JP2540143B2 - 組換え体ｄｎａ類およびその用途 - Google Patents
組換え体ｄｎａ類およびその用途Info
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- JP2540143B2 JP2540143B2 JP62021658A JP2165887A JP2540143B2 JP 2540143 B2 JP2540143 B2 JP 2540143B2 JP 62021658 A JP62021658 A JP 62021658A JP 2165887 A JP2165887 A JP 2165887A JP 2540143 B2 JP2540143 B2 JP 2540143B2
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、組換え体DNA分子類、特に、β−ラクタ
ム抗生物質類ことにペニシリン類とセファロスポリン類
の生合成に関与する１以上の酵素の遺伝情報を指定する
１以上の遺伝子を有するDNAフラグメントが挿入されこ
れを保有する微生物宿主を形質転換するのに用いる組換
え体ベクター類に関する。
ム抗生物質類ことにペニシリン類とセファロスポリン類
の生合成に関与する１以上の酵素の遺伝情報を指定する
１以上の遺伝子を有するDNAフラグメントが挿入されこ
れを保有する微生物宿主を形質転換するのに用いる組換
え体ベクター類に関する。
ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces c
lavuligerus）のごとき微生物によって産生されるβ−
ラクタム抗生物質の生合成の解釈については進展は遅々
としたものであった。それにもかかわらず、ある種のペ
ニシリン類とセファロスポリン類（セファマイシン類を
含む）の生合成経路が密接に関連していることが立証さ
れたのである。
lavuligerus）のごとき微生物によって産生されるβ−
ラクタム抗生物質の生合成の解釈については進展は遅々
としたものであった。それにもかかわらず、ある種のペ
ニシリン類とセファロスポリン類（セファマイシン類を
含む）の生合成経路が密接に関連していることが立証さ
れたのである。
イソペニシリンＮは、前記両グループの化合物を生合
成する場合の中間体であり、トリペプチドのδ（Ｌ−α
−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン
（LLD−ACVと呼称される場合もあるが、この明細書では
さらに簡単にACVと呼称する）にサイクラーゼ（cyclas
e）酵素を作用させて製造される。中間体のイソペニシ
リンＮはペニシリンＧに変換することができるが、エピ
メラーゼ酵素の作用でペニシリンＮにも変換することが
できる。そして、後者のペニシリンＮから、最初の、エ
クスパンダーゼ（expandase）酵素による環拡大反応（r
ing expansion）とこれに続く多段の経路によって、種
々のセファロスポリン類やセファマイシン類が誘導され
る。この技術の水準を最近要約したものが、J.F.Martin
およびP.Liras,Trend in Biotechnology,1985,３,39-44
に記載されている。セファマイシンＣを生合成する場
合、まずペニシリンＮがデアセトキシセファロスポリン
Ｃに変換され、次いでこのデアセトキシセファスポリン
Ｃがジオキシゲナーゼ酵素によってデスアセチルセファ
ロスポリンＣに変換される。このデスアセチルセファス
ポリンＣはＯ−カルバモイル化されてＯ−カルバモイル
デスアセチルセファロスポリンＣに変換され、ついでこ
のカルバモイル化物がセファマイシンＣに変換される。
セファマイシンＣの７α−メトキシ基は、次の２工程に
よって、すなわち、Ｏ−カルバモイルデスアセチルセフ
ァロスポリンＣに７−ヒドロキシラーゼ酵素を作用させ
て、その７α−ヒドロキシ誘導体を得、次いでメチル化
反応に付することによって誘導されるということは、J.
D.Hoodらの研究（J.Chem.Soc.Chem.Commun,1983,第1187
-1188頁およびその引用文献）に照らして可能であろ
う。
成する場合の中間体であり、トリペプチドのδ（Ｌ−α
−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン
（LLD−ACVと呼称される場合もあるが、この明細書では
さらに簡単にACVと呼称する）にサイクラーゼ（cyclas
e）酵素を作用させて製造される。中間体のイソペニシ
リンＮはペニシリンＧに変換することができるが、エピ
メラーゼ酵素の作用でペニシリンＮにも変換することが
できる。そして、後者のペニシリンＮから、最初の、エ
クスパンダーゼ（expandase）酵素による環拡大反応（r
ing expansion）とこれに続く多段の経路によって、種
々のセファロスポリン類やセファマイシン類が誘導され
る。この技術の水準を最近要約したものが、J.F.Martin
およびP.Liras,Trend in Biotechnology,1985,３,39-44
に記載されている。セファマイシンＣを生合成する場
合、まずペニシリンＮがデアセトキシセファロスポリン
Ｃに変換され、次いでこのデアセトキシセファスポリン
Ｃがジオキシゲナーゼ酵素によってデスアセチルセファ
ロスポリンＣに変換される。このデスアセチルセファス
ポリンＣはＯ−カルバモイル化されてＯ−カルバモイル
デスアセチルセファロスポリンＣに変換され、ついでこ
のカルバモイル化物がセファマイシンＣに変換される。
セファマイシンＣの７α−メトキシ基は、次の２工程に
よって、すなわち、Ｏ−カルバモイルデスアセチルセフ
ァロスポリンＣに７−ヒドロキシラーゼ酵素を作用させ
て、その７α−ヒドロキシ誘導体を得、次いでメチル化
反応に付することによって誘導されるということは、J.
D.Hoodらの研究（J.Chem.Soc.Chem.Commun,1983,第1187
-1188頁およびその引用文献）に照らして可能であろ
う。
現在よく知られているように、組換え体DNA技術によ
って、あるベクターが有するDNAを宿主細胞に挿入する
ことによって、形質転換された宿主に、挿入DNAが有す
る遺伝子がエンコード（encode）するどんな蛋白質や酵
素でも合成する性能を付与することが可能である（組換
え体DNA方法論の充分な検討、この明細書に用いる用語
の辞典については、R.W.OldとS.B.Primrose著、第３
版、Blackwell Scientific Publications,1985の“Prin
ciples of gene manipulation"を参照のこと）。
って、あるベクターが有するDNAを宿主細胞に挿入する
ことによって、形質転換された宿主に、挿入DNAが有す
る遺伝子がエンコード（encode）するどんな蛋白質や酵
素でも合成する性能を付与することが可能である（組換
え体DNA方法論の充分な検討、この明細書に用いる用語
の辞典については、R.W.OldとS.B.Primrose著、第３
版、Blackwell Scientific Publications,1985の“Prin
ciples of gene manipulation"を参照のこと）。
シイ・アクレモニウム（C.acremonium）由来のイソペ
ニシリンＮシンテターゼ（サイクラーゼ）遺伝子のイー
・コリ（E.coli）における分離と発現は最近、S.M.Sams
onらによって報告された（Nature,1985,318,191-19
4）。
ニシリンＮシンテターゼ（サイクラーゼ）遺伝子のイー
・コリ（E.coli）における分離と発現は最近、S.M.Sams
onらによって報告された（Nature,1985,318,191-19
4）。
この発明を明確にするため、下記の図面が参照され
る。
る。
第１（ａ）図は、ペニシリンとセファロスポリンの生
合成に関与する遺伝子の遺伝情報を指定するエス・クラ
ブリゲルスATCC27064染色体DNA（Ｉ）のエンドヌクレア
ーゼ制限地図である。
合成に関与する遺伝子の遺伝情報を指定するエス・クラ
ブリゲルスATCC27064染色体DNA（Ｉ）のエンドヌクレア
ーゼ制限地図である。
第１（ｂ）図は、プラスミドpBROC138内に含まれるDN
A（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。
A（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。
第１（ｃ）図は、プラスミドpBROC137内に含まれるDN
A（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。
A（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。
第１（ｄ）図は、プラスミドpBROC303内に含まれるDN
A（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。
A（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。
第２図は、プラスミドpBROC137とpBROC138のエンドヌ
クレアーゼ制限地図である。
クレアーゼ制限地図である。
第３図は、プラスミドpBROC303のエンドヌクレアーゼ
制限地図である。
制限地図である。
したがって、この発明は、ペニシリンとセファロスポ
リンのβ−ラクタム化合物の生合成に関与する１以上の
酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有する、第
１（ａ）図に示す制限座位の配置を有するDNA（Ｉ）ま
たはそのDNA由来のフラグメントを提供するものであ
る。
リンのβ−ラクタム化合物の生合成に関与する１以上の
酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有する、第
１（ａ）図に示す制限座位の配置を有するDNA（Ｉ）ま
たはそのDNA由来のフラグメントを提供するものであ
る。
さらにこの発明は、ペニシリンおよびセファロスポリ
ンのβ−ラクタム化合物類の生合成に関与する１つ以上
の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有する挿
入DNAもしくはこのDNA由来の制限フラグメントを有し、
前記DNAが第１（ａ）図に示す制限座位の配置を有す
る、宿主細胞を形質転換できる組換え体ベクターを提供
するものである。
ンのβ−ラクタム化合物類の生合成に関与する１つ以上
の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有する挿
入DNAもしくはこのDNA由来の制限フラグメントを有し、
前記DNAが第１（ａ）図に示す制限座位の配置を有す
る、宿主細胞を形質転換できる組換え体ベクターを提供
するものである。
したがって、この発明は他の態様として、この発明の
組換え体ベクターによって形質転換された宿主細胞を提
供するものである。かような宿主細胞として適切なのは
微生物であり、好ましいのは、イー・コリ（E.coli）、
ストレプトミセス属の微生物の、例えばエス・リビダン
ス66（S.lividans 66）（DSM寄託番号第1567号）であ
る。
組換え体ベクターによって形質転換された宿主細胞を提
供するものである。かような宿主細胞として適切なのは
微生物であり、好ましいのは、イー・コリ（E.coli）、
ストレプトミセス属の微生物の、例えばエス・リビダン
ス66（S.lividans 66）（DSM寄託番号第1567号）であ
る。
当業者によって容易に認識されることであるが、式Ｉ
（ａ）に示す全DNAセグメント（Ｉ）をこの発明の組換
え体プラスミドに利用することは不便で望ましくないこ
とである。したがって、式Ｉ（ａ）に示す全長のDNA
（Ｉ）由来の適切な制限フラグメントは、ペニシリン類
とセファロスポリン類の生合成に関与する１以上の完全
な遺伝子を有する場合、挿入DNAとして用いることがで
きる。
（ａ）に示す全DNAセグメント（Ｉ）をこの発明の組換
え体プラスミドに利用することは不便で望ましくないこ
とである。したがって、式Ｉ（ａ）に示す全長のDNA
（Ｉ）由来の適切な制限フラグメントは、ペニシリン類
とセファロスポリン類の生合成に関与する１以上の完全
な遺伝子を有する場合、挿入DNAとして用いることがで
きる。
この発明の制限フラグメントは、公知の方法により、
適切な制限酵素で開裂することによってDNAセグメント
