JP2540143C

JP2540143C -

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Publication number: JP2540143C
Authority: JP
Original assignee: ビーチヤム・グループ・ピーエルシー
Publication date: 1999-10-04

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、組換え体ＤＮＡ分子類、特に、β−ラクタム抗生物質類ことにペ
ニシリン類とセファロスポリン類の生合成に関与する１以上の酵素の遺伝情報を
指定する１以上の遺伝子を有するＤＮＡフラグメントが挿入されこれを保有する
微生物宿主を形質転換するのに用いる組換え体ベクター類に関する。ストレプトミセス・クラブリゲルス（Ｓtreptomyces clavuligerus）のごとき
微生物によって産生されるβ−ラクタム抗生物質の生合成の解釈については進展
は遅々としたものであった。それにもかかわらず、ある種のペニシリン類とセフ
ァロスポリン類（セファマイシン類を含む）の生合成経路が密接に関連している
ことが立証されたのである。イソペニシリンＮは、前記両グループの化合物を生合成する場合の中間体であ
り、トリペプチドのδ（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バ
リン（ＬＬＤ−ＡＣＶと呼称される場合もあるが、この明細書ではさらに簡単にＡＣＶと呼称する）にサイクラーゼ
（cyclase）酵素を作用させて製造される。中間体のイソペニシリンＮはペニシ
リンＧに変換することができるが、エピメラーゼ酵素の作用でペニシリンＮにも
変換することができる。そして、後者のペニシリンＮから、最初の、エクスパン
ダーゼ（expandase）酵素による環拡大反応（ring expansion）とこれに続く多
段の経路によって、種々のセファロスポリン類やセファマイシン類が誘導される
。この技術の水準を最近要約したものが、Ｊ．Ｆ．ＭartinおよびＰ．Ｌiras，
Ｔrend in Ｂiotechnology，1985， 3，39-44に記載されている。セファマイシ
ンＣを生合成する場合、まずペニシリンＮがデアセトキシセファロスポリンＣに
変換され、次いでこのデアセトキシセファスポリンＣがジオキシゲナーゼ酵素に
よってデスアセチルセファロスポリンＣに変換される。このデスアセチルセファ
スポリンＣはＯ−カルバモイル化されてＯ−カルバモイルデスアセチルセファロ
スポリンＣに変換され、ついでこのカルバモイル化物がセファマイシンＣに変換され
る。セファマイシンＣの7α−メトキシ基は、次の２工程によって、すなわち、
Ｏ−カルバモイルデスアセチルセファロスポリンＣに7−ヒドロキシラーゼ酵素
を作用させて、その7α−ヒドロキシ誘導体を得、次いでメチル化反応に付する
ことによって誘導されるということは、Ｊ．Ｄ．Ｈoodらの研究（Ｊ．Ｃhem．Ｓ
oc．Ｃhem．Ｃommun，1983，第1187-1188頁およびその引用文献）に照らして可
能であろう。現在よく知られているように、組換え体ＤＮＡ技術によって、あるベクターが
有するＤＮＡを宿主細胞に挿入することによって、形質転換された宿主に、挿入
ＤＮＡが有する遺伝子がエンコード（encode）するどんな蛋白質や酵素でも合成
する性能を付与することが可能である（組換え体ＤＮＡ方法論の充分な検討、こ
の明細書に用いる用語の辞典については、Ｒ．Ｗ．ＯldとＳ．Ｂ．Ｐrimrose著
、第３版、Ｂlackwell Ｓcientific Ｐublications，1985の“Ｐrinciples of gene manipulation”を
参照のこと）。シイ・アクレモニウム（Ｃ．acremonium）由来のイソペニシリンＮシンテター
ゼ（サイクラーゼ）遺伝子のイー・コリ（Ｅ．Coli）における分離と発現は最近
、Ｓ．Ｍ．Ｓamsonらによって報告された（Ｎature．1985， 318，191-194）。この発明を明確にするため、下記の図面が参照される。第１(a)図は、ペニシリンとセファロスポリンの生合成に関与する遺伝子の遺
伝情報を指定するエス・クラブリゲルスＡＴＣＣ27064染色体ＤＮＡ（Ｉ）のエ
ンドヌクレアーゼ制限地図である。第１(b)図は、プラスミドpＢＲＯＣ138内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分の
エンドヌクレアーゼ制限地図である。第１(C)図は、プラスミドpＢＲＯＣ137内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分の
エンドヌクレアーゼ制限地図である。第１(d)図は、プラスミドpＢＲＯＣ303内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分の
エンドヌクレアーゼ制限地図である。第２図は、プラスミドpＢＲＯＣ137とpＢＲＯＣ138のエンドヌクレアーゼ制限
地図である。第３図は、プラスミドpＢＲＯＣ303のエンドヌクレアーゼ制限地図である。したがって、この発明は、ペニシリンとセファロスポリンのβ−ラクタム化合
物の生合成に関与する１以上の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有す
る、第１(a)図に示す制限座位の配置を有するＤＮＡ（Ｉ）またはそのＤＮＡ由
来のフラグメントを提供するものである。さらにこの発明は、ペニシリンおよびセファロスポリンのβ−ラクタム化合物
類の生合成に関与する１つ以上の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有
する挿入ＤＮＡもしくはこのＤＮＡ由来の制限フラグメントを有し、前記ＤＮＡ
が第１(a)図に示す制限座位の配置を有する、宿主細胞を形質転換できる組換え
体ベクターを提供するものである。したがって、この発明は他の態様として、この発明の組換え体ベクターによっ
て形質転換された宿主細胞を提供するものである。かような宿主細胞として適切
なのは微生物であり、好ましいのは、イー・コリ（Ｅ．coli）、ストレプトミセ
ス属の微生物の、例えばエス・リビダンス 66（Ｓ．lividans 66）（ＤＳＭ寄
託番号第1567号）である。当業者によって容易に認識されることであるが、式Ｉ(a)に示す全ＤＮＡセグ
