．９ ｋｂ Ｈ１ｎｄＩＩＩ ／
Ｋ ｐｎ ｌフラグメント杓０５μ９、およびプラス
ｉ ト’ ｐｏ Ｇ Ｏ４の〜２ 、２ ｋｂ Ｋ ｐ
ｎｌ／ ＩＩ ｉｎ旧■フラクメ７ ト１’７０．５
ｕ９を連結し、得られたプラスミドを用いて大腸菌Ｋ１
２ＪＭ１０９を形質転換し、１００μ９／ｚＱのアブラ
マイ／ンに対し耐性となるようにする。この連結および
形質転換は、実施例２Ｄの教示と実質的に同様にして行
なう。制限地図の作成ならひにアガロースゲル電気泳動
および池の試験により常套的に示されるように、（１ら
れた形質転換体の幾らかは、第９図に示すとおり〜８ｋ
ｂプラスミドのみを含む。本明細書中大腸菌Ｋ １．２
ＪＭ１０９／ｐＯＷ１０６１と称するこのような形質転
換体を選択し、アブラマインン１００μ９／スρを含有
するＴＹ寒寒天−蒔き、次いて通常の微生物学的方法を
用いて培養する。得られた形質転換体を実施例１に記載
のごとくプラスミドｐＯＷＩ０６２を単離するのに使用
する。 実施例９ アスペルキラス・ニデユランスにおけるア／
ルトランスフェラーセ遺伝子の遺伝子破壊 ペニシリンＧ”成ができず、代わりにイソペニシリンＮ
を蓄積するアスベルキラス・ニデユランス菌株は、ただ
ｌコピーのアンルトランスフエラーセ遺伝子しか含んで
いないことか知られるペニシリンＧ産生アスペルギラス
菌株から最も良くうν造される。所望のＡＴ欠損菌株は
、十目同な単一交差現象においてゲノム性ア／ルトラン
スフエラーセ遺伝子を非機能性ア／ルトランスフェラー
ゼ遺伝子で妨害することによって組立てられる。適当な
非機能性遺伝子は、該遺伝子の５゛および３゛両末端か
ら一部分を除くことにより組立てることができる。 メントの単離 プラスミドｐＲＨ５（実施例２で構築）を実施例１に記
載のようにして大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９／１）ＲＨ５か
ら単離する。プラスミドｐＲＨ５およそ５μ９を１ＸＥ
ｃｏＲ１緩衝液［５０ｍＭトリスート（ｃ１！（ｐＨ８
，０）、１０ ｍＭ ＭｇＣＱｔ、および０．ＩＭＮａ
Ｃｆｉ］中のＥｃｏＲｌ ８単位にて３７℃で１時間
完全に切断し、次いで得られた〜５ｋｂＥｃ。 Ｒ１フラグメントをＤＮＡ末端を平滑にするため以下の
ごとく大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）フレノウフラグメントて
処理する。ＥｃｏＲ１消化したプラスミドｐＲｌ（５５
ｕ（１（〜５ ｕ９）を、各ｄＮＴＰ ２ｍＭを含有
する溶液１μａ、ＩＯＸ緩衝液［０，５Ｍｈリスー１４
Ｃ（！（ｐＨ７，２）、０ 、 Ｉ Ｍ ＭｇＳ Ｏ４
、および１ｍ１ＶＩＤＴＴ］２．５μｆ！およびＨ，０
１６，５ｕＱと混合する。次いでフレノウフラグメント
２単位を加え、Ｕａ物を２２°Ｃで１５分間インキュベ
ートする。 次いで７０°Ｃで５分間処理することにより酵素を熱不
活性化する。得られた〜５ｋｂ毛滑末端ＤＮＡフラグメ
ントを実施例２Ｂのごとくゲル電気泳動により常套的に
単離しエタノール沈澱する。所望の〜５ｋｂ平滑末端フ
ラグメントはＴＥ緩衝液１００μＣに、容解し、後に使
用するためにＯ′Ｃで保存する。 プラスミドｐＯＧＯ４（ＮＲＲＬ Ｂ−］ ８ ］
７１）を実施例１に記載のように大腸菌Ｋ ｌ ２ Ｊ
Ｍ Ｉ Ｏ９／ｐＯＧＯ４から月１離する。ＥｃｏＲ
Ｉの代わりにＮ ｃｏ ｌを（φ用する他は実施例９１
Ａに記載のごとくしてプラスミドｐＯＧＯ４およそ５μ
９を制限酵素Ｎｃｏｌで完全に切断し、このＤＮＡ末端
を実施例９１Ａに記載のように充填する。先端を切った
ΔＴ遺伝子を含む〜０．８ｋｂ平滑末端フラグメントを
分離し、実施例２Ｂのごとくアガロースゲル電気泳動に
よって単離する。次いで精製された〜０．８ｋｂフラグ
メントをＴＥ緩１Ｔ液約１００μａに溶解し、後の使用
に備えてＯ′Ｃで保存する。 ＣプラスミドｐＯＷＩ０６３の構築 実施例９Ａにおいて組立てられた〜５ｋｂ平滑末々：１
４フラグメント約１ｕ９および実施例９Ｂにおいて♀１
１立てられた〜０．８ｋｂ平滑末端フラグメントＱ。 ５μ９を連結し、得られたプラスミドを大腸菌に１２
Ｊ Ｍ １．０９の形質転換に使用する。この連結およ
びＩＦニ質転換は実施例２Ｄと実質的に同様にして行な
う。アガロースゲル電気泳動および他の試験により常套
的に示されるように、形質転換体のうち幾らかは所望の
