JPH02502606A - 新規物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規物質 この発明は、ＤＮＡ分子、および微生物宿主の形質転換に用いる組み換え体ベク ターに関する。特にこの発明は、ペニシリンの生合成に関与する酵素の生合成用 遺伝子、その遺伝子を有するベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞 およびそのような宿主細胞のペニシリン生産への用途に関する。

ペニシリン類と（セファマイシン類を含む）セファロスポリン類の生合成経路は 密接に関連していることが確認されている。

イソペニシリンＮは、上記両グループの化合物の生合成時の中間体であり、°シ クラーゼ（ｃｙｃｌａｓｅ）　’酵素がトリペプチドのδ（し−α−アミノアジ ピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン（以後ＬＬＤ−ＡＣＶまたはさらに簡略 化してＡＣＶと呼ぶ場合がある）に作用して形成される。中間体のイソペニシリ ンＮは、ペニシリンＧに変換することができるが、または°エピメラーゼ°酵素 の作用でペニシリンＮに変換可能で、このペニシリンＮから°エクスパンダーゼ （ｅｘｐａｎｄａｓｅ）　’酵素で最初、環拡大反応に付した後、多段の経路を 経て種々のセファロスポリン類とセファマイシン類を誘導することができる。こ れら技術分野の水準の最近の要約は、ジェイ・エフ・マーチンとピー・リラス（ Ｊ、Ｆ、ＭａｒＬｉｎ　ａｎｄ　Ｐ、Ｌｉｒａｓ）がＴｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３巻、　３９−４４頁、　１９８５年に報告してい る。

その構成成分であるアミノ酸から中間体のトリペプチドのＡＣｖが生成する反応 は、充分理解されておらず、アトリントンら（＾ｄｌｉｎｇＬｏｎ　ｅＬ　ａｌ ）　ｓ　Ｂｉｏｅｈｅ＊、　Ｊ、、　２１３巻、５７３〜５７６頁、１９８３年 で報告され、ニス・イー・ジエンセン（Ｓ、Ｅ、Ｊｅｎｓｏｎ）　ＣＲＣＣｒｉ ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３巻、第 ３部、２７７−３ＩＯ頁、１９８６年や、ヌーシュら（Ｎｕｅｓｃｈ　ｅＬ　ａ ｌ）　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４１巻、５４頁、１９８７年 にまとめられているように、全経路の研究をするのに最も困難な段階である。

現在よく知られているように、組み換えＤＮＡ法によって、宿主細胞に、ベクタ ーが保有するＤＮＡを挿入することができ、その結果、このようにして形質転換 された宿主に、挿入ＤＮＡが保有する遺伝子がコードするあらゆるタンパク質や 酵素を合成する性能を付与することができる（組み換えＤＮＡ法の詳細な考察と 、本願で用いる用語の用語集については、アール、ダブリュ、オールドとニス、 ビー、プリムローズ（Ｒ，Ｙ、０１ｄ　ａｎｄ　Ｓ、Ｂ、Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）著 、’Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ’第３ 版、Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 　１９８５年を参照のこと）。

シイ・アクレモニウム（Ｃ，ａｃｒｅａｏｎｉｕ■）由来のイソペニシリンＮ　 シンテターゼ（シクラーゼ）遺伝子の単離とイー・コリ（Ｅ、　ｅｏｌ　ｉ）で の発現は、ニス・エム・サムスンら（Ｓ、Ｍ、５ａｓｓｏｎ　ｅＬ　ａｌ）　％ 　Ｎａｔｕｒｅ、３１８巻、１９１−１９４頁、１９８５年に報告されている。

さらに、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｔ’ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｓ　ｃｈｒｙｏ ｇｅｎｕ■）のイソペニシリンＮ　シンテターゼ（ＪＰＮｓ）遺伝子は、カール ら（Ｃａｒｒ　ｅｔ　ａｔ）　　（Ｇｅｎｅ、　４８巻、２５７−２６６頁、１ ９８６年）が単離し、配列を決定している。

β−ラクタム化合物の生合成に関与するニス・クラブリゲルス（Ｓ、　Ｃｌａｖ ｕｌｉｇｅｒｕｓ）＾ＴＣＣ２７０６４のある種の遺伝子の単離と発現は、ヨー ロッパ特許願公開第０２３３７１５号に開示されている。

しかし、今まで、ＡＣＶの合成に関与する酸素の産生に有用であると具体的に同 定されたＤＮＡは全くない。

この発明は、ＡＣＶシンテターゼをコードする遺伝子からなるＤＮＡを提供する ものである。

零馳で用いる場合、“＾Ｃｖシンテターゼをコードする遺伝子゛または“＾Ｃｖ シンテターゼ遺伝子°という用語は、ＡＣＶをその前駆体から生合成するのに関 与する酵素をコードするＤＮＡを記載するに用いる。

この発明のＤＮＡは、以下に述べるように、ペニシリン類および／またはセファ ロスポリン類を産生ずる当該技術分野で公知の生物、例えばペニシリウム（Ｐｅ ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）　、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　、フラ ボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕａ）およびストレプトマイセス（ ５ＬｒｅｐＬｏｓｙｃｅｓ　）属に属する種の菌類の全ＤＮＡもしくは染色体Ｄ ＮＡから単離することができる。この発明のＤＮＡが大多数の前記の染色体ＤＮ Ａから単離され、それが゛天然状聾°すなわち天然に存在する形態ではないこと は勿論理解されるであろう。一つの態様として、この発明のＤＮＡは、単離され た実質的に純粋な形態かおよび／または特に＾Ｃｖシンテターゼ遺伝子で構成さ れている。

ＡＣＶシンテターゼ遺伝子に加えて、この発明のＤＮＡは、さらに、ペニシリン およびセファロスポリンのβ−ラクタム化合物の生合成に関与する遺伝子、特に イソペニシリンＮシンテターゼ（ｌＰＮＳ　）遺伝子および／またはアシルトラ ンスフェラーゼ（ＡＣＴ）遺伝子を有している。またこの発明のＤＮＡは、ペニ シリンおよびセファロスポリンのβ−ラクタム化合物の生合成に関与する調節要 素もしくは調節遺伝子をもっていてもよく、または特別なもしくは公知の機能を もたない隣接ＤＮＡをもっていてもよい。

特別な］ｌにおいて、この発明のＤＮＡは、適切な宿主生物特に真菌類の宿主に 発現される、ペニシリン産生全生合成遺伝子クラスターで構成されている。前記 遺伝子クラスターは、大部分の隣接する染色体ＤＮＡから分離されたのであり、 その天然状態のものではないことは理解されてあろう。

本願に用いられる°ペニシリン”という用語にはイソペニシリンＮが含まれ、ま たペニシリン■とペニシリンＧのようなペニシリンも含まれ、これらのペニシリ ンは、宿主生物が適切な側鎖前駆体、例えばフェノキシ酢酸もしくはフェニル酢 酸の存在下で培養すると形成される。

さらにこの発明は、この発明のＤＮＡを保有し、宿主細胞を形質転換できる組み 換え体ベクターを提供するものである。上記のベクターとしては、高レベルの遺 伝子転写を発現できる高発現ベクターが好ましい。

この発明の他の態様では、この発明の組み換え体ベクターで形質転換された宿主 細胞特に真菌類の宿主が提供される。

さらにこの発明は、通常の形質転換条件下で宿主と組み換え体ベクターとを混合 することからなる。この発明の組み換え体ベクターで宿主細胞を形質転換する方 法を提供するものであるこの発明を明確に定義するために、下記図面を参照する 。

第１（ａ）図は、フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ　ｓｐ 、）ＳＣ１２，１５４ＤＮＡの一部分の制限地図であり、ＡＣＶの生合成に関与 する１つ以上の遺伝子からなる（　ＴＰＳ／ＷＥという印をつけた）領域と、シ クラーゼ、エピメラーゼおよびエクスパンダーゼの遺伝子からなる（ＣＸＩとい う印を付けた）領域とを示す。

ｍｌ　（ｂ）図は第１　（ａ）図のＤＮＡのＣＸＩ領域の制限地図である。

第２（ａ）図はニス・クラブリゲルス　ＡＴＣＣ２７０６４ＤＮＡの一部分の制 限地図であり、その制限断片を第２（ｂ）図（ｐＢＲＯｃ１３ｇと命名された組 み換え体プラスミド内にクローン化されたＤＮＡ　）と第２（ｃ）図（ｐＢＲＯ ｃ　＋３７と命名された組み換え体プラスミドにクローン化されたＤＮＡ　）と に示す。

第３図は、ｐＢＲＯｃ１４１と命名された組み換え体プラスミドの制限地図であ る。

第４図は、ｐＢＲＯｃＩ４７と命名された組み換え体プラスミドの制限地図であ る。

第５（ａ）図は、ニス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４内にあってペニシリ ンとセファロスポリンの生合成に関与する遺伝子を構成するＤＮＡの制限地図で ある。

第５（ｂ）図は、ｐＢＲＯｃ３７１と命名された組み換え体プラスミドにクロー ン化されたＤＮＡの断片の制限地図である。

第５（ｃ）図は、ｐＢＲＯｃ４０１と命名された組み換え体プラスミドにクロー ン化されたＤＮＡの断片の制限地図である。

第５（ｄ）図＋！、フラボバクテリウム種ＳＣ１２，１５４ノ断片ＴＰＳ／ＶＥ が雑種形成するニス・クラブリゲルスＤＮＡの領域を示す。

第６図は、ＡＣＶとサイクラーゼの遺伝子を保存する第１　（ａ）図に示すフラ ボバクテリウムＤＮＡの領域［第６（ａ）図コと、ｐＧＸ３．２と命名されるコ スミドクローン内のピー・クリソゲナムＤＮＡのの対応する領域［第６図（ｂ） 参照コとの交差雑種形成地図を示し、その交差雑種形成領域（ＧＸＩ、ＧＸ２お よびＧＸ３と印がつけである）と、ｐＧＸｓｌｏ、ｐＧＸＥｌ、　ｐＧＸｓｌｌ 、　ｐＧＸ−Ｃ１、ｐＣＹＸ４、ｐＧＸＢＧおよびｐＧＸＢ２０と命名されたピ ー・クリソゲナムＤＮＡのプラスミドサブクローンの範囲を示す。

第７図は、エイ・ニデユランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　ＤＮＡの交差雑種 形成地図を示し、第６（ｂ）図に示ずピー・クリソゲナムＤＮＡの対応する領域 と交差雑種形成する（ＧＸＩ、ＧＸ２およびＧＸ３という印をつけた）領域を示 す。

上記の図において、略語のＢａｍ旧、　５ｐｈ１などは制限エンドヌクレアーゼ の通常の略語であり（オールドとプリムローズの前記文献参照）またアガロース ゲル電気泳動法で行う大きさ決定実験によって測定された、ＤＮＡのキロベース （Ｗｂ）による概略の長さが示されている。第１〜７図が、例示されたＤＮＡに 存在する可能性があるすべての制限部位を示そうとするものではないことは理解 されるであろう。第６図の点線は、下記のようにプローブされたときに、とぎれ ていない線で示した断片よりも弱く雑種形成する制限断片を示す。

好ましい態様において、この発明のＤＮＡは、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌ ｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　、フラボバクテリウム （Ｆ１ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｓ）、もしくはストレペトマイセス（Ｓｔｒｅ ｐｔｏＩＩｙｃｅｓ）属の種から得られ、より好ましくは、ペニシリウム、アス ペルギルスもしくはフラボバクテリウムから得られる。

この発明のＤＮＡは、ピー・クリソゲナムから有利に得られる。

この発明の特定の態様において、完全な＾Ｃｖシンテターゼ遺伝子からなるピー ・クリソゲナムＤＮＡ　（１）もしくはこのＤＩｌ＾由来の制限断片を提供する ものであり、このＤＮＡ（１）は第６（ｂ）図に示す制限部位の配列をもってい る。

ＤＮＡ　（１）は、下記の方法によってピー・クリソゲナムから得ることができ る。

ＤＮＡ　（１）の特定の副断片（ｓｕＭ　ｒａｇｍｅｎｔ　）は、ＧＸｌ、　Ｇ Ｘ２およびＧＸ３という印をつけた領域にあるＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲ１断片であ る。

この発明のさらに特定の態様として、完全な＾Ｃｖシンテターゼ遺伝子からなる フラボバクテリウム種ＳＣ＋２，１５４ＤＮＡもしくはそのＤＮＡ由来の制限断 片を提供するものであり、このＤＮＡは第１（ａ）図に示す制限部位の配列をも っている。

特定の態様として、上記のフラボバクテリウムＤＮＡは第６（ａ）図に示すよう な構造（ＩＩ）を有する。

（ロ）の特定の副断片は、ＧＸＩ、　ＧＸ２およびＧＸ３という印をつけた領域 にあるＢａ−旧−Ｂａ＠旧断片である。

この発明は、さらに特定の実施態様として、ＡＣＶシンテターゼ遺伝子からなる ニス・クラブリゲルスＤＮＡ　（、［１）もしくはそのＤＮＡ由来の制限断片を 提供するしのであり、上記ＤＮＡ（ＩＩＩ）は第５（ｄ）図に示す制限部位の配 列をもっている。

