JP2930546B2 - 蛋 白 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、組換え体ＤＮＡ
分子類、特に、β−ラクタム抗生物質類、ことにペニシ
リン類とセファロスポリン類の生合成に関与する１以上
の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有するＤ
ＮＡフラグメントが挿入されこれを保有する微生物宿主
を形質転換するのに用いる組換え体ベクター類で形質転
換された宿主から産生される蛋白に関する。 【０００２】 【従来技術】ストレプトミセス・クラブリゲルス（Stre
ptomyces clavuligerus）のごとき微生物によって産生
されるβ−ラクタム抗生物質の生合成の解釈については
進展は遅々としたものであった。それにもかかわらず、
ある種のペニシリン類とセファロスポリン類（セファマ
イシン類を含む）の生合成経路が密接に関連しているこ
とが立証されたのである。 【０００３】イソペニシリンＮは、前記両グループの化
合物を生合成する場合の中間体であり、トリペプチドの
δ（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ
−バリン（ＬＬＤ−ＡＣＶと呼称される場合もあるが、
この明細書ではさらに簡単にＡＣＶと呼称する）にサイ
クラーゼ(cyclase）酵素を作用させて製造される。中間
体のイソペニシリンＮはペニシリンＧに変換することが
できるが、エピメラーゼ酵素の作用でペニシリンＮにも
変換することができる。そして、後者のペニシリンＮか
ら、最初の、エクスパンダーゼ(expandase）酵素による
環拡大反応(ring expansion）とこれに続く多段の経路
によって、種々のセファロスポリン類やセファマイシン
類が誘導される。この技術の水準を最近要約したもの
が、J. F.MartinおよびP. Liras, Trend in Biotechnol
ogy, 1985, 3,39-44に記載されている。セファマイシン
Ｃを生合成する場合、まずペニシリンＮがデアセトキシ
セファロスポリンＣに変換され、次いでこのデアセトキ
シセファロスポリンＣがジオキシゲナーゼ酵素によって
デスアセチルセファロスポリンＣに変換される。このデ
スアセチルセファロスポリンＣはＯ−カルバモイル化さ
れてＯ−カルバモイルデスアセチルセファロスポリンＣ
に変換され、ついでこのカルバモイル化物がセファマイ
シンＣに変換される。セファマイシンＣの７α−メトキ
シ基は、次の２工程によって、すなわち、Ｏ−カルバモ
イルデスアセチルセファロスポリンＣに７−ヒドロキシ
ラーゼ酵素を作用させて、その７α−ヒドロキシ誘導体
を得、次いでメチル化反応に付することによって誘導さ
れるということは、J. D. Hoodらの研究（J. Chem. So
c. Chem. Commun, 1983, 第1187−1188頁およびその引
用文献）に照らして可能であろう。 【０００４】現在よく知られているように、組換え体Ｄ
ＮＡ技術によって、あるベクターが有するＤＮＡを宿主
細胞に挿入することによって、形質転換された宿主に、
挿入ＤＮＡが有する遺伝子がエンコード(encode）する
どんな蛋白質や酵素でも合成する性能を付与することが
可能である（組換え体ＤＮＡ方法論の充分な検討、この
明細書に用いる用語の辞典については、R. W. OldとS.
B. Primrose著、第３版、Blackwell Scientific Public
ations. 1985の“Principles of gene manipulation ”
を参照のこと）。 【０００５】シイ・アクレモニウム(C. acremonium）由
来のイソペニシリンＮシンテターゼ（サイクラーゼ）遺
伝子のイー・コリ(E. coli）における分離と発現は最
近、S.M. Samsonらによって報告された（Nature, 1985,
318, 191-194）。 【０００６】 【発明の実施の形態】この発明を明確にするため、下記
の図面が参照される。第１（ａ）図は、ペニシリンとセ
ファロスポリンの生合成に関与する遺伝子の遺伝情報を
指定するエス・クラブリゲルスATCC 27064染色体ＤＮＡ
（Ｉ）のエンドヌクレアーゼ制限地図である。 【０００７】第１（ｂ）図は、プラスミドpBROC 138内
に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ
制限地図である。第１（ｃ）図は、プラスミドpBROC 13
7内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレア
ーゼ制限地図である。第１（ｄ）図は、プラスミドpBRO
C 303内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌク
レアーゼ制限地図である。 【０００８】第２図は、プラスミドpBROC 137とpBROC 1
38のエンドヌクレアーゼ制限地図である。第３図は、プ
ラスミドpBROC 303のエンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。したがって、この発明は、ペニシリンとセファロス
ポリンのβ−ラクタム化合物の生合成に関与する１以上
の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有する、
第１（ａ）図に示す制限座位の配置を有するＤＮＡ
（Ｉ）またはそのＤＮＡ由来のフラグメントを提供する
ものである。 【０００９】さらにこの発明は、ペニシリンおよびセフ
ァロスポリンのβ−ラクタム化合物類の生合成に関与す
る１つ以上の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子
を有する挿入ＤＮＡもしくはこのＤＮＡ由来の制限フラ
グメントを有し、前記ＤＮＡが第１（ａ）図に示す制限
座位の配置を有する、宿主細胞を形質転換できる組換え
体ベクターを提供するものである。 【００１０】したがて、この発明は他の態様として、こ
の発明の組換え体ベクターによって形質転換された宿主
細胞を提供するものである。かような宿主細胞として適
切なのは微生物であり、好ましいのは、イー・コリ(E.