メント（Ｉ）をこの発明の組換え体プラスミドに利用することは不便で望ましく
ないことである。したがって、式Ｉ(a)に示す全長のＤＮＡ（Ｉ）由来の適切な
制限フラグメントは、ペニシリン類とセファロスポリン類の生合成に関与する１
以上の完全な遺伝子を有する場合、挿入ＤＮＡとして用いることができる。この発明の制限フラグメントは、公知の方法により、適切な制限酵素で開裂す
ることによってＤＮＡセグメント（Ｉ）から得ることができる。特に好ましいＤＮＡフラグメントとしては、前記第１(b)図、第１(C)図および
第１(d)図に示す制限座位の配置を有するＤＮＡフラグメントが挙げられる。第１〜３図において、略記号ＣlaＩ、ＢclＩなどは制限エンドヌクレアーゼ類
の通常の略記号であり（ＯldおよびＰrimroseの前記文献参照）、アガロースゲ
ル電気泳動法で行ったサイジング実験によって測定したものであるがＤＮＡのお
よその長さ〔キロベース（Ｋb）〕を示した。第１〜３図は、前記サイジング実
験によって測定された、制限酵素開裂座位の近似の位置を示すもので、図示した
ＤＮＡに存在する可能性のあるすべての制限座位を、示そうと必ずしも意図する
ものではないと解されるべきである。第１(a)図に示されるＤＮＡまたは第１(b)，１(c)および１(d)図に示すフラグ
メントのような前記ＤＮＡ由来の適切な制限フラグメントは、ペニシリン類もし
くはセファロスポリン類の生合成に関与する酵素の遺伝子情報を指定する遺伝子
を発現できるいずれの宿主細胞でも形質転換しうるいずれのベクターにも連結することが
できる。この発明のＤＮＡを発現できる適切な宿主細胞としては、イー・コリ、ペニシ
リウム（Ｐenicillium）種、セファロスポリウム（Ｃephalosporium）種、また
はエス・クラブリゲルスおよびエス・リビダンスのようなストレプトミセスの種
（スペシーズ）が挙げられる。通常、この発明のＤＮＡがクローンされるベクターは、プラスミドであり、例
えばストレプトミセス属の菌（Ｓtreptomycete）由来のプラスミド、またはテン
ペレートファージもしくはビルレントファージである。適切なベクターの例は、pＩＪ702（分子量８.９メガドルトン）であり、すな
わちＫatz,Ｅ．ら、Ｊ．Ｇen．microbiol．1983， 129，2703-2714に記載された
高コピイ数プラスミドでＪohn Ｉnnes Ｉnstitute，Ｎorwich，英国より入手可
能である。適切なテンペレートファージの例は、φＣ31 として知られているファージであり、Ｌomovskaya，Ｎ．Ｄ.,Ｃhater，Ｋ．Ｆ.
，Ｍkrtumian，Ｎ．Ｍ.,Ｂacheriol．Ｒev.，1980， 44，206〜229に記載されて
いる。この発明の組換え体ベクターは、第１(a)図に示す挿入ＤＮＡもしくはこのＤ
ＮＡ由来の制限フラグメントを、選択された〔線形化(linearized)〕ベクターに
、任意の便利な方法例えば付着端の直接接合法、ホモポリマー・テーリング法（
tailing）またはリンカーもしくはアダプター分子により、連結することによっ
て製造することができる。上記の方法によって製造された組換え体ベクターは、２つの可能な配向のうち
の一つの配向の挿入ＤＮＡを有していることが分かる。両方の配向を有する組換
え体ベクターもこの発明の権利範囲に含まれる。適切な組換え体ベクターは、上記の第１(b)，１(C)および１(d)図に示す制限
座位の配置を特徴とするＤＮＡフラグメントを有するプラスミドである。好ましい組換え体分子は： (i) 第１(b)図に示すＤＮＡフラグメントがpＩＪ702のＢglII座位に挿入され
ているか（その構造物は以下にpＢＲＯＣ138と呼称される）、 (ii) 第１(C)図に示すＤＮＡフラグメントがpＩＪ702のＢglII座位に挿入さ
れているか（その構造物は以下にpＢＲＯＣ137と呼称される）、または (iii) 第１(d)図に示すＤＮＡフラグメントがpＩＪ702のＢglII座位に挿入さ
れている（その構造物は以下にpＢＲＯＣ300と呼称される）分子である。この発明のＤＮＡを作製するために、ランダム配列のＤＮＡフラグメントをエ
ス・クラブリゲルス（ＡＴＣＣ27064）の全細胞ＤＮＡを任意の便利な制限酵素
で部分消化することによって生成させることができる。エンドヌクレアーゼＳau
３ＡＩ（以下Ｓau ３Ａと略記する）とそのアイソシゾマー類は、この目的に
特に適している。次いでこのＤＮＡフラグメントは、ショ糖勾配法でサイズの分画がなされ、3Ｋbを超え好ましくは15Ｋbを超えない長さのフラ
グメントが分離される。好ましいフラグメントは大きさが4〜14Ｋbのものである
。次いでそのＤＮＡフラグメントは、適切に開裂されたベクター例えばpＩＪ702
に通常の“ショット・ガン”法によって連結され、再環化した後、その組換え体
ベクターは、セファマイシンＣを産生する性能の欠除しているエス・クラブリゲ
リスの菌株に形質転換される。この目的のために適切なエス・クラブリゲルスの菌株は、エス・クラブリゲル
スＮＣＰ−５であり、これは、Ｂeecham Ｃulture Ｃollectionに1986年１月29
日付けで寄託番号ＢＣＣ１で寄託され、その後the Ｎational Ｃollection of
Ｉndustrial and Ｍarine Ｂacteria，Ａberdeen，Ｓcotlandに移され、その寄
託（ＮＣＩＢ 12208，1986年２月19日付で寄託）は、特許手続上の微生物の寄
託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて行われた。したがって、エス・クラブリゲルスＮＣＩＢ 12208はこの発明の他の態様を形成する。エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５（エス・クラブリゲルスＮＣＩＳ12208）の
派生と特性は次のとおりである。エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の派生（derivation）エス・クラブリゲルス（ＡＴＣＣ27064）の試料の密封アンプルを開いたとこ
ろ種々の形態を示した。14の異なるタイプが認められた。これらの一つを、エス
・クラブリゲルスＳＣ−２として分離した。これを培養すると、エス・クラブリ
ゲルスＳＣ−２自体が種々の形態を示した。‘小さな’変種の一例から、‘大き