この発明は、さらに特定の実施憇として、完全なＡＣＶシンテターゼ遺伝子から なるエイ・ニデユランスＤＮＡ　（ＩＶ　’）もしくはそのＤＮＡ由来の制限断 片を提供するものであり、このＤＮＡ　（ＩＶ　）は第７図に示す制限部位の配 列をもっている。

この発明の、ＤＮＡ　（＋　）、（Ｅｌ）、（Ｉ［ｌ）もしくは（ＩＶ）の制限 断片はＤＮＡセグメント（１）〜（■）から、適切な制限酵素を用いて、公知の 方法で切断することによって得ることができる。

特定の態様として、この発明は、宿主細胞を形質転換することができて、完全な ＡＣＶシンテターゼ遺伝子を保有する、挿入ＤＮＡ（１）、（ＩＩ）、（Ｉ［ｌ ）もＬ＜は（ＩＶ）またはそれらＤＮＡ由来の制限断片をもった組み換え体ベク ターを提供するものである。

例えば第５（ｄ）図、第１（ａ）図、第６（ａ）図、第６（ｂ）図もしくは第７ 図に特徴づけられているこの発明のＤＮＡまたはこれらＤＮＡ由来の適切な制限 断片は、いずれの適切なベクターにも連結することができる。ＡＣＶシンテター ゼを産生ずるために、このベクターは、ＡＣＶ遺伝子を発現することが可能な宿 主細胞を、形質転換もしくはトランスフェクトすることができなければならない 。

通常前記ベクターはプラスミドであり、例えばストレプトマイシー）　（Ｓｔｒ ｅｐＬｏｍｙｃｅｔｅ）または溶原性ファージもしくは溶菌ファージ由来のプラ スミドである。

適切なベクターの例はｐｌＪ　７０２　（分−７−１：　８．９メガダルトン） であり、これは、カップ・イーら（Ｋａｔｚ、　Ｅ、　ｅＬ　ａｌ）　、Ｊ、Ｇ ｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１２９巻、２７０３−２７１４頁、１９８３年に記載さ れた高コピー数のプラスミドであり、英国、ノーリッチのＪｏｈｎ　１ｎｎｅｓ 　Ｉｎ−５ｔｉｔｕｔｅから入手できる。

適切な溶原性ファージの例はφＣ３１として知られているもので、これはロモフ スカヤーｘヌ・ディ（Ｌｏ＊ｏｖｓｋａｙａ、　１１．Ｄ、）、チャタ−・ケイ ・エフ（ＣｈａＬｅｒ、　Ｋ、Ｆ、）　、マクルッミアン・エヌーｘム（Ｍｋｒ ｔｕｓｉａｎ、　Ｎ、Ｍ、）　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｒｅｖ、、　４４巻、 ２０６〜２２９頁、１９８０年に記載されている。

ＡＣ，Ｖシンテターゼ遺伝子を子嚢類（ａｓｃｏｍｙｃｅＬｅ）もしくは不完全 菌類（ｄｅｕＬｅｒｏｍｙｃｅｔｅ）の宿主に発現さけるためには、フィラメン ト状真菌類のベクターを使用することが有利である。

適切なベクターには、３ｍｄＳ遺伝子を保有するｐ３ＳＲ２［べり−とターナ− （Ｂｅｒｉ　ａｎｄ　Ｔｕｒｎｅｒ）　、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 　１１巻、６３９−６４１頁、１９８７年］と、ｐｙｒ−４マーカーを有するｐ ＣＡＰ２とが含まれる。

この発明の組み換え体ベクターは、標準の方法によって作製することができる。

例えば、第１（ａ）図、第５（ｄ）図、第６（ａ）図、第６（ｂ）図もしくは第 ７図に特徴づけられる挿入ＤＮＡ、またはそれらＤ）ＩＡ由来の適切な制限断片 を、通常の方法、例えば付着末端の直接結合法、ホモポリマーのテーリング法ま たはリンカ−分子もしくはアダプター分子によって、選択したベクターに結合さ せることによって製造することができる。

上記の方法で製造した組み換え体ベクターは、２つの可能性のある方向の１つに 挿入ＤＮＡを保存していることは明らかである。各方向に挿入ＤＮＡを有する組 み換え体ベクターはいずれもこの発明の範囲に含まれる。

さらにこの発明は、ペニシリンもしくはセファロスポリン産生微生物からこの発 明のＤＮＡを得る方法を提供するものである。

その方法は、下記の工程： （ａ）ペニシリンらしくはセファロスポリン産生微生物から得た染色体ＤＮＡ断 片から遺伝子ライブラリィを構築し、（ｂ）１回以上の雑種形成実験を実施して 、前期ライブラリィから、この発明のＤＮＡを自存するクローンを選択し、およ び（ｃ）この発明のＤＮＡを単離する、 で構成されている。

上記方法において、適切な微生物は、中間体のトリペプチドＡＣＶを経てペニシ リン類および／またはセファロスポリン類を産生ずるいずれの微生物でもよい。

かような生物には、例えば、ビー・クリソゲナム、エイ・ニデユランス、シー・ アクレモニウム、ストレプトマイセス種の例えばニス・グラブリゲルス、および フラボバクテリウム種例えばフラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４が含まれる 。

上記遺伝子ライブラリィは、通常の“ショット・ガン”法、すなわち（ａ）ペニ シリンもしくはセファロスポリン産生微生物の染色体Ｄｌｉ＾を、１つ以上の適 切な制限エンドヌクレアーゼ例えば５ａｕ３ＡＩで部分的に消化し、 （ｂ）サイズ分画を行って適切な長さの断片を得て、（ｃ）得られた断片をベク ターに結合して組み換え体ベクターを得て、ついで （ｄ）ｊｌ切な宿主を上記組み換え体ベクターで形質転換またはトランスフェク トする、 方法で製造することができる。

上記のように、形質転換またはトランスフェクシヨンは、当該技術分野で公知の 通常の方法で実施できる。

サイズ分画は、ショ糖の勾配を用いて行うのが適切で、選択されたサイズ限界内 の断片が選択される。

好ましい態様において、°コスミドライブラリイ°は、長さが約３０〜５０ｋｂ 例えば３５〜４０ｋｂの断片を選択し、ｎη記断片をコスミドベクター例えばベ クターｐＣＡＰ２　［ブリストル大学のシイ・ターナ−（ｃ、Ｔｕｒｎｅｒ）よ り入手可能］に前記断片を結合することによって製造することができる。

クローンを同定するためには、その遺伝子と雑種形成しうる標識をつけたプロー ブを用いる必要がある。

通常、該プローブは、例えば０Ｐで放射能標識がなされている。放射能ｔ１識は 、標準の方法、例えば５゛末端もしくは３°末端標識法またはニックトランスレ ーション法で行うことができる。

この発明のＤＮＡを得る方法は、セファロスポリン類を産生ずる第１微生物由来 のＤＮＡ断片の遺伝子ライブラリィから単離した生合成遺伝子ラスターと、ペニ シリン類は産生ずるがセファロスポリン類は産生じない第２微生物由来の全ＤＮ Ａとの交差雑種形成実験を実施する方法である。上記２つの生物内の生合成経路 は、イソペニシリンＮの形成後分岐するので、雑種形成すると予想される生合成 遺伝子は、ＡＣＶシンテターゼとイソペニシリンＮシンテターゼをコードする生 合成遺伝子だけである。

その２つの遺伝子は、別の実験を行うことによって識別できるが、最も好都合な 方法は、ビー・クリソゲナムのＪＰＮｓ遺伝子もしくはその断片のようなイソペ ニシリンＮシンテターゼ遺伝子に対して特異的なプローブと雑種形成さ什る方法 である（カールら、Ｇｅｎｅ、　４８巻、２５７−２６６頁、　１９８６年）。

次いで第１微生物由来のＡＣＶ遺伝子を標準の方法で単離し、その遺伝子もしく はその遺伝子の断片からなるＤＩＩＡを、第２のもしくはいずれかの他の適切な β−ラクタム化合物産生微生物の遺伝子ライブラリィから＾ＣＶ遺伝子を単離す るためのプローブとして使用できる。

変異体を後から酵素検定法もしくは相補的検定法に付して、第１もしくは第２の 生物のＡＣＶ　ＤＦＩＡからタンパク質を発現さける実験を、ＩＮＮ＾を同定す るために、以下に述べるように、実施しなければならない。

好ましいＩＢ様において、第！微生物はフラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４ で第２微生物はビー・クリソゲナムである。

当該技術分野の熟練者が上記のような交差雑種形成実験を繰り返さなくてもよい ように、この発明のＤＦＩＡはブダペスト条約の条件下にあるカルチャー・コレ クションに寄託されている。

そのＤＮＡはコスミドｐＣＡＰＺ中に、ピー・クリソゲナムＣＭ＋　３１４６５ ２ＤＮＡの約３８Ｋｂの挿入物を保有し、ｐＣＸ３．２と命名されている。その 挿入物は第６（ｂ）図に示す全遺伝子クラスターからなり、すなわちへＣｖシン テターゼ遺伝子のみならず、ビー・クリソゲナムのイソペニシリンＮ（ＩＰＮＳ ）遺伝子とアシルトランスフェラーゼ（八ＣＴ）遺伝子を保有している。ｐＣＸ ３．２はイー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）Ｄ旧に導入され、得られた形質転換宿主は １９８７年１１月２３日に受託番号ＮＣＩＢ　１２５９１号でＮａｔｉｏｎａｌ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ＩｎｄｕｓｔｒｉａＩ　Ｂａｃｔｅｒｉａに寄 託された。菌株ＮＣＩＢ　１２５９１とｐＣＸ３．２は、この発明の別の態様を 構成する。

ｐＣＸ３．２は上記の寄託された微生物から容易に得ることができ、所望により 、上記のＩ　ＰＮＳ遺伝子とＡＣＴ遺伝子をもっていない副断片を作製すること ができる。

ＡＣＴシンテターゼ遺伝子の副断片も遺伝子プローブとして価値のあるものであ ることは明らかである。このような副断片はこの発明の範囲に含まれる。

必要に応じてこの発明のＤＮＡが単離されたという証拠は、＾Ｃｖを合成する性 能を欠いている、ある種のペニシリンもしくはセファロスポリンを産生ずる°阻 止された変異体（＋）ｌ□（１（ｅｄ　ｍｕｔａｎＬ）”を修復するのに、その ＤＮＡを用いることによって得ることができる。この目的のために有用な変異体 には、エイ・ニデユランス菌株、特に突然変異部分（ｍｕｔａｔｉｏｎ）　ｎｐ ｅＡ　　００２２　［メイキングスら（Ｍａｋｉｎｇｓ　ｅＬ　ａｌ）　、Ｊ、 Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１２２＠、３３９頁、１９８１頁コを含有す るＮＰ＾５と命名された同菌株が含まれる。

この発明のフラボバクテリウムＤＮＡを得るには、まずフラボバクテリウム種５ Ｃ１２，１５４を入手することが必要である。この微生物は、スクイブ社（Ｓｑ ｕｉｂｂ）がそのカルチャーコレクシジンから我々に親切に提供してくれたもの で、ダラム陰性の桿菌であり、その性質は、ビー・ディ・シンら（１’、Ｄ、Ｓ ｉｎｇｈ　ｅｔ　ａｌ）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、　 ＸＸＸＶ巻、１０号１３９７〜１３９９頁、１９８２年に始めて報告された。こ の微生物の適切な醗酵条件もその報告に報告された。

フラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４の再単離品を、英国、スコツトランド、 アバディーンにあるＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｒ　Ｉｎｄ ｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに寄託した。その寄 託（ＮＣＩＢ　１２３３９号：寄託臼１９８６年ｌＯ月１５日）は、特許手続上 の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされている。

フラボバクテリウムＩ　５Ｃ１２，１５４の染色体ＤＮＡ断片の°遺伝子ライブ ラリィ°は上記の方法で作製することができる。

フラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４のニスミドライブラリイは、ｅｙ　ｅｔ 　ａｌ）　Ｇｅｎｅ、　２４巻、　２９９〜３０８頁、　１９８３年の方法によ って有利に作製することができる。

あるいは、長さが一般に３〜＋５ｋｂ好ましくは４〜７ｋｂのフラボバクテリウ ム種５Ｃ１２，１５４の染色体ＤＦＩＡの小片のライブラリィを、前記断片をプ ラスミドベクター例えばｐＡＴ１５３に結合して作製してもよい。

この発明のフラボバクテリウムＤＮＡを含有するクローンを選択する前に、ペニ シリン類やセファロスポリン類の生合成に関与する多数の遺伝子を、フラボバク テリウム種５Ｃ１２，１５４以外の微生物が産生ずる、β−ラクタム化合物の生 合成に関与する酵素をコードするＤＮＡ片で、前記遺伝子ライブラリィをプロー ブすることによってクローン化するのが有利である。適切なプローブには、シク ラーゼ、エピメラーゼまたはエクスパンダーゼ酵素をコードする遺伝子、または 合成オリゴヌクレオチド類を保有るす前記遺伝子の断片が含まれる。上記のプロ ーブが得られる適切な微生物にはストレプトマイセス属に属する種の微生物（Ｓ Ｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　５ｐｅｃｉｅｓ）があるが、特にニス・クラブリゲル ス＾ＴＣＣ２７０６４が挙げられる。ピー・クリソゲナムのＩＰＮＳ遺伝子また はその副断片もプローブとして用いるのに有利である。