〜５．７ｋｂプラスミドのみを念むく第１０図）。本明
細書中大腸菌Ｋ １．２ Ｊ Ｍ Ｉ Ｏ９／ｐＯＷ１
０６３と弥するこのような形質転換体を選択し、アブラ
マイシン１００μ９／コシを含有するＴＹ寒天」二に蒔
き、次いて常套の微生物学的手法を用いて培養する。得
られた形質転換体を実施例１に記４戊のようにプラスミ
ドｐＯＷ］０６３のｄｉ離に使用する。 ■、プラスミドＩ）ＯＷ１０６３を用いるアスペルプラ
スミドｐｏＷ）０６３によるアスペルギラスの形質転換
アスペルギラスブロトブラストの調製およびプラスミド
ｐＯＷ１０６３を使用するＡＴＣＣ２８９０１のごとき
アスペルギラス・ニデユランス菌株の形質転換は、実施
例５の方法と実質的に同様にして達成することができる
。 アスベルキラス形質転換体を前記実施例５Ｂのようにし
て単離、成長させ、細胞抽出物を調製しペニシリンＧ生
産について検定した。形質転換体のうち幾らかは、ゲノ
ム性アシルトランスフェラーゼ遺（公子の妨害を含む十
目同な組換え現象のためこペニシリンＧの合成かできな
いであろう。このような形質転換体は２個の不完全な非
機能性Ａ Ｔ遺伝子を含んでいる。一方のＡＴは３″暗
号化配列を欠き、他方は５′暗号化領域の一部を欠いて
いる。この過程を以下の図式に示す。 この所望の形質転換体はβ−ラクタム生合成過程の最終
生成物としてイソベニ７リンＮを蓄積する。 二の形質転換体の常任的確認はケ７ムＤ Ｎ Ａの制限
酵素分析およびその池の試験を含む。プラスミドｐＯＷ
Ｉ０６１により形質転換することによって所望のアスペ
ルキラス形質転換体のペニシリンＧ生合成能が復元する
（実施例３を参照）。 実施例１０ アスペルギラス・ニデユランス中のアシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子置換ペニシリンＧ
を生産できないアスペルギラス菌株を作るもう１つの方
法は、遺伝子置換による方法である。ゲノムアシルトラ
ンスフェラーゼ遺（公子を、相同な二重交差現象に有ｆ
ｌｌなプロトコールによって非機能的アシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子に置換する。所望の非機能的遺伝子は、
プラスミドの持つアシルトランスフェラーゼ遺伝子を耐
性マーカーで妨害することにより組立てられる。 この場合ペニシリウムＩＰＮｓプロモーターを有するフ
レオマインン耐性遺伝子を用いる。 プラスミドｐＫＣ７８７（実施例２Ｃ）およそ５μ９を
実施例３Ａの教示と実質的に同様にして制限酵素Ｐｖｕ
［およびＨｉｎｄ［ｌで完全に切断し、所望の〜２．７
ｋｂ Ｐｖｕｌ／１（ｉｎｄＩＩｌフラグメントを実施
例２Ｂのようにアガロースゲル電気泳動によりキ離する
。次いで精製したフラグメントをＴＥ緩山液約１００μ
ρに溶解し、将来の使用のためにＯｏＣで保存する。 プラスミドｐＯＧ○４（ＮＲＲＬ ＋３−１８１７１
）を実施例１に記４戊のように大腸菌ＫＩ２ＪＭ１０９
／ｐＯＧ○４から得る。プラスミドｐｏｃｏ４約５μ７
を実施例３ＡのようにＨｉｎｄｌｌｌおよびＰ ｖｕ
１て消化し、次いてＡＴ遺伝子を含む所望の〜２８ ｋ
ｂ Ｈ１ｎｄｌｌｌ／ Ｐ ｖｕ ｌフラグメントを実
施例２Ｂのようにアガロースゲル電気泳動によって単離
する。精製したフラグメントをＴ Ｅ Ｈ術成約１００
μＱに溶解し、後の使用のため００ＣでＩｎする。 Ｃ，プラ１ ミドｐＯＷ１０６４の構築プラスミドｐＫ
Ｃ７８７山来の〜２．７ ｋｂ ｔ（１ｎｄＩＴＩ／Ｐ
ｖｕｌフラグメント約１μ９およびプラスミドｐｏｃｏ
４の〜２．８ｋｂ Ｈｉｎｄｌｌｌ／ Ｐｖｕｌフラグ
メント杓０５μ９を連結し、得られた連結反応物を用い
て大腸菌Ｋ１２ＪＭＩ０９／ｐＯＷＩ０６４を１し質や
置換し、了ブラマインン１． ＯＯμ９／肩σに対し耐
性とする。この連結および形質転換は実施例２Ｄの方法
と実質的に同様にして行なう。アガロースゲル電気泳動
およびその他の試験で示さ４するように、形質転換体の
うち幾らかは所望の〜５５ｋｂプラスミドのみを含んで
いる（添付の第１２図を参照）。本明細書中大腸菌に１
２ＪＭ１０９／ｐＯＷ１０６４と称するこうした形質転
換体を選択し、アブラマイシ７ ］ ００ ｕｇ／ｘＱ
を含有するＴＹ寒天上に蒔き、常套の微生物学的手法を
用（Ｘで培養する。得られた形質転換体を用（Ｘで実施