な’コロニイの変異細胞が自然に得られ、エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５と命
名された。エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の分類エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の分類学的および形態学的性質は、エス・ク
ラブリゲルス（ＡＴＣＣ27064）のそれに本質的に類似していることが見出された。これらの性質
については、米国特許第3,862,008号やＨiggins,・Ｃ．Ｅ．およびＫastner，Ｒ
．Ｅ．のＩnt.Ｊ．Ｓystematic Ｂacteriol.，1971,21,326-331にも記載されて
いる。エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の培養法は、英国特許第1,508,977号明
細書に、エス・クラブリゲルス（ＡＴＣＣ27064）について記載された方法と類
似している。前記“ショットガン”法によって得られた形質転換細胞は、セファマイシンＣ
に感受性の微生物に接触させてその微生物の増殖特性を試験することによって、
セファマイシンＣの産生能についてスクリーニングされる。この目的に適切な微
生物はエイ・フェカリス（Ａ．faecalis）である（the Ｎational Ｃollection
of Ｉndustrial and Ｍarine ＢacteriaにＮＣＩＳ8156の寄託番号で寄託されて
おり、また請求があればいつでもthe Ｂeecham Ｃulture Ｃollection（寄託番
号ＢＣＣ２）から誰でも入手しうる）。スクリーニングのために、エイ・フェカリースは、寒天プレート上で便利に培養され、次
いで相補性試験が、当該技術分野で公知の通常の方法で形質転換細胞類のプラグ
を寒天プレートに挿入することによって行われる。エイ・フェカリスのようなセファマイシン感受性微生物を新たに接種した培地
に成育阻害領域を生成する性能によって陽性と確認された形質転換細胞が単離さ
れ、これに保有されている組換え体ベクターが‘陽性’の各コロニイから通常の
方法で単離される。その組換え体ベクターを適切な制限酵素で消化することによ
って、各ベクターに挿入されたエス・クラブリゲルスＤＮＡは、この発明のＤＮ
Ａを保有しているということを調べるために通常の方法で種々の制限酵素で開裂
することによって確認され、大きさを測定し地図にされる。かようにして単離された２以上の‘重複’挿入体は、全部もしくは部分的にこ
の発明のＤＮＡに含まれているが、小さすぎてペニシリン類およびセファロスポ
リン類の生合成に関与する完全な遺伝子（intact gene）を入れることができないので、通常のしかたで、共通の制
限座位を開裂し次いで連結する（例えばＤＮＡリガーゼによって）ことによって
しばしば融合されて、例えばpＢＲＯＣ137とpＢＲＯＣ138の挿入ＤＮＡもしくは
前記定義のこれらのＤＮＡ由来の適切な制限フラグメントが得られる。ＤＮＡセグメントＩは、pＢＲＯＣ137もしくはpＢＲＯＣ138のエス・クラブリ
ゲルスＤＮＡを用い、エス・クラブリゲルスの全細胞ＤＮＡとpＨＣ79〔Ｈohn，
Ｂ．およびＣollins，Ｊ.，（1980），Ｇene， 11,291〕とで作製されたコスミ
ドを保有するイー・コリ細胞を、コロニイ・ハイブリッド形成法によって、同定
することによって単離される。次いでプラスミドpＢＲＯＣ303がpＩＪ702とセグ
メントＩ(d)のＤＮＡ（フラグメントＩから得られる）とから、簡単なサブクロ
ーニング法によって組立てられる。ペニシリン類とセファロスポリン類の生合成に関与する酵素の生産は、この発
明のＤＮＡを適切なベクター例えばpＩＪ702に再挿入し、次いで適切な宿主微生物、例えばエス・
リビダンス66（ＤＳＭ1567）を、前記のようにして作製した組換え体ベクターで
形質転換することによって達成される。このようにして製造された特に価値のある酵素には、‘サイクラーゼ（cyclas
e）’すなわちイソペニシリンＮシンテターゼ（ＡＣＶをイソペニシリンＮに変
換できる）、‘エクスパンダーゼ’すなわちデアセトキシセファロスポリンＣシ
ンテターゼ（ペニシリンＮをデアセトキシセファロスポリンＣに変換できる）、
‘エピメラーゼ’すなわちペニシリンＮシンテターゼ（イソペニシリンＮをペニ
シリンＮに変換できる）およびＯ−カルバモイルデスアセチルセファロスポリン
Ｃ−7−ヒドロキシラーゼ（Ｏ−カルバモイルデスアセチルセファロスポリンＣ
とセファロスポリンＣとをそれぞれの7-ヒドロキシ誘導体に変換できる）として
、当該技術分野で知られている酵素（Ｊ．Ｆ．ＭartinおよびＰ．Ｌirasの前記
文献）が含まれる。エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ27064の前記酵素類やペニシリン類とセ
ファロスポリン類の合成をもたらす性能を有するいずれの他の蛋白類も、この発
明の形質転換された宿主によって産生される場合は、この発明の他の態様を形成
するものである。これら蛋白や酵素類は高純度の形態で得ることが好ましい。かような蛋白や酵素は、通常の方法によって単離・精製される。この発明のＤＮＡとこれを保有するベクターは、工業界の多くの分野で用途が
見出されている。このようなことは、前記ベクターで形質転換された宿主微生物
およびその微生物が発現する酵素にもあてはまる。例えばこのＤＮＡは、ハイブ
リッド形成プローブとして利用して、エス・クラブリゲルス（ＡＴＣＣ27064）
や、類似の構造と特異性を有する酵素を産生する他の微生物の全細胞ＤＮＡに存
在する、関連もしくは重複の遺伝子を同定・単離することができる。したがって
、この発明は微生物内でβ−ラクタム抗生物質の生合成に関与する遺伝子を単離するために、β−ラクタム抗生物質産生の微生物のＤＮＡに
ハイブリッド形成できるＤＮＡ（Ｉ）もしくはそのフラグメントの使用を提供す
るものである。前記ＤＮＡを保有する組換え体ベクターは、適切な宿主に形質転
換されると、セファマイシンＣのような価値ある抗生物質を多量に合成する遺伝
学的に改変された微生物を製造したりまたは遺伝子転移法による新規なもしくは
ハイブリッドの抗生物質を生成させる（例えばＤ．Ａ．Ｈopwoodら、Ｎature，1
985， 314，642-644参照）のに有用である。この発明のＤＮＡによってエンコー