coli）、ストレプトミセス属の微生物の、例えばエス・
リビダンス 66（S. lividans 66)(ＤＳＭ寄託番号第15
67号）である。 【００１１】当業者によって容易に認識されることであ
るが、式Ｉ（ａ）に示す全ＤＮＡセグメント（Ｉ）をこ
の発明の組換え体プラスミドに利用することは不便で望
ましくないことである。したがって、式Ｉ（ａ）に示す
全長のＤＮＡ（Ｉ）由来の適切な制限フラグメントは、
ペニシリン類とセファロスポリン類の生合成に関与する
１以上の完全な遺伝子を有する場合、挿入ＤＮＡとして
用いることができる。 【００１２】この発明の制限フラグメントは、公知の方
法により、適切な制限酵素で開裂することによってＤＮ
Ａセグメント（Ｉ）から得ることができる。特に好まし
いＤＮＡフラグメントとしては、前記第１（ｂ）図、第
１（ｃ）図および第１（ｄ）図に示す制限座位の配置を
有するＤＮＡフラグメントが挙げられる。 【００１３】第１〜３図において、略記号ClaI、BclIな
どは制限エンドヌクレアーゼ類の通常の略記号であり
（OldおよびPrimroseの前記文献参照）、アガロースゲ
ル電気泳動法で行ったサイジング実験によって測定した
ものであるがＤＮＡのおよその長さ〔キロベース（K
b）〕を示した。第１〜３図は、前記サイジング実験に
よって測定された、制限酵素開裂座位の近似の位置を示
すもので、図示したＤＮＡに存在する可能性のあるすべ
ての制限座位を、示そうと必ずしも意図するものではな
いと解されるべきである。 【００１４】第１（ａ）図に示されるＤＮＡまたは第１
（ｂ）、１（ｃ）および１（ｄ）図に示すフラグメント
のような前記ＤＮＡ由来の適切な制限フラグメントは、
ペニシリン類もしくはセファロスポリン類の生合成に関
与する酵素の遺伝子情報を指定する遺伝子を発現できる
いずれの宿主細胞でも形質転換しうるいずれのベクター
にも連結することができる。 【００１５】この発明のＤＮＡを発現できる適切な宿主
細胞としては、イー・コリ、ペニシリウム（Penicilliu
m）種、セファロスポリウム（Cephalosporium）種、ま
たはエス・クラブリゲルスおよびエス・リビダンスのよ
うなストレプトミセスの種（スペシーズ）が挙げられ
る。通常、この発明のＤＮＡがクローンされるベクター
は、プラスミドであり、例えばストレプトミセス属の菌
(Streptomycete）由来のプラスミド、またはテンペレー
トファージもしくはビルレントファージである。 【００１６】適切なベクターの例は、pIJ702（分子量8.
9メガドルトン）であり、すなわちKatz, E. ら、J. Ge
n. microbiol. 1983, 129, 2703-2714に記載された高コ
ピイ数プラスミドでJohn Innes Institute, Norwich,
英国より入手可能である。適切なテンペレート ファー
ジの例はφＣ31として知られているファージであり、Lo
movskaya, N. D.,Chater, K. F.,Mkrtumian, N. M.,Bac
heriol. Rev.,1980, 44, 206〜229に記載されている。 【００１７】この発明の組換え体ベクターは、第１
（ａ）図に示す挿入ＤＮＡもしくはこのＤＮＡ由来の制
限フラグメントを、選択された〔線形化（linearize
d）〕ベクターに、任意の便利な方法、例えば付着端の
直接接合法、ホモポリマー・テーリング法（tailing）
またはリンカーもしくはアダプター分子により、連結す
ることによって製造することができる。 【００１８】上記の方法によって製造された組換え体ベ
クターは、２つの可能な配向のうちの一つの配向の挿入
ＤＮＡを有していることが分かる。両方の配向を有する
組換え体ベクターもこの発明の権利範囲に含まれる。適
切な組換え体ベクターは、上記の第１（ｂ）、１（ｃ）
および１（ｄ）図に示す制限座位の配置を特徴とするＤ
ＮＡフラグメントを有するプラスミドである。好ましい
組換え体分子は： （ｉ） 第１（ｂ）図に示すＤＮＡフラグメントがpIJ70
2のBglII座位に挿入されているか（その構造物は以下に
pBROC 138と呼称されている）、（ii） 第１（ｃ）図に
示すＤＮＡフラグメントがpIJ702のBglII座位に挿入さ
れているか（その構造物は以下にpBROC 137と呼称され
る）、または（iii）第１（ｄ）図に示すＤＮＡフラグ
メントがpIJ702のBglII座位に挿入されている（その構
造物は以下にpBROC 300と呼称されている）分子であ
る。 【００１９】この発明のＤＮＡを作製するために、ラン
ダム配列のＤＮＡフラグメントをエス・クラブリゲルス
（ATCC 27064）の全細胞ＤＮＡを任意の便利な制限酵素
で部分消化することによって生成させることができる。
エンドヌクレアーゼSau 3AI（以下Sau 3Aと略記する）
とそのアイソシゾマー類は、この目的に特に適してい
る。 【００２０】次いでこのＤＮＡフラグメントは、ショ糖
勾配法でサイズの分画がなされ、３Kbを超え、好ましく
は15Kbを超えない長さのフラグメントが分離される。好