例１に記載のようにプラスミドｐＯＷＩ０６４を単離す
る。 プラスミドｐＯＷ１０６４（上記で構築）を実施例１に
記載のようにして大腸菌ＫＩ２ＪＭ１０９／ｐＯＷ］０
６４から単離する。実施例９１Ｂの教示と実質的に同様
にしてプラスミドｐＯＷｌ。 ６．１およそ５μ９をＮ ｃｏ Ｉで）肖化し、このフ
ラグメントの末端をフレノウ酵素を用いて平滑にする。 得られた〜４．７ ｋｂフラグメントをアガロースゲル
電気泳動により常套的に単離する。得られた〜４ 、７
ｋｂフラグメントをＴＥ緩衝液約１００μｇに溶解し
、後の使用に備えてＯ′Ｃで保存する。 プラスミドｐＲＨ５（実施例２で構築）を実施例１に記
１ｉのように大腸菌から単離する。プラスミドｐＲＨ５
約５μ９を、実施例９１Ａと実質的に同様にしてＥｃｏ
Ｒｌで、そして実施例８Ｄと実質的に同様にしてＨｉｎ
ｄｌＴＩで消化し、得られたフラグメントの末端を実施
例９［Ｂと実質的に同様にしてフレナラ酵素で充填する
。得られたフラグメントのうち１個は、アガロースゲル
電気泳動により常套的に単離される〜２．ｌｋｂ平滑末
端制限フラグメントである。所望の〜２゜ｌｋｂ平滑末
端フラグメントをＴ Ｅｌｌ液液１００μｇに溶解し、
将来の使用のためにＯ′Ｃて保存する。 実施例１０ｎＡの〜４ 、７ ｋｂ平滑末端フラグメン
ト約１μ９および実施例１０１１Ｂの〜２．＋ｋｂ平滑
末端フラグメント約０５μ９を連結し、得られたプラス
ミドを用いて大腸菌Ｋ ｌ ２ Ｊ Ｍ ｌ ０９を形
質転換し、アプラマイ／ン１００μ９／ｍＱに対し耐性
とする。この連結および形質転換は実施例２Ｄと実質的
に同様にして行なう。アガロースゲル電気泳動および他
の試験で常套的に示されるように、この形質転換体のう
ち幾らかは〜６．８ｋｂプラスミドのみを含んでいる（
添付の第１３図に示す）。本明細書中大腸菌Ｋ］２ＪＭ
Ｉ０９／ｐＯＷ１０６５と称するこのような形質転換体
を選択し、アブラマインンＩ ＯＯｕｇ／ ｍＱを含有
するＴＹ寒天」−に蒔き、次いて常套の微生物学的手法
を用いて培養する。得られた形質転換体を実施例１に記
載のごとくプラスミドｐＯＷ］０６５の単離に使用する
。 アスペルギラスブロトブラストの調製およびプラスミド
ｐＯＷＩ０６５を使用するＡＴＣＣ２８９０＋のごとき
アスペルキラス・ニデユランス菌株の形質転換を実施例
５に従って達成する。形質転換前にプラスミドを直線化
すると所望の相間二重交差を含む形質転換体を取得てき
る可能性か増す。これは形質転換に先立ちプラスミドｐ
ＯＷ１０６５をＨｉｎｄＩＩｌ消化することによって行
う。 アスペルギラス形質転換体を前記実施例５Ｂのように単
離および成長させ、細胞抽出物を調うνしペニシリンＧ
生産について検定する。形質転換体の幾らかは、二重交
差を含む相同組換え現象のためにペニシリンＧ合成かで
きない。このような現象において、機能的ゲノムア／ル
トランスフェラーセ遺伝子はケノムから失われ、下記に
示すプラスミドｐＯＷ１０６５の持つ変異体である非機
能的アシルトランスフェラーゼ遺伝子かとって代わるで
あろう。さらに所望の形質転換体はインベニンリノＮを
痰積するであろう。このような形質転挟体のさらなる確
認は、サイン・ハイブリダイゼー／３ン分析と組合わせ
たアスペルギラスゲノムＤＮＡの制限酵素分析を含んで
よい。プラスミドｐＯＷ１０６１を用いたＡＴ欠損菌株
の形質転換（実施例３を参μ、α）は、この菌株のベニ
／リノＧ生合成能を回復するであろうし、かくして所望
の二重交差現象が起こったということを決定するもう１
つの手段をも提供するものである。 実施例１１ アスペルギラスＡＴ欠損閑におけるセファ
ロスポリン類の生産 実施例９および１０で作られるアスペルギラスへＴ欠損
株を、デアセトキンセファロスポリンＣ／ンテターゼ（
エクスパンダーゼ）およびインペニシリンＮエピメラー
ゼ（エビメラーセ）をコードする遺伝子を本菌株中に導
入することにより、アスペルキラス中で有用なセファロ
スポリン類を生産するよう活用する。このような遺伝子
は、宿主生物中で機能する転写および翻訳支配領域の支
配下にある限り、どんな遺伝子も好適である。 特に好ましいエクスパンダーゼおよびエピメラーゼ遺伝
子の組はストレプトマイセス・クラブリゲラスから導か
れる。Ｓ、クラブリゲラスのエクスパンダーセ遺伝子は
、取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８２６４のもとてＮＲＲ