ド（encode）されている酵素は特に、例えば公知のβ−ラクタム抗生物質を、そ
の天然の前駆体から製造したりまたは新規なβ−ラクタム抗生物質を例えば化学
合成法で得られた非天然の前駆体から製造したりするために適切な固体の担体に
固定化される場合、細胞の存在しない系で使用することができる。この発明のＤＮＡもしくはそのフラグメント（完全な遺伝子を必ずしももって
いない）は、組換え体ＤＮＡの技術もしくは天然の組換え工程によって、β−ラクタム合成に関
与する遺伝子のフラグメントと結合され、ハイブリッド酵素の合成を命令しうる
ハイブリッド遺伝子が製造される。かような酵素類は、前記方法と類似の方法に
よって新規な抗生物質を製造するのに用いられる。またこの発明のＤＮＡは、特定部位の突然変異誘発法の公知の技術（例えば、
Ｇ．Ｗinterら、Ｎature，1982， 299，756-758又はＺollerとＳmith，Ｎucleic
Ａcids Ｒesearch，1982，10，6487-6500に記載されたのと類似のしかた）によ
って改変され、特異な突然変異および／または欠失がなされたＤＮＡが得られる
。その突然変異ＤＮＡは、β−ラクタム抗生物質を産生することがすでに知られ
ている適切な宿主微生物から公知のβ−ラクタム抗生物質を増大した収率（また
はタイター）で得るために使用される。またこの突然変異ＤＮＡは、遺伝子転移
法によって新規もしくはハイブリッドの抗生物質を得るのに用いられ、または上
記記載の方法と類似の方法によって新規な抗生物質を製造するのに用いうる突然変位酵素（ムューテイン，mutein）
の産生に用いられる。かような突然変異ＤＮＡはこの発明の範囲内にあると解さ
れる。この発明を下記実施例で説明するが、本願発明を限定するものではない。実施例製造例１ Sau 3Aで消化されたエス・クラブリゲルス27064 DNAの４〜１５Ｋｂ
の大きさのピースの単離 (a)全細胞ＤＮＡ(total cellular DNA)をエス・クラブリゲルス27064から下記の
方法で製造した。ｉ）エス・クラブリゲルス27064の胞子を、トリプトン・ソヤ・ブロスマルトー
ス増殖培地入りの２つの振盪フラスコ（30ｍl／250ｍlスプリング振盪フラスコ
；トリプトン・ソヤ・ブロス30g/l，マルトース10g／l）に接種し、２６℃で４
８時間(240rpm)培養した。 ii）菌系体(mycelium)を、10,000Ｇで遠心分離して収穫した。 iii）上澄フラクションを流出させ、ペレットを１０ｍlの溶解液（lysing solut
ion;50mMトリスpH 8.5,50mM Na₂EDTA,１５％庶糖、リゾチーム３ｍｇ／ｍl）に
再懸濁させ、３７℃で１時間培養した。 iv）２ｍｇのプロティナーゼＫ（ＳＩＧＭＡ chemicals社）含有のナトリウムラウリルサルフェート（１０％溶液）の0.5ｍl
を添加し、培養を１５分間続け、さらにSLS/Prot K溶液を加え培養をさらに１５
分間続けた。ｖ）酢酸ナトリウム（0.3Mまで）と氷冷エタノール（２容積）とを加えた後、Ｄ
ＮＡをガラス棒でまき取った。これを数回繰返しＤＮＡの半透明粘性の製剤を得
た。(b)エス・クラブリゲルス27064からの染色体ＤＮＡのSau 3Aによる部分消化 180μｇの全細胞ＤＮＡを、推奨された緩衝液中、１２単位のSau 3A制限酵素(
NEW ENGLAND BIOLABS供給)とともに３０分間３７℃で培養した。酵素を７０℃で
変性させることによって反応を停止させた。ＤＮＡの消化の度合をアガロースゲ
ル電気泳動法によって試験したところ、得られたフラグメントは１５Ｋｂ〜0.16
Ｋｂの大きさの範囲にあることが見出された。(c)ショ糖勾配法(40〜10% W/v)によるSau 3Aによって部分的に消化されたＤＮＡ
の分画ショ糖の勾配法(40〜10%)を“Genetic ManipuLation of Streptomyces-A Labo
ratory Manual,著者：D.A.Hopwoodら，the John Innes Foundation発行1985”に
記載してあるのと同様にして、ショ糖の勾配(40〜10%)を13ｍlの遠心分離管内に
作製した。エス・クラブリゲルス27064ＤＮＡのSau 3Aによる部分消化物（0.5ｍl中100μ
ｇ）を前記ショ糖勾配の上面に注意深く積層し、その系を２１時間30000rpm(10⁵
gav)で遠心分離した。遠心分離管を遠心分離器から取り外し、該分離管の底部にあけた孔から、400
μlづつのフラクションを採取した。これらのフラクションの５μl試料をゲル電
気泳動法で試験し、大きさが４〜１４ＫｂのＤＮＡを含有することを示したフラ
クションを集めた。このようにして、Sau 3Aで消化され、大きさが４−１４ＫｂのＤＮＡの１２μ
ｇを得た。製造例２エス・クラブリゲルス27064ＤＮＡのSau 3Aによるフラグメントをク
ローンするのに適切なpIJ702ベクターＤＮＡの製造 (a)プラスミドＤＮＡの単離エス・クラブリゲルス27064：pIJ702の胞子を振盪フラスコ中のＴＳＢ／マル
トース培地［培地調製に関する製造例1(a)参照］に接種した。プラスミドの安定
性を保持するためにチオストレプトンを2.5μｇ／ｍlまで添加した。微生物を４
８時間、２６℃で培養した。pIJ702［Katz,E.ら,J.Gen.Microbiol.(1983)129,27
03-2714参照］プラスミドを、中性溶菌法（the Neutral Lysis Procedure,Hopwo
odら，1985の前記文献参照）を用いて菌系体から単離した。このようにして、pI
J 702ＤＮＡの５０μｇを単離した。(b)エス・クラブリゲルス27064からのpIJ702ＤＮＡのＢｇｌIIによる消化３０μｇのpIJ 702 ＤＮＡを、推奨の制限緩衝液（全容積400μｌ）中のBglII
制限酵素（Amersham Internationalにより供給された100単位）で、３０分間３
７℃で消化した。７０℃で３０分間培養することによって反応を停止した。反応混合物の試料をアガロースゲル電気泳動法（0.7%ゲル）で試験したところ
、当初存在した共有閉環状プラスミド［closed covalent circular(ccc)plasmid
］はすべて直線形に変換していた。(c)BglIIで消化されたpIJ 702ＤＮＡの小牛の腸のアルカリ性ホスファターゼ（
ＣＩＡＰ）による処理この処理は、“Molecular Cloning-A Laboratory Monual,“Maniatis,T.ら，c