ましいフラグメントは大きさが４〜１４Kbのものであ
る。次いでそのＤＮＡフラグメントは、適切に開裂され
たベクター、例えばpIJ702に通常の“ショット・ガン”
法によって連結され、再環化した後、その組換え体ベク
ターは、セファマイシンＣを産生する性能の欠如してい
るエス・クラブリゲルスの菌株に形質転換される。 【００２１】この目的のために適切なエス・クラブリゲ
ルスの菌株は、エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５であ
り、これは、Beecham Culture Collectionに1986年１月
29日付けで寄託番号BCC1で寄託され、その後the Nation
al Collection of Industrialand Marine Bacteria, Ab
erdeen, Scotlandに移され、その寄託（NCIB 12208, 19
86 年２月19日付で寄託）は、特許手続上の微生物の寄
託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて行わ
れた。 【００２２】したがって、エス・クラブリゲルスＮＣＩ
Ｂ 12208はこの発明の他の態様を形成する。エス・クラ
ブリゲルスＮＣＰ−５（エス・クラブリゲルスＮＣＩＳ
12208）の派生と特性は次のとおりである。エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の派生（derivation） エス・クラブリゲルス（ATCC 27064）の試料の密封アン
プルを開いたところ種々の形態を示した。１４の異なる
タイプが認められた。これらの一つを、エス・クラブリ
ゲルスＳＣ−２として分離した。これを培養すると、エ
ス・クラブリゲルスＳＣ−２自体が種々の形態を示し
た。“小さな”変種の一例から、“大きな”コロニイの
変異細胞が自然に得られ、エス・クラブリゲルスＮＣＰ
−５と命名された。エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の分類 エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の分類学的および形態
学的性質は、エス・クラブリゲルス（ATCC 27064）のそ
れに本質的に類似していることが見出された。これらの
性質については、米国特許第3,862,008号やHiggins, C.
E.およびKastner, R. E.のInt. J. Systematic Bacter
iol., 1971, 21, 326-331にも記載されている。エス・
クラブリゲルスＮＣＰ−５の培養法は、英国特許第1,50
8,977号明細書に、エス・クラブリゲルス（ATCC 2706
4）について記載された方法と類似している。 【００２３】前記“ショット・ガン”法によって得られ
た形質転換細胞は、セファマイシンＣに感受性の微生物
に接触させてその微生物の増殖特性を試験することによ
って、セファマイシンＣの産生能についてスクリーニン
グされる。この目的に適切な微生物はエイ・フェカリス
（A. faecalis）である（the National Collection of
Industrial and Marine Bacteria にＮＣＩＳ 8156の寄
託番号で寄託されており、また請求があればいつでもth
e Beecham Culture Collection（寄託番号BCC2）から誰
でも入手しうる）。スクリーニングのために、エイ・フ
ェカリースは、寒天プレート上で便利に培養され、次い
で相補性試験が、当該技術分野で公知の通常の方法で形
質転換細胞類のプラグを寒天プレートに挿入することに
よって行われる。 【００２４】エイ・フェカリスのようなセファマイシン
感受性微生物を新たに接種した培地に成育阻害領域を生
成する性能によって陽性と確認された形質転換細胞が単
離され、これに保有されている組換え体ベクターが“陽
性”の各コロニイから通常の方法で単離される。その組
換え体ベクターを適切な制限酵素で消化することによっ
て、各ベクターに挿入されたエス・クラブリゲルスＤＮ
Ａは、この発明のＤＮＡを保有しているということを調
べるために通常の方法で種々の制限酵素で開裂すること
によって確認され、大きさを測定し地図にされる。 【００２５】かようにして単離された２以上の“重複”
挿入体は、全部もしくは部分的にこの発明のＤＮＡに含
まれているが、小さすぎてペニシリン類およびセファロ
スポリン類の生合成に関与する完全な遺伝子（intact g
ene）を入れることができないので、通常のしかたで、
共通の制限座位を開裂し、次いで連結する（例えばＤＮ
Ａリガーゼによって）ことによってしばしば融合され
て、例えばpBROC 137とpBOC 138の挿入ＤＮＡもしくは
前記定義のこれらのＤＮＡ由来の適切な制限フラグメン
トが得られる。 【００２６】ＤＮＡセグメントＩは、pBROC 137もしく
はpBROC 138のエス・クラブリゲルスＤＮＡを用い、エ
ス・クラブリゲルスの全細胞ＤＮＡとpHC 79〔Hohn, B.