（Ｉ）から得ることができる。
適切な制限酵素で開裂することによってDNAセグメント
（Ｉ）から得ることができる。
特に好ましいDNAフラグメントとしては、前記第１
（ｂ）図、第１（ｃ）図および第１（ｄ）図に示す制限
座位の配置を有するDNAフラグメントが挙げられる。
（ｂ）図、第１（ｃ）図および第１（ｄ）図に示す制限
座位の配置を有するDNAフラグメントが挙げられる。
第１〜３図において、略記号ClaI、BclIなどは制限エ
ンドヌクレアーゼ類の通常の略記号であり（OldおよびP
rimroseの前記文献参照）、アガロースゲル電気泳動法
で行ったサイジング実験によって測定したものであるが
DNAのおよその長さ〔キロベース（Kb）〕を示した。第
１〜３図は、前記サイジング実験によって測定された、
制限酵素開裂座位の近似の位置を示すもので、図示した
DNAに存在する可能性のあるすべての制限座位を、示そ
うと必ずしも意図するものではないと解されるべきであ
る。
ンドヌクレアーゼ類の通常の略記号であり（OldおよびP
rimroseの前記文献参照）、アガロースゲル電気泳動法
で行ったサイジング実験によって測定したものであるが
DNAのおよその長さ〔キロベース（Kb）〕を示した。第
１〜３図は、前記サイジング実験によって測定された、
制限酵素開裂座位の近似の位置を示すもので、図示した
DNAに存在する可能性のあるすべての制限座位を、示そ
うと必ずしも意図するものではないと解されるべきであ
る。
第１（ａ）図に示されるDNAまたは第１（ｂ）,1
（ｃ）および１（ｄ）図に示すフラグメントのような前
記DNA由来の適切な制限フラグメントは、ペニシリン類
もしくはセファロスポリン類の生合成に関与する酵素の
遺伝子情報を指定する遺伝子を発現できるいずれの宿主
細胞でも形質転換しうるいずれのベクターにも連結する
ことができる。
（ｃ）および１（ｄ）図に示すフラグメントのような前
記DNA由来の適切な制限フラグメントは、ペニシリン類
もしくはセファロスポリン類の生合成に関与する酵素の
遺伝子情報を指定する遺伝子を発現できるいずれの宿主
細胞でも形質転換しうるいずれのベクターにも連結する
ことができる。
この発明のDNAを発現できる適切な宿主細胞として
は、イー・コリ、ペニシリウム（Penicillium）種、セ
ファロスポリウム（Cephalosporium）種、またはエス・
クラブリゲルスおよびエス・リビダンスのようなストレ
プトミセスの種（スペシーズ）が挙げられる。
は、イー・コリ、ペニシリウム（Penicillium）種、セ
ファロスポリウム（Cephalosporium）種、またはエス・
クラブリゲルスおよびエス・リビダンスのようなストレ
プトミセスの種（スペシーズ）が挙げられる。
通常、この発明のDNAがクローンされるベクターは、
プラスミドであり、例えばストレプトミセス属の菌（St
reptomycete）由来のプラスミド、またはテンペレート
ファージもしくはビルレントファージである。
プラスミドであり、例えばストレプトミセス属の菌（St
reptomycete）由来のプラスミド、またはテンペレート
ファージもしくはビルレントファージである。
適切なベクターの例は、pIJ702（分子量8.9メガドル
トン）であり、すなわちKatz,E.ら、J.Gen.microbiol.1
983,129,2703-2714に記載された高コピイ数プラスミド
でJohn Innes Institute,Norwich,英国より入手可能で
ある。
トン）であり、すなわちKatz,E.ら、J.Gen.microbiol.1
983,129,2703-2714に記載された高コピイ数プラスミド
でJohn Innes Institute,Norwich,英国より入手可能で
ある。
適切なテンペレート ファージの例は、φC31として
知られているファージであり、Lomovskaya,N.D.,Chate
r,K.F.,Mkrtumian,N.M.,Bacheriol.Rev.,1980,44,206〜
229に記載されている。
知られているファージであり、Lomovskaya,N.D.,Chate
r,K.F.,Mkrtumian,N.M.,Bacheriol.Rev.,1980,44,206〜
229に記載されている。
この発明の組換え体ベクターは、第１（ａ）図に示す
挿入DNAもしくはこのDNA由来の制限フラグメントを、選
択された〔線形化（linearized）〕ベクターに、任意の
便利な方法例えば付着端の直接接合法、ホモポリマー・
テーリング法（tailing）またはリンカーもしくはアダ
プター分子により、連結することによって製造すること
ができる。
挿入DNAもしくはこのDNA由来の制限フラグメントを、選
択された〔線形化（linearized）〕ベクターに、任意の
便利な方法例えば付着端の直接接合法、ホモポリマー・
テーリング法（tailing）またはリンカーもしくはアダ
プター分子により、連結することによって製造すること
ができる。
上記の方法によって製造された組換え体ベクターは、
２つの可能な配向のうちの一つの配向の挿入DNAを有し
ていることが分かる。両方の配向を有する組換え体ベク
ターもこの発明の権利範囲に含まれる。
２つの可能な配向のうちの一つの配向の挿入DNAを有し
ていることが分かる。両方の配向を有する組換え体ベク
ターもこの発明の権利範囲に含まれる。
適切な組換え体ベクターは、上記の第１（ｂ）,1
（ｃ）および１（ｄ）図に示す制限座位の配置を特徴と
するDNAフラグメントを有するプラスミドである。好ま
しい組換え体分子は： （ｉ）第１（ｂ）図に示すDNAフラグメントがpIJ702のB
gl II座位に挿入されているか（その構造物は以下にpBR
OC138と呼称される）、 （ii）第１（ｃ）図に示すDNAフラグメントがpIJ702のB
gl II座位に挿入されているか（その構造物は以下にpBR
OC137と呼称される）、または （iii）第１（ｄ）図に示すDNAフラグメントがpIJ702の
Bgl II座位に挿入されている（その構造物は以下にpBRO
C300と呼称される） 分子である。
（ｃ）および１（ｄ）図に示す制限座位の配置を特徴と
するDNAフラグメントを有するプラスミドである。好ま
しい組換え体分子は： （ｉ）第１（ｂ）図に示すDNAフラグメントがpIJ702のB
gl II座位に挿入されているか（その構造物は以下にpBR
OC138と呼称される）、 （ii）第１（ｃ）図に示すDNAフラグメントがpIJ702のB
gl II座位に挿入されているか（その構造物は以下にpBR
OC137と呼称される）、または （iii）第１（ｄ）図に示すDNAフラグメントがpIJ702の
Bgl II座位に挿入されている（その構造物は以下にpBRO
C300と呼称される） 分子である。
この発明のDNAを作製するために、ランダム配列のDNA
フラグメントをエス・クラブリゲルス（ATCC27064）の
全細胞DNAを任意の便利な制限酵素で部分消化すること
によって生成させることができる。エンドヌクレアーゼ
Sau 3AI（以下Sau 3A）と略記する）とそのアイソシゾ
マー類は、この目的に特に適している。
フラグメントをエス・クラブリゲルス（ATCC27064）の
全細胞DNAを任意の便利な制限酵素で部分消化すること
によって生成させることができる。エンドヌクレアーゼ
Sau 3AI（以下Sau 3A）と略記する）とそのアイソシゾ
マー類は、この目的に特に適している。
次いでこのDNAフラグメントは、ショ糖勾配法でサイ
ズの分画がなされ、3Kbを超え好ましくは15Kbを超えな
い長さのフラグメントが分離される。好ましいフラグメ
ントは大きさが４〜14Kbのものである。次いでそのDNA
フラグメントは、適切に開裂されたベクター例えばpIJ7
02に通常の“ショット・ガン”法によって連結され、再
環化した後、その組換え体ベクターは、セファマイシン
Ｃを産生する性能の欠除しているエス・クラブリゲリス
の菌株に形質転換される。
ズの分画がなされ、3Kbを超え好ましくは15Kbを超えな
い長さのフラグメントが分離される。好ましいフラグメ
ントは大きさが４〜14Kbのものである。次いでそのDNA
フラグメントは、適切に開裂されたベクター例えばpIJ7
02に通常の“ショット・ガン”法によって連結され、再
環化した後、その組換え体ベクターは、セファマイシン
Ｃを産生する性能の欠除しているエス・クラブリゲリス
の菌株に形質転換される。
この目的のために適切なエス・クラブリゲルスの菌株
は、エス・クラブリゲルスNCP−５であり、これは、Bee
cham Culture Collectionに1986年１月29日付けで寄託
番号BCC1で寄託され、その後the National Collection
of Industrial and Marine Bacteria,Aberdeen,Scotlan
dに移され、その寄託（NCIB12208,1986年２月19日付で
寄託）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブタペスト条約に基づいて行われた。
は、エス・クラブリゲルスNCP−５であり、これは、Bee
cham Culture Collectionに1986年１月29日付けで寄託
番号BCC1で寄託され、その後the National Collection
of Industrial and Marine Bacteria,Aberdeen,Scotlan
dに移され、その寄託（NCIB12208,1986年２月19日付で
寄託）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブタペスト条約に基づいて行われた。
したがって、エス・クラブリゲルスNCIB12208はこの
発明の他の態様を形成する。
発明の他の態様を形成する。
エス・クラブリゲルスNCP−５（エス・クラブリゲル
スNCIS12208）の派生と特性は次のとおりである。
スNCIS12208）の派生と特性は次のとおりである。
エス・クラブリゲルスNCP−５の派生（derivation） エス・クラブリゲルス（ATCC27064）の試料の密封ア
ンプルを開いたところ種々の形態を示した。14の異なる
タイプが認められた。これらの一つを、エス・クラブリ
ゲルスSC−２として分離した。これを培養すると、エス
・クラブリゲルスSC−２自体が種々の形態を示した。
‘小さな’変種の一例から、‘大きな’コロニイの変異
細胞が自然に得られ、エス・クラブリゲルスNCP−５と
命名された。
ンプルを開いたところ種々の形態を示した。14の異なる
タイプが認められた。これらの一つを、エス・クラブリ
ゲルスSC−２として分離した。これを培養すると、エス
・クラブリゲルスSC−２自体が種々の形態を示した。
‘小さな’変種の一例から、‘大きな’コロニイの変異
細胞が自然に得られ、エス・クラブリゲルスNCP−５と
命名された。
エス・クラブリゲルスNCP−５の分類 エス・クラブリゲルスNCP−５の分類学的および形態
学的性質は、エス・クラブリゲルス（ATCC−27064）の
それに本質的に類似していることが見出された。これら
の性質については、米国特許第3,862,008号やHiggins,
C.E.およびKastner,R.E.のInt.J.Systematic Bacterio
l.,1971,21,326-331にも記載されている。エス・クラブ
リゲルスNCP−５の培養法は、英国特許第1,508,977号明
細書に、エス・クラブリゲルス（ATCC27064）について
記載された方法と類似している。
学的性質は、エス・クラブリゲルス（ATCC−27064）の
それに本質的に類似していることが見出された。これら
の性質については、米国特許第3,862,008号やHiggins,
C.E.およびKastner,R.E.のInt.J.Systematic Bacterio
l.,1971,21,326-331にも記載されている。エス・クラブ
リゲルスNCP−５の培養法は、英国特許第1,508,977号明
細書に、エス・クラブリゲルス（ATCC27064）について
記載された方法と類似している。
前記“ショットガン”法によって得られた形質転換細
胞は、セファマイシンＣに感受性の微生物に接触させて
その微生物の増殖特性を試験することによって、セファ
マイシンＣの産生能についてスクリーニングされる。こ
の目的に適切な微生物はエイ・フェカリス（A.faecali
s）である（the National Collection of Industrial a
nd Marine BacteriaにNCIS8156の寄託番号で寄託されて