old Spring Harbour Laboratory(1982)発行”に記載されているのと同様にして
行った。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、CIAPで処理したＤＮＡを試験した結果、酵素に
よって脱リン酸化を行った後は、もはや自己連結(self-ligate)しないことが分
かった。製造例３．エス・クラブリゲルス27064の、3au 3Aで消化された全細胞ＤＮＡと
、ＢｇｌIIで消化されCIAPで処理されたpIJ702ＤＮＡとの連結 Sau 3Aで消化されたエス・クラブリゲルス 27064の染色体ＤＮＡ（4-14Kb）の１μｇを含有する１５μｌの水を入れた１２
の各容器に、ＢｇｌIIで消化されCIAPで処理されたpIJ702（0.5μg／ポット）含
右の緩衝液100μｌを加えて、最終濃度を1.5μｇＤＮＡ／150μｌ、トリス塩酸
ｐＨ7.5緩衝液(66mM)、MgCl₂(6.6mM)、ジチオトレイトール(10mM)およびアデノ
シントリホフエート(0.4mM)とした。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（0.1単位、Amersham I
nternational社より供給）を各ポットに添加し、各系を１５℃で７２時間培養し
、必要な容器に移した。製造例４．エス・クラブリゲルスNCP-5:pIJ702/27064クローンのライブラリイの
作製 (a)pIJ702中に挿入されたＤＮＡの頻度とＤＮＡ挿入体の大きさに関する、エ
ス・リビダンス６６内の連結ＤＮＡの試験 1.5μｇの連結ＤＮＡ（エス・クラブリゲルス27064から製造され、ＢｇｌIIで
消化されCIAPで処理されたPIJ702を連結したエス・クラブリゲルス27064のSau 3
Aによって得られた４−１４Ｋｂのフラグメント）を１０μｌのＴＥ緩衝液（１ｍＭ Na₂EDTA,10mMトリス塩酸ｐＨ8
.2）に溶解し、その５μｌづつの２つのを、エス・リビダンス６６(ＤＳＭ 1567
)の原形質体［１０¹⁰原形質体／ｍｌ，２５％ポリエチレングリコール（平均分
子量1000）の存在下、“Genetic Manipulation of Streptomyes-A Laboratory M
annual”に記載したのと同様にして製造］の100μｌづつの２つの形質転換する
のに用いた。形質転換した後、その原形質体の１０^-4まで希釈した液を、プレート上のＲ２
ＹＥ寒天に塗布した（Hopwoodらの前記文献参照）。３２℃で２４時間培養した後、プレートを軟普通ブイヨン寒天（SNBA）［８ｇ
Difco普通ブイヨン／ｌ、プラスミドが産生するコロニイを選択するためのチオ
ストレプトン抗生物質(500μg/l)と、これらのコロニイが産生する、pIJ702のme
l遺伝子に挿入体を持つプラスミドを検出するためのＬ−チロシン（１ｇ／ｌ）
とを含有する３ｇ寒天／ｌ］でオーバーボアーした（overpour）。数日の培養後、黒色コロニイの頻度（２％を超えない）と連結ＤＮＡの形質転
換効率（9.3×10³形質転換体／μｇＤＮＡ）を、カウンティング(counting)によ
って確認することができた。前記の方法（製造例２ａ）で、エス・リビダンス６６の１０ケの白色コロニイ
からプラスミドを調製した。これらのプラスミド製剤をBclＩ制限酵素で消化し
、次いでアガロースゲル電気泳動法でＤＮＡ挿入体の大きさを測定した。このようにして測定した結果、クローンされたＤＮＡの平均の大きさは５Ｋｂ
であった。(b)連結ＤＮＡ試料のエス・クラブリゲルスNCP-5(エス・クラブリゲルスNCIB 12
208)への形質転換 1.5μｇの連結ＤＮＡを、2×5μｌのＴ．Ｅ．緩衝液内で、2×100μｌのエス
・クラブリゲルスNCP−５原形質体（１０¹⁰原形質体／ｍｌ，前記のHopwoodら(1
985)の文献に記載されたのと同様にして製造］に形質転換した。この形質転換さ
れた原形質体を、26℃でＲ⁵寒天［100ｇショ糖／ｌ、１０ｇデキストリン/ｌ、5.1ｇＭｇＣｌ₂・6H₂O/l，１ｇカザミノ酸／ｌ，0.05ｇMgS
O₄・7H₂O/l,2.5gL-アルギニンHCl/l，１ｍｌ微量元素／ｌ，20g Oxoid Technica
l Agar No.3/1,0.05g KH₂PO₄/l,3.7ｇ CaCl₂・2H₂O/l,5.7g TES緩衝液PH7.2/l］
上で再生させた。なお微量元素溶液は、FeSO4・7H₂O1g/l,MnCl₂・4H₂O1g/l,ZnSO
₄・7H₂O1g/lを含有している。４８時間再生させた後、チオストレプトン（50μ
ｇ／ｍｌ）含有のSNBA（製造例４ａに記載したのと同一）で覆うことによってチ
オストレプトン耐性コロニイを選択した。さらに７２時間後、形質転換されたコ
ロニイを個々にかきとって、抗生物質生産に適切なひとつの普通寒天培地上に配
列した。この寒天培地は、デキストリン１０ｇ／ｌ、K₂HPO₄1g/l、MgSO₄・7H₂O
1g/l、(NH₄)₂SO₄1g/l、Indust-rial chalk 4g/l、微量元素溶液１ｍｌ、寒天20g
/l、酵母エキス２ｇ／ｌおよび細菌学的ペプトン2.5g,/ｌを含有するＭ５Ｄ⁺寒
天培地である。またその微量元素溶液は、FeSO4・7H₂O 0.1%、MnCl₂・4H₂O 0.1
％およびZnSO₄・7H₂O 0.01％並びにチオストレプトン（2.5μｇ/ｍｌ）を含有している。 pIJ702:エス・クラブリゲルス27064ＤＮＡプラスミドによって与えられたチオ
ストレプトン耐性を示した4500のＮＣＰ−５コロニイをこの方法で得た。製造例５．セファマイシンＣ産生のためのＮＣＰ−５：pIJ 702/エス・クラブリ
ゲルス27064ライブラリイのスクリーニングＭ５Ｄ⁺寒天培地上２６℃で１０日間培養した後、８ｍｍ径の寒天プラグをそ
れぞれの菌糸体パッチから切りとり、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes
faecalis)ATCC 8750/NCIB 8156を予め新たに接種したＤＳＴ寒天培地（40g Oxo
id DST寒天/l水）上に置いた（Claridge,C.A.およびJonson,D.L.(1962)Antimicr
ob.Ag.Chemother.682-686参照）。この生物は、セファロスポリンＣとセファマ
イシンＣのごときある種のセファロスポリン類に感受性であるが、用いられる増