およびCollins, J.,（1980）, Gene, 11, 291〕とで作
製されたコスミドを保有するイー・コリ細胞を、コロニ
イ・ハイブリッド形成法によって、同定することによっ
て単離される。次いでプラスミドpBROC 303がpIJ702と
セグメントＩ（ｄ）のＤＮＡ（フラグメントＩから得ら
れる）とから、簡単なサブクローニング法によって組立
てられる。 【００２７】ペニシリン類とセファロスポリン類の生合
成に関与する酵素の生産は、この発明のＤＮＡを適切な
ベクター、例えばpIJ702に再挿入し、次いで適切な宿主
微生物、例えばエス・リビダンス66（ＤＳＭ1567）を、
前記のようにして作製した組換え体ベクターで形質転換
することによって達成される。このようにして製造され
た特に価値のある酵素には、“サイクラーゼ（cyclas
e）”、すなわちイソペニシリンＮシンテターゼ（ＡＣ
ＶをイソペニシリンＮに変換できる）、“エクスパンダ
ーゼ”、すなわちデアセトキシセファロスポリンＣシン
テターゼ（ペニシリンＮをデアセトキシセファロスポリ
ンＣに変換できる）、“エピメラーゼ”、すなわちペニ
シリンＮシンテターゼ（イソペニシリンＮをペニシリン
Ｎに変換できる）およびＯ−カルバモイルデスアセチル
セファロスポリンＣ−７−ヒドロキシラーゼ（Ｏ−カル
バモイルデスアセチルセファロスポリンＣとセファロス
ポリンＣとをそれぞれの７−ヒドロキシ誘導体に変換で
きる）として、当該技術分野で知られている酵素（J.
F. MartinおよびP. Lirasの前記文献）が含まれる。エ
ス・クラブリゲルスATCC 27064の前記酵素類やペニシリ
ン類とセファロスポリン類の合成をもたらす性能を有す
るいずれの他の蛋白類も、この発明の形質転換された宿
主によって産生される場合は、この発明の他の態様を形
成するものである。これら蛋白や酵素類は高純度の形態
で得ることが好ましい。 【００２８】かような蛋白や酵素は、通常の方法によっ
て単離・精製される。この発明のＤＮＡとこれを保有す
るベクターは、工業界の多くの分野で用途が見出されて
いる。このようなことは、前記ベクターで形質転換され
た宿主微生物およびその微生物が発現する酵素にもあて
はまる。例えばこのＤＮＡは、ハイブリッド形成プロー
ブとして利用して、エス・クラブリゲルス（ATCC 2706
4）や、類似の構造と特異性を有する酵素を産生する他
の微生物の全細胞ＤＮＡに存在する、関連もしくは重複
の遺伝子を同定・単離することができる。したがって、
この発明は微生物内でβ−ラクタム抗生物質の生合成に
関与する遺伝子を単離するために、β−ラクタム抗生物
質産生の微生物のＤＮＡにハイブリッド形成できるＤＮ
Ａ（Ｉ）もしくはそのフラグメントの使用を提供するも
のである。前記ＤＮＡを保有する組換え体ベクターは、
適切な宿主に形質転換されると、セファマイシンＣのよ
うな価値ある抗生物質を多量に合成する遺伝学的に改変
された微生物を製造したりまたは遺伝子転移法による新
規なもしくはハイブリッドの抗生物質を生成させる（例
えばD. A. Hopwoodら、Nature, 1985, 314, 642-644参
照）のに有用である。この発明のＤＮＡによってエンコ
ードされている酵素は特に、例えば公知のβ−ラクタム
抗生物質を、その天然の前駆体から製造したりまたは新
規なβ−ラクタム抗生物質を例えば化学合成法で得られ
た非天然の前駆体から製造したりするために適切な固体
の担体に固定化される場合、細胞の存在しない系で使用
することができる。 【００２９】この発明のＤＮＡもしくはそのフラグメン
ト（完全な遺伝子を必ずしももっていない）は、組換え
体ＤＮＡの技術もしくは天然の組換え工程によって、β
−ラクタム合成に関与する遺伝子のフラグメントと結合
され、ハイブリッド酵素の合成を命令しうるハイブリッ
ド遺伝子が製造される。かような酵素類は、前記方法と
類似の方法によって新規な抗生物質を製造するのに用い
られる。 【００３０】またこの発明のＤＮＡは、特定部位の突然
変異誘発法の公知の技術（例えば、G. Winterら、Natur
e, 1982, 299, 756-758又はZollerとSmith, Nucleic Ac
idsResearch, 1982, 10, 6487-6500に記載されたのと類
似のしかた）によって改変され、特異な突然変異および
／または欠失がなされたＤＮＡが得られる。その突然変
異ＤＮＡは、β−ラクタム抗生物質を産生することがす
でに知られている適切な宿主微生物から公知のβ−ラク