Ｌから入手可能な大腸菌に１２菌株ＲＲＩ△〜ｉ１５中
のプラスミドｐＯＷ３８０から誘導することができる。 Ｓ クラブリケラスのエピメラーゼ遺伝子は、取得計号
ＮＲＲＬＢ−１８４３１のもとてＮＲＲＬから入手でき
る大腸菌Ｋ １２ＲＲＩ△ＭＩ５中のプラスミドｐＯＷ
３９０から人手できる。次いてこれらの遺伝子は、米国
特許出願第０６／８０１５２３号に記載されプラスミド
ｐＬＣ２（ＡＴＣＣ５３３３４）から入毛可能なベニツ
リウムのイソペニシリンＮ／／テターゼプロモーターの
ようなアスペルギラス中て機能する周知のプロモーター
のいずれかの支配下に置かねばならない。 次いでエクスパンダーゼおよびエピメラーゼ遺伝子を含
むベクターを実施例５の方法によってアスペルギラスＡ
Ｔ欠損株中に導入する。形質転換体を選択し、３０’Ｃ
で７〜１０日間成長させ、セファロスポリン生産につい
て常套的に検定する。 大嶺例１２ アシルトランスフェラーゼの非転写（アン
チセンス）ＲＮＡを使用するペニシリンＧ生産菌におけ
るセファロスポリン類の生産プラスミドｐＬＣ２（ＡＴ
ＣＣ５３３３４）より入手できるベニ７リウム・クリソ
ゲナムイソベニンリンＮ／ンテターゼプロモーターはア
スペルギラスおよびベニツリウムの両者において機能的
である。本実施例にはアスペルギラス中でアスベルキラ
スア／ルトランスフェラーゼ遺伝子を１史用する方法を
記載するが、ペニシリウムア／ルトランスフェラーセ遺
伝子を用いたベニツリウムにおける頑似の方法を実施す
ることもできる。単に本明細書中のアスペルギラスの代
わりにベニ／リウムＡＴ暗号化領域で置きかえる必要が
あるだけである。ベニツリウムＡ Ｔ 漬（Ｅ子は、一
般に入手可能なペニシリウム菌株からのゲ７ムＤ Ｎ
Ａのライブラリーから本発明に係るＡＴ遺伝子をハイブ
リダイゼ−７ヨンプローブとして使用して単離すること
ができる。 実施例１に記載のように単離されるプラスミドｐ＋、、
Ｃ２からの二本鎖ＤＮＡフラグメントを増幅するため
にポリメラーセ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。このフ
ラグメントはアシルトランスフェラーセ遺伝子の５゛調
節領域を含んでいる。反応（装置および試薬はＰｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、 １４０Ｑ ５３ｒｄ
Ｓｔ、 、 Ｅｍｅｒｙｖｉ ｌ Ｉｅ、 ＣＡ ９４
６０８から入手可能）は下記の一本鎖プライマーを用い
て実施する。反応成分は、ＩＸ緩ｔｉ液中のｄＮＴＰ各
々２００μＭ、プライマー各１μＭ、鋳型（テンプレー
ト）Ｉｎｇ、およびアンプリタフ（ＡｍｐｌｉＬａｑ”
、’）ＤＮＡポリメラーセ２５ｔ１１位（総量１００μ
のである。この反応物を９・１°Ｃて１分間、５０〜６
０°Ｃで１分間、そして７２℃で１分間、２５サイクル
の間インキュベートする。最終サイクルの後７２°Ｃて
のインキュベーションを７分間継続し、全ての鎖の重合
を完成させねばならない。ＤＮＡブライマーはイタクラ
等［１ｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 （１９７７） ５
ｃｉｅｎｃｅ １９８ ： １０５６］、フレア等［Ｃ
ｒｅａ ｅｔ ａｌ、（１９７８） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７５ ： ５７６５］
、スン等［１１ｓｕｉｎｇ ｅｔ ａｌ、 （１９８３
） Ｎｕｃ、Ａｃｄ、 Ｒｅｓ、 ＩＩ ： ３２２７
］、またはナラング等［Ｎａｒａｎｇ ｅｔａｔ、 （
１９８０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ ６８ ： ９０］の方法により手法で合成してよ
い。このブライマーはＡ Ｂ Ｓ （Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ、８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃ
ｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ、Ｃ
Ａ ９４４０４）３８０ Ａ Ｄ Ｎ Ａ合成装置の