殖条件下でＮＣＰ−５によって産生される低濃度のクラバラン酸の存在下でさえ
もペニシリンＮには感受性ではない。従ってペニシリンＮとクラバラン酸のみを産生したＮＣＰ−５は
通常、エイ・フェカリスNCIB 8156の増殖を阻害するゾーンを与えない。しかし
その親のエス・クラブリゲルス菌株は上記のゾーンを与える（この菌株は、ペニ
シリンＮ、クラバラン酸およびセファマイシンＣを産生するからである）。前記
プラグからの抗生物質を、ＤＳＴ／エイ・フェカリス寒天に拡散させ、３７℃で
一夜培養した後、エイ・フェカリスの増殖状態を、抗生作用のゾーンについて試
験した。このようにして、クローンのライブラリーの任意のメンバーによるセファロス
ポリン抗生物質類産生の可能性を調べた。２つのクローンの、標識されたＮＣＰ
−5/36/5とＮＣＰ−5/10/7とは、エイ・フェカリスに対して抗生作用のゾーンを
与えることが見出された。製造例６．NCP-5/36/5とNCP-5/10/7のプラスミド含量の試験 (a)プラスミドの物理試験プラスミド製剤をNCP-5/36/5とNCP-5/10/7とから製造例２ａに記載したのと同様にして作製した。ふたつのポジティブ（positi
ve)の各々の３０ｍｌ培養物から、数μｇのプラスミド物質を単離することがで
きた。制限酵素座位の地図を作成したところ、プラスミドの一つの種だけがNCP-
5/10/5に存在し、別のひとつの種のみがNCP-5/10/7に存在するということを明確
に示した。制限地図（第１図参照）は、pIJ 702に、約5.7Ｋｂと約5.8ＫｂのＤ
ＮＡ挿入部をそれぞれを有するNCP-5/36/5とNCP-5/10/7から単離されるというこ
とを示唆している。この二つのＤＮＡ挿入体は、地図にされた制限酵素座位によ
って示唆されているように、ほぼ2.7Ｋｂの共通フラグメントを有するようであ
る。次いでこのことは、pBROC138の³²Ｐで標識された各フラグメントがpBROC137
ＤＮＡの予測された部分と広範なハイブリッドを形成するのをサザン分析法でし
めすことによって証明された。(b)プラスミドpBROC 137とpBROC 138のＮＣＰ−５への再導入 pBROC 137とpBROC 138とＤＮＡの100ノナグラムづつを、エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５を再形質転換するのに用いた。その
形質転換されたコロニイを分離し、製造例５に記載したのと同様にしてエイ・フ
ェカリスバイオアッセイ・プレートで試験した。 pBROC 137もしくはpBROC 138で形質転換されたＮＣＰ−５のコロニイ全部の少
なくとも９０％が、エイ・フェカリスに抗生作用のゾーンを与えることができる
ことが明らかになった。このことは、pBROC 137とpBROC 138中に存在するＤＮＡ
が、ＮＣＰ−５の受ける突然変異を修復できる遺伝情報を有することを立証して
いる。製造例７．pBROC 137、pBROC 138およびpBROC 303によってストレプトミセス・
リビダンス６６に与えられる新規な酵素活性の測定 100ナノグラムづつのpBROC 137ＤＮＡ、pBROC 138ＤＮＡおよびpBROC 303ＤＮ
Ａを、エス・リビダンス６６に形質転換した（製造例４ａに記載したのと同様に
して）。エス・リビダンス66：pBROC137、エス・リビダンス66：pBROC138およびエス・リビダンス66：pBROC 303の培養物を、YEME(30ｍ
ｌグルコース10ｇ／ｌ、ショ糖340ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／ｌ、細菌学的ペプ
トン５ｇ／ｌ、酵母エキス（Oxoid)3g/lからなり、チオストレプトン抗生物質を
50μｇ／ｍｌ含有する）の振盪フラスコ中で培養した。この培養物を、４８時間
、３２℃、240rpmで培養した。菌糸体を10,000gで遠心分離して収穫し、トリス
塩酸緩衝液ｐＨ7.0(0.05M)で洗浄した。菌糸体を再び遠心分離し、ペレットを2.
5ｍｌのトリス緩衝液中に再懸濁させた。1000psiでフレンチ・プレッシャー・セ
ルを用い細胞を破壊し、破壊細胞の製剤を１０⁵ｇで６０分間遠心分離し、細胞
を含有せず粒子のない、溶解性酵素製剤を得た。(a)エクスパンダーゼ酵素活性の例証エス・リビダンス66:pIJ 702、エス・リビダンス66:pBROC 137およびエス・リ
ビダンス66:pBROC 138由来の酵素製剤を、環拡大アセイシステムに用いて（Jens
en,S.E.,Westlake,D.W.S.およびWol fe.S.,(1983)Antimicrob.Ag.Chemother.24(3)307-312に記載してあるのと同様に
して）、デアセトキシセファロスポリンＣシンテターゼの存在を測定した。これらの著者によって記載された、イー・コリＥＳＳ／ペニシリナーゼ(DIFCO
Penicillinase Concentrate 10⁴u/ml)バイオアセイシステムを利用することに
よって、エス・リビダンス66:pIJ 702エキストラクトはペニシリンＮをペニシリ
ナーゼ耐性抗生物質に形質転換できないが、一方エス・リビダンス66:pBROC 137
とエス・リビダンス66:pBROC 138からのエキストラクトは前記形質転換を行うこ
とができることを示すことができた。エス・リビダンス66:pBROC 137酵素エキス
トラクトは、前記アッセイシステム中のペニシリンＮをペニシリナーゼ耐性抗生
物質に十分形質転換することができたが、エス・リビダンス66:pBROC 138からの
酵素エキストラクトは、この点について著しく低い活性を示した。次いで環拡大
試験体を、ペニシリンＮ、デアセトキシセファロスポリンＣおよびデアセチルセファロスポリンＣの標準試料とともに、セルロースの薄層ク
ロマトグラフィ用プレート上でクロマトグラフィ（ブタノール／酢酸／水，3/1/
1）に付した。寒天含有のイー・コリＥＳＳ／Difcoペニシリナーゼ上のクロマト
グラフィのバイオアッセイによって、３７℃で一夜培養後に、エス・リビダンス
66:pBROC 137酵素エキストラクトはペニシリンＮをデアセトキシセファロスポリ
ンＣに形質転換するが、エス・リビダンス66:pIJ 702からの酵素のエキストラク
トはこの形質転換を行わないことが分かった。デアセチルセファロスポリンＣが
いずれかの細胞エキストラクトによってペニシリンＮから合成されるということ