おり、また請求があればいつでもthe Beecham Culture
Collection（寄託番号BCC2）から誰でも入手しうる）。
スクリーニングのために、エイ・フェカリースは、寒天
プレート上で便利に培養され、次いで相補性試験が、当
該技術分野で公知の通常の方法で形質転換細胞類のプラ
グを寒天プレートに挿入することによって行われる。
胞は、セファマイシンＣに感受性の微生物に接触させて
その微生物の増殖特性を試験することによって、セファ
マイシンＣの産生能についてスクリーニングされる。こ
の目的に適切な微生物はエイ・フェカリス（A.faecali
s）である（the National Collection of Industrial a
nd Marine BacteriaにNCIS8156の寄託番号で寄託されて
おり、また請求があればいつでもthe Beecham Culture
Collection（寄託番号BCC2）から誰でも入手しうる）。
スクリーニングのために、エイ・フェカリースは、寒天
プレート上で便利に培養され、次いで相補性試験が、当
該技術分野で公知の通常の方法で形質転換細胞類のプラ
グを寒天プレートに挿入することによって行われる。
エイ・フェカリスのようなセファマイシン感受性微生
物を新たに接種した培地に成育阻害領域を生成する性能
によって陽性と確認された形質転換細胞が単離され、こ
れに保有されている組換え体ベクターが‘陽性’の各コ
ロニイから通常の方法で単離される。その組換え体ベク
ターを適切な制限酵素で消化することによって、各ベク
ターに挿入されたエス・クラブリゲルスDNAは、この発
明のDNAを保有しているということを調べるために通常
の方法で種々の制限酵素で開裂することによって確認さ
れ、大きさを測定し地図にされる。
物を新たに接種した培地に成育阻害領域を生成する性能
によって陽性と確認された形質転換細胞が単離され、こ
れに保有されている組換え体ベクターが‘陽性’の各コ
ロニイから通常の方法で単離される。その組換え体ベク
ターを適切な制限酵素で消化することによって、各ベク
ターに挿入されたエス・クラブリゲルスDNAは、この発
明のDNAを保有しているということを調べるために通常
の方法で種々の制限酵素で開裂することによって確認さ
れ、大きさを測定し地図にされる。
かようにして単離された２以上の‘重複’挿入体は、
全部もしくは部分的にこの発明のDNAに含まれている
が、小さすぎてペニシリン類およびセファロスポリン類
の生合成に関与する完全な遺伝子（intact gene）を入
れることができないので、通常のしかたで、共通の制限
座位を開裂し次いで連結する（例えばDNAリガーゼによ
って）ことによってしばしば融合されて、例えばpBROC1
37とpBROC138の挿入DNAもしくは前記定義のこれらのDNA
由来の適切な制限フラグメントが得られる。
全部もしくは部分的にこの発明のDNAに含まれている
が、小さすぎてペニシリン類およびセファロスポリン類
の生合成に関与する完全な遺伝子（intact gene）を入
れることができないので、通常のしかたで、共通の制限
座位を開裂し次いで連結する（例えばDNAリガーゼによ
って）ことによってしばしば融合されて、例えばpBROC1
37とpBROC138の挿入DNAもしくは前記定義のこれらのDNA
由来の適切な制限フラグメントが得られる。
DNAセグメントＩは、pBROC137もしくはpBROC138のエ
ス・クラブリゲルスDNAを用い、エス・クラブリゲルス
の全細胞DNAとpHC79〔Hohn,B.およびCollins,J.,（198
0）,Gene,11,291〕とで作製されたコスミドを保有する
イー・コリ細胞を、コロニイ・ハイブリッド形成法によ
って、同定することによって単離される。次いでプラス
ミドpBROC303がpIJ702とセグメントＩ（ｄ）のDNA（フ
ラグメントＩから得られる）とから、簡単なサブクロー
ニング法によって組立てられる。
ス・クラブリゲルスDNAを用い、エス・クラブリゲルス
の全細胞DNAとpHC79〔Hohn,B.およびCollins,J.,（198
0）,Gene,11,291〕とで作製されたコスミドを保有する
イー・コリ細胞を、コロニイ・ハイブリッド形成法によ
って、同定することによって単離される。次いでプラス
ミドpBROC303がpIJ702とセグメントＩ（ｄ）のDNA（フ
ラグメントＩから得られる）とから、簡単なサブクロー
ニング法によって組立てられる。
ペニシリン類とセファロスポリン類の生合成に関与す
る酵素の生産は、この発明のDNAを適切なベクター例え
ばpIJ702に再挿入し、次いで適切な宿主微生物、例えば
エス・リビダンス66（DSM1567）を、前記のようにして
作製した組換え体ベクターで形質転換することによって
達成される。
る酵素の生産は、この発明のDNAを適切なベクター例え
ばpIJ702に再挿入し、次いで適切な宿主微生物、例えば
エス・リビダンス66（DSM1567）を、前記のようにして
作製した組換え体ベクターで形質転換することによって
達成される。
このようにして製造された特に価値のある酵素には、
‘サイクラーゼ（cyclase）’すなわちイソペニシリン
Ｎシンテターゼ（ACVをイソペニシリンＮに変換でき
る）、‘エクスパンダーゼ’すなわちデアセトキシセフ
ァロスポリンＣシンテターゼ（ペニシリンＮをデアセト
キシセファロスポリンＣに変換できる）、‘エピメラー
ゼ’すなわちペニシリンＮシンテターゼ（イソペニシリ
ンＮをペニシリンＮに変換できる）およびＯ−カルバモ
イルデスアセチルセファロスポリンＣ−７−ヒドロキシ
ラーゼ（Ｏ−カルバモイルデスアセチルセファロスポリ
ンＣとセファロスポリンＣとをそれぞれの７−ヒドロキ
シ誘導体に変換できる）として、当該技術分野で知られ
ている酵素（J.F.MartinおよびP.Lirasの前記文献）が
含まれる。エス・クラブリゲルスATCC27064の前記酵素
類やペニシリン類とセファロスポリン類の合成をもたら
す性能を有するいずれの他の蛋白類も、この発明の形質
転換された宿主によって産生される場合は、この発明の
他の態様を形成するものである。これら蛋白や酵素類は
高純度の形態で得ることが好ましい。
‘サイクラーゼ（cyclase）’すなわちイソペニシリン
Ｎシンテターゼ（ACVをイソペニシリンＮに変換でき
る）、‘エクスパンダーゼ’すなわちデアセトキシセフ
ァロスポリンＣシンテターゼ（ペニシリンＮをデアセト
キシセファロスポリンＣに変換できる）、‘エピメラー
ゼ’すなわちペニシリンＮシンテターゼ（イソペニシリ
ンＮをペニシリンＮに変換できる）およびＯ−カルバモ
イルデスアセチルセファロスポリンＣ−７−ヒドロキシ
ラーゼ（Ｏ−カルバモイルデスアセチルセファロスポリ
ンＣとセファロスポリンＣとをそれぞれの７−ヒドロキ
シ誘導体に変換できる）として、当該技術分野で知られ
ている酵素（J.F.MartinおよびP.Lirasの前記文献）が
含まれる。エス・クラブリゲルスATCC27064の前記酵素
類やペニシリン類とセファロスポリン類の合成をもたら
す性能を有するいずれの他の蛋白類も、この発明の形質
転換された宿主によって産生される場合は、この発明の
他の態様を形成するものである。これら蛋白や酵素類は
高純度の形態で得ることが好ましい。
かような蛋白や酵素は、通常の方法によって単離・精
製される。
製される。
この発明のDNAとこれを保有するベクターは、工業界
の多くの分野で用途が見出されている。このようなこと
は、前記ベクターで形質転換された宿主微生物およびそ
の微生物が発現する酵素にもあてはまる。例えばこのDN
Aは、ハイブリッド形成プローブとして利用して、エス
・クラブリゲルス（ATCC27064）や、類似の構造と特異
性を有する酵素を産生する他の微生物の全細胞DNAに存
在する、関連もしくは重複の遺伝子を同定・単離するこ
とができる。したがって、この発明は微生物内でβ−ラ
クタム抗生物質の生合成に関与する遺伝子を単離するた
めに、β−ラクタム抗生物質産生の微生物のDNAにハイ
ブリッド形成できるDNA（Ｉ）もしくはそのフラグメン
トの使用を提供するものである。前記DNAを保有する組
換え体ベクターは、適切な宿主に形質転換されると、セ
ファマイシンＣのような価値ある抗生物質を多量に合成
する遺伝学的に改変された微生物を製造したりまたは遺
伝子転移法による新規なもしくはハイブリッドの抗生物
質を生成させる（例えばD.A.Hopwoodら、Nature,1985,3
14,642-644参照）のに有用である。この発明のDNAによ
ってエンコード（encode）されている酵素は特に、例え
ば公知のβ−ラクタム抗生物質を、その天然の前駆体か
ら製造したりまたは新規なβ−ラクタム抗生物質を例え
ば化学合成法で得られた非天然の前駆体から製造したり
するために適切な固体の担体に固定化される場合、細胞
の存在しない系で使用することができる。
の多くの分野で用途が見出されている。このようなこと
は、前記ベクターで形質転換された宿主微生物およびそ
の微生物が発現する酵素にもあてはまる。例えばこのDN
Aは、ハイブリッド形成プローブとして利用して、エス
・クラブリゲルス（ATCC27064）や、類似の構造と特異
性を有する酵素を産生する他の微生物の全細胞DNAに存
在する、関連もしくは重複の遺伝子を同定・単離するこ
とができる。したがって、この発明は微生物内でβ−ラ
クタム抗生物質の生合成に関与する遺伝子を単離するた
めに、β−ラクタム抗生物質産生の微生物のDNAにハイ
ブリッド形成できるDNA（Ｉ）もしくはそのフラグメン
トの使用を提供するものである。前記DNAを保有する組
換え体ベクターは、適切な宿主に形質転換されると、セ
ファマイシンＣのような価値ある抗生物質を多量に合成
する遺伝学的に改変された微生物を製造したりまたは遺
伝子転移法による新規なもしくはハイブリッドの抗生物
質を生成させる（例えばD.A.Hopwoodら、Nature,1985,3
14,642-644参照）のに有用である。この発明のDNAによ
ってエンコード（encode）されている酵素は特に、例え
ば公知のβ−ラクタム抗生物質を、その天然の前駆体か
ら製造したりまたは新規なβ−ラクタム抗生物質を例え
ば化学合成法で得られた非天然の前駆体から製造したり
するために適切な固体の担体に固定化される場合、細胞
の存在しない系で使用することができる。
この発明のDNAもしくはそのフラグメント（完全な遺
伝子を必ずしももっていない）は、組換え体DNAの技術
もしくは天然の組換え工程によって、β−ラクタム合成
に関与する遺伝子のフラグメントと結合され、ハイブリ
ッド酵素の合成を命令しうるハイブリッド遺伝子が製造
される。かような酵素類は、前記方法と類似の方法によ
って新規な抗生物質を製造するのに用いられる。
伝子を必ずしももっていない）は、組換え体DNAの技術
もしくは天然の組換え工程によって、β−ラクタム合成
に関与する遺伝子のフラグメントと結合され、ハイブリ
ッド酵素の合成を命令しうるハイブリッド遺伝子が製造
される。かような酵素類は、前記方法と類似の方法によ
って新規な抗生物質を製造するのに用いられる。
またこの発明のDNAは、特定部位の突然変異誘発法の
公知の技術（例えば、G.Winterら、Nature,1982,299,75
6-758又はZollerとSmith,Nucleic Acids Research,198
2,10,6487-6500に記載されたのと類似のしかた）によっ
て改変され、特異な突然変異および／または欠失がなさ
れたDNAが得られる。その突然変異DNAは、β−ラクタム
抗生物質を産生することがすでに知られている適切な宿
主微生物から公知のβ−ラクタム抗生物質を増大した収
率（またはタイター）で得るために使用される。またこ
の突然変異DNAは、遺伝子転移法によって新規もしくは
ハイブリッドの抗生物質を得るのに用いられ、または上
記記載の方法と類似の方法によって新規な抗生物質を製
造するのに用いうる突然変位酵素（ムューテイン,mutei
n）の産生に用いられる。かような突然変異DNAはこの発
明の範囲内にあると解される。
公知の技術（例えば、G.Winterら、Nature,1982,299,75
6-758又はZollerとSmith,Nucleic Acids Research,198
2,10,6487-6500に記載されたのと類似のしかた）によっ
て改変され、特異な突然変異および／または欠失がなさ
れたDNAが得られる。その突然変異DNAは、β−ラクタム
抗生物質を産生することがすでに知られている適切な宿
主微生物から公知のβ−ラクタム抗生物質を増大した収