ごとき自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成してもよい。最
初のブライマーはこのフラグメント中にＨｉｎｄｌ１１
部位を組み込んでいる。このブライマーの配列は Ｈｉｎｄｌｌｌ ５’ −ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴｒＣＡＧＧＣＡＡＣＣＴ
第２のブライマーはフラグメント中にＮｃｏｌサイトを
組み込んでおり、翻訳開始サイトから２０塩基対下流で
ブライミングを開始する。 Ｎｃ。 ＰＣＲ反応の生成物は長さ４８８塩基対のＤＮＡフラグ
メントである。ＨｉｎｄｌＩＩ制限部位は５゛末端から
４塩基対のところに位置する。Ｎｃｏ＋制限部位は３°
末瑞から４塩基対のところに位置する。 増幅されたＤＮＡをフェノールで２回、クロロホルムで
２回抽出し、エタノール沈澱し、水に再懸濁する。次い
でこのフラグメントを、ＥｃｏＲＩの代わりにＮｃｏｌ
を使用する他は実施例９１Ａと実質上同様にして制限酵
素Ｎｃｏｌによって、そして実施例８Ｄと実質上同様に
して制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩによって完全に切断し、フ
ェノール抽出し、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱
し、水２５μＱに再懸濁する。この時点でフラグメント
は約４７８塩Ｊλ対の長さである。 上記Ａ項に示すように、ＰＣＲ反応は５′末端でＨｉｎ
ｄＩ［Ｉ制限部位と、そして３”末端でＮｃｏｌ制限部
位と境界を接するアシルトランスフェラーゼ遺伝子を含
む多数のＤＮＡフラグメントを産み出すのに用いられる
。ＰＣＲ反応の鋳型は実施例１に記載の通り単離された
プラスミドｐＯＧＯ４である。この反応のためのブライ
マーは以下のように表わされる： このブライマーはＡＴオープン・リーディング・フレー
ムの５′末端から２０塩基対の所でブライミングを開始
する。 第２のブライマーはＡＴオーブン・リーディング・フレ
ームの３′末端付近から２０塩基対の所でブライミング
を開始する： 増幅したＤ Ｎ Ａフラグメントを２回フェノール抽出
し、２回クロロホルム抽出し、エタノール沈澱し、ｌ−
１，０に再懸濁し、Ｈｉｎｄ［ＩＩおよびＮｃｏｌて切
断し、フェノール、続いてクロロホルム抽出し、エタノ
ール沈澱し、水に再懸濁する。生成したＤＮ Ａフラグ
メントは長さ１２９０塩基対である。 制限酵素切断の後、これは約１２８０塩基対の長さであ
る。 Ａ項で得たＤＮＡフラグメントおよび」項て得たＤＮＡ
フラグメントの当モル■を混合し、実施例２ Ｄに従っ
て連結する。リガーセをフェノール、次いでクロロホル
ムによる抽出によって不活性化する。このＤＮＡを次い
でエタノール沈澱し、水にｉ′ｆ丁懸濁する。次に連結
した物質を制限酵素ＨｉｎｄｌＩＩで切断し、次いてこ
の酵素を上記のごとく不活性化する。生成したＤＮＡフ
ラグメントをＨｌＯｌ、：再懸濁する。 所望の生成物を次のように表すことができる１１ｉｎｄ
ｌｌｌ Ｎｃｏｌ ｔ
ｔｉｎｄｌｌ、＼Ｔプロモーター リバースＡＴ遺
伝子Ｄ、 ＨｉｎｄＩ［Ｉ切断したｐＲＨ５プラスミ
ドＤＮＡの票習 プラスミドｐＲＨ５（実施例２）を制限酵素Ｈｉｎｄ■
で完全に切断する。反応混合物はフェノール、次いでク
ロロホルム抽出し、エタノール沈澱シ、Ｈ，Ｏに再懸濁
する。 Ｅ、プラスミドｐｐ Ｓ ９５の最終的な構築０項で得
たＤＮＡフラグメントを、Ｄ項で得たＨｉｎｄｌｌｌ切
断プラスミドｐＲＨ５ＤＮＡに連結して所望のプラスミ
ドｐＰＳ９５を作る。所望のプラスミドｐＰＳ９５を含
む連結混合物をコンピテントな大腸菌に１２ＪＭ１０９
細胞中に導入して形質転換させる。この連結および形質
転換は実施例２Ｄと実質上同様にして行なう。形質転換
反応物の一部をアブラマイシンｌ ＯＯｕ９／ ｘ（ｌ
を含有するし寒天上に蒔く。アブラマイシン耐性形質転
換体をゲル電気泳動によってｐＲ）（５への挿入につい
てスクリーニングする。ｐＲＨ５中のＨｉｎｄＩ［Ｉフ
ラグメントは２つの配向のうちの一方となるであろう。 フラグメントが所望の配向を持つプラスミドをｐＰ Ｓ
９５と定め、制限酵素分析により常套的に同定する。 プラスミドｐＰ Ｓ ９５の構造および機能地図を第１
５図に示す。 ＡＴ非転写プラスミドｐＰ Ｓ ９５を含むアスペルギ