タム抗生物質を増大した収率（またはタイター）で得る
ために使用される。またこの突然変異ＤＮＡは、遺伝子
転移法によって新規もしくはハイブリッドの抗生物質を
得るのに用いられ、または上記記載の方法と類似の方法
によって新規な抗生物質を製造するのに用いうる突然変
異酵素（ミューテイン、mjutein）の産生に用いられ
る。かような突然変異ＤＮＡはこの発明の範囲内にある
と解される。 【００３１】この発明を下記実施例で説明するが、本願
発明を限定するものではない。実施例 製造例１ Sau 3Aで消化されたエス・クラブリゲルス27
064 ＤＮＡの４〜15Kbの大きさのピースの単離 （ａ）全細胞ＤＮＡ（total cellular DNA）をエス・ク
ラブリゲルス27064から下記の方法で製造した。 ｉ）エス・クラブリゲルス27064の胞子を、トリプトン
・ソヤ・ブロスマルトース増殖培地入りの２つの振盪フ
ラスコ（30ml／250mlスプリング振盪フラスコ；トリプ
トン・ソヤ・ブロス30g/ｌ，マルトース10ｇ／ｌ）に接
種し、26℃で48時間（240rpm）培養した。 ii）菌系体（mycelium)を、10,000Ｇで遠心分離して収
穫した。 iii)上澄フラクションを流出させ、ペレットを10mlの溶
解液（lysing solution;50mMトリスpH 8.5, 50mM Na2ED
TA, 15％庶糖、リゾチーム３mg／ml）に再懸濁させ、37
℃で１時間培養した。 iv）２mgのプロティナーゼＫ（SIGMA chemicals 社）含
有のナトリウムラウリルサルフェート（10％溶液）の0.
5mlを添加し、培養を15分間続け、さらにSLS/Prot K溶
液を加え培養をさらに15分間続けた。 ｖ）酢酸ナトリウム（0.3Mまで）と氷冷エタノール（２
容積）とを加えた後、ＤＮＡをガラス棒でまき取った。
これを数回繰返しＤＮＡの半透明粘性の製剤を得た。（ｂ）エス・クラブリゲルス27064からの染色体ＤＮＡ
のSau 3Aによる部分消化 180μｇの全細胞ＤＮＡを、推奨された緩衝液中、12単
位のSau 3A制限酵素（NEW ENGLAND BIOLABS 供給）とと
もに30分間37℃で培養した。酵素を70℃で変性させるこ
とによって反応を停止させた。ＤＮＡの消化の度合をア
ガロースゲル電気泳動法によって試験したところ、得ら
れたフラグメントは15Kb〜0.16Kbの大きさの範囲にある
ことが見出された。（ｃ）ショ糖勾配法（40〜10％W/v)によるSau 3Aによっ
て部分的に消化されたＤＮＡの分画 ショ糖の勾配法（40〜10％）を“Genetic Manipulation
of Streptomyces-A Laboratory Manual,著者：D.A.Hop
woodら，the John Innes Foundation発行 1985"に記載
してあるのと同様にして、ショ糖の勾配（40〜10％）を
13mlの遠心分離管内に作製した。 【００３２】エス・クラブリゲルス27064ＤＮＡのSau 3
Aによる部分消化物（0.5ml中100μｇ）を前記ショ糖勾
配の上面に注意深く積層し、その系を21時間30000rpm(1
05gav)で遠心分離した。遠心分離管を遠心分離器から取
り外し、該分離管の底部にあけた孔から、400μｌづつ
のフラクションを採取した。これらのフラクションの５
μｌ試料をゲル電気泳動法で試験し、大きさが４〜14Kb
のＤＮＡを含有することを示したフラクションを集め
た。 【００３３】このようにして、Sau 3Aで消化され、大き
さが４〜14KbのＤＮＡの12μｇを得た。製造例２ エス・クラブリゲルス27064ＤＮＡのSau 3A
によるフラグメントをクローンするのに適切なpIJ702ベ
クターＤＮＡの製造 （ａ）プラスミドＤＮＡの単離 エス・クラブリゲルス27064：pIJ702の胞子を振盪フラ
スコ中のＴＳＢ／マルトース培地［培地調製に関する製
造例1(a)参照］に接種した。プラスミドの安定性を保持
するためにチオストレプトンを2.5μｇ／mlまで添加し
た。微生物を48時間、26℃で培養した。pIJ702［Katz,
E.ら,J. Gen.Microbiol.(1983)129,2703-2714参照］プ
ラスミドを、中性溶菌法（the Neutral Lysis Procedur
e,Hopwoodら，1985の前記文献参照）を用いて菌系体か
ら単離した。このようにして、pIJ702 ＤＮＡの50μｇ
を単離した。（ｂ）エス・クラブリゲルス27064からのpIJ702ＤＮＡ