は全く確認されなかった(デアセトキシセファロスポリンＣのＲｆ＝0.55，デア
セチルセファロスポリンＣのＲｆ＝0.39)。（ペニシリンＮはペニシリナーゼが
存在するので検出されない）(b)イソ−ペニシリンＮの、イー・コリＥＳＳに対してより活性な化学形態への
変換 Jesen,S.Eらによって開発されたイソ−ペニシリンＮエピメラーゼアッセイを用いて［Can.J.Microbiol.(1983)29(11),1526-15
31］、エス・リビダンス66:pBROC 137からの細胞と粒子の存在しない酵素エキス
トラクト（製造例７ａと同様）が、イソ−ペニシリンＮを、イソペニシリンＮ自
体よりもイー・コリＥＳＳに対する活性が少なくとも１０倍の化学的形態に変換
できるということを例証することができた。エス・リビダンス66:pIJ 702からの
同様のエキストラクトはこのような変換ができなかった。(c)エス・リビダンス66:pBROC 303の、細胞の存在しない製剤による、Ｏ−カル
バモイル・デスアセチル・セファロスポリンＣとセファロスポリンＣの、それぞ
れの7−ヒドロキシ誘導体への変換エス・リビダンス66:pBROC 303の、細胞なしの製剤（0.9ｍｌ）を、アスコル
ビン酸ナトリウム(2.8ｍＭ）、硫酸第一鉄（0.045ｍＭ）、α−ケトグルタレー
ト（１ｍＭ）、塩化カリウム（7.5ｍＭ）、硫酸マグネシウム（7.5ｍＭ）、トリ
ス−塩酸ｐＨ7.0(0.05M)およびＯ−カルバモイル・デスアセチル・セファロスポリンＣ（0.5ｍＭ）もしくはセファロスポリン（0.5
ｍＭ）とともに、最終容積1.2ｍｌとし、２２℃で培養した。２時間培養後、振盪しながら２５μｌの氷酢酸を添加し、次いで遠心分離（10
,000G,５分間）して蛋白を除去した上澄液を得た。この液体をＱＡＥ−セファデ
ックスカラム（１ｍｌ容積）に吸収させた。この樹脂を250μlの水と200μlの0.
2ＭＮａＣｌで洗浄した。さらに250μlの0.2ＭＮａＣｌによって前記樹脂から
セファロスポリン類を溶離させた。これらを濃縮した反応生成物の試料20μlをＣ₁₈逆相マイクロボンダパックカ
ラムを用いる高速液体クロマトグラフィによって分析した。Ｏ−カルバモイル・
デスアセチル・セファロスポリンＣを7−ヒドロキシＯ−カルバモイル・デスア
セチル・セファロスポリンＣから分離するための移動相は0.1Ｍ NaH₂PO₄，ｐＨ3
.2であった。セファロスポリンＣを7−ヒドロキシセファロスポリンＣから分離
するために、移動相のｐＨを4.2まで上昇させた。溶離は２ｍｌ／分の流速で260ｎｍでの紫外吸収で検出して行った
。このようにして、Ｏ−カルバモイル・デスアセチル・セファロスポリンＣ（保
持時間5.7分）がそのヒドロキシ誘導体（保持時間3.0分）に約50％変換したこと
、ならびにセファロスポリンＣ（保持時間18.2分）が7−ヒドロキシセファロス
ポリンＣ（保持時間6.6分）に約３５％変換したことを証明することができた。
エス・リビダンス６６：pIJ 702のエキストラクトはこのような形質転換を行え
なかった。製造例８．エス・リビダンス66:pBROC 137とエス・リビダンス66:pBROC 138とに
よって産生された蛋白質のナトリウムラウリルサルフェート／ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による分析エス・リビダンス66:pBROC 137、エス・リビダンス66:pBROC 138およびエス・
リビダンス66:pIJ 702の、細胞と粒子のないエキストラクト（製造例７ａと同様
）の５μｌと１０μｌとを、ナトリウムラウリルサルフェート(SLS)で処理して
溶解している蛋白質を変性し、Laemmliの方法(英国、Nature,1970,227 680)を用いて、
SLS/12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるクロマトグラフイに付した。
クーマシーブリリアントブルーで染色することによって次のことが明らかになっ
た。すなわち同時にクロマトグラフに付した分子量が公知の蛋白質から判断でき
たが、エス・リビダンス66:pBROC 137とエス・リビダンス66:pBROC 138からのエ
キストラクトは約29,500ドルトンの蛋白質を示し、これはエス・リビダンス66:p
IJ 702からのエキストラクトには存在しないかごくわずかしか存在していないこ
とが分かった。エス・リビダンス66:pBROC 137からのエキストラクトも、大きさ
が約60,000ドルトンの著しくよく染まる蛋白質を示した。製造例９ pBROC 137とpBROC 138に含有されているＤＮＡと隣接するエス・クラ
ブリゲルス染色体からのＤＮＡの単離、特性表示およびサブクローニングａ）ｐＨＣ79中のエス・クラブリゲルスATCC 27064ＤＮＡのライブラリイの組立て 10μｇのｐＨＣ79ＤＮＡ［Holm,B.およびCollins J.(1980)Genell,291-298)を
、制限酵素のSalＩとBamHIとによって完全に消化(digest)した。さらに１０μｇ
のｐＨＣ79ＤＮＡをEcoRIとBamHIとで完全消化した。必要な“コスミドアーム(c
osmid arms)”を単離するため、上記の両消化物を、ショ糖勾配法(10〜40%)で分
画した。各コスミドアームの収量は５μｇを超える量であった。エス・クラブリゲルスATCC 27064の染色体ＤＮＡの100μｇを、Sau 3AＩで部
分的に消化し、ショ糖勾配法(10〜40%)で分画した。３０Ｋｂを超え５０Ｋｂを
超えない制限フラグメントを含有するフラクションを集め、この大きさの範囲の
Sau 3AＩによるフラグメントの約10μｇを得た。これらのフラグメントを、1:1:
1のモル比で、前記コスミドアームに連結した（ＤＮＡ濃度200μｇｍl^-1）。
２４時間後、この連結混合物をλファージに生体外でパッケージした（フアージ
λ・パッケージング・エキストラクトとプロトコールは、Am ersham International PLCが供給されている）。イー・コリＤＨＩをトランスフ
ェクションさせることによって［Low,B.(1968)PNAS 60,161-167］、5×10⁷のト
ランスフェクタント(transfectant)／（μｇパッケージされたＤＮＡ）を得た。ｂ）エス・クラブリゲルスATCC 27064 DNAライブラリイからのＤＮＡセグメント