付加されたＤＮＡが゛バックグラウンド°雑種形成を起こさないならば、プロー ブ中に存在していてもよい。例えばそのプローブは、組換え体ベクターの一部を 形成してもよい。正のクローンが選択されるライブラリィを作製するのに用いた ベクターと明確に相同でないならば、いずれの好都合なベクターを使用してもよ い。

プローブＤＮＡとしては、第２（ａ）図に示す制限部位の配列をもっているもの が適切であり、またはニス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４のエクスパンダ ーゼ酵素またはエピメラーゼ酵素をコードする全遺伝子もしくはその一部からな る前記制限部位の配列の断片が好ましい。

上記の好ましい断片には、第２（ｂ）図と第２（ｃ）図に示す制限部位の配列を 有するＤＮＡとその適切な副断片とが含まれる。

プローブとして用いられる特定の副断片は、第２（ｃ）図に示すＤＮＡの３ｋｂ 長のＢａ＋ｌ１ｌｌｌフラグメントである。そのフラグメントをｐｌＪ７０２に クローン化するとｐＢＲＯｃ１４１と命名された組換え体プラスミドが得られる （第３図参照）。

プローブとして有用なその外の副断片は、ｐＢＲＯｃ１４１から得られるＫｐｎ ｌ−Ｐｓｔ　Ｉ（２，１ｋｂ）　ＤＮＡ断片である。

第２図に示すニス・クラブリゲルスの染色体ＤＮＡは、欧州特許出願公開第０２ ３３７１５号に記載されているようにして得ることができる。

この発明のＤＮＡを保有するフラボバクテリウム遺伝子のライブラリィからそれ らのクローンを選択するために、標識を付けたプローブを通常の雑種形成実験に 用いて、正のコロニーを例えばオートラジオグラフィーで同定することができる 。組換え体ベクターは、通常の方法によって、正の各コロニーから単離すること ができる。組換え体ベクターを適切な制限酵素で消化する際に、各ベクターに含 まれているフラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４ＤＮＡは、この発明のＤＮＡ を含有しているということをチェックするため、通常の方法で各種の制限酵素で 切断することによって同定され、大きさが測定され、地図が作成される。このよ うにして単離された２つ以上の°オーバーラツプしている。

挿入物（すなわち共通ＤＮＡを有する挿入物）は、この発明のＤＮＡ内に全部も しくは一部が包含され、個々には小さすぎて完全な遺伝子を包含できないが、共 通の制限部位で切断し、次いで通常の方法で（例えばＤＮＡリガーゼを用いて） 結合することによって融合させることができる。

プローブとして便利なものとしてはフラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４の染 色体ＤｌｉＡの一片であってもよく、これはそのプローブの領域を越えて延びる この発明の、フラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４染色体ＤＮＡを同定するの に用いることができることは、勿論理解されるであろう。この技術は、当該技術 分野の熟練者には公知のものであり、時には染色体歩行法と呼ばれる。このよう に、一つの好ましい態様において、フラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４ＤＮ Ａの比較的短い断片は、プラスミドベクター、例えばｐＡＴ１５３に包含されて いるフラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４の染色体ＤＮＡ断片のライブラリィ を、ニス・クラブリゲルスの染色体ＤＮＡの適切な１片、例えば、第２（Ｃ）図 に示すＤＮＡもしくはその副断片でプローブすることによって単離することがで きる。

このようにして単離されたフラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４のＤＮＡ断片 、例えばｐＢＲＯｃ１４３にクローン化されたＤＮＡ　［第１（ｂ）図コは、こ の発明のＤＮＡもしくはその適切な断片を含むＤＮＡの長い断片をニスミドライ ブラリイから単離するためのプローブとして使用することができる。

単離されたＤＮＡが＾Ｃｖ遺伝子を包含しているということの証明は、同じ酵素 をコードする他の微生物、例えば上記のようなピー・クリソゲナムとニス・クラ ブリゲルス由来のＤＮＡと直接交差雑種形成させる試験を行うことによって得ら れる。

このような雑種形成試験に用いるＤＮＡとしては、ピー・クリソゲナムＮＲＲＬ 　１９５１から得られる全染色体ＨＡが適切である。

上記ＤＮＡは、フラボバクテリウムＤＮＡの２つの領域［第６（ａ）図にＧＸＩ −ＧＸ３およびＪＰＮｓという印がつけられている］を同定するのに用いられる が、上記の領域は雑種を形成して、そのＤＮＡがペニシリンとセファロスポリン の生合成の初期の段階で関与する遺伝子を包含しているということを示す。これ ら領域の一つのフラボバクテリウムイソペニシリンＮシンテターゼ（ＩＰＮＳ） 遺伝子としての同定は、ピー・クリソゲナム由来のＩＰＮＳ遺伝子またはその断 片でプローブすることによって行われ、したがって交差雑種形成する残りの領域 は、ＡＣＶの生合成に関与する遺伝子に相当する。

ＡＣＶの生合成遺伝子もしくはその断片（例えばＧＸＩと命名されているもの） に相当するフラボバクテリウムＤＮＡの領域は、プローブとして使用して、＾Ｃ ｖ遺伝子を含有するクローンをピー・クリソゲナム遺伝子ライブラリィから単離 することができる［第６（ｂ）図参照］。

へＣｖシンテターゼ酵素の産生は、この発明のＤＮＡを適正なベクターに挿入し 、このようにして形成された組換え体ＤＮＡで、適切な宿主、例えばイー・コリ 、ニス・リビダンス６６　（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ６６）　（ＤＳＭ　１５６７ ）またはピー・クリソゲナムを形質転換することによって実施することができる 。

上記のように、ピー・クリソゲナム内で＾ＣＶシンテターゼ遺伝子を発現するた めにフィラメント状真菌ベクターが通常用いられる。

＾Ｃｖシンテ゛ターゼ酵素で、上記の組換えＤＮＡ技術によって製造されるもの は、この発明の他の！ｇ様に含まれる。この酵素は、高純度の形態のものが好ま しい。

その酵素は、通常の方法で単離し精製するこができる。

この発明のＤＮＡとそのＤＮＡを含むベクターは、産業上の利用分野に用途を見 つけることができる。また、このことは前記ベクターで形質転換された宿主微生 物にも当てはまる。ＡＣＶシンテターゼ酵素にも産業用途がある。前記ＤＮＡを 含有する組換え体ベクターは、適切な宿主に形質転換されると、ペニシリンＧや ■のような価値のある抗生物質の合成量が増大した遺伝子的に修飾された微生物 を産生ずるか、または遺伝子転移法よって新規なまたはハイブリッドの抗生物質 を生成する価値あるベクターである［例えば、ディ・エイ・ホップウッドら（Ｄ 、＾、Ｈ。

ｐｗｏｏｄ　ｅＬ　ａｌ）　、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻、６４２〜６４４頁、１ ９８５年参照］。

したがってこの発明には、ＡＣＶシンテターゼ遺伝子を適切な宿主に導入し、そ の遺伝子にペニシリン生合成に関与する他の生合成遺伝子または他のすべての生 合成遺伝子を任意に連結させることができるという重要な利点がある。このよう に、ＡＣＶ遺伝子をすでにもっている宿主内で、＾Ｃｖ遺伝子のコピー数また発 現レベルを増大させるか、または宿主を＾Ｃｖ合成の段階で阻止している変異を 修復することができる。

それ故、１つの態様として、この発明は、天然でペニシリンを産生する宿主細胞 からまたは＾Ｃｖ合成の段階で阻止されている前記宿主の非産生突然変異体から ペニシリンを産生ずる方法であって、。

（ａ）前記宿主または、前記宿主の前記非産生突然変異体を、この発明のＤＮＡ を包含するベクターで形質転換し、ついで（ｂ）その結果形成された形質転換体 を、適切な条件下で培養して、ペニシリンを産生さ仕る、 段階からなる方法を提供するものである。

上記の方法に用いる宿主として好ましいのは真菌類の宿主であり、特にピー・ク リソゲナムである。

その上この発明のＤＮＡは、上記のようなペニシリンを産生ずる完全な生合成遺 伝子クラスターで構成されている場合、このクラスター化遺伝子を用いて天然で はペニシリンを産生じない適切な真菌類の宿主からペニシリンを得ることができ る。

したがって、他の態様として、この発明は、天然ではペニシリンを産生じない真 菌類の宿主にペニシリンを産生ずる方法であって、下記段階： （ａ）ペニシリンを産生ずる完全な生合成遺伝子のクラスターを保有するＤＮＡ を単離し、 （ｂ）得られたＤＮＡを適切なベクターに挿入して組換え体ベクターを形成し、 （ｃ）前記宿主を該組換え体ベクターで形質転換し、ついで（ｄ）得られた杉質 転換宿主を適切な条件下で培養してペニシリンを産生さ仕る、 段階からなる方法を提供するものである。

この明細書で用いられる°真菌類の宿主°という用語には子嚢菌類［サツカロミ セス科類（Ｓａｃｃｋａｒｏｇ＋ｙｃｅｔａｃｅａｅ）または酵母科菌のような 半子嚢菌類を含む］、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌類（ ＺｙｇｏＩＩｙｃｅＬｅｓ　）および不完全菌類が含まれる。

特に適切な真菌類の宿主は、フィラメント状の子嚢菌類と不完全菌類であり、例 えばペニシリウム属の特にピー・クリソゲナム、セファロスポリウム属（Ｃｅｐ ｈｌｏｓｐｏｒｉｕｓ）の特にシー・アクレモニウム（Ｃ−ａｅｒｅＩＩｏｎｉ ｕｍ）　、アスペルギルス属とニューロスポーラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　） の種の真菌類である。

天然ではペニシリンを産生じない真菌類の宿主として好ましいものにはアスペル ギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）とニューロスポーラ１ クラツサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）がある。

適切な真菌類の宿主は、＾Ｃｖの生合成に必要なすべてのアミノ酸類を入手でき ることは明らかである。

上記の方法のいずれでも用いられる組換え体ベクターとして好ましいのはｐＣＸ ３．２である。

上記の方法で産生ずることができる好ましいペニシリンには、ペニシリンＧとペ ニシリンＶが含まれる。

この発明によれば、クラスター内の遺伝子が適切な宿主に発現される場合の、セ ファロスポリンの製造法に用いることができる（　ＡＣＶシンテターゼ、ＩＰＮ Ｓ、エピメラーゼおよびエクスパンダーゼからなる）遺伝子クラスターを組立て ることができることは、前記説明から明らかである。このような遺伝子クラスタ ーは、その遺伝子クラスターを保有する組換え体ベクターと、その遺伝子クラス ターが形質転換された宿主と同様にこの発明の他の態様を構成する。好ましい宿 主にはフラボバクテリウム属とストレプトマイセス属に属する種の微生物である 。

フラボバクテリウム属の、例えばフラボバクテリウム種５Ｃ１２、＋５４ｆ７） 　ＩＰＮＳ、エキスパンダーゼおよびエピメラーゼの遺伝子は、（個々のもしく はクラスター化した）その遺伝子を有する組換え体ベクターと、その組換え体ベ クターが形質転換された宿主と同様にこの発明の他の態様を構成する。

さらに別の態様としては、この発明のＤＮＡもしくはその断片（必ずしも完全な 遺伝子を保有していない）は、組換えＤＮＡ法もしくは天然の組換え過程で、β −ラクタム化合物生合成に関与する遺伝子の断片を用いて結合され、雑種酵素の 合成を指令できる雑種遺伝子を産生ずることができる。このような酵素は、上記 の過程と類似の過程で新規な抗生物質の産主に利用できる。

また、この発明のＤＮＡは、公知技術である部位特異的突然変異誘発法［例えば 、ジー・ウィンターら（Ｇ、Ｙｉｎｔｅｒ　ｅＬ　ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ、　２ ９９巻、７５６〜７５ｇ頁、１９８２年、またはシラーとスミス（Ｚｏｌｌｅｒ 　ａｎｄ　Ｓｗ＋１ｔｈ）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ 、　１０巻、６４８７〜６５００頁１９８２年に記載されているのと類似の方法 ］で修飾して、特異的な突然変異および／または欠失を起こさせたＤＮＡを提供 することかでざる。上記の突然変異をさせたＤＮＡを利用して、公知のβ−ラク タム抗生物質をすでに産生じている適切な宿主微生物から、該抗生物質を、増大 した収ｉｔ（もしくは力価）で得ることができる。また上記の突然変異をさせた ＤＮＡは、遺伝子転移によって新規抗生物質もしくはハイブリッド抗生物質を得 るのに利用したり、または上記方法に類似した方法で新規な構成物質を産生ずる のに利用できる突然変異酵素［ミューティン（Ｍｕｔｅｉｎ）　］を生産するの に利用することができる。