のBglIIによる消化 30μｇのpIJ 702 ＤＮＡを、推奨の
制限緩衝液（全容積400μｌ）中のBglII制 限酵素（Amersham Internationalにより供給された100
単位）で、30分間37℃で消化した。 【００３４】70℃で30分間培養することによって反応を
停止した。反応混合物の試料をアガロースゲル電気泳動
法（0.7％ゲル）で試験したところ、当初存在した共有
閉環状プラスミド［closed covalent circular (ccc) p
lasmid]はすべて直線形に変換していた。（ｃ）BglIIで消化されたpIJ 702 ＤＮＡの小牛の腸の
アルカリ性ホスファターゼ（CIAP）による処理 この処理は、“Molecular Cloning-A Laboratory Monua
l,“Maniatis,T.ら，cold Spring Harbour Laboratory
(1982)発行”に記載されているのと同様にして行った。 【００３５】Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、CIAPで処理
したＤＮＡを試験した結果、酵素によって脱リン酸化を
行った後は、もはや自己連結(self-ligate)しないこと
が分かった。製造例３． エス・クラブリゲルス27064の、3au 3Aで
消化された全細胞ＤＮＡと、BglIIで消化されCIAPで処
理されたpIJ702ＤＮＡとの連結 Sau 3Aで消化されたエス・クラブリゲルス27064の染色
体ＤＮＡ（4-14Kb）の１μｇを含有する15μｌの水を入
れた12の各容器に、BglIIで消化されCIAPで処理されたp
IJ702（0.5μｇ／ポット）含有の緩衝液100μｌを加え
て、最終濃度を1.5μｇＤＮＡ／150μｌ、トリス塩酸pH
7.5緩衝液（66mM）、MgCl2(6.6mM)、ジチオトレイトー
ル（10mM）およびアデノシントリホフエート（0.4mM)と
した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（0.1単位、Amersham Intern
ational社より供給）を各ポットに添加し、各系を15℃
で72時間培養し、必要な容器に移した。製造例４． エス・クラブリゲルスNCP-5:pIJ702/27064
クローンのライブラリイの作製 （ａ）pIJ702中に挿入されたＤＮＡの頻度とＤＮＡ挿入
体の大きさに関する、エス・リビダンス66内の連結ＤＮ
Ａの試験 1.5μｇの連結ＤＮＡ（エス・クラブリゲルス27064から
製造され、BglIIで消化されCIAPで処理されたPIJ702を
連結したエス・クラブリゲルス27064のSau 3Aによつて
得られた４〜14４Kbのフラグメント）を10μｌのＴＥ緩
衝液（１mM Na2EDTA, 10mMトリス塩酸ｐＨ8.2)に溶解
し、その５μｌづつの２つを、エス・リビダンス66（Ｄ
ＳＭ 1567)の原形質体［1010原形質体／ml，25％ポリエ
チレングリコール（平均分子量1000)の存在下、“Genet
ic Manipulation of Streptomyes-ALaboratory Mannua
l"に記載したのと同様にして製造］の100μｌづつの２
つの形質転換するのに用いた。 【００３６】形質転換した後、その原形質体の10-4まで
希釈した液を、プレート上のＲ２ＹＥ寒天に塗布した(H
opwoodらの前記文献参照）。32℃で24時間培養した後、
プレートを軟普通ブイヨン寒天（SNBA)［８ｇDifco普通
ブイヨン／ｌ、プラスミドが産生するコロニイを選択す
るためのチオストレプトン抗生物質（500μｇ／ｌ）
と、これらのコロニイが産生する、pIJ702のmel遺伝子
に挿入体を持つプラスミドを検出するためのＬ−チロシ
ン（１ｇ／ｌ）とを含有する３ｇ寒天／ｌ］でオーバー
ボアーした（overpour)。 【００３７】数日の培養後、黒色コロニイの頻度（２％
を超えない）と連結ＤＮＡの形質転換効率（9.3×103形
質転換体／μｇＤＮＡ）を、カウンティング（countin
g)によって確認することができた。前記の方法（製造例
２ａ）で、エス・リビダンス66の10ケの白色コロニイか
らプラスミドを調製した。これらのプラスミド製剤をBc
lI制限酵素で消化し、次いでアガロースゲル電気泳動法
でＤＮＡ挿入体の大きさを測定した。 【００３８】このようにして測定した結果、クローンさ
れたＤＮＡの平均の大きさは５Kbであった。（ｂ）連結ＤＮＡ試料のエス・クラブリゲルスNCP-5