（Ｉ）のの単離と、このＤＮＡのpIJ 702へのサブクローニングエス・クラブリゲルスATCC 27064ＤＮＡの挿入体を有するpHC 79を保有するイ
ー・コリＤＨＩの5000のコロニイを、ニトロセルロースのフィルターに固定化し
て溶解した。pBROC137由来の1.2KbBClI−KpnIエンデットフラグメントを単離し
てニックトランスレートした。このフラグメントを、標準コロニイハイブリット
形成技法によってフィルターをプローブ(probe)した。７つのハイブリッドを形
成しているコロニイが得られ、そのうちのひとつが第１(a)図に示すＤＮＡセグ
メント（Ｉ）を保有していた。ＤＮＡセグメント（Ｉ）のフラグメントのサブクローニングを、このクローンされたＤＮＡの１０μｇをBamHIで消化すること
から開始した。ベクターのpIJ 702の５μｇをBgl IIで消化し、CIAPで処理して
再環化するのを防止した。前記のBam HIで生成したフラグメントと、BglIIで消
化しCIAPで処理したpIJ 702とを、2:1のモル比で連結し、５０μｇ／ｍlのＤＮ
Ａ濃度とした。１５℃で２４時間培養後、0.5μｇの連結混合物をエス・リビダ
ンス66に形質転換し、2×10⁵形質転換細胞／μｇを得た。この形質転換細胞をス
クリーニングすることによって、他のBamHIフラグメントクローンを有するpBROC
303を単離することができた。

【図面の簡単な説明】第１(a)図は、ペニシリンとセファロスポリンの生合成に関与する遺伝子の遺
伝情報を指定するエス・クラブリゲルスATCC 27064染色体ＤＮＡ（Ｉ）のエンド
ヌクレアーゼ制限地図、第１(b)図は、プラスミドpBROC 138内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエン
ドヌクレアーゼ制限地図、第１(C)図は、プラスミドpBROC 137内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエン
ドヌクレアーゼ制限地図、第１(d)図は、プラスミドpBROC 303内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエン
ドヌクレアーゼ制限地図、第２図は、プラスミドpBROC 137とpBROC 138のエンドヌクレアーゼ制限地図お
よび第３図は、プラスミドpBROC 303のエンドヌクレアーゼ制限地図である。

Claims

【特許請求の範囲】１．下記制限部位の立体配置：を有し、ペニシリンとセファロスポリンのβ-ラクタム化合物類の生合成に関与
するペニシリンＮ合成酵素、デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素及びＯ−
カルバモイルデスアセチルセファロスポリンＣ７−ヒドロキシラーゼをコードす
る遺伝子を含む、ストレプトミセス・クラブリゲルス ATCC 27064 DNAコスミド
ライブラリーからSau 3A制限フラグメントとして得ることができるDNA。２．ペニシリンＮ合成酵素又はデアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素を
エンコードし、下記制限部位の立体配置；を有する、ストレプトミセス・クラブリゲルス ATCC 27064 DNAライブラリーか
らSau3A制限フラグメントとして得ることができる特許請求の範囲第１項記載のD
NA。３．Ｏ−カルバモイルデスアセチルセファロスポリンＣ７−ヒドロキシラー
ゼをエンコードし、下記制限部位の立体配置；を有する、下記制限部位の立体配置：を有するDNAからBam HI制限フラグメントとして得ることができる特許請求の範
囲第１項記載のDNA。４．ストレプトミセス属の菌由来のプラスミドまたはテンペレートファージ
中にクローン化された、下記制限部位の立体配置：を有し、ペニシリンとセファロスポリンのβ-ラクタム化合物類の生合成に関与
するペニシリンＮ合成酵素、デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素及びＯ−
カルバモイルデスアセチルセファロスポリンＣ７−ヒドロキシラーゼをコードす
る遺伝子を含む、ストレプトミセス・クラブリゲルス ATCC 27064 DNAコスミド
ライブラリーからSau3A制限フラグメントとして得ることができるDNAを含有する
組換えベクター。５．プラスミドが、pIJ 702である特許請求の範囲第４項記載の組換えベク
ター。６．下記制限部位の立体配置；で示される約11.5kbのpBROC137もしくは約11.6kbのpBROC138、又は下記制限部位
の立体配置；で示される約12.5kbのpBROC303からなる特許請求の範囲第５項記載の組換えベク
ター。７．ストレプトミセス属の菌由来のプラスミドまたはテンペレートファージ
中にクローン化された、下記制限部位の立体配置：を有し、ペニシリンとセファロスポリンのβ-ラクタム化合物類の生合成に関与
するペニシリンＮ合成酵素、デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素及びＯ−
カルバモイルデスアセチルセファロスポリンＣ７−ヒドロキシラーゼをコードす
る遺伝子を含む、ストレプトミセス・クラブリゲルス ATCC 27064 DNAコスミド
ライブラリーからSau3A制限フラグメントとして得ることができるDNAを含有する
少なくとも１つの組換えベクターで形質転換された宿主。８．宿主が、ストレプトミセス属の菌である特許請求の範囲第７項記載の宿
主。９．ストレプトミセス属の菌が、DSM寄託番号1567のエス・リビダンス66(S.
lividans 66)である特許請求の範囲第８項記載の宿主。１０．ストレプトミセス・クラブリゲルスNCIB 12208。１１．下記制限部位の立体配置；を有し、ペニシリンとセファロスポリンのβ-ラクタム化合物類の生合成に関与
するペニシリンＮ合成酵素、デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素及びＯ−
カルバモイルデスアセチルセファロスポリンＣ７−ヒドロキシラーゼをコードす
る遺伝子を含む、ストレプトミセス・クラブリゲルス ATCC 27064 DNAコスミド
ライブラリーからSau 3A制限フラグメントとして得ることができるDNAを、β-ラ
クタム抗生物質を産生する微生物のDNAにハイブリッド形成させることからなる
、その微生物からのβ-ラクタム抗生物質の生合成に関与する遺伝子の単離方法
。