率（またはタイター）で得るために使用される。またこ
の突然変異DNAは、遺伝子転移法によって新規もしくは
ハイブリッドの抗生物質を得るのに用いられ、または上
記記載の方法と類似の方法によって新規な抗生物質を製
造するのに用いうる突然変位酵素（ムューテイン,mutei
n）の産生に用いられる。かような突然変異DNAはこの発
明の範囲内にあると解される。
この発明を下記実施例で説明するが、本願発明を限定
するものではない。
するものではない。
実施例 製造例１ Sau 3Aで消化されたエス・クラブリゲルス27
064DNAの４〜15Kbの大きさのピースの単離 （ａ）全細胞DNA（total cellular DNA）をエス・クラ
ブリゲルス27064から下記の方法で製造した。
064DNAの４〜15Kbの大きさのピースの単離 （ａ）全細胞DNA（total cellular DNA）をエス・クラ
ブリゲルス27064から下記の方法で製造した。
ｉ）エス・クラブリゲルス27064の胞子を、トリプトン
・ソヤ・ブロスマルトース増殖培地入りの２つの振盪フ
ラスコ（30ml/250mlスプリング振盪フラスコ；トリプト
ン・ソヤ・ブロス30g/l,マルトース10g/l）に接種し、2
6℃で48時間（240rpm）培養した。
・ソヤ・ブロスマルトース増殖培地入りの２つの振盪フ
ラスコ（30ml/250mlスプリング振盪フラスコ；トリプト
ン・ソヤ・ブロス30g/l,マルトース10g/l）に接種し、2
6℃で48時間（240rpm）培養した。
ii）菌系体（mycelium）を、10,000Gで遠心分離して収
穫した。
穫した。
iii）上澄フラクションを流出させ、ペレットを10mlの
溶解液（lysing solution;50mMトリスpH8.5,50mM Na2ED
TA,15％庶糖、リゾチーム3mg/ml）に再懸濁させ、37℃
で１時間培養した。
溶解液（lysing solution;50mMトリスpH8.5,50mM Na2ED
TA,15％庶糖、リゾチーム3mg/ml）に再懸濁させ、37℃
で１時間培養した。
iv）2mgのプロティナーゼＫ（SIGMA chemicals社）含有
のナトリウムラウリルサルフェート（10％溶液）の0.5m
lを添加し、培養を15分間続け、さらにSLS/Prot k溶液
を加え培養をさらに15分間続けた。
のナトリウムラウリルサルフェート（10％溶液）の0.5m
lを添加し、培養を15分間続け、さらにSLS/Prot k溶液
を加え培養をさらに15分間続けた。
ｖ）酢酸ナトリウム（0.3Mまで）と氷冷エタノール（２
容積）とを加えた後、DNAをガラス棒でまき取った。こ
れを数回繰返しDNAの半透明粘性の製剤を得た。
容積）とを加えた後、DNAをガラス棒でまき取った。こ
れを数回繰返しDNAの半透明粘性の製剤を得た。
（ｂ）エス・クラブリゲルス27064からの染色体DNAのSa
u 3Aによる部分消化 180μｇの全細胞DNAを、推奨された緩衝液中、12単位
のSau 3A制限酵素（NEW ENGLAND BIOLABS供給）ととも
に30分間37℃で培養した。酵素を70℃で変性させること
によって反応を停止させた。DNAの消化の度合をアガロ
ースゲル電気泳動法によって試験したところ、得られた
フラグメントは15Kb〜0.16Kbの大きさの範囲にあること
が見出された。
u 3Aによる部分消化 180μｇの全細胞DNAを、推奨された緩衝液中、12単位
のSau 3A制限酵素（NEW ENGLAND BIOLABS供給）ととも
に30分間37℃で培養した。酵素を70℃で変性させること
によって反応を停止させた。DNAの消化の度合をアガロ
ースゲル電気泳動法によって試験したところ、得られた
フラグメントは15Kb〜0.16Kbの大きさの範囲にあること
が見出された。
（ｃ）ショ糖勾配法（40〜10％ W/v）によるSau 3Aによ
って部分的に消化されたDNAの分画 ショ糖の勾配法（40〜10％）を“Genetic ManipuLati
on of Streptomyces-A Laboratory Manual,著者:D.A.Ho
pwoodら,the John Innes Foundation発行1985"に記載し
てあるのと同様にして、ショ糖の勾配（40〜10％）を13
mlの遠心分離管内に作製した。
って部分的に消化されたDNAの分画 ショ糖の勾配法（40〜10％）を“Genetic ManipuLati
on of Streptomyces-A Laboratory Manual,著者:D.A.Ho
pwoodら,the John Innes Foundation発行1985"に記載し
てあるのと同様にして、ショ糖の勾配（40〜10％）を13
mlの遠心分離管内に作製した。
エス・クラブリゲルス27064DNAのSau 3Aによる部分消
化物（0.5ml中100μｇ）を前記ショ糖勾配の上面に注意
深く積層し、その系を21時間30000rpm（105gav）で遠心
分離した。
化物（0.5ml中100μｇ）を前記ショ糖勾配の上面に注意
深く積層し、その系を21時間30000rpm（105gav）で遠心
分離した。
遠心分離管を遠心分離器から取り外し、該分離管の底
部にあけた孔から、400μｌづつのフラクションを採取
した。これらのフラクションの５μｌ試料をゲル電気泳
動法で試験し、大きさが４〜14KbのDNAを含有すること
を示したフラクションを集めた。
部にあけた孔から、400μｌづつのフラクションを採取
した。これらのフラクションの５μｌ試料をゲル電気泳
動法で試験し、大きさが４〜14KbのDNAを含有すること
を示したフラクションを集めた。
このようにして、Sau 3Aで消化され、大きさが４−14
KbのDNAの12μｇを得た。
KbのDNAの12μｇを得た。
製造例２ エス・クラブリゲルス27064DNAのSau 3Aによ
るフラグメントをクローンするのに適切なpIJ702ベクタ
ーDNAの製造 （ａ）プラスミドDNAの単離 エス・クラブリゲルス27064:pIJ702の胞子を振盪フラ
スコ中のTSB/マルトース培地［培地調製に関する製造例
１（ａ）参照］に接種した。プラスミドの安定性を保持
するためにチオストレプトンを2.5μg/mlまで添加し
た。微生物を48時間、26℃で培養した。pIJ702［Katz,
E.ら,J.Gen.Microbiol.（1983）129,2703-2714参照］プ
ラスミドを、中性溶菌法（the Neutral Lysis Procedur
e,Hopwoodら,1985の前記文献参照）を用いて菌系体から
単離した。このようにして、pIJ702DNAの50μｇを単離
した。
るフラグメントをクローンするのに適切なpIJ702ベクタ
ーDNAの製造 （ａ）プラスミドDNAの単離 エス・クラブリゲルス27064:pIJ702の胞子を振盪フラ
スコ中のTSB/マルトース培地［培地調製に関する製造例
１（ａ）参照］に接種した。プラスミドの安定性を保持
するためにチオストレプトンを2.5μg/mlまで添加し
た。微生物を48時間、26℃で培養した。pIJ702［Katz,
E.ら,J.Gen.Microbiol.（1983）129,2703-2714参照］プ
ラスミドを、中性溶菌法（the Neutral Lysis Procedur
e,Hopwoodら,1985の前記文献参照）を用いて菌系体から
単離した。このようにして、pIJ702DNAの50μｇを単離
した。
（ｂ）エス・クラブリゲルス27064からのpIJ702DNAのBg
l IIによる消化 30μｇのpIJ 702DNAを、推奨の制限緩衝液（全容積40
0μｌ）中のBgl II制限酵素（Amersham International
により供給された100単位）で、30分間37℃で消化し
た。
l IIによる消化 30μｇのpIJ 702DNAを、推奨の制限緩衝液（全容積40
0μｌ）中のBgl II制限酵素（Amersham International
により供給された100単位）で、30分間37℃で消化し
た。
70℃で30分間培養することによって反応を停止した。
反応混合物の試料をアガロースゲル電気泳動法（0.7
％ゲル）で試験したところ、当初存在した共有閉環状プ
ラスミド［closed covalent circular（ccc）plasmid］
はすべて直線形に変換していた。
％ゲル）で試験したところ、当初存在した共有閉環状プ
ラスミド［closed covalent circular（ccc）plasmid］
はすべて直線形に変換していた。
（ｃ）Bgl IIで消化されたpIJ702DNAの小牛の腸のアル
カリ性ホスファターゼ（CIAP）による処理 この処理は、“Molecular Cloning-A Laboratory Mon
ual,“Maniatis,T.ら,cold Spring Harbour Laboratory
（1982）発行”に記載されているのと同様にして行っ
た。
カリ性ホスファターゼ（CIAP）による処理 この処理は、“Molecular Cloning-A Laboratory Mon
ual,“Maniatis,T.ら,cold Spring Harbour Laboratory
（1982）発行”に記載されているのと同様にして行っ
た。
T4DANリガーゼの存在下、CIAPで処理したDNAを試験し
た結果、酵素によって脱リン酸化を行った後は、もはや
自己連結（self-ligate）しないことが分かった。
た結果、酵素によって脱リン酸化を行った後は、もはや
自己連結（self-ligate）しないことが分かった。
製造例3. エス・クラブリゲルス27064の、3au 3Aで消
化された全細胞DNAと、Bgl IIで消化されCIAPで処理さ
れたpIJ702DNAとの連結 Sau 3Aで消化されたエス・クラブリゲルス27064の染
色体DNA（4-14Kb）の１μｇを含有する15μｌの水を入
れた12の各容器に、Bgl IIで消化されCIAPで処理された
pIJ702（0.5μg/ポット）含有の緩衝液100μｌを加え
て、最終濃度を1.5μgDNA/150μｌ、トリス塩酸pH7.5緩
衝液（66mM）、MgCl2（6.6mM）、ジチオトレイトール
（10mM）およびアデノシントリホフエート（0.4mM）と
した。T4DNAリガーゼ（0.1単位、Amersham Internation
al社より供給）を各ポットに添加し、各系を15℃で72時
間培養し、必要な容器に移した。
化された全細胞DNAと、Bgl IIで消化されCIAPで処理さ
れたpIJ702DNAとの連結 Sau 3Aで消化されたエス・クラブリゲルス27064の染
色体DNA（4-14Kb）の１μｇを含有する15μｌの水を入
れた12の各容器に、Bgl IIで消化されCIAPで処理された
pIJ702（0.5μg/ポット）含有の緩衝液100μｌを加え
て、最終濃度を1.5μgDNA/150μｌ、トリス塩酸pH7.5緩
衝液（66mM）、MgCl2（6.6mM）、ジチオトレイトール
（10mM）およびアデノシントリホフエート（0.4mM）と
した。T4DNAリガーゼ（0.1単位、Amersham Internation
al社より供給）を各ポットに添加し、各系を15℃で72時
間培養し、必要な容器に移した。
製造例4.エス・クラブリゲルスNCP-5:pIJ702/27064クロ
ーンのライブラリイの作製 （ａ）pIJ702中に挿入されたDNAの頻度とDNA挿入体の大
きさに関する、エス・リビダンス66内の連結DNAの試験 1.5μｇの連結DNA（エス・クラブリゲルス27064から
製造され、Bgl IIで消化されCIAPで処理されたPIJ702を
連結したエス・クラブリゲルス27064のSau 3Aによつて
得られた４−14Kbのフラグメント）を10μｌのTE緩衝液
（1mM Na2EDTA,10mMトリス塩酸pH8.2）に溶解し、その
５μｌづつの２つのを、エス・リビダンス66（DSM156
7）の原形質体［1010原形質体/ml,25％ポリエチレング
リコール（平均分子量1000）の存在下、“Genetic Mani
pulation of Streptomyes-A Laboratory Mannual"に記
載したのと同様にして製造］の100μｌづつの２つの形
質転換するのに用いた。
ーンのライブラリイの作製 （ａ）pIJ702中に挿入されたDNAの頻度とDNA挿入体の大
きさに関する、エス・リビダンス66内の連結DNAの試験 1.5μｇの連結DNA（エス・クラブリゲルス27064から
製造され、Bgl IIで消化されCIAPで処理されたPIJ702を