このように突然変異させたＤＮＡはこの発明の範囲に含まれることは明らかであ ろう。

この発明を以下の実施例によって説明する。

製造例１　フラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４由来で、ニス・クラブリゲル スエクスパンダーゼに相同のＤＮＡのクローン化（ａ）ｐＢＲＯｃ　１３７由来 のニス・クラブリゲルスエクスパンダーゼ遺伝子のｐＨ７０２へのサブクローン 化。

３μ２のｐＢＲＯｃ　１３７ＤＮＡ（欧州特許願公開第０２３３７１５号と第２ （Ｃ）図参照）を、Ｂａ＋ｏＨＩ、　ＰｓＬＩおよびＰｖｕ　Ｉｆの制限酵素で 消化し、得られた断片を、Ｂｇｌｌｌで消化されたｐｌＪ７０２と、１５℃で１ ６時間かけて結合した。１００ナノグラムのＤＮＡに相当する上記結合混合物の 一部をニス・リビダンス６６　（Ｓ、ｌ１ｖｉｄａｎｓ６６）に形質転換した。

形質転換体を、エキスパンダーゼ酵素活性を発現する性能について（欧州特許願 公開第０２３３７１５号の製造例７に記載したのと同様して）選別した。ｐｌＪ ７０２にクローン化された第２（Ｃ）図に示す３キロベースのＢａｍ１ｌｌ　Ｄ ＮＡ断片は、特にＰＢＲＯＣＩ　４１に示す方向にクローン化させると（第３図 参＠）、ニス・リビダンス６６にエキスパンダーゼ活性を与えることができるこ とが見出された。

（ｂ）雑種形成試験 ｐＢＲＯｃ１４１の、ａｌｐで標識したＫｐｎｌ／Ｐｓｔｌ　（２，１キロベー ス）ＤＮＡ断片を、Ｂａａ旧で消化された、セファロスポリン産生フラボバクテ リウム種５Ｃ１２，１５４由来の全細胞ＤＮＡに対するサザーン雑種形成試験に 用いた［シン・ピー・ディら（Ｓｉｎｇｈ、Ｐ、Ｄ、）Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉ ｃｓ、　３５（１０）巻、１３９７〜１３９９頁、１９８２年参照］。雑種を形 成しなかった”ｐｅｗ識ＤＮＡを、７０℃の２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで洗浄 して除去した時、ニス・クラブリゲルスＤＮＡが、フラボバクテリウム種５Ｃ１ ２，１５４の全細胞ＤＮＡの大きさが約６キロベースの断片と雑種形成すること が見出された。

フラボバクテリウムＤＮＡの上記断片をクローン化するために、１００μ９の全 細胞ＤＮＡをＢａｇ旧で完全に消化し、ショ糖勾配法を用いて大きさで分画して ５〜７キロベースの断片を得、次いでイー・コリ　Ｄｌｌｌ内のＰＡＴＩ５３の Ｂａｍ１１１部位にクローン化した［ライブ・エイ・ジェイとシエラット・ディ （Ｔｗｉｇｇ、Ａ、Ｊ、ａｎｄ　５ｈｅｒｒａｔｔ、Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　 ２８３巻、２＋６頁、１９８０年コ。このようにして得たフラボバクテリウｌ一 種５Ｃ１２、１５４ＤＮＡのｐＡＴ＋５３クローンを保有する４００個のイー・ コリＤｌ１１コロニーを、上記の雑種形成緊縮性（ｈｙｂｒｉｄｉｚａＬｉｏｎ 　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を用いて、コロニーと、ｐＢＲＯＣＩ４１ＤＮＡの５ ｆｆＰで標識した断片との雑種形成によって選択した。

２つの雑種形成するコロニーが得られたが、これらは、ｐＡＴ＋５３にクローン 化された、第１（ｂ）図に示すフラボバクテリウムＤＮＡの６．３キロベースの 断片を保有していた。このプラスミドはｐＢＲＣ１４３と命名された。

製造例２　　Ｓ、リビダンス６６内の、ｐＢＲＯｃ１４３のフラボバクテリウム ＤＮＡによる酵素活性の発現 イー・コリＤＨＩ由来のｐＢＲＯｃ１４３のｌＯμ９をＢａ−旧制限酵素で消化 し、Ｂｇｌｎで消化したｐｌＪ７０２　ＤＩＩＡの２μ９と結合し、次いでニス ・リビダンス６６に形質転換した。このようにしてＩ）ＢＲＯＣ１４７とｐＢＲ Ｏｃ１４８　（第４図参照）、すなわち可能な両方向にフラボバクテリウム種５ Ｃ１２，１５４ＤＮＡを保育するｐｌＪ７０２が構築された。

ニス・リビダンス６６二ｐＢＲＯｃ１４７、ニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲ ＯＣ１４８およびニス・リビダンス６６　：　ｐｌＪ７０２を用い、欧州特許願 公開第０２３３７１５号製造例７に記載の方法によって、細胞と粒子とを含有し ない可溶性酵素の製剤を製造した。

（ａ）バイオアッセイによるエキスパンダーゼ酵素活性の証明ニス・リビダンス ６６　：　ｐｎＲＯｃ＋４７とニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲｏＣ】４８は 、環拡張検定システム［ジエンセン・ニス・イーら（Ｊｅｎｓｅｎ、Ｓ、Ｅ、ｅ Ｌ　ａｌ）＾ｎＬ　１ｍ１ｅｒｏｂ、Ａｑ、Ｃｈｅｓ＋ｏｔｈｅｒ、　（２４） ３巻、３０７〜３１２頁、１９８３年に記載されている］に用いて、デアセトキ シセファロスポリンＣシンテターゼの存在を決定した。

イー・コリＥＳＳ／ベニシリナーゼ［ディフコＣＤＩＦＣＯ）ペニシリナーゼ濃 縮物１０’ｕ／ｉ（！］による上記著者らが発表したパイオアフセイシステムを 利用することによって、ニス・リビダンス６６　：　ｐｌＪ７０２とニス・リビ ダンス６６　：　ｐＢＲＯｃ１４８の抽出物は、ペニシリンＮをベニシリナーゼ 耐性抗生物質に変換することができないが、ニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲ Ｏｃ１４７の抽出物は、上記の変換をかなり実施できることが分かった。

（ｂ）高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析法によるエキスパンダーゼ酵 素活　の証明 ニス・リビダンス６６　：　ｐｌＪ７０２、ニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲ Ｏｃ１４７、およびニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲＯＣＩ４８由来の酵素製 剤を、最終体積１．２ｍＱで、環拡張検定システム（ジエンセン・ニス・イーら の前記文献参照）に用いた。

２時間培養後、３０μＱの氷酢酸を撹拌しながら添加し次いで遠心分離（１０， ０ＯＯＧ　、　５分間）して、タンパク質が除去された上澄み液を得た。この液 体を、ＱＡＥ−セファデックスのカラム（体積１ｙＣ）に吸収させた。カラムの 樹脂を２００μぐの水と２００μｇの０．２Ｍ　ＮａＣ１で洗浄した。さらに２ ５ｈ１２の０．２Ｍ　Ｎａｃｌで該樹脂からセファロスポリン類を溶出させた。

これらの精製反応生成物の試料（２０μＱ）を、Ｃｌ１ｌ逆相マイクロボンダバ ツク・カラム（Ｍｉｃｒｏｂｏｎｄａｐａｋ　ｃｏｌｕｓ＋ｍ）　（移動相０、 　ＩＭ　ＮａＨｔＰＯａ、　ｐＨ３，２）を用いるＩＩＰＬＣで分析した。溶出 は２１１！／分で２６ｏｎ−における紫外線検出法によって行った。試料を、セ ファロスポリナーゼによる処理の前後に分析した。

上記の方法によって以下のことが分かった。すなわちニス・リビダンス６６　： 　ｐｌＪ７０２とニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲＯｃ１４Ｂの抽出物は、ペ ニシリンＮをデアセトキシセファロスポリンＣに変換することができなかったが 、ニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲＯｃ１４７の抽出物は、ペニシリンＮを変 換して標品のデアセトキシセファロスポリンＣと同じ保持時間（９，６分）を有 するＨＰＬＣピークを与えた。

（ｃ）イソペニシリンＮエピメラーゼ活性のバイオアッセイとＨ匙息弘粘聚匡吸 ジエンセン・ニス・イーらが開発したイソペニシリンＮエピメラーゼアッセイ［ Ｃａｎｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　２９（１１）巻、１５２６〜１５：（１頁、１ ９８３年コを用いてニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲＯｃ１４７と特にニス・ リビダンス６６　：　ｐＢＲＯｃ１４ｇの、細胞や粒子を含有しない酵素抽出物 がイソペニシリンＮそのものよりもイー・コリＥＳＳに対して少なくとも１０倍 以上の活性を有する化学影態に変換することができることを証明することができ た。ニス・リビダンス６６：ｐｌＪ７０２由来の同様の抽出物ではこのような活 性を証明できなかった。

イー・コリＥＳＳ／ディフコベニシリナーゼ［製造例２（ａ）に記載コの反応生 成物をバイオアッセイに付した結果、ニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲＯｃ１ ４７由来の抽出物が、イソペニシリンＮをペニシリナーゼ耐性抗生物質［製造例 ２（ｂ）に示す精製法とＨＰＬＣによってデアセトキシセファロスポリンＣであ ることが分かった］に変換することができるが、一方エス・リビダンス６６　： 　ｐｌＪ７０２とニス・リビダンス６６　：　ｐＢＲＯｃＩ４８由来の抽出物は 、上記の変換をすることができないことが分かった。

製造例３　クローン化されたｐＢＲＯｃ１４３のフラボノ（クテリウムＤＮＡ中 のイソペニシリンＮシンテターゼの位置決定ｐＨＲＯｃ１４３のフラボバクテリ ウム種ＳＣ１２，１５４ＤＮＡがイソペニシリンＮシンテターゼ遺伝子を保有し ているということを確認するために、サザーン雑種形成法を利用し、ペニシリウ ムイソペニシリンＮシンテターゼ遺伝子で、プラスミドＤＮＡをプローブした。

ペニシリウムイソペニシリンＮシンテターゼ遺伝子ＤＮＡは、デイヴイッド・ス ミスとジジン・エイチ・プル（Ｄａｖｉｄ　Ｓｍ１ｔｈａｎｄ　Ｊｏｈｎ　Ｈ， Ｂｕｌｌ　（英国、ブリストル、ブリストル大学、微生物学部）から入手した。

彼等は、［サムソンら（Ｓａａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ、　３１８ 巻、１９１〜＋９４頁、１９８５年および欧州特許願公開第０２００４２５号に 記載されたものと同様にして、上記のＤＮＡを、セファロスポリウム拳アクレモ ニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕ＋ｓ　ａｅｒｅａｏｎｉｕｍ）のイソペニ シリンＮシンテターゼ遺伝子の２０５〜２６４位のヌクレオチドに相当するオリ ゴヌクレオチドプローブを用いて、ピー・クリソゲナムＣＭ＋　３１４６５２の 遺伝子バンクから、雑種形成法で単離した。

（ａ）フラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４の全細胞ＤＮＡの制限酵素消化物 の、ペニシリウムイソペニシリンＮシンテターゼ遺伝子によるブロービング。

！ＩＰで櫟識したＢａ１ｌｌｌ／Ｘｂａｌで切断した一重鎖ＤＮＡ断片（大きさ が約０．９ｋｂで、ピー・クリソゲナムＣＭ＋　３１４６５２のイソペニシリン Ｎシンテターゼ遺伝子の大部分に相当する）　２５内ｇ　（ＩＯ＠ｄｐｍ／μｇ ）を、Ｂａａｌ旧で消化された、フラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４由来の 全細胞ＤＮＡのＩｕ９によるサザーン雑種杉成試験法に用いた。

ジーン・スクリーン・プラス（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ）雑種形成転 移膜（ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＰｒｏｄｕｃＬｓ社が供給している）に結合 させたフラボバクテリウムＤＮＡを用い、すべての標識したプローブを利用して 、予備雑種形成と雑種形成とを１％ＳＤＳ、ＩＭ塩化ナトリウム、１０％硫酸デ キストランおよび変性サケ精液ＤＮＡ（２００μｖ＃（１）含有混合液中６５℃ で行った。

１６時間培養後、上記の膜を、２．５ｇの２　ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを用い 、６５℃で３時間洗って未結合のプローブを除去した。次いで得られた膜を、増 感紙を用い、−８０℃で１４日゛間Ｘ線フィルムと接触させた。上記フィルムを 現像した結果、大きさがほぼ６〜７ｋｂの、フラボバクテリウムＤＮＡのＢａｇ 旧断片に相当する放射能を示す単一の強いバンドが雑種形成膜上に存在すること が分かった。このバンドはｐＢＲＯＣＩ４３が保有するＢａｇ旧フラフラボバク テリウムＤＮＡ断片きさと非常によく類似している。