ラス菌株を用いて実施例１１に記載のようにセファロス
ポリン類を生産する。
第１図は、アシルトランスフェラーゼの反応を示す模式
図であり、 第２図は、β−ラクタム生合成経路を示す模式第３図は
、プラスミドｐＯＧＯ４の制限部位および機能地図の模
式図であり、 第４図は、プラスミドｐＵＴ７１５の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第５図は、プラスミドりＬＣ２の制限部位および機能地
図の模式図であり、 第６図は、プラスミドｐＫＣ７８７の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第７図は、プラスミドｐＲＨ５の制限部位および機能地
図の模式図であり、 第８図は、プラスミドｐＯＷ］０６１の制限部位および
機能地図の模式図であり、 第９図は、プラスミドｐＯＷ１０６２の制限部位および
機能地図の模式図であり、 第１０図は、プラスミドｐＯＷ１０６３の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１１図は、プラスミドｐＯＷ１０６４の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１２図は、プラスミドｐＯＷ１０６５の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１３図は、プラスミドｐＰ Ｓ ９５の制限部位およ
び機能地図の模式図である。 Ｆｉｇｕｒｅ ３ （〜７．２ ｋｂ）
図であり、 第２図は、β−ラクタム生合成経路を示す模式第３図は
、プラスミドｐＯＧＯ４の制限部位および機能地図の模
式図であり、 第４図は、プラスミドｐＵＴ７１５の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第５図は、プラスミドりＬＣ２の制限部位および機能地
図の模式図であり、 第６図は、プラスミドｐＫＣ７８７の制限部位および機
能地図の模式図であり、 第７図は、プラスミドｐＲＨ５の制限部位および機能地
図の模式図であり、 第８図は、プラスミドｐＯＷ］０６１の制限部位および
機能地図の模式図であり、 第９図は、プラスミドｐＯＷ１０６２の制限部位および
機能地図の模式図であり、 第１０図は、プラスミドｐＯＷ１０６３の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１１図は、プラスミドｐＯＷ１０６４の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１２図は、プラスミドｐＯＷ１０６５の制限部位およ
び機能地図の模式図であり、 第１３図は、プラスミドｐＰ Ｓ ９５の制限部位およ
び機能地図の模式図である。 Ｆｉｇｕｒｅ ３ （〜７．２ ｋｂ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アスペルギラス・ニデュランスのイソペニシリンＮ
：アシルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ活性をコード
している単離したＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ化合物。 ２、次のアミノ酸残基配列をコードしている単離したＤ
ＮＡ配列を含有する請求項１記載のＤＮＡ化合物： 【ＤＮＡ配列があります】 ［配列中、Ａｌａはアラニン残基、Ａｒｇはアルギニン
残基、Ａｓｎはアスパラギン残基、Ａｓｐはアスパラギ
ン酸残基、Ｃｙｓはシステイン残基、Ｇｌｎはグルタミ
ン残基、Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ｇｌｙはグリシン
残基、Ｈｉｓはヒスチジン残基、Ｉｌｅはイソロイシン
残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｍ
ｅｔはメチオニン残基、Ｐｈｅはフェニルアラニン残基
、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒ
はトレオニン残基、Ｔｒｐはトリプトファン残基、Ｔｙ
ｒはチロシン残基、そしてＶａｌはバリン残基である］
。 ３、解読鎖が次の単離したＤＮＡ配列を含有している請