連結したエス・クラブリゲルス27064のSau 3Aによつて
得られた４−14Kbのフラグメント）を10μｌのTE緩衝液
（1mM Na2EDTA,10mMトリス塩酸pH8.2）に溶解し、その
５μｌづつの２つのを、エス・リビダンス66（DSM156
7）の原形質体［1010原形質体/ml,25％ポリエチレング
リコール（平均分子量1000）の存在下、“Genetic Mani
pulation of Streptomyes-A Laboratory Mannual"に記
載したのと同様にして製造］の100μｌづつの２つの形
質転換するのに用いた。
形質転換した後、その原形質体の10-4まで希釈した液
を、プレート上のR2YE寒天に塗布した（Hopwoodらの前
記文献参照）。
を、プレート上のR2YE寒天に塗布した（Hopwoodらの前
記文献参照）。
32℃で24時間培養した後、プレートを軟普通ブイヨン
寒天（SNBA）［8gDifco普通ブイヨン/l、プラスミドが
産生するコロニイを選択するためのチオストレプトン抗
生物質（500μg/l）と、これらのコロニイが産生する、
pIJ702のmel遺伝子に挿入体を持つプラスミドを検出す
るためのＬ−チロシン（1g/l）とを含有する3g寒天/l］
でオーバーボアーした（overpour）。
寒天（SNBA）［8gDifco普通ブイヨン/l、プラスミドが
産生するコロニイを選択するためのチオストレプトン抗
生物質（500μg/l）と、これらのコロニイが産生する、
pIJ702のmel遺伝子に挿入体を持つプラスミドを検出す
るためのＬ−チロシン（1g/l）とを含有する3g寒天/l］
でオーバーボアーした（overpour）。
数日の培養後、黒色コロニイの頻度（２％を超えな
い）と連結DNAの形質転換効率（9.3×103形質転換体／
μgDNA）を、カウンティング（counting）によって確認
することができた。
い）と連結DNAの形質転換効率（9.3×103形質転換体／
μgDNA）を、カウンティング（counting）によって確認
することができた。
前記の方法（製造例2a）で、エス・リビダンス66の10
ケの白色コロニイからプラスミドを調製した。これらの
プラスミド製剤をBcl I制限酵素で消化し、次いでアガ
ロースゲル電気泳動法でDNA挿入体の大きさを測定し
た。
ケの白色コロニイからプラスミドを調製した。これらの
プラスミド製剤をBcl I制限酵素で消化し、次いでアガ
ロースゲル電気泳動法でDNA挿入体の大きさを測定し
た。
このようにして測定した結果、クローンされたDNAの
平均の大きさは5Kbであった。
平均の大きさは5Kbであった。
（ｂ）連結DNA試料のエス・クラブリゲルスNCP-5（エス
・クラブリゲルスNCIB 12208）への形質転換 1.5μｇの連結DNAを、２×５μｌのT.E.緩衝液内で、
２×100μｌのエス・クラブリゲルスNCP−５原形質体
（1010原形質体/ml,前記のHopwoodら（1985）の文献に
記載されたのと同様にして製造］に形質転換した。この
形質転換された原形質体を、26℃でR5寒天［100gショ糖
/l、10gデキストリン/l、5.1gMgCl2・6H2O/l,1gカザミ
ノ酸/l,0.05gMgSO4・7H2O/l,2.5gL−アルギニンHCl/l,1
ml微量元素/l,20g Oxoid Technical Agar No.3/1,0.05g
KH2PO4/l,3.7gCaCl2・2H2O/l,5.7g TES緩衝液PH7.2/l］
上で再生させた。なお微量元素溶液は、FeSO4・7H2O1g/
l,MnCl2・4H2O1g/l,ZnSO4・7H2O1g/lを含有している。4
8時間再生させた後、チオストレプトン（50μg/ml）含
有のSNBA（製造例4aに記載したのと同一）で覆うことに
よってチオストレプトン耐性コロニイを選択した。さら
に72時間後、形質転換されたコロニイを個々にかきとっ
て、抗生物質生産に適切なひとつの普通寒天培地上に配
列した。この寒天培地は、デキストリン10g/l、K2HPO41
g/l、MgSO4・7H2O1g/l、(NH4)2SO41g/l、Industrial ch
alk 4g/l、微量元素溶液1ml、寒天20g/l、酵母エキス2g
/lおよび細菌学的ペプトン2.5g/lを含有するM5D+寒天培
地である。またその微量元素溶液は、FeSO4・7H2O0.1
％、MnCl2・4H2O0.1％およびZnSO4・7H2O0.01％並びに
チオストレプトン（2.5μg/ml）を含有している。
・クラブリゲルスNCIB 12208）への形質転換 1.5μｇの連結DNAを、２×５μｌのT.E.緩衝液内で、
２×100μｌのエス・クラブリゲルスNCP−５原形質体
（1010原形質体/ml,前記のHopwoodら（1985）の文献に
記載されたのと同様にして製造］に形質転換した。この
形質転換された原形質体を、26℃でR5寒天［100gショ糖
/l、10gデキストリン/l、5.1gMgCl2・6H2O/l,1gカザミ
ノ酸/l,0.05gMgSO4・7H2O/l,2.5gL−アルギニンHCl/l,1
ml微量元素/l,20g Oxoid Technical Agar No.3/1,0.05g
KH2PO4/l,3.7gCaCl2・2H2O/l,5.7g TES緩衝液PH7.2/l］
上で再生させた。なお微量元素溶液は、FeSO4・7H2O1g/
l,MnCl2・4H2O1g/l,ZnSO4・7H2O1g/lを含有している。4
8時間再生させた後、チオストレプトン（50μg/ml）含
有のSNBA（製造例4aに記載したのと同一）で覆うことに
よってチオストレプトン耐性コロニイを選択した。さら
に72時間後、形質転換されたコロニイを個々にかきとっ
て、抗生物質生産に適切なひとつの普通寒天培地上に配
列した。この寒天培地は、デキストリン10g/l、K2HPO41
g/l、MgSO4・7H2O1g/l、(NH4)2SO41g/l、Industrial ch
alk 4g/l、微量元素溶液1ml、寒天20g/l、酵母エキス2g
/lおよび細菌学的ペプトン2.5g/lを含有するM5D+寒天培
地である。またその微量元素溶液は、FeSO4・7H2O0.1
％、MnCl2・4H2O0.1％およびZnSO4・7H2O0.01％並びに
チオストレプトン（2.5μg/ml）を含有している。
pIJ702:エス・クラブリゲルス27064DNAプラスミドに
よって与えられたチオストレプトン耐性を示した4500の
NCP−５コロニイをこの方法で得た。
よって与えられたチオストレプトン耐性を示した4500の
NCP−５コロニイをこの方法で得た。
製造例5.セファマイシンＣ産生のためのNCP−5:pIJ 702
/エス・クラブリゲルス27064ライブラリイのスクリーニ
ング M5D+寒天培地上26℃で10日間培養した後、8mm径の寒
天プラグをそれぞれの菌糸体パッチから切りとり、アル
カリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ATCC
8750/NCIB 8156を予め新たに接種したDST寒天培地（40
g Oxoid DST寒天/l水）上に置いた（Claridge,C.A.およ
びJonson,D.L.（1962）Antimicrob.Ab.（Chemother.682
-686参照）。この生物は、セファロスポリンＣとセファ
マイシンＣのごときある種のセファロスポリン類に感受
性であるが、用いられる増殖条件下でNCP−５によって
産生される低濃度のクラバラン酸の存在下でさえもペニ
シリンＮには感受性ではない。従ってペニシリンＮとク
ラバラン酸のみを産生したNCP−５は通常、エイ・フェ
カリスNCIB 8156の増殖を阻害するゾーンを与えない。
しかしその親のエス・クラブリゲルス菌株は上記のゾー
ンを与える（この菌株は、ペニシリンＮ、クラバラン酸
およびセファマイシンＣを産生するからである）。前記
プラグからの抗生物質を、DST/エイ・フェカリス寒天に
拡散させ、37℃で一夜培養した後、エイ・フェカリスの
増殖状態を、抗生作用のゾーンについて試験した。
/エス・クラブリゲルス27064ライブラリイのスクリーニ
ング M5D+寒天培地上26℃で10日間培養した後、8mm径の寒
天プラグをそれぞれの菌糸体パッチから切りとり、アル
カリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ATCC
8750/NCIB 8156を予め新たに接種したDST寒天培地（40
g Oxoid DST寒天/l水）上に置いた（Claridge,C.A.およ
びJonson,D.L.（1962）Antimicrob.Ab.（Chemother.682
-686参照）。この生物は、セファロスポリンＣとセファ
マイシンＣのごときある種のセファロスポリン類に感受
性であるが、用いられる増殖条件下でNCP−５によって
産生される低濃度のクラバラン酸の存在下でさえもペニ
シリンＮには感受性ではない。従ってペニシリンＮとク
ラバラン酸のみを産生したNCP−５は通常、エイ・フェ
カリスNCIB 8156の増殖を阻害するゾーンを与えない。
しかしその親のエス・クラブリゲルス菌株は上記のゾー
ンを与える（この菌株は、ペニシリンＮ、クラバラン酸
およびセファマイシンＣを産生するからである）。前記
プラグからの抗生物質を、DST/エイ・フェカリス寒天に
拡散させ、37℃で一夜培養した後、エイ・フェカリスの
増殖状態を、抗生作用のゾーンについて試験した。
このようにして、クローンのライブラリーの任意のメ
ンバーによるセファロスポリン抗生物質類産生の可能性
を調べた。２つのクローンの、標識されたNCP−5/36/5
とNCP−5/10/7とは、エイ・フェカリスに対して抗生作
用のゾーンを与えることが見出された。
ンバーによるセファロスポリン抗生物質類産生の可能性
を調べた。２つのクローンの、標識されたNCP−5/36/5
とNCP−5/10/7とは、エイ・フェカリスに対して抗生作
用のゾーンを与えることが見出された。
製造例6.NCP-5/36/5とNCP-5/10/7のプラスミド含量の試
験 （ａ）プラスミドの物理試験 プラスミド製剤をNCP-5/36/5とNCP-5/10/7とから製造
例2aに記載したのと同様にして作製した。ふたつのポジ
ティブ（positive）の各々の30ml培養物から、数μｇの
プラスミド物質を単離することができた。制限酵素座位
の地図を作成したところ、プラスミドの一つの種だけが
NCP-5/10/5に存在し、別のひとつの種のみがNCP-5/10/7
に存在するということを明確に示した。制限地図（第１
図参照）は、pIJ 702に、約5.7Kbと約5.8KbのDNA挿入部
をそれぞれ有するNCP-5/36/5とNCP-5/10/7から単離され
るということを示唆している。この二つのDNA挿入体
は、地図にされた制限酵素座位によって示唆されている
ように、ほぼ2.7Kbの共通フラグメントを有するようで
ある。次いでこのことは、pBROC138の32Pで標識された
各フラグメントがpBROC137DNAの予測された部分と広範
なハイブリッドを形成するのをサザン分析法でしめすこ
とによって証明された。
験 （ａ）プラスミドの物理試験 プラスミド製剤をNCP-5/36/5とNCP-5/10/7とから製造
例2aに記載したのと同様にして作製した。ふたつのポジ
ティブ（positive）の各々の30ml培養物から、数μｇの
プラスミド物質を単離することができた。制限酵素座位
の地図を作成したところ、プラスミドの一つの種だけが
NCP-5/10/5に存在し、別のひとつの種のみがNCP-5/10/7
に存在するということを明確に示した。制限地図（第１
図参照）は、pIJ 702に、約5.7Kbと約5.8KbのDNA挿入部
をそれぞれ有するNCP-5/36/5とNCP-5/10/7から単離され
るということを示唆している。この二つのDNA挿入体
は、地図にされた制限酵素座位によって示唆されている
ように、ほぼ2.7Kbの共通フラグメントを有するようで
ある。次いでこのことは、pBROC138の32Pで標識された
各フラグメントがpBROC137DNAの予測された部分と広範
なハイブリッドを形成するのをサザン分析法でしめすこ
とによって証明された。
（ｂ）プラスミドpBROC 137とpBROC 138のNCP−５への
再導入 pBROC 137とpBROC 138とDNAの100ノナグラムづつを、
エス・クラブリゲルスNCP−５を再形質転換するのに用
いた。その形質転換されたコロニイを分離し、製造例５
に記載したのと同様にしてエイ・フェカリス バイオア