（淋市、友引；尿０ ｂ）ペニシリウムイソペニシリンＮシンテターゼ遺伝子による、ｐＢＲＯｃ１４ ３　ＤＮＡのブロービングいくつかの異なる組合わせの制限酵素で消化したｐＢ ＲＯｃ１４３　ＤＮＡの試料を、製造例３λ）の条件と同じ条件を用いるサザー ン雑種形成試験によって、Ｐで標識したペニシリウムイソペニシリンＮシンテタ ーゼ遺伝子ＤＮＡでプローブした。

そのプローブは、ｐＢＲＯｃ＋４３が保有するフラボバクテリウム種５Ｃ１２， １５４ＤＮＡの小さい方のＢａｍＨ１／５ａｃｌＤＮＡ断片（アガロースゲル電 気泳動法で判定された大きさが約１．３ｋｂ）とだけ強く結合した。このプロー ブはｐＢＲＯｃ１４３中の他の部分に結合しなかった。

この発見によって、ペニシリウム・クリソゲナムＣＭ＋　３１４６５２のイソペ ニシリンＮシンテターゼ遺伝子と高度に相同のフラボバクテリウム種５Ｃ１２， １５４ＤＮＡがｐＢＲＯｃＩ４３内に存在することｈ（確認された。

製造例４　フラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４の染色体由来で、ｐＢＲＯＣ １４３内に包含されている前記ＤＮＡの隣に存在するＤＮＡの単離龜）°フラボ バクテリウム種５Ｃ１２，１５４の全細胞ＤＮＡのｐＭＭＢ３３コスミドライブ ラリイの構築 ダラム陰性のニスミドｐ）１ＭＢ３３を、英国、バーミンガム、ノ（−ミンガム 大学、遺伝学部のエフ・シー・エイチ・フランクリン（Ｆ、Ｃ，Ｉｌ、Ｆｒａｎ ｋｌｉｎ）博士から入手した。フラボノ（クテリウム種５Ｃ１２，１５４の全細 胞ＤＮＡのライブラリィを構築するのに用０る上記ニスミドの使用法は、フライ ら（Ｆｒｅｙ　ｅＬ　ａｔ）　（Ｇｅｎｅ、　２４＠、２９９〜３０Ｂ頁、　１ ９８３年）にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｍｓ）の全ＤＮ＾のライブラ リィの構築について詳細に記載されている。

我々は、イー・コリＤｌｌｌ　：　ｐＭＭＢ３３クローンのコロニー１０．Ｇｏ 。

個を得ることができた。またそのクローンの試料は、前記コスミドベクターｐｉ ｉＭＢ３３にクローン化されたフラボｌ（クテリウムＤＮＡの約３５ｋｂのＳａ ｕ　３＾Ｉ断片を保有していることが分かった。

ｂ　）　ｐＢＲＯｃ１４３に包含されているフラボバクテリウムＤＮＡによる、 フラボバクテリウム全細胞ＤＮＡのイー・コリＤＨＩｐＭＭＢ３３コスミドライ ブラリイのブロービング ｐＢＲＯｃ＋４３の６．３ｋｂ　Ｂａｍ１ｌｌ断片２５ｎｇに、英国、アマ−ジ ャムのＡｓｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社が市販しているマルチ プライムキラ）　（Ｍｕｌｔｉｐｒｉ＊ｅ　ｋｉｔ）を用いて、”Ｐ　ｄｃｔｐ 由来のリンで放射能のｍ識を付けた。フラボバクテリウム種５Ｃ１２，１５４の イー・コリＤＩＩＩｐＭＭＢニスミドライブラリイを、米国、ボストン、アルレ ノ（ニイ・ストリート５４９の！ｉＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ 社が供給する８２１１Ｉ１１の雑種形成転移膜ディスクにレプリカプレートした 。転移させたコロニーを溶解し、予備雑種形成し、メーカーのＮＥＮ社力（推奨 する放射性プローブを用いて６５℃で雑種形成させた。

−夜雑種形成させた後、得られた膜を、２　ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを用いて ６５℃で３時間洗浄し、最後に、０．ｌＸ５ＳＣを用Ｌ１て室温で１時間洗浄し た。

得られた膜をＸ線フィルムに２４時間露出した結果、ｐＢＲＯｃＩ４３ＤＮＡが 雑種形成した３７個のコロニーが現れた。

これらのコロニーを保存してあったライブラリィから単離し、それらのニスミド ＤＮＡ含量を試験した。雑種形成しているコロニーの２つだけが欠失のないニス ミドＤＮＡの製剤を与えるということが分かった。これらのニスミド（ｐＢＲＯ ｃ１５５とｐＢＲＯｃ１５６）を制限エンドヌクレアーゼを用いて地図を作成し たところ、これらニスミドは、はとんど同じＤＮＡ片を存するがニスミドｐＭＭ ８３３の場合の反射方向であることが分かった。このＤＮＡの関連部分を第１　 （ａ）図に示す。

製造例５ ニスクラブリゲルス＾ＴＣＣ２７０６４ＤＮＡのライブラリィのｐ）ｌｃ７９へ 二ｌ」 １１０７ｚのｐＨＣ７９ＤＮＡ［ホーン・ビーとコリンズ・ジエイ（ｌｌｏｈｎ 。

Ｂ　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓ　Ｊ、）　Ｇｅｎｅ、　１１巻、２９１〜２９８頁 、１９８０年］を制限酵素５ａｉｌとＢａ霧旧で完全に消化した。別のｌＯμ９ のｐＨｃ７９のＤＮＡをＥｃｏＲＩとＢａ−旧で完全に消化した。所要の゛コス ミドベーム°を単離するために、上記の両方の消化物をショ糖勾配法（１０％〜 ４０％）で分画した。各ニスミドアームの収量は〉５μ？であった。

１００ｕ９のニス・クラブリゲルス＾ＴＣＣ２７０６４の染色体ＤＮＡを５ａｕ ３ＡＩで部分的に消化し、ショ糖勾配法（１０〜４０％）で分画した。

＞　３０ｋｂで＜　５０ｋｂの制限断片を含有する両分をプールし、この大きさ の範囲のＳａｕ　３＾ｌ断片約ｌＯμ２を得た。これらの断片を、ｌ：１：１の モル比でニスミドアームに結合さ仕た（ＤＮ＾濃度２０ｈｇｍｌ−’）。２４時 間後、結合混合物をλファージに生体外でＩくツケーノした（ファージλをパフ ケージする抽出物とプロトコールは＾＋５ｅｒｓｈａ＋＊　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌ　ＰＬＣが供給している）。イー・コリＤ旧をトランスフェクトするこ とによって［ロウ・ビー（Ｌｏｗ、Ｂ、）　ＰＮＡＳ、　６０巻、１６１〜１６ ７頁、１９６８年コｌμｇのパッケージされたＤＮＡ当たり５　Ｘ　１０’のト ランスフェクタントを得た。

ニス・クラブリゲルス＾ＴＣＣ２７０６４ＤＮＡ挿入物を保有するｐＩＩＣ７９ を包含する５０００個のイー・コリＤ旧コロニーをニトロセルロースフィルター 上に固定化し、溶解した。ｐＢＲＯｃ１３７由来でＢａ難旧−Ｋｐｎｌ末端を有 する１、２ｋｂの断片［ヨーロッパ特許願公開第０２３３７１５号の記載どおり にして作製。第２（ｃ）図参照］を単離し、切断修復で標識した。この断片は、 標準コロニー雑種形成法によって前記フィルターをプローブするのに用いた。７ つの雑種を形成するコロニーを得たが、その中の１つ（ｐＢＲＯＣ３７１）が第 ５（ｂ）図に示すＤＮＡセグメントを保有していた。

第５（ｂ）図に示すｐＢＲＯｃ３７１ＤＮＡの゛左方末端°に位置する３、８ｋ ｂのＢａｍＨｌ−Ｂａ＋ａ旧断片を、次に、標準の方法を用いてｐＡＴ＋５３の ＢａＩ＆旧部位にサブクローン化した。得られた構築物をｐＢＲＯｃ３８１と命 名した。

ニス・クラブリゲルス＾ＴＣＣ２７０６４ＤＮＡの挿入物を有するｐＨｃ７９を もった５ｏｏｏｔｔｓのイー・コリＤｌｌ＋コロニーをニトロセルロースのフィ ルターに固定化して溶菌した。ｐＢＲＯｃ３８１由来の３．８ｋｂＢａ＋１ｌｌ ｌ断片を単離し、切断修復で標識した。その標識断片を、標準のコロニー雑種形 成法で前記フィルターをプローブするのに用いた。１１個の雑種形成するコロニ ーを得たが、その内４個が第５図に示すＤＮＡセグメント（Ｃ）を保有していた 。これらのニスミド類の１つのｐＢＲＯｃ４０１の地図作成データによって、こ のＤＮＡが、欧州特許願公開第０２３３７１５号の第１　（ａ）図に開示された ＤＮＡの“左方末端°をこえて約９ｋｂ延出していることが分かった。

ペニシリウム・クリソゲナムＣＭ＋　３１４６５２由来のイソペニシリンＮシン テターゼ遺伝子の０．９ｋｂＸｂａｌ　−Ｂａｍ１ｌｌ断片（製造例３に記載し たとおりのもの）を単離し、”Ｐ−ｄＣＴＰを用いて切断修復で標識した。ニス ・クラブリゲルス＾ＴＣＣ２７０６４を、ＢｃｌｌとＢｇｉｌｌの制限ヌクレア ーゼで消化したものを、アガロースを用いて電気泳動法に付し、ニトロセルロー スフィルターに移転させ、上記の０，９ｋｂの標識断片でプローブした［Ｇｅｎ ｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉ。

ｎ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ　；ホップウッドら（１１ｏｐｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ）が１９８５年にｔｈｅ 　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって出版］。フィルターは 、６８℃で３０分間、２　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、Ｘ線フィ ルムに露出させた。９６時間の露出後、単一のＢｃｌｌ断片（１Ｊｋｂ）と単一 のＢｇｌｎ断片（６，６ｋｂ）がプローブと雑種形成することが観察された。

（ｂ）ニスミドでクローン化されたＤＮＡ第５（ｃ）図に示すＤＮＡセグメント を保有するニスミドｐＢＲＯｃ４０１（製造例７参照）を、Ｂｅ１ｌ制限エンド ヌクレアーゼで消化し、アガロースを用いて電気泳動さ仕、次にニトロセルロー スフィルターに移転させた。そのフィルターを、上記のイソペニシリンＮシンテ ターゼ遺伝子の標識をつけた０、９ｋｂの断片でプローブした。第５（ｃ）図の ＤＮＡ内に含まれている１、８ｋｂのＢｃｌｌ断片が該プローブと雑種形成する ことが観察された。この断片は、該プローブと雑種形成した染色体ＤＮＡのＢｃ ｌｌ断片と同じ大きさでペニシリウム・クリソゲナムはペニシリン類を産生ずる が、セファロスポリン類は産生じない。したがってピー・クリソゲナムがフラボ バクテリウムＭ　５Ｃ１２，１５４と共通してもっている唯一の抗生物質遺伝子 は、イソペニシリンＮを構成するアミノ酸類からのイソペニシリンＮの生合成に 関与する遺伝子である。

ペニシリウム・クリソゲナム　ＮＲＲＬ　１９５１の全染色体ＤＮＡを、ｐＢＲ ＯＣ１５５由来のＤＩｌ＾の断片（第１　（ａ）図参照）でプローブすることに よって、ビー・クリソゲナムＮＲＲＬ　１９５１ＤＮＡと雑種形成する、ｐＢＲ Ｏｃ１５５内のフラボバクテリウムＤＮＡの２つの断片（第１　（ａ）図におい てＴＰＳ／ＶＥとＣＸＩと命名）を決定することができた。フラボバクテリウム のイソペニシリンＮシンテターゼ遺伝子をコードするＤＮＡの、ｐＢＲＯｃ１４ ３とｐＢＲＯｃ１５５内のおおよその位置はすでに同定されているので（製造例 ３　）　、　ｐＢＲＯｃ１５５の他の雑種形成する断片を、ＡＣＶ　トリペプチ ドの生合成に関与する遺伝子として選定することができた。

さらに、ｐＢＲＯＣ１５５ノＤＮＡ断片ＴＰＳ／ＶＥが、抗生物質の生合成に関 与しかつ＾ＣＶシンテターゼ遺伝子であるということは、このＤＮＡが単独で、 ＪＰＮｓ遺伝子が位置する部位に近いニス・クラブリゲルス全細胞Ｄ？Ｉ＾の部 位と雑種形成することから分かった。

λ）ペニシリウム・クリソゲナムＮＲＲＬ　１９５１の全染色体細胞の単離 ４０時間振盪フラスコで培養したピー・クリソゲナムＮＲＲＬ　１９５１の５０ ０１１１１［ハムリン・ビー−ｃ）ら（ｌｌａｍｌｙｎ　Ｐ、　Ｆ、　ｅｔ　ａ ｌ）、Ｅｎｚｙ＋ａｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　３巻、３２１〜３ ２５頁、１９８１年の条件で培養）を、ブッフナー漏斗のモスリン布を通して濾 過して収穫した。　濾過物を水で充分に洗浄し、次いで小容積のＳＳＥ緩衝液（ スペルミジン塩酸４ｍＭ、スペルミン塩酸１　ｍＭ、　ＮａｔＥＤＴ＾１０ｍＭ 、）リス塩基１０ｍＭ、ＫＣＬＯ，１ｍＭをＨＣＩ溶液でｐ）１７．０に調整） で洗浄した。