（エス・クラブリゲルスNCIB 12208）への形質転換 1.5μｇの連結ＤＮＡを、２×５μｌのＴ．Ｅ．緩衝液
内で、２×100μｌのエス・クラブリゲルスNCP−５原形
質体（1010原形質体／ml，前記のHopwoodら(1985)の文
献に記載されたのと同様にして製造］に形質転換した。
この形質転換された原形質体を、26℃でＲ5 寒天［100
ｇショ糖／ｌ、10ｇデキストリン／ｌ、5.1ｇMgCl2・6H
2O／ｌ，１ｇカザミノ酸／ｌ，0.05ｇMgSO4・7H2O／ｌ,
2.5gL −アルギニンHCl/ｌ，１ml微量元素／ｌ，20g O
xoid Technical Agar No.3/1, 0.05gKH2PO4 ／ｌ ,3.7g
CaCl2・2H2O／l, 5.7g TES緩衝液pH7.2/l］上で再生さ
せた。なお微量元素溶液は、FeSO4 ・7H2O 1g/l,MnCl2・4
H2O 1g/l,ZnSO4 ・7H2O 1g/lを含有している。48時間再
生させた後、チオストレプトン（50μｇ／ml）含有のSN
BA（製造例４ａに記載したのと同一）で覆うことによっ
てチオストレプトン耐性コロニイを選択した。さらに72
時間後、形質転換されたコロニイを個々にかきとって、
抗生物質生産に適切なひとつの普通寒天培地上に配列し
た。この寒天培地は、デキストリン10ｇ／ｌ、K2HPO4 1
g/l 、MgSO4・7H2O 1g/l、(NH4) 2SO4 1g/l 、Industria
l chalk 4g/l, 微量元素溶液１ml、寒天20g/l、酵母エ
キス２ｇ／ｌおよび細菌学的ペプトン2.5g/lを含有する
Ｍ５Ｄ+ 寒天培地である。またその微量元素溶液は、Fe
SO4・7H2O 0.1％、MnCl2・4H2O 0.1％およびZnSO4・7H2O
0.01％並びにチオストレプトン（2.5μｇ／ml）を含有
している。 【００３９】pIJ702：エス・クラブリゲルス27064ＤＮ
Ａプラスミドによって与えられたチオストレプトン耐性
を示した4500のＮＣＰ−５コロニイをこの方法で得た。製造例５． セファマイシンＣ産生のためのＮＣＰ−
５：pIJ 702/エス・クラブリゲルス27064ライブラリイ
のスクリーニング Ｍ５Ｄ+寒天培地上26℃で10日間培養した後、８mm径の
寒天プラグをそれぞれの菌糸体パッチから切りとり、ア
ルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)ATCC
8750/NCIB 8156を予め新たに接種したＤＳＴ寒天培地
（40g Oxoid DST寒天／ｌ水）上に置いた（Claridge,C.
A.およびJonson,D.L.(1962)Antimicrob.Ag.Chemother.6
82-686参照）。この生物は、セファロスポリンＣとセフ
ァマイシンＣのごときある種のセファロスポリン類に感
受性であるが、用いられる増殖条件下でＮＣＰ−５によ
って産生される低濃度のクラバラン酸の存在下でさえも
ペニシリンＮには感受性ではない。従ってペニシリンＮ
とクラバラン酸のみを産生したＮＣＰ−５は通常、エイ
・フェカリスNCIB 8156の増殖を阻害するゾーンを与え
ない。しかしその親のエス・クラブリゲルス菌株は上記
のゾーンを与える（この菌株は、ペニシリンＮ、クラバ
ラン酸およびセファマイシンＣを産生するからであ
る）。前記プラグからの抗生物質を、ＤＳＴ／エイ・フ
ェカリス寒天に拡散させ、37℃で一夜培養した後、エイ
・フェカリスの増殖状態を、抗生作用のゾーンについて
試験した。 【００４０】このようにして、クローンのライブラリー
の任意のメンバーによるセファロスポリン抗生物質類産
生の可能性を調べた。２つのクローンの、標識されたＮ
ＣＰ−5/36/5とＮＣＰ−5/10/7とは、エイ・フェカリス
に対して抗生作用のゾーンを与えることが見出された。製造例６．NCP-5/36/5とNCP-5/10/7のプラスミド含量の
試験 （ａ）プラスミドの物理試験 プラスミド製剤をNCP-5/36/5とNCP-5/10/7とから製造例
２ａに記載したのと同様にして作製した。ふたつのポジ
ティブ（positive)の各々の30ml培養物から、数μｇの
プラスミド物質を単離することができた。制限酵素座位
の地図を作成したところ、プラスミドの一つの種だけが
NCP-5/10/5に存在し、別のひとつの種のみがNCP-5/10/7
に存在するということを明確に示した。制限地図（第１