ッセイ・プレートで試験した。
再導入 pBROC 137とpBROC 138とDNAの100ノナグラムづつを、
エス・クラブリゲルスNCP−５を再形質転換するのに用
いた。その形質転換されたコロニイを分離し、製造例５
に記載したのと同様にしてエイ・フェカリス バイオア
ッセイ・プレートで試験した。
pBROC 137もしくはpBROC 138で形質転換されたNCP−
５のコロニイ全部の少なくとも90％が、エイ・フェカリ
スに抗生作用のゾーンを与えることができることが明ら
かになった。このことは、pBROC 137とpBROC 138中に存
在するDNAが、NCP−５の受ける突然変異を修復できる遺
伝情報を有することを立証している。
５のコロニイ全部の少なくとも90％が、エイ・フェカリ
スに抗生作用のゾーンを与えることができることが明ら
かになった。このことは、pBROC 137とpBROC 138中に存
在するDNAが、NCP−５の受ける突然変異を修復できる遺
伝情報を有することを立証している。
製造例7.pBROC 137、pBROC 138およびpBROC 303によっ
てストレプトミセス・リビダンス66に与えられる新規な
酵素活性の測定 100ナノグラムづつのpBROC 137DNA、pBROC 138DNAお
よびpBROC 303DNAを、エス・リビダンス66に形質転換し
た（製造例4aに記載したのと同様にして）。
てストレプトミセス・リビダンス66に与えられる新規な
酵素活性の測定 100ナノグラムづつのpBROC 137DNA、pBROC 138DNAお
よびpBROC 303DNAを、エス・リビダンス66に形質転換し
た（製造例4aに記載したのと同様にして）。
エス・リビダンス66:pBROC137、エス・リビダンス66:
pBROC138およびエス・リビダンス66:pBROC 303の培養物
を、YEME（30mlグルコース10g/l、ショ糖340g/l、麦芽
エキス3g/l、細菌学的ペプトン5g/l、酵母エキス（Oxoi
d）3g/lからなり、チオストレプトン抗生物質を50μg/m
l含有する）の振盪フラスコ中で培養した。この培養物
を、48時間、32℃、240rpmで培養した。菌糸体を10,000
gで遠心分離して収穫し、トリス塩酸緩衝液pH7.0（0.05
M）で洗浄した。菌糸体を再び遠心分離し、ペレットを
2.5mlのトリス緩衝液中に再懸濁させた。1000psiでフレ
ンチ・プレッシャー・セルを用い細胞を破壊し、破壊細
胞の製剤を105ｇで60分間遠心分離し、細胞を含有せず
粒子のない、溶解性酵素製剤を得た。
pBROC138およびエス・リビダンス66:pBROC 303の培養物
を、YEME（30mlグルコース10g/l、ショ糖340g/l、麦芽
エキス3g/l、細菌学的ペプトン5g/l、酵母エキス（Oxoi
d）3g/lからなり、チオストレプトン抗生物質を50μg/m
l含有する）の振盪フラスコ中で培養した。この培養物
を、48時間、32℃、240rpmで培養した。菌糸体を10,000
gで遠心分離して収穫し、トリス塩酸緩衝液pH7.0（0.05
M）で洗浄した。菌糸体を再び遠心分離し、ペレットを
2.5mlのトリス緩衝液中に再懸濁させた。1000psiでフレ
ンチ・プレッシャー・セルを用い細胞を破壊し、破壊細
胞の製剤を105ｇで60分間遠心分離し、細胞を含有せず
粒子のない、溶解性酵素製剤を得た。
（ａ）エクスパンダーゼ酵素活性の例証 エス・リビダンス66:pIJ 702、エス・リビダンス66:p
BROC 137およびエス・リビダンス66:pBROC 138由来の酵
素製剤を、環拡大アセイシステムに用いて（Jensen,S.
E.,Westlake,D.W.S.およびWolfe,S.,（1983）Antimicro
b.Ag.Chemother.24(3)307-312に記載してあるのと同様
にして）、デアセトキシセファロスポリンＣシンテター
ゼの存在を測定した。
BROC 137およびエス・リビダンス66:pBROC 138由来の酵
素製剤を、環拡大アセイシステムに用いて（Jensen,S.
E.,Westlake,D.W.S.およびWolfe,S.,（1983）Antimicro
b.Ag.Chemother.24(3)307-312に記載してあるのと同様
にして）、デアセトキシセファロスポリンＣシンテター
ゼの存在を測定した。
これらの著者によって記載された、イー・コリESS/ペ
ニシリナーゼ（DIFCO Penicillinase Concentrate 104
μ/ml）バイオアセイシステムを利用することによっ
て、エス・リビダンス66:pIJ702エキストラクトはペニ
シリンＮをペニシリナーゼ耐性抗生物質に形質転換でき
ないが、一方エス・リビダンス66:pBROC 137とエス・リ
ビダンス66:pBROC 138からのエキストラクトは前記形質
転換を行うことができることを示すことができた。エス
・リビダンス66:pBROC 137酵素エキストラクトは、前記
アッセイシステム中のペニシリンＮをペニシリナーゼ耐
性抗生物質に十分形質転換することができたが、エス・
リビダンス66:pBROC 138からの酵素エキストラクトは、
この点について著しく低い活性を示した。次いで環拡大
試験体を、ペニシリンＮ、デアセトキシセファロスポリ
ンＣおよびデアセチルセファロスポリンＣの標準試料と
ともに、セルロースの薄層クロマトグラフィ用プレート
上でクロマトグラフィ（ブタノール／酢酸／水,3/1/1）
に付した。寒天含有のイー・コリESS/Difcoペニシリナ
ーゼ上のクロマトグラフィのバイオアッセイによって、
37℃で一夜培養後に、エス・リビダンス66:pBROC 137酵
素エキストラクトはペニシリンＮをデアセトキシセファ
ロスポリンＣに形質転換するが、エス・リビダンス66:p
IJ 702からの酵素のエキストラクトはこの形質転換を行
わないことが分かった。デアセチルセファロスポリンＣ
がいずれかの細胞エキストラクトによってペニシリンＮ
から合成されるということは全く確認されなかった（デ
アセトキシセファロスポリンＣのRf＝0.55,デアセチル
セファロスポリンＣのRf＝0.39）。（ペニシリンＮはペ
ニシリナーゼが存在するので検出されない） （ｂ）イソ−ペニシリンＮの、イー・コリESSに対して
より活性な化学形態への変換 Jesen,S.Eらによって開発されたイソ−ペニシリンＮ
エピメラーゼアッセイを用いて［Can.J.Microbiol.（19
83）29(11),1526-1531］、エス・リビダンス66:pBROC 1
37からの細胞と粒子の存在しない酵素エキストラクト
（製造例7aと同様）が、イソ−ペニシリンＮを、イソペ
ニシリンＮ自体よりもイー・コリESSに対する活性が少
なくとも10倍の化学的形態に変換できるということを例
証することができた。エス・リビダンス66:pIJ 702から
の同様のエキストラクトはこのような変換ができなかっ
た。
ニシリナーゼ（DIFCO Penicillinase Concentrate 104
μ/ml）バイオアセイシステムを利用することによっ
て、エス・リビダンス66:pIJ702エキストラクトはペニ
シリンＮをペニシリナーゼ耐性抗生物質に形質転換でき
ないが、一方エス・リビダンス66:pBROC 137とエス・リ
ビダンス66:pBROC 138からのエキストラクトは前記形質
転換を行うことができることを示すことができた。エス
・リビダンス66:pBROC 137酵素エキストラクトは、前記
アッセイシステム中のペニシリンＮをペニシリナーゼ耐
性抗生物質に十分形質転換することができたが、エス・
リビダンス66:pBROC 138からの酵素エキストラクトは、
この点について著しく低い活性を示した。次いで環拡大
試験体を、ペニシリンＮ、デアセトキシセファロスポリ
ンＣおよびデアセチルセファロスポリンＣの標準試料と
ともに、セルロースの薄層クロマトグラフィ用プレート
上でクロマトグラフィ（ブタノール／酢酸／水,3/1/1）
に付した。寒天含有のイー・コリESS/Difcoペニシリナ
ーゼ上のクロマトグラフィのバイオアッセイによって、
37℃で一夜培養後に、エス・リビダンス66:pBROC 137酵
素エキストラクトはペニシリンＮをデアセトキシセファ
ロスポリンＣに形質転換するが、エス・リビダンス66:p
IJ 702からの酵素のエキストラクトはこの形質転換を行
わないことが分かった。デアセチルセファロスポリンＣ
がいずれかの細胞エキストラクトによってペニシリンＮ
から合成されるということは全く確認されなかった（デ
アセトキシセファロスポリンＣのRf＝0.55,デアセチル
セファロスポリンＣのRf＝0.39）。（ペニシリンＮはペ
ニシリナーゼが存在するので検出されない） （ｂ）イソ−ペニシリンＮの、イー・コリESSに対して
より活性な化学形態への変換 Jesen,S.Eらによって開発されたイソ−ペニシリンＮ
エピメラーゼアッセイを用いて［Can.J.Microbiol.（19
83）29(11),1526-1531］、エス・リビダンス66:pBROC 1
37からの細胞と粒子の存在しない酵素エキストラクト
（製造例7aと同様）が、イソ−ペニシリンＮを、イソペ
ニシリンＮ自体よりもイー・コリESSに対する活性が少
なくとも10倍の化学的形態に変換できるということを例
証することができた。エス・リビダンス66:pIJ 702から
の同様のエキストラクトはこのような変換ができなかっ
た。
（ｃ）エス・リビダンス66:pBROC 303の、細胞の存在し
ない製剤による、Ｏ−カルバモイル・デスアセチル・セ
ファロスポリンＣとセファロスポリンＣの、それぞれの
７−ヒドロキシ誘導体への変換 エス・リビダンス66:pBROC 303の、細胞なしの製剤
（0.9ml）を、アスコルビン酸ナトリウム（2.8mM）、硫
酸第一鉄（0.045mM）、α−ケトグルタレート（1mM）、
塩化カリウム（7.5mM）、硫酸マグネシウム（7.5mM）、
トリス−塩酸pH7.0（0.05M）およびＯ−カルバモイル・
デスアセチル・セファロスポリンＣ（0.5mM）もしくは
セファロスポリン（0.5mM）とともに、最終容積1.2mlと
し、22℃で培養した。
ない製剤による、Ｏ−カルバモイル・デスアセチル・セ
ファロスポリンＣとセファロスポリンＣの、それぞれの
７−ヒドロキシ誘導体への変換 エス・リビダンス66:pBROC 303の、細胞なしの製剤
（0.9ml）を、アスコルビン酸ナトリウム（2.8mM）、硫
酸第一鉄（0.045mM）、α−ケトグルタレート（1mM）、
塩化カリウム（7.5mM）、硫酸マグネシウム（7.5mM）、
トリス−塩酸pH7.0（0.05M）およびＯ−カルバモイル・
デスアセチル・セファロスポリンＣ（0.5mM）もしくは
セファロスポリン（0.5mM）とともに、最終容積1.2mlと
し、22℃で培養した。
２時間培養後、振盪しながら25μｌの氷酢酸を添加
し、次いで遠心分離（10,000G,5分間）して蛋白を除去
した上澄液を得た。この液体をQAE−セファデックスカ
ラム（1ml容積）に吸収させた。この樹脂を250μｌの水
と200μｌの0.2M NaClで洗浄した。さらに250μｌの0.2
M NaClによって前記樹脂からセファロスポリン類を溶離
させた。
し、次いで遠心分離（10,000G,5分間）して蛋白を除去
した上澄液を得た。この液体をQAE−セファデックスカ
ラム（1ml容積）に吸収させた。この樹脂を250μｌの水
と200μｌの0.2M NaClで洗浄した。さらに250μｌの0.2
M NaClによって前記樹脂からセファロスポリン類を溶離
させた。
これらを濃縮した反応生成物の試料20μｌをC18逆相
マイクロボンダパックカラムを用いる高速液体クロマト
グラフィによって分析した。Ｏ−カルバモイル・デスア
セチル・セファロスポリンＣを７−ヒドロキシＯ−カル
バモイル・デスアセチル・セファロスポリンＣから分離
するための移動相は0.1M NaH2PO4,pH3.2であった。セフ
ァロスポリンＣを７−ヒドロキシセファロスポリンＣか
ら分離するために、移動相のpHを4.2まで上昇させた。
溶離は2ml/分の流速で260nmでの紫外吸収で検出して行
った。
マイクロボンダパックカラムを用いる高速液体クロマト
グラフィによって分析した。Ｏ−カルバモイル・デスア
セチル・セファロスポリンＣを７−ヒドロキシＯ−カル
バモイル・デスアセチル・セファロスポリンＣから分離
するための移動相は0.1M NaH2PO4,pH3.2であった。セフ
ァロスポリンＣを７−ヒドロキシセファロスポリンＣか
ら分離するために、移動相のpHを4.2まで上昇させた。