モスリンについた乾燥した菌糸体をスキーズした後これを、０．５ＸＳＳＥでう すいペーストと混合し、液体窒素で急速凍結し、乳鉢と乳棒で粉砕した。６５℃ で解凍し、ペーストをミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）　（Ｃａｌｂｉｏｃｈ ｅ＋ａ社から供給され、ｌｏｍＭのＥＤＴＡで予め煮沸したもの）で濾過し、０ ．５ＸＳＳＥで洗浄し全容積４０ｘ（ｌのホモジネートとする。濾液を４℃にて ５ｏｏｏｙで２０分間遠心分離し核のベレットを得、これを０．５ＸＳＳＥ、　 ０．２％ノニデットＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ　ＮＰ４０）　（Ｓｉｇｍａ社） の５１１Ｑに、組織粉砕器を用いて再分散させた。

得られた懸濁液を、０．５．ｍ！のｌＯ％ＳＤＳ、　１００μ９７ＭＱのプロテ イナーゼにとともに室温で培養し、前記の核を溶解し、得られた混合物を等容積 の中性フェノール／クロロホルムで除タンパクした。−２０℃のエタノールをＤ ＩＩＡに添加した後、ＤＩＩＡを溶液からガラス棒にまきとり、概略乾燥させて ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。

ｂ　）　ｐＢＲＯｃ１５５ＤＮＡの断片と、ペニシリウム・クリソゲナムＮｌ’ ＩＲＬ　１９５１全染色体ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物との雑種形成 。

２５μ？のｐＢＲＯｃ１５５プラスミドＤＮＡを、Ｂａ１ｌ旧制限エンドヌクレ アーゼで完全に消化し、得られた断片をすべてアガロースゲルの電気泳動法に付 した後単離した。各断片（２５μｇ）に、製造例４ｂ）に記載の方法を用いてｓ ′ｐで放射能の標識を付け、Ｂｇｌｌｌエンドヌクレアーゼ制限醇素で消化され た、ピー・クリソゲナムの全染色体ＤＮＡの試料を、２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤ Ｓ、６４℃の緊縮条件を用いるサザーン雑種形成試験でプローブするのに用いた 。

ＣＸＩ断片（第１図参照）は、ペニシリウム・クリソゲナムＮＲＲＬ　１９５１ 　ＤＮＡの５　ｋｂ　Ｂｇｌ　１１断片と雑種形成した。基準のペニシリウム・ クリソゲナムのイソペニシリンＮシンテーゼＤＮ＾［製造例＆ａ）と同じ］をプ ローブとして用いる同様のサザーン雑種形成実験は、同じサイズの断片との雑種 形成を示した。断片ＴＰＳ／ＶＦ、を構成する２つのＢａａｌｌｌ断片（第１図 参照）は、ペニシリウム・クリソゲナムＮＲＲＬ　１９５１　ＤＮＡの、Ｂｇｌ ＩＩで生成した８、５ｋｂと５ｋｂの断片と雑種形成した。ｐＢＲＯｃ１５５Ｄ Ｎ＾のその外の断片は全く雑種を影成しなかった。

＾Ｃｖシンテターゼに対応すると考えられる交差雑種形成領域がフラボバクテリ ウムニスミドのクローン内の、３．０ｋｂと２．２ｋｂの２つの隣接するＢａ５ ｌｌｌ断片に見出された。これらの断片は、交差雑種成形地図を構築するための プローブとして用いた（製造例ＩＯと第６図参照）。

ｅ　）　ｐＢＲＯｃ１５５の断片ＴＰＳ／ＶＥの、ニス・クラブリゲルス２７０ ６４ＤＮ＾との雑種形成。

製造９ｂ）と同様にして１Ｐで標識したＴＰＳ／ＷＥ断片ＤＮ＾２５ｎｇを、２ 　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ、６５℃の緊縮条件を用い、種々の制限エンドヌク レアーゼで消化したニス・クラブリゲルス２７０６４全細胞ＤＮＡに対するサザ ーン雑種形成試嗟のプローブとして用いた。

ＴＰＳ／ＷＥ断片が、ニス・クラブリゲルスの１つもしくは２つの断片としか雑 種形成しないことが観察された。

ｐＢＲＯｃ３７ｔとｐＢＲＯｃ４０１の制限エンドヌクレアーゼ消化断片（製造 例６と７参照）を、（２Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ、　６５℃の緊縮条件を用い て）３″Ｐで標識したＴＰＳ／ＶＥ断片ＤＮＡでプローブした所、ｐＢＲＯＣ３ ７１の°左方゛末端とｐＢＲＯｃ４０１の゛右方°末端の断片だけが雑種を形成 した。上記のしかたでさらにサザーン雑種形成を行わＵることによって、ＴＩ’ Ｓ／ＭＥ　ＤＮＡが雑種形成するＤＮＡの部分［第５ｄ）図に示す］が画きださ れた。

製造例１Ｏ−１６ （ａ）■ ビー・クリソゲナム ＣＭＩ　３１４６５２は、オリゴマイシン耐性でニコチンアミド要求性の菌株で 、ブダペスト条約の規程に基づいてＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　Ｍｙｅｏｌｏｇ ｉｃａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅに寄託した。１９８７年４月１６日付けで寄託し た。

ＣＩＪ＋　３１７７３４は、ニコチンアミド要求性野生型ビー・クリソゲナムで あり、１９８７年７月２２日にＣｏ＋ａｍｏｎｗｅａｌＬｈ　Ｍｙｃｏｌｏｇｉ ｃａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕＬｅに寄託した。

エシェリキア・コリ ＤＨＩ　：　ｒｅｃＡ、　ｐａｌＡ、　ｈｓｒ、　ｈｓ＊＋、　ｅｎｄｏｌＢ、 　ｒｅｌ＾１；ＤＨ５α：Ｆ−、ｅｎｄＡＩ　、ｈｓｄＲ１７，（ｒｋ−、ｓｋ ＋）　、　５ｕｐＥ４４．ｔｈｉ−１、−。

ｒｅｅＡ　１　、　ｇｙｒＡ９６．φ８０ｄｌａｃｚ　ｍ１５゜菌株は、ハナハ ン（Ｈａｎａｈａｎ　）の方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　１６６巻、５５７ 　ｍ５８０頁、１９８３年）にしたがって形質転換した。ＮＣＩＢ　１２５９１ 　：第６ｂ図に示す遺伝子クラスターを含有するニスミドｐＣＸ３．２をもって いる。

エイ・ニデユランス ＮＰＡ５　：　ｐｙｒ　Ｇ＋８９．　ｐｙｒｏ＾４　、　ｆｖＡＩ　、　ｎｐｅ Ａ　００２２゜（ｂ）ＤＮＡの単離と処理 ピー・クリソゲナムからの全ＤＮＡ抽出は、バランスら（Ｂａｌｌａｎｃｅ　ｅ ｔ　ａｔ）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＠ｎｕｎ 、、１１２巻、２８４〜２８９頁、１９８３年に記載されているのと同様に行っ た。小規模のプラスミドの単離、制限醇素による消化、連結、サザーン分析およ びイー・コリのコロニーの雑種形成を含むＤＮＡ処理の標準法を用いた［マニア ナイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）　、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ ｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａ−Ｌｏｒｙ、米国、ニューヨーク、１９８２年コ、 　ＤＮＡ断片は、メーカーの指示にしたがって、シーンクリーンキット（Ｇｅｎ ｅｃｌｅａｎ　Ｋｉｔ）（ＢＩｏ　１０１１ＮＣ，米国、カリフォリニア州、う ・ジョラ）を用いてアガロースゲルで精製した。

６跣ｑ箱、ｙＫ影で＃０ 遺伝子ライブラリーを構築するために、ピー・クリソゲナムＣＭ＋　３１４６５ ２由来の全ＤＮＡを部分的に制限酵素Ｓａｕ　３ＡＩで消化し、分離用アガロー スゲルでサイズ分画して３５〜４０ｋｂの断片を得た。これらの断片を、エイ・ ニデユランスのクローン化ベクターｐＣＡＰ２のＢａ１Ｉ旧部位に連結した。組 換え体分子を、生体外でラムダ粒子にパッケージし、イー・コリＤ旧をアンピシ リン耐性にトランスフェクトするのに用いた。

（Ｃ）　　エイ・ニデユランスの形　転換エイ・ニデユランスの形質転換を、バ ランスとターナ−（Ｂａｌｌａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｕｒｎｅｒ）（Ｇｅｎｅ、３ ６巻、３２１〜３３１頁、１９８５年）に記載されているのと同様にして実施し た。

（ｄ）ペニシリンのバイオアッセイ 検定すべき菌株を、プラスチック製の組織培養皿のウェルに入れた２ｘＱのＦＭ 培地［ホルトとマクドナルド（Ｈａｌｔ　ａｎｄ　Ｍａｅ−ｄｏｎａｌｄ）、Ａ ｎｔｏｎｉｅ　Ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、３４巻、４０９−４１６頁、 １９６８年］に接種した。２５度で５日間静置培養を行った後、そのブロス１０ ０μｇを、バランス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子 （１００ｘＱ当り、２ＸＩＯ”胞子数／ｘＱのＩｆｆ（りと、１００ｍ（当り、 ２％２゜３．５−トリフェニルテトラゾリウム　クロリド（ＴＴＣ）の０．５ｘ （１とを接種した普通寒天プレートのウェルに入れた。そのプレートを３０℃で 一夜培養した。

製造例！０ 図の構築 製造例９（ｂ）で得た３、ＯｋｂのフラボバクテリウムＢａ１ｌ旧断片をプロー ブとして用いて、上記のようにして作製したピー・クリソゲナムＣＭ＋　３１４ ６５２コスミド遺伝子ライブラリイの５０００１のコロニーを選別した。５つの 正に雑種形成するコロニーを得た。

これらコロニーを制限酵素で消化した結果、これらコロニーの内４つは同一で、 第５番目のものは、その配列のがなりの部分が、これら４つのコロニーと共通の ものであった。これらのクローンの１つであるｐＧＸ３．２を採取し、分析した 。このクローンは、コスミドベクターｐＣＡＰ２内に約３８ｋｂのピー・クリソ ゲナムＤＮＡを含有している。ピー・クリソゲナムＩＰＮＳ遺伝子で、ｐＧＸ３ ．２の制限酵素消化物のサザーンプロットをプローブすることによって、ＪＰＮ ｓ遺伝子がこのニスミド内に存在することが分かった。またそのプロットをフラ ボバクテリウムの３．ＯｋｂのＢａ＠旧断片でプローブしたが、この断片は、単 一の５．５ｋｂのＸｈｏ　１バンドと単一の８．ＯｋｂのＥｃｏＲｌバンドと雑 種形成した。これらの断片は、ｐＵｃ１９Ｌ：サブクローン化し、それぞれｐＧ ＸｓｌｌとＰＧＸＥＩを与える。

制限地図を、これらの両サブクローンとその外のサブクローンについて構築して 第６（ｂ）図に示す。ｐＧＸ−Ｃ１は、プラスミドｐＵｃ９にクローン化された ピー・クリソゲナムＩＰＮＳ遺伝子と重なり合っているが、その構築物はｐＣＹ Ｘ４と命名されている。

ニスミドクローンｐＣＸ３．２は、ＡＣＶ遺伝子とＩＰＮｓ遺伝子をもっている だけでなく、さらにピー・クリソゲナムのアシルトランスフェラーゼをもってい る。ＡＣＴ遣°伝子は、サブクローンｐＧＸＢ２０内に位置しているが［第６（ ｂ）図参照］、このことは、この領域に関連するＲＮＡの転写を示す我々自身の 実験で指摘され、次いで１９８８年ＩＯ月２日〜７日に米国、インゲイアナ州ブ ルーミントンで開催された、工業用微生物の遺伝学と分子生物学に関する米国微 生物学会第４回大会において、ニー・イー・ビイーンストラ（＾、）：、　ｖ６ ｅｎｓｔｒａ）が開示したピー・クリソゲナムのＡＣＴ遺伝子の位置についての 報告で確認されたものである。

第６図（ｂ）に示すＰＣＸ３．２のサブクローン類の制限消化物のサザーンプロ ットを、製造例９（ｂ）で得た３、０ｋｂと２．２ｋｂのフラボバクテリウムＤ ＮＡ断片でプローブした。その３．Ｏｋｂの断片が、第６（ｂ）図中にＧＸＩと いう印をつけた３、５ｋｂのＸｈｏｌ−５ａｉｌ断片と雑種形成した。２．２ｋ ｂノ断片は、ＧＸＩ領域（７）Ｘｈｏｌ−Ｐｓｔ断片と、ＧＸ２とＧＸ３という 印が付けられた２つの別の領域と雑種形成した。