求項２記載のＤＮＡ化合物： 【ＤＮＡ配列があります】 【ＤＮＡ配列があります】 ［配列中、Ａはデオキシアデニル残基、Ｇはデオキシグ
アニル残基、Ｃはデオキシシチジル残基、そしてＴはチ
ミジル残基である］。 ４、プラスミドｐＯＧＯ４の〜２．１ｋｂＰｖｕＩ−Ｓ
ｐｈＩ制限フラグメント。 ５、請求項１記載の単離したＤＮＡ配列を含有している
組換えＤＮＡベクター。 ６、ｐＯＷ１０６１、ｐＯＷ１０６２、ｐＯＷ１０６３
、ｐＯＷ１０６４、またはｐＯＷ１０６５である請求項
６記載の組換えＤＮＡベクター。 ７、アシルトランスフェラーゼ活性をコードしているＤ
ＮＡを発現させるように設置したプロモーターおよび翻
訳活性化配列をさらに含有している請求項５記載の組換
えＤＮＡベクター。 ８、プロモーターおよび翻訳活性化配列が大腸菌、アス
ペルギラス、ペニシリウムまたはセファロスポリウム中
で機能するものである請求項７記載の組換えＤＮＡ発現
ベクター。９、プロモーターが大腸菌λｐＬプロモータ
ーである請求項８記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。 １０、プロモーターがペニシリウム・クリソゲナムのＩ
ＰＮＳ遺伝子のプロモーターである請求項８記載の組換
えＤＮＡ発現ベクター。 １１、プロモーターおよび翻訳活性化配列がセファロス
ポリウム中で機能するものである請求項８記載の組換え
ＤＮＡ発現ベクター。 １２、プロモーターがセファロスポリウム・アクレモニ
ウムのＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターである請求項１１
記載の組換えＤＮＡベクター。 １３、アシルトランスフェラーゼ活性を発現しうる組換
え宿主細胞の作成方法であって、（ａ）該宿主細胞中で
機能するプロモーターおよび翻訳活性化配列；および （ｂ）該プロモーターおよび翻訳活性化配列から発現す
るように設置された請求項１記載のＤＮＡ配列； を含有する組換えＤＮＡ発現ベクターで該宿主細胞を形
質転換することを特徴とする方法。 １４、組換え宿主細胞中でアシルトランスフェラーゼ活
性を発現させる方法であって、請求項１３記載の形質転
換宿主細胞を遺伝子発現に適した条件下で培養すること
を特徴とする方法。 １５、組換え宿主細胞が大腸菌、ペニシリウムまたはア
スペルギラスである請求項１４記載の方法。 １６、形質転換宿主細胞が大腸菌Ｋ１２、ペニシリウム
またはアスペルギラスである請求項５記載の組換えＤＮ
Ａベクターで形質転換した組換え宿主細胞。 １７、ペニシリンＧ産生菌をセファロスポリン産生菌に
変換する方法であって、 （ａ）アシルトランスフェラーゼ遺伝子から導いたＤＮ
Ａ配列を含有する組換えＤＮＡベクターでペニシリンＧ
産生菌細胞を形質転換し； （ｂ）該菌細胞におけるアシルトランスフェラーゼ遺伝
子の発現を削除し；そして （ｃ）行程（ｂ）の菌細胞を、エクスパンダーゼおよび
エピメラーゼ酵素活性の発現をコードしている遺伝子を
含有する１またはそれ以上のベクターで形質転換する； ことを特徴とする方法。 １８、セファロスポリン類の製造方法であって、請求項
１７記載の形質転換菌細胞をセファロスポリン産生に適
した条件下で培養することを特徴とする方法。 １９、ペニシリンＧ産生菌がアスペルギラスまたはペニ
シリウムである請求項１８記載の方法。 ２０、ＤＮＡ配列がアスペルギラスのアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子またはペニシリウムのアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含有している請求項１８記載の方法。 ２１、ペニシリンＧ産生菌をセファロスポリン産生菌に
変換する方法であって、ペニシリンＧ産生菌細胞を、エ
クスパンダーゼおよびエピメラーゼ酵素活性の発現をコ
ードしている遺伝子、ならびに転写されてアシルトラン
スフェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡに相補性であるＲＮＡ分
子を生成させうるＤＮＡ配列を含有する１またはそれ以
上の組換えＤＮＡベクターで形質転換することを特徴と
する方法。 ２２、セファロスポリン類の製造方法であって、請求項
２１記載の形質転換菌細胞を、転写によってアシルトラ