溶離は2ml/分の流速で260nmでの紫外吸収で検出して行
った。
このようにして、Ｏ−カルバモイル・デスアセチル・
セファロスポリンＣ（保持時間5.7分）がそのヒドロキ
シ誘導体（保持時間3.0分）に約50％変換したこと、な
らびにセファロスポリンＣ（保持時間18.2分）が７−ヒ
ドロキシセファロスポリンＣ（保持時間6.6分）に約35
％変換したことを証明することができた。エス・リビダ
ンス66:pIJ 702のエキストラクトはこのような形質転換
を行えなかった。
セファロスポリンＣ（保持時間5.7分）がそのヒドロキ
シ誘導体（保持時間3.0分）に約50％変換したこと、な
らびにセファロスポリンＣ（保持時間18.2分）が７−ヒ
ドロキシセファロスポリンＣ（保持時間6.6分）に約35
％変換したことを証明することができた。エス・リビダ
ンス66:pIJ 702のエキストラクトはこのような形質転換
を行えなかった。
製造例8.エス・リビダンス66:pBROC 137とエス・リビダ
ンス66:pBROC 138とによって産生された蛋白質のナトリ
ウムラウリルサルフェート／ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法による分析 エス・リビダンス66:pBROC 137、エス・リビダンス6
6:pBROC 138およびエス・リビダンス66:pIJ 702の、細
胞と粒子のないエキストラクト（製造例7aと同様）の５
μｌと10μｌとを、ナトリウムラウリルサルフェート
（SLS）で処理して溶解している蛋白質を変性し、Laemm
liの方法（英国、Nature,1970,227 680）を用いて、SLS
/12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるクロマ
トグラフイに付した。クーマシーブリリアントブルーで
染色することによって次のことが明らかになった。すな
わち同時にクロマトグラフに付した分子量が公知の蛋白
質から判断できたが、エス・リビダンス66:pBROC 137と
エス・リビダンス66:pBROC 138からのエキストラクトは
約29,500ドルトンの蛋白質を示し、これはエス・リビダ
ンス66:pIJ 702からのエキストラクトには存在しないか
ごくわずかしか存在していないことが分かった。エス・
リビダンス66:pBROC 137からのエキストラクトも、大き
さが約60,000ドルトンの著しくよく染まる蛋白質を示し
た。
ンス66:pBROC 138とによって産生された蛋白質のナトリ
ウムラウリルサルフェート／ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法による分析 エス・リビダンス66:pBROC 137、エス・リビダンス6
6:pBROC 138およびエス・リビダンス66:pIJ 702の、細
胞と粒子のないエキストラクト（製造例7aと同様）の５
μｌと10μｌとを、ナトリウムラウリルサルフェート
（SLS）で処理して溶解している蛋白質を変性し、Laemm
liの方法（英国、Nature,1970,227 680）を用いて、SLS
/12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるクロマ
トグラフイに付した。クーマシーブリリアントブルーで
染色することによって次のことが明らかになった。すな
わち同時にクロマトグラフに付した分子量が公知の蛋白
質から判断できたが、エス・リビダンス66:pBROC 137と
エス・リビダンス66:pBROC 138からのエキストラクトは
約29,500ドルトンの蛋白質を示し、これはエス・リビダ
ンス66:pIJ 702からのエキストラクトには存在しないか
ごくわずかしか存在していないことが分かった。エス・
リビダンス66:pBROC 137からのエキストラクトも、大き
さが約60,000ドルトンの著しくよく染まる蛋白質を示し
た。
製造例９ pBROC 137とpBROC 138に含有されているDNA
と隣接するエス・クラブリゲルス染色体からのDNAの単
離、特性表示およびサブクローニング ａ）pHC79中のエス・クラブリゲルスATCC 27064DNAのラ
イブラリイの組立て 10μｇのpHC79DNA［Holm,B.およびCollins J.（198
0）Gene11,291-298）を、制限酵素のSal IとBamHIとに
よって完全に消化（digest）した。さらに10μｇのpHC7
9DNAをEcoRIとBamHIとで完全消化した。必要な“コスミ
ドアーム（cosmid arms）”を単離するため、上記の両
消化物を、ショ糖勾配法（10〜40％）で分画した。各コ
スミドアームの収量は５μｇを超える量であった。
と隣接するエス・クラブリゲルス染色体からのDNAの単
離、特性表示およびサブクローニング ａ）pHC79中のエス・クラブリゲルスATCC 27064DNAのラ
イブラリイの組立て 10μｇのpHC79DNA［Holm,B.およびCollins J.（198
0）Gene11,291-298）を、制限酵素のSal IとBamHIとに
よって完全に消化（digest）した。さらに10μｇのpHC7
9DNAをEcoRIとBamHIとで完全消化した。必要な“コスミ
ドアーム（cosmid arms）”を単離するため、上記の両
消化物を、ショ糖勾配法（10〜40％）で分画した。各コ
スミドアームの収量は５μｇを超える量であった。
エス・クラブリゲルスATCC 27064の染色体DNAの100μ
ｇを、Sau 3AIで部分的に消化し、ショ糖勾配法（10〜4
0％）で分画した。30Kbを超え50Kbを超えない制限フラ
グメントを含有するフラクションを集め、この大きさの
範囲のSau 3AIによるフラグメントの約10μｇを得た。
これらのフラグメントを、1:1:1のモル比で、前記コス
ミドアームに連結した（DNA濃度200μg ml-1）。24時間
後、この連結混合物をλファージに生体外でパッケージ
した（フアージλ・パッケージング・エキストラクトと
プロトコールは、Amersham International PLCが供給さ
れている）。イー・コリDHIをトランスフェクションさ
せることによって［Low,B.（1968）PNAS 60,161-16
7］、５×107のトランスフェクタント（transfectant）
／（μｇパッケージされたDNA）を得た。
ｇを、Sau 3AIで部分的に消化し、ショ糖勾配法（10〜4
0％）で分画した。30Kbを超え50Kbを超えない制限フラ
グメントを含有するフラクションを集め、この大きさの
範囲のSau 3AIによるフラグメントの約10μｇを得た。
これらのフラグメントを、1:1:1のモル比で、前記コス
ミドアームに連結した（DNA濃度200μg ml-1）。24時間
後、この連結混合物をλファージに生体外でパッケージ
した（フアージλ・パッケージング・エキストラクトと
プロトコールは、Amersham International PLCが供給さ
れている）。イー・コリDHIをトランスフェクションさ
せることによって［Low,B.（1968）PNAS 60,161-16
7］、５×107のトランスフェクタント（transfectant）
／（μｇパッケージされたDNA）を得た。
ｂ）エス・クラブリゲルスATCC 27064DNAライブラリイ
からのDNAセグメント（Ｉ）のの単離と、このDNAのpIJ
702へのサブクローニング エス・クラブリゲルスATCC 27064DNAの挿入体を有す
るpHC 79を保有するイー・コリDHIの5000のコロニイ
を、ニトロセルロースのフィルターに固定化して溶解し
た。pBROC137由来の1.2KbBClI−KpnIエンデットフラグ
メントを単離してニックトランスレートした。このフラ
グメントを、標準コロニイハイブリット形成技法によっ
てフィルターをプローブ（probe）した。７つのハイブ
リッドを形成しているコロニイが得られ、そのうちのひ
とつが第１（ａ）図に示すDNAセグメント（Ｉ）を保有
していた。
からのDNAセグメント（Ｉ）のの単離と、このDNAのpIJ
702へのサブクローニング エス・クラブリゲルスATCC 27064DNAの挿入体を有す
るpHC 79を保有するイー・コリDHIの5000のコロニイ
を、ニトロセルロースのフィルターに固定化して溶解し
た。pBROC137由来の1.2KbBClI−KpnIエンデットフラグ
メントを単離してニックトランスレートした。このフラ
グメントを、標準コロニイハイブリット形成技法によっ
てフィルターをプローブ（probe）した。７つのハイブ
リッドを形成しているコロニイが得られ、そのうちのひ
とつが第１（ａ）図に示すDNAセグメント（Ｉ）を保有
していた。
DNAセグメント（Ｉ）のフラグメントのサブクローニ
ングを、このクローンされたDNAの10μｇをBamHIで消化
することから開始した。ベクターのpIJ 702の５μｇをB
gl IIで消化し、CIAPで処理して再環化するのを防止し
た。前記のBam HIで生成したフラグメントと、Bgl IIで
消化しCIAPで処理したpIJ 702とを、2:1のモル比で連結
し、50μg/mlのDNA濃度とした。15℃で24時間培養後、
0.5μｇの連結混合物をエス・リビダンス66に形質転換
し、２×105形質転換細胞／μｇを得た。この形質転換
細胞をスクリーニングすることによって、他のBamHIフ
ラグメントクローンを有するpBROC 303を単離すること
ができた。
ングを、このクローンされたDNAの10μｇをBamHIで消化
することから開始した。ベクターのpIJ 702の５μｇをB
gl IIで消化し、CIAPで処理して再環化するのを防止し
た。前記のBam HIで生成したフラグメントと、Bgl IIで
消化しCIAPで処理したpIJ 702とを、2:1のモル比で連結
し、50μg/mlのDNA濃度とした。15℃で24時間培養後、
0.5μｇの連結混合物をエス・リビダンス66に形質転換
し、２×105形質転換細胞／μｇを得た。この形質転換
細胞をスクリーニングすることによって、他のBamHIフ
ラグメントクローンを有するpBROC 303を単離すること
ができた。
第１（ａ）図は、ペニシリンとセファロスポリンの生合
成に関与する遺伝子の遺伝情報を指定するエス・クラブ
リゲルスATCC 27064染色体DNA（Ｉ）のエンドヌクレア
ーゼ制限地図、 第１（ｂ）図は、プラスミドpBROC 138内に含まれるDNA
（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図、 第１（Ｃ）図は、プラスミドpBROC 137内に含まれるDNA
（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図、 第１（ｄ）図は、プラスミドpBROC 303内に含まれるDNA
（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図、 第２図は、プラスミドpBROC 137とpBROC 138のエンドヌ
クレアーゼ制限地図および第３図は、プラスミドpBROC
303のエンドヌクレアーゼ制限地図である。
成に関与する遺伝子の遺伝情報を指定するエス・クラブ
リゲルスATCC 27064染色体DNA（Ｉ）のエンドヌクレア
ーゼ制限地図、 第１（ｂ）図は、プラスミドpBROC 138内に含まれるDNA
（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図、 第１（Ｃ）図は、プラスミドpBROC 137内に含まれるDNA
（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図、 第１（ｄ）図は、プラスミドpBROC 303内に含まれるDNA
（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地図、 第２図は、プラスミドpBROC 137とpBROC 138のエンドヌ
クレアーゼ制限地図および第３図は、プラスミドpBROC
303のエンドヌクレアーゼ制限地図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 ジョン・エドワード・ハドソン イギリス国、サリイ アールエイチ３ ７エイジェイ、ベッチウオース、ブロッ クハム・パーク（無番地) (72)発明者 イアン・デイビッド・ノーマンセル イギリス国、ウエスト・サセツクス ビ イエヌ14 ８キューエイチ、ウワーシン グ、クラランダン・ロード（無番地)