したがって、フラボバクテリウムの遺伝子クラスターとピー・クリソゲナムのク ラスター間に３つの明確な相同領域があることは明らかである。

−・クリソゲナムとエイ・ニデユランス間の交差雑種形成地図の構築 コスミドベクターｐＣＡＰＺ内に構築された全エイ・ニデユランスＤＮＡのニス ミドライブラリイを、ＧＸＩとＧＸ３のＤＮＡ領域を存するｐＧＸｓＩｌのＩ’ ５Ｌ１−３ａｌｌ断片（第６図参照）でプローブした。

正の雑種形成をおこなうクローンが同定された。このようにして単離された１つ のニスミドクローンをＰＮＧＸＩと命名し、さらに、ピー・クリソゲナムのニス ミドクローンｐＣＸ３．２のＧＸＩ％ＧＸ２およびＧＸ３の領域を含む別のプロ ーブを用いて地図を作製した。

得られた交差雑種形成地図を第７図に示す。相同領域がピー・クリソゲナム中の その領域とほぼ同じ距離で延びており、がっＧＸＩ、ＧＸ２およびＧＸ３は、こ れらが連結しているＩＰＮ遺伝子の転写にたいして同じ順に位置している。

製造例！２ 単一もしくは複数のピー・クリソゲナムＡＣＶシンテターゼ遺伝子に相同の配列 がセファロスポリウム・アクレモニウム中に存在していることの例証 セファロスポリウム・アクレモニウムは、セファロスポリン類のβ−ラクタム抗 生物質を産生ずるので、生合成経路の最初の部分の遺伝子を、ペニシリンを産生 ずるピー・クリソゲナムと共通してもっている。これらはＡＣＶシンテターゼ遺 伝子とＪＰＮｓ遺伝子である。配列分析の結果、７４％の相同性が、シー・アク レモニウムとピー・クリソゲナムのＩＰＮＳ遺伝子間にヌクレオチドレベルで存 在していることが分かった（カールら、Ｇｅｎｅ。

４８巻、２５７−２６６頁）。同じレベルの相同性がＡＣＶシンテターゼ遺伝子 間に存在するが、このことから、上記のようにして単離されたピー・クリソゲナ ムのＡＣＶシンテターゼ遺伝子を、プローブとして用いて、シー・アクレモニウ ムから同等の遺伝子を単離することができるであろう。このことを例証するため に、下記の実験を行った。

プラスミドＰＧＸＥＩ、すなわちビー・クリソゲナムのＧＸＩ、ＧＸ２およびＧ Ｘ３　（ＡＣＶシンテターゼ）の領域を保有するｐＣＸ３．２のサブクローン（ 第６ｂｌｉＵ）を、Ｓ′ｐで標識して、シー・アクレモニウムＡＴＣＣ１１５５ ０から作製した、全ＤＮＡのＢｓ■旧消色消化物ザーンプロットに対するプロー ブとして使用した。緊縮条件は、２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳおよび５５℃であ った。はぼ３．２ｋｂと５．１ｋｂの２つの雑種形成バンドを得た。β−ラクタ ム化合物を産生じない近縁のフィラメント状の真菌類のニス・クラッサＮＣＰ４ とエイ・ニガーＡＢ４．１由来の全ＤＮＡのＢａ鵬旧消化物のサザンプロットを ＰＧＸＥＪでプローブしたが、雑種形成の同じ緊縮条件下で、雑種形成バンドは 全く検出されなかった。

製造例■３ エイ・ニデユランスのペニシリン非産生変異のｐＣＸ３．２による修徽 ＰＣＸ３．２中に存在するＤＮＡ　［第６（ｂ）図］がＡＣＶ　）リベプチドの 合成に関与しているという証拠は、そのクラスターをエイ・ニデユランス中のペ ニシリン非産生変異を修復するのに利用できるということで提供された。

ｐＣＸ３．２を用いて、ペニシリン生合成経路に関与する遺伝子に変異を有する エイ・ニデユランス菌株を直接形質転換した。問題の菌株ＮＰ＾５は、ＡＣＶ合 成の段階で阻止されている（　ｎｐｅＡ００２２）　［？−キンスら（Ｍａｋｉ ｎｓ　ｅｔ　ａｔ）、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２２巻、３３９−３ ４３頁、１９８１年］。

ＮＰＡ５の形質転換体のペニシリン産生性能を検定してみると、ｐＰＣＹ７（エ イ・ニデユランスを形質転換しかっビー・クリソゲナムＩＮＦＳ遺伝子を保有で きるプラスミド）で形質転換した場合、負であったが、試験した５つのｐＣＸ３ ．２形質転換体の内３つは正のペニシリン産生性を示した。これら形質転換体は 、バイオアッセイプレート上ｌ二野生型よりは少し小さいかないしは非産生の対 照品よりはわずかに大きい阻害領域を生成する。その領域はベニシリナーゼ感受 性である。ｐＣＸ３．２で得られる形質転換体内の上記領域のサイズが変動する 理由は明らかでないが、ビー・クリソゲナムＤＮＡを含有するエイ・ニデユラン ス形質転換体は、成長速度が減少している時は、異種ＤＮＡの存在に影響される ということが原因かもしれない。この状態では、これら形質転換体は、野生型レ ベルのペニシリンを産生できない。

これらの結果は、ビー・クリソゲナムから単離された遺伝子クラスターは、ＡＣ Ｖのベニンリン産生の合成が阻止されているエイ・ニデユランス菌株の性能を回 復できるということを示しｐＣＣ２０２とｐ３ＳＲ２とで共形質転換された、ビ ー・クリソゲナムＣＭ＋３１７７３４の形質転換体の、高レベルのＡＣＶシンテ ターゼの酵素活性の例証 ビー・クリソゲナムＣＭ１３１７７３４の酵素製剤と、ｐＣＸ３．２もしくはｐ ３ＳＲ２で共形質転換された前記菌株の形質転換体由来の酵素製剤とを、ＡＣＶ シンテターゼ活性のレベルを測定するのに用いた。

ビー・クリソゲナムＣＭ＋　３１７７３４とその形質転換体を、３５ｙ／（１の コーン・ステイープ・リカー（ｃｏｒｎ　５ｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ）、１５ｙ ／＆のグルコース、５ｙ／ＱのＣａＣＯ５および８９／Ｑの菜種油からなりｐｌ ｉｓ、９の２０１１２１７１種培地の入った２５０ｘｐ振ｍフラスコに１０’胞 子／ＭＱを接種するのに用いた。振盪フラスコを２日間２５℃、２５０ｒｐｍテ 培養し、８５９／（！のラクトース、３５９＃！のコーン・ステイープ・リカー 、６ｙ／Ｑのフェノキシ酢酸、ｌｏｇ／ＱのＣａＣ０，ｌ、　Ｇ　Ｗ／ｅの菜種 油ｐＨ６，０（１０％交差）を含有する液２０ｘＱが入っている最終段階の振盪 フラスコＺこ接種するのに用いた。

次に最終段階の振盪フラスコを、収穫前に類似の条件で、１〜２日間成長させた 。

収穫するために、２〜３個の振盪フラスコの内容物を集め、５．５ｃ園のＧＦ／ Ａディスクで濾過し、２００ｍ１２の水冷した等張食塩水で洗浄した。次いで菌 糸体のパッドを１２ｘＱの抽出緩衝液［０，１Ｍ−ＭｏＰＳ、ｐｉ（７，５，５ ０ｍＭ−ＫＣＩ　、　２０ｍＭ−ＥＤＴＡ、　３０＋１Ｍ−２メルカプトエタノ ール、５０％のグリセロール（Ｖ／Ｖ）］に浸漬し、動力設定６のウルトラソニ ックスＷ　−３８５型超音波処理器の１７２インチのホーンで２０秒間づつ４バ ースト超音波処理を行った。超音波処理をした抽出物を４０．０００９で２０分 間遠心分離し、２村の上澄み液を、グリセロール含量が２０％（Ｖ／Ｖ）である こと以外は抽出緩衝液と同じＩ！衝液で予め平衡化したＰＤ−１０セフアデツク ス（登録商標）カラムで脱塩した。タンパク質を含有する両分を集めて、検定に 用いた。

ＡＣＶシンテターゼの検定は、ジエンセンら（Ｊｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）の方 法（ＦＥＩｔＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔｓ、４９巻、２１３−２１８頁 、１９８８年）と、バンクとデマイン（Ｉｌａｎｋｏ　ａｎｄ　Ｄｅａａｉｎ） の方法（Ｊ、＾−，Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。

１０９巻、２８５Ｂ−２８６０頁、１９８８年）に基づいて行った。

培養混合物は、プロテアーゼ阻害剤のアプロチニンをｌｘｇ／峠含有しているこ とを除いてバンクとデマインが記載しているのと同じものであった。培養時間は 、１２０〜２４０分間の転回で変えた。対照品として培養混合物をゼロ時間で培 養をやめてクロマトグラフィに付した。

チオライト　Ｍ　Ｂ　（Ｔｈｉｏｌｙｔｅ　ＭＢ、登録商標）を用いる被覆法（ ｍｅｔｈｏｄ　ｏｒ　ｄｅｒｉｖａｔｊｓａｔｊｏｎ）、ＩＩＰＬＣによる分離 法および蛍光定量法による検出法は、シェラセンらが報告しているのと同様であ るが以下のように変更した。酢酸ナトリウム溶＃緩衝液のＰＨは４．４に低下さ せた。溶出の最初の５分間は同一溶離剤の９０：１０（Ｖ／Ｖ）の酢酸ナトリウ ム：メタノールで行った。５分〜３５分の間は、酢酸ナトリウム：メタノールが ９０　：　１０から５５：４５へと変化する直線勾配を採用した。

ＡＣＶの溶出は（基準液に０．５ｄ−ジチオトレイトールが含有されているため に還元された単量体の形態である）、２９．５分の保持時間で観察された。０． １ナノモルＡＣＶの感度が達成された。

ｐｃＸ３．２テ形質転換されりＣＭｌ　３１７７３４（７）形質転換体ニハ、ｐ ＣＸ３．２に存在するペニシリウム・クリソゲナムＤＮＡの配列を欠いたｐ３ｓ Ｒ２で形質転換されたＣ１１ｌ　３１７７３４に比べて著しく高レベルのＡＣＶ シンテターゼが一貫して検出された。

このようにＰＣＸ３．２に入っているピー・クリソゲナムＤＮＡのほぼ３８ｋｂ の挿入物が、ＡＣＶシンテターゼの酵素活性のレベルに直接影響する単一もしく は複数の遺伝子を保育しているということを示すことができた。

製造例１５ ｐＰＥＮ３で形質転換されたピー・クリソゲナムＣ輩１３１７７３４の形質ｐＣ Ｘ３．２ノように、ＧＸｌ、ＧＸ２およびＧＸ３（７）配列（フラホハクテリウ ム種のＡＣＶシンテターゼ遺伝子と相同の領域）を有するが、Ｉ　ＰＮＳ遺伝子 とＡＣＴ遺伝子を欠いたプラスミドベクターｐＰＥＮ３を構築した。この構築は 、ｐＧＸＥ１由来のＥｃｏＲＩ断片をｐ３ＳＲ２にサブクローン化することによ って行った。次いでこのベクターを用いてＣＭＩ　３１７７３４を形質転換し、 形質転換体をＡＣＶシンテターゼ活性について検定した。抽出法と酵素検定法は 製造例１４に記載したのと同じである。

の形質転換体には、Ｃ１１ｌ　３１７７３４と、ｐ３ＳＲ２だけで形質転換され ゛たＣＭＩ　３１７７３４の形質転換体と比べて高いレベルのＡＣＶシンテター ゼが測定された。

このようにして、　ｐＰＥＮ３に含まれているピー・クリソゲナムＤＮＡの８． Ｏｋｂ挿入物は、ＡＣＶシンテクーゼのレベルに直接影響する単一もしくは複数 の遺伝子を保有していることを例証することができた。

ピー・クリソゲナムＡＣＶンンテターゼ遺伝子の不均一な　現エヌ・クラップと エイ・ニガーは、検出可能なβ−ラクタム化合物を全く産生せず、またピー・ク リソゲナムの、ＡＣＶシンテターゼ、イソペニシリンＮシンテターゼ（ＪＰＮｓ ）もしくはアシルトランスフェラーゼ（八ＣＴ）の遺伝子に著しく相同性のＤＮ Ａ配列を全くもっていない。これらの遺伝子が他のβ−ラクタム化合物産生体と 高い相同性を有するごとが知られているならば［ウェイゲルら（Ｗｅｉｇｅｌ　 ｅｔ　ａｌ）、Ｊ、ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＳ１７００゜３８１７−３８２６ 頁、１９８８年コ、これらの真菌類はペニシリン生合成酵素をコードする遺伝子 をもっていないと考えられる。

エヌ・クラップとエイ・ニガー内でのピー・クリソゲナムＡＣＶンンテターゼ遺 伝子の発現を利用して、ニスミドクローンｐＣＸ３．２内でのペニシリン生合成 に必須の上記の遺伝子とその外のすべての遺伝子の存在を例証した［製造例１Ｏ と第６（ｂ）図参照コ。