ンスフェラーゼのアンチセンスＲＮＡが産生される条件
下、およびセファロスポリンの産生に適した条件下で培
養することを特徴とする方法。 ２３、ペニシリンＧ産生菌がアスペルギラスである請求
項２２記載の方法。 ２４、ＤＮＡ配列がアスペルギラスのアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子またはペニシリウムのアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含有している請求項２２記載の方法。 ２５、ペニシリンＧ産生菌をペニシリンＮ産生菌に変換
する方法であって、ペニシリンＧ産生菌細胞を、エピメ
ラーゼ酵素活性の発現をコードしている遺伝子、ならび
に転写されてアシルトランスフェラーゼ遺伝子のｍＲＮ
Ａに相補性であるＲＮＡ分子を生成させうるＤＮＡ配列
を含有する１またはそれ以上の組換えＤＮＡベクターで
形質転換することを特徴とする方法。 ２６、ペニシリンＮの製造方法であって、請求項２５記
載の形質転換菌細胞を、転写によってアシルトランスフ
ェラーゼ相補性のＲＮＡ分子が産生される条件下、およ
び抗生物質の産生に適した条件下で培養することを特徴
とする方法。 ２７、ペニシリンＧ産生菌がアスペルギラスまたはペニ
シリウムである請求項２６記載の方法。 ２８、ＤＮＡ配列がアスペルギラスのアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子またはペニシリウムのアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含有している請求項２６記載の方法。 ２９、ペニシリンＧ産生菌をペニシリンＮ産生菌に変換
する方法であって、 （ａ）アシルトランスフェラーゼ遺伝子から導いたＤＮ
Ａ配列を含有する組換えＤＮＡベクターでペニシリンＧ
産生菌細胞を形質転換し； （ｂ）該菌細胞におけるアシルトランスフェラーゼ遺伝
子の発現を削除し；そして （ｃ）不活性化されたアシルトランスフェラーゼ遺伝子
を含有している菌細胞を、エピメラーゼ酵素活性の発現
をコードしている遺伝子を含有するベクターで形質転換
する； ことを特徴とする方法。 ３０、ペニシリンＮの製造方法であって、請求項２９記
載の形質転換菌細胞を抗生物質産生に適した条件下で培
養することを特徴とする方法。 ３１、ペニシリンＧ産生菌がアスペルギラスまたはペニ
シリウムである請求項３０記載の方法。 ３２、ＤＮＡ配列がアスペルギラスのアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子またはペニシリウムのアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含有している請求項３１記載の方法。 ３３、解読鎖が次の単離したＤＮＡ配列を含有している
請求項２記載のＤＮＡ化合物： 【ＤＮＡ配列があります】 ［配列中、Ａはデオキシアデニル残基、Ｇはデオキシグ
アニル残基、Ｃはデオキシシチジル残基、そしてＴはチ
ミジル残基である］。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41340189A | 1989-09-27 | 1989-09-27 | |
| US413401 | 1989-09-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03133384A true JPH03133384A (ja) | 1991-06-06 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2260282A Pending JPH03133384A (ja) | 1989-09-27 | 1990-09-27 | アスペルギラスのアシルトランスフェラーゼ活性をコードしているｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクター |
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| JP (1) | JPH03133384A (ja) |
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