Claims (11)
- 【請求項１】下記制限部位の立体配置： を有し、ペニシリンとセファロスポリンのβ−ラクタム
化合物類の生合成に関与する１以上の酵素をコードする
１以上の遺伝子を含む、ストレプトミセス・クラブリゲ
ルスDNAコスミドライブラリーからはSau 3A制限フラグ
メントとして得ることができるDNA。 - 【請求項２】ペニシリンＮ合成酵素又はデアセトキシセ
ファロスポリンＣ合成酵素をエンコードし、下記制限部
位の立体配置： を有する、ストレプトミセス・クラブリゲルスDNAライ
ブラリーからはSau 3A制限フラグメントとして得ること
ができる特許請求の範囲第１項記載のDNA。 - 【請求項３】ｏ−カルバモイルデスアセチルセファロス
ポリンC7−ヒドロキシラーゼをエンコードし、下記制限
部位の立体配置： を有する、下記制限部位の立体配置： を有するDNAからBam HI制限フラグメントとして得るこ
とができる特許請求の範囲第１項記載のDNA。 - 【請求項４】ストレプトミセス属の菌由来のプラスミド
またはテンペレートファージ中にクローン化された、下
記制限部位の立体配置： を有し、ペニシリンとセファロスポリンのβ−ラクタム
化合物類の生合成に関与する１以上の酵素をコードする
１以上の遺伝子を含む、ストレプトミセス・クラブリゲ
ルスDNAコスミドライブラリーからはSau 3A制限フラグ
メントとして得ることができるDNAを含有する組換えベ
クター。 - 【請求項５】プラスミドが、pIJ 702である特許請求の
範囲第４項記載の組換えベクター。 - 【請求項６】下記制限部位の立体配置： で示される約11.5kbのpBROC137もしくは約11.6kbのpBRO
C138、又は下記制限部位の立体配置： で示される約12.5kbのpBROC303からなる特許請求の範囲
第５項記載の組換えベクター。 - 【請求項７】ストレプトミセス属の菌由来のプラスミド
またはテンペレートファージ中にクローン化された、下
記制限部位の立体配置： を有し、ペニシリンとセファロスポリンのβ−ラクタム
化合物類の生合成に関与する１以上の酵素をコードする
１以上の遺伝子を含む、ストレプトミセス・クラブリゲ
ルスDNAコスミドライブラリーからはSau 3A制限フラグ
メントとして得ることができるDNAを含有する少なくと
も１つの組換えベクターで形質転換された宿主。 - 【請求項８】宿主が、ストレプトミセス属の菌である特
許請求の範囲第７項記載の宿主。 - 【請求項９】ストレプトミセス属の菌が、DSM寄託番号1
567のエス・リビダンス66（S.lividans 66）である特許
請求の範囲第８項記載の宿主。 - 【請求項１０】ストレプトミセス・クラブリゲルスNCIB
12208。 - 【請求項１１】下記制限部位の立体配置： を有し、ペニシリンとセファロスポリンのβ−ラクラム
化合物類の生合成に関与する１以上の酵素をコードする
１以上の遺伝子を含む、ストレプトミセス・クラブリゲ
ルスDNAコスミドライブラリーからはSau 3A制限フラグ
メントとして得ることができるDNAを、β−ラクタム抗
生物質を産生する微生物のDNAにハイブリッド形成させ
ることからなる、その微生物からのβ−ラクタム抗生物
質の生合成に関与する遺伝子の単離方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB868602441A GB8602441D0 (en) | 1986-01-31 | 1986-01-31 | Compounds |
| GB868604439A GB8604439D0 (en) | 1986-02-22 | 1986-02-22 | Compounds |
| GB8602441 | 1986-05-17 | ||
| GB8612057 | 1986-05-17 | ||
| GB868612057A GB8612057D0 (en) | 1986-05-17 | 1986-05-17 | Compounds |
| GB8604439 | 1986-05-17 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8021528A Division JP2930546B2 (ja) | 1986-01-31 | 1996-02-07 | 蛋 白 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62198394A JPS62198394A (ja) | 1987-09-02 |
| JP2540143B2 true JP2540143B2 (ja) | 1996-10-02 |
Family
ID=27262913
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62021658A Expired - Lifetime JP2540143B2 (ja) | 1986-01-31 | 1987-01-30 | 組換え体ｄｎａ類およびその用途 |
| JP8021528A Expired - Lifetime JP2930546B2 (ja) | 1986-01-31 | 1996-02-07 | 蛋 白 |
| JP37089098A Expired - Lifetime JP3321107B2 (ja) | 1986-01-31 | 1998-12-25 | 組換え体ｄｎａ類およびその用途 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8021528A Expired - Lifetime JP2930546B2 (ja) | 1986-01-31 | 1996-02-07 | 蛋 白 |
| JP37089098A Expired - Lifetime JP3321107B2 (ja) | 1986-01-31 | 1998-12-25 | 組換え体ｄｎａ類およびその用途 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6066468A (ja) |
| EP (1) | EP0233715B1 (ja) |
| JP (3) | JP2540143B2 (ja) |
| DE (1) | DE3789880T2 (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6709859B1 (en) * | 1986-01-31 | 2004-03-23 | Beecham Group P.L.C. | Chromosomal DNA Fragments Encoding Enzymes for Encoding B-Lactam Biosynthesis Enzymes, and Vector and Transformants for Their Expression |
| EP0233715B1 (en) * | 1986-01-31 | 1994-05-25 | BEECHAM GROUP plc | Isolation and expression of genes involved in the biosynthesis of beta-lactams |
| EP0303364A1 (en) * | 1987-08-10 | 1989-02-15 | The Governors of the University of Alberta | Cloning and nucleotide sequence determination of the isopenicillin N synthetase gene from streptomyces clavuligerus |
| US4950603A (en) * | 1987-11-02 | 1990-08-21 | Eli Lilly And Company | Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from Streptomyces lipmanii |
| GB8728811D0 (en) * | 1987-12-09 | 1988-01-27 | Beecham Group Plc | Novel substance |
| US6258555B1 (en) | 1987-12-09 | 2001-07-10 | Beecham Group P.L.C. | DNA encoding ACV synthetase |
| US5070020A (en) * | 1988-05-09 | 1991-12-03 | Eli Lilly And Company | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase |
| GB8813055D0 (en) * | 1988-06-02 | 1988-07-06 | Beecham Group Plc | Novel substance |
| FI104984B (fi) * | 1988-08-11 | 2000-05-15 | Dsm Nv | Menetelmä biosynteettisten tai säätelygeenien identifioimiseksi ja käyttämiseksi sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi |
| US5082772A (en) * | 1988-10-24 | 1992-01-21 | Eli Lilly And Company | Process for preparing deacetylcephalosporin c |
| US5747285A (en) * | 1989-02-01 | 1998-05-05 | Gist-Brocades, Nv. | DNA comprising regulatory regions from gene y of penicillium chrysogenum |
| GB8904762D0 (en) * | 1989-03-02 | 1989-04-12 | Glaxo Group Ltd | Biological process |
| US6037156A (en) * | 1989-05-30 | 2000-03-14 | Beecham Group P.L.C. | DNA molecules and vectors encoding clavulanic acid biosynthesis enzymes |
| CA2018367A1 (en) * | 1989-06-12 | 1990-12-12 | Chang-An Yu | Purified enzyme and process therefor |
| US5882879A (en) * | 1990-02-28 | 1999-03-16 | Gist-Brocades, N.V. | Method for influencing β-lactam antibiotic production and for isolation of large quantities of ACV synthetase |
| US5318896A (en) * | 1991-09-11 | 1994-06-07 | Merck & Co., Inc. | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) |
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| EP0886646A1 (en) | 1996-02-20 | 1998-12-30 | Smithkline Beecham Corporation | Novel compounds |
| US6150340A (en) | 1997-02-07 | 2000-11-21 | Smithkline Beecham Corporation | RNA-dependent amidotransferase from Staphylococcus aureus |
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| US5082772A (en) * | 1988-10-24 | 1992-01-21 | Eli Lilly And Company | Process for preparing deacetylcephalosporin c |
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