ａ）エヌ・クラップのｐＣＸ３．２による形質転換エヌ・クラップのｐｙｒ−４ 遺伝子を有するｐＣＸ３．２を用い、ポルマーとヤノフスキイ（Ｖｏｌｌｍｅｒ 　ａｎｄ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ）の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ４．８３巻、４１１１６９−４８７３頁、１９８６年）によって 、エヌ・クラップＮＣＰ４すなわちｐｙｒ−４栄養要求体を原栄養体に形質転換 した。

形質転換体を選択培地で画線培養することによって３回精製し、胞子を５０ｘｆ ｆのＦＭ改良培地に接種するのに使用した。振盪しながら３０℃で３日間培養し た後、その醗酵ブロス１５０μＱを標準法を用いてバイオアッセイに付した。試 験した２０個の形質転換体の内４個が、バシラス・サチリスに対する抗生作用領 域を生成したが、これらの領域はベニシリナーゼ感受性であった。

親菌株のＮＣＰ４はこのような領域を全く生成しなかった。

２つの形質転換体のＰＣＸ　１とＰＣＸ５と、親菌株ＮＣＰ４を、さらに、バシ ラス・キャリドラクチイスＣ９５３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｅａｌｉｄｏｌａｃｔ ｉｓＣ９５３）に対する抗生物質の産生について、バイオアッセイ（トリプトン 大豆寒天中０．５Ｘ　１Ｇ’胞子／ｍｌの濃度で一夜４６℃で培養）によって試 験した。ＩＯｎｇ＝１μｇ／ｚｃの基準を含めたが常に直線関係が観察された。

試験結果は、ＰＣＸ　Ｉがペニシリンを１７０ｎｇ／ｉ（！の濃度まで産生し、 ＰＣＸ５がペニシリンを６４ｎｇ／ｚｇの濃度まで産生ずることを示した。ＮＣ Ｐ４には、同条件下でペニシリンは全く検出されなかった。

産生されたペニシリンＶは、シャーら（Ｓｈａｈ　ｅｔ　ｓ＋）がＡｎａｌｙｓ Ｌ。

１１３巻、１１９７−１２００頁、１９８８年に発表したのと同様にして１−ヒ ドロキシベンゾトリアゾールで被覆した後、ＨＰＬＣで証明された。

３種の酵素の、ＡＣＶシンテターゼ、ＪＰＮシンテターゼおよびアシルトランス フェラーゼをこれらの３つの培養物中に検定した。

３つの培養物をすべて、１０’胞子／ｊ１１２の濃度で最終段階の培地（製造例 １４参照）に直接接種し、３０℃にて２６０ｒｐｍで２４〜４８時間培養した。

ＡＣＶシンテターゼとアシルトランスフェラーゼについての抽出法は、製造例！ ４に記載したのと類似の方法であった。ＪＰＮシンテターゼについての抽出法は 、抽出緩衝液が３０−輩−トリスＨＣＩ　ｐＨ８，０、Ｏ，ＩｍＭ−Ｄ丁丁およ びｆ、ｏｓＭフエニルメチルスルホニルフルオリドで構成され、ＰＤ−１０カラ ムがこの緩衝液で予め平衡化されることを除いて同様である。

ＡＣＶシンテターゼの培養条件は製造例１４に記載したとおりである。アシルト ランスフェラーゼの培養条件は、ルエンゴら（Ｌｕｅｎｇｏ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ 、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ＸＸＸ＠、ＩＸ号、１５６５−１５７３頁、１９８ ６年に記載されたのと同じである。培養は１２０分間行った。生成したペニシリ ンは、ペニシリンＧを基準品として用いたことを除いて上記したのと同様にして 、バイオアッセイによって、バシラス・キャリドラクチスに対して測定した。Ｊ ＰＮシンテターゼの培養条件は、ラモスら（Ｒａｍｏｓら）ＡｎＬｉ、Ｍｉｃｒ ｏｂ、Ａｇｅｎｔｓ。

ＣｈｅｍｏＬｈｅｒ、　２７巻、３８０−３８７頁、１９８５年に記載されてい るのと同じである。培養は１２０分間行った。生成したＪＰＮは、０．１〜１０ μｇ／ｌの濃度のＩＰＮを基準に用いること意外は、上記と同様にして、バイオ アッセイによって、バシラス・キャリドラクチスに対して測定した。

得られた測定値を第１表に示す。３種の全酵素がＰＣＸＩとＰＣＸ５の両方に検 出されたが対照品には検出されないかまたはごく低レベルしか存在していなかっ た。

１１表 ｐｃＸ３．２で形質転換されたニューロスポーラ・クラップＮＣＰ４の形菌ｈ　 　　ＡＣＶシンテターゼ　　ＪＰＮシンテターゼ寧　　　アシルトランスフェラ ーゼ本ＰＣＸＩ　　　　　　＋　　　　　　　　　　２０　　　　　　　　　　 　　　３８９ＰＣＸ５　　　　　　＋　　　　　　　　　　３９　　　　　　　 　　　　　　３６４ＮＣＰ４　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　０．５（対照） Ｘ　ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質 ＰＣＸＩ、　ＰＧＩ１および１ｌｃＰ４のサザーンプロット分析の結果から、Ｐ ＣＸＩとＰＧＩ１が、ＡＣＶシ７テターゼ、ＩＰＮＳおよびＡＣＴノ遺伝子を有 する領域をもつ完全なＰＧＩ３．２のＤＮＡをもっていることが分かった。ＮＣ Ｐ４は、ＰＧＩ３．２に含まれているピー・クリソゲナムＤＮＡとは全く相同で なかった。

上記の結果は、ＰＧＩ３．２が、第一級アミノ酸からペニシリンを生合成するの に必要なすべての遺伝子を有し、それ故、公知のｌ　ＰＮＳとＡＣＴの遺伝子の みならず＾Ｃｖシンテターゼ遺伝子を包含しているにちがいないということを例 証している。またＰＧＩ３．２はその外の必要な未確認の遺伝子と調節遺伝子を 保有していてもよい。

ｂ）エイ・ニガーのＰＧＩ３．２による形質転換エイ・ニガーＡＢ４．１すなわ ちｐｙｒＧ栄養素要求体を、エルトンら（Ｙｅｌｔｏｎ　ｅＬ　ａｌ）Ｐｒｏｃ 、１ｉｓｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｊ１＠、１４７０−１４７４頁、１９８４年の 方法を用いて、ＰＧＩ３．２で形質転換した。得られた形質転換体を精製し、上 記したのと同様にしてペニシリン産生量についてバイオアッセイを行った。試験 を行った４つの形質転換体のうち３つが、ピー・サチリスに対する抗生作用領域 を生成した。この領域はベニシリナーゼで処理すると著しく減少するが、親菌株 はごく小さなペニシリナーゼ耐性領域を与えただけである。

３つの形質転換体ＡＮ３３、ＡＮ３４およびＡＮ３６と、親菌株のＡＢ４．１と を、製造例１６（ａ）に記載したのと同様にして、バシルス・キャリドラクチイ スＣ９５３に対する抗生物質の生産を、バイオアッセイで、試験した。試験結果 は、ＡＮ３３．ＡＮ３４およびＡＮ３６がそれぞれ１．３．０．８および２．３ Ｂｇ／ｘＱの濃度でペニシリンを産生じたことを示した。ＡＢ４．Ｉには、類似 の条件下でペニシリンは全く検出されなかった。産生されたペニシリンＶは、シ ャーらの文献１１３巻、１１９７−１２００頁１９８８年に記載のとおりにして ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾールで被覆した後ＨＰＬＣで証明された。

前記の４つの培養物中の、３つの酵素、すなわち＾Ｃｖシンテターゼ、ｌ　ＰＮ ＳおよびＡＣＴを、製造例！６（ｓ）に記載したものと類似の方法で検定した。

測定値を第２表に示す。ＡＣＶシンテターゼの活性は、検出された＾Ｃｖを定量 することが難しいので正と負だけで示しである。

３つの形質転換体はすべて酵素活性を有していたが八Ｂ４，１はもっていなかっ た。ＩＰＮシンテターゼ活性も３つの形質転換体に見出されたが八Ｂ４．１には 見出されなかった。アシルトランスフェラーゼ活性は、ＡＢ４．ｌに小レベルで 検出されたが、３つの形質転換体全部については著しく大きかった。

第２表 ＰＧＩ３．２で形質転換されたアスペルギルス・ニガーＡＢ４．１の形質転換体 の酵素活性 菌ＦＪｐ　　　ＡＣＶシンテターゼ　　ＪＰＮシンテターゼ享　　　アシルトラ ンスフェラーゼ本ＡＮ３３　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　２８ＡＮ３４　　　　　　＋　　　　　　　　　　　３．０　 　　　　　　　　　　１６ＡＮ３Ｂ　　　　　　＋　　　　　　　　　　１４． ５　　　　　　　　　　　１８ＡＢ４．１　　　− （対照） 本　ｎｍｏｌ／分／ｘｙタンパク質 ２つの形質転換体＾Ｎ３３とＡＮ３４由来の全ＤＮＡのサザーンプロット分析結 果は、これらのＤＮＡが完全なＰＧＩ３．２ＤＮＡを含有し、一方親菌株は、Ｐ ＧＩ３．２に含まれているピー・クリソゲナムＤＮＡと全く相同性でないことを 示した。ＡＮ３６については試験しなかった。

上記の結果によって、ＰＧＩ３．２が、第一級アミノ酸からペニシリンを生合成 するのに必要なすべての遺伝子を保有し、それ故、公知のＩＰＮＳとＡＣＴの遺 伝子のみな・らず＾Ｃ■シンテターゼ遺伝子を保有しているに違いないことが例 証された。またＰＧＩ３．２はその外の必要な未確認遺伝子と調節遺伝子を含有 していてもよい。

（以下余白） 【ｒ　　　　　　− □　ρＩＪ　７０２０ＮＡ ＝ｚｚｚＩス・’７ラグ’）ｊ”ｚＬス［１ＮＡｐｌＪ　７０２　［ＩＮＡ ’２２ＺＥｌ　７ラガ：”／ｒ’）ｆ’）ラムＳＣ１２，１５１，ＤＮＡ１；上 吉己の７う広゛ノ＼゛クチ９ウムｒ：ｗ４プゾの方匈ｒ：　４１．；万ＬＴＬ） ６人Ｃ−１＋Ｉ　　　　　　　　　ＣＦ　　　　　　　　　　　ｂ国際調査報告 −一瞥−ｓ１暑ｉｉ−−１１４１１１Ｍ−１−１１１−−１ｌ４１１１／ＧＥミ εε１０）Ｏε：ミ国際調査報告 ＧＰ８ε０１０ε３

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．ＡＣＶシンテターゼをコードする遺伝子からなるＤＮＡ。
2. ２．ペニシリウム、アスペルギルス、フラボバクテリウムまたはストレプトマイ セス属に属する種から得られるＡＣＶシンテターゼをコードする遺伝子からなる 請求項１記載のＤＮＡ。
3. ３．ピー・クリソゲナムから得られる請求項２記載のＤＮＡ。
4. ４．さらに、イソペニシリンＮシンテターゼをコードする遺伝子からなる請求項 １〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡ。
5. ５．さらに、アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる請求項１〜 ４のいずれか１つに記載のＤＮＡ。
6. ６．真菌類の宿主内でペニシリンを産生する全生合成遺伝子クラスターを保有す る請求項１〜５のいずれかひとつに記載のＤＮＡ。
7. ７．請求項１〜６のいずれか１つに記載のＤＮＡからなる組換え体ベクター。
8. ８．高発現ベクターである請求項７記載のベクター。
9. ９．ｐＣＸ３．２と命名された請求項７記載のベクター。
10. １０．請求項７〜９のいずれか１つに記載のベクターで形質転換された宿主。
11. １１．真菌類の宿主である請求項１０記載の宿主。
12. １２．天然ではペニシリン非産生体である真菌類宿主内でペニシリンを産生させ る方法であって、下記段階：（ａ）請求項６に記載のＤＮＡを単離し、（ｂ）前 記ＤＮＡをベクターに挿入して組換え体ベクターを形成し、 （ｃ）前記宿主を上記組換え体ベクターで形質転換し、ついで（ｄ）上記の形質 転換された宿主を適切な条件下で培養してペニシリンを産生させる ことからなる方法。
13. １３．紺換え体ベクターがｐＣＸ３．２である請求項１２記載の方法。
14. １４．天然でペニシリン産生体である宿主細胞、またはＡＣＶ合成の段階で阻止 された前記宿主の非産生性突然変異体からペニシリンを産生させる方法であって 、下記段階：（ａ）前記宿主、またはその非産生性突然変異体を、請求項７〜９ のいずれか１つに記載のベクターで形質転換し、ついで（ｂ）このようにして形 成された形質転換体を、適切な条件下で培養し、ペニシリンを産生させる ことからなる方法。
15. １５．宿主がピー・クリソゲナムである請求項１４記載の方法。
16. １６．ペニシリンＧまたはペニシリンＶを産生する請求項１２〜１５のいずれか ひとつに記載の方法。
17. １７．菌株　ＮＣＩＢ　１２５９１。