図参照）は、pIJ 702に、約5.7Kbと約5.8KbのＤＮＡ挿
入部をそれぞれを有するNCP-5/36/5とNCP-5/10/7から単
離されるということを示唆している。この二つのＤＮＡ
挿入体は、地図にされた制限酵素座位によって示唆され
ているように、ほぼ2.7Kbの共通フラグメントを有する
ようである。次いでこのことは、pBROC138の32Ｐで標識
された各フラグメントがpBROC137ＤＮＡの予測された部
分と広範なハイブリッドを形成するのをサザン分析法で
しめすことによって証明された。（ｂ）プラスミドpBROC 137とpBROC 138のＮＣＰ−５へ
の再導入 pBROC 137とpBROC 138とＤＮＡの100ノナグラムづつ
を、エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５を再形質転換する
のに用いた。その形質転換されたコロニイを分離し、製
造例５に記載したのと同様にしてエイ・フェカリス バ
イオアッセイ・プレートで試験した。 【００４１】pBROC 137もしくはpBROC 138で形質転換さ
れたＮＣＰ−５のコロニイ全部の少なくとも90％が、エ
イ・フェカリスに抗生作用のゾーンを与えることができ
ることが明らかになった。このことは、pBROC 137とpBR
OC 138中に存在するＤＮＡが、ＮＣＰ−５の受ける突然
変異を修復できる遺伝情報を有することを立証してい
る。製造例７． pBROC 137、pBROC 138およびpBROC 303に
よってストレプトミセス・リビダンス66に与えられる新
規な酵素活性の測定 100ナノグラムづつのpBROC 137ＤＮＡ、pBROC 138ＤＮ
ＡおよびpBROC 303ＤＮＡを、エス・リビダンス66に形
質転換した（製造例４ａに記載したのと同様にして）。 【００４２】エス・リビダンス66：pBROC137、エス・リ
ビダンス66：pBROC138およびエス・リビダンス66：pBRO
C 303の培養物を、YEME(30mlグルコース10ｇ／ｌ、ショ
糖340ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／ｌ、細菌学的ペプトン
５ｇ／ｌ、酵母エキス（Oxoid)3g/ からなり、チオスト
レプトン抗生物質を50μｇ／ml含有する）の振盪フラス
コ中で培養した。この培養物を、48時間、32℃、240rpm
で培養した。菌糸体を10,000gで遠心分離して収穫し、
トリス塩酸緩衝液pH7.0（0.05M)で洗浄した。菌糸体を
再び遠心分離し、ペレットを2.5mlのトリス緩衝液中に
再懸濁させた。1000psiでフレンチ・プレッシャー・セ
ルを用い細胞を破壊し、破壊細胞の製剤を10 5ｇで60分
間遠心分離し、細胞を含有せず粒子のない、溶解性酵素
製剤を得た。（ａ）エクスパンダーゼ酵素活性の例証 エス・リビダンス66:pIJ 702、エス・リビダンス66:pBRO
C 137およびエス・リビダンス66:pBROC138由来の酵素製
剤を、環拡大アセイシステムに用いて（Jensen,S.E.,We
stlake,D.W.S.およびWolfe,S.,(1983)Antimicrob.Ag.Ch
emother.24(3)307-312に記載してあるのと同様にし
て）、デアセトキシセファロスポリンＣシンテターゼの
存在を測定した。 【００４３】これらの著者によって記載された、イー・
コリＥＳＳ／ペニシリナーゼ（DIFCO Penicillinase Co
ncentrate 104 u/ml）バイオアセイシステムを利用する
ことによって、エス・リビダンス66:pIJ702エキストラ
クトはペニシリンＮをペニシリナーゼ耐性抗生物質に形
質転換できないが、一方エス・リビダンス66:pBROC 137
とエス・リビダンス66:pBROC 138からのエキストラクト
は前記形質転換を行うことができることを示すことがで
きた。エス・リビダンス66:pBROC 137酵素エキストラク
トは、前記アッセイシステム中のペニシリンＮをペニシ
リナーゼ耐性抗生物質に十分形質転換することができた
が、エス・リビダンス66:pBROC 138からの酵素エキスト
ラクトは、この点について著しく低い活性を示した。次
いで環拡大試験体を、ペニシリンＮ、デアセトキシセフ
ァロスポリンＣおよびデアセチルセファロスポリンＣの
標準試料とともに、セルロースの薄層クロマトグラフィ
用プレート上でクロマトグラフィ（ブタノール／酢酸／
水，3/1/1）に付した。寒天含有のイー・コリＥＳＳ／D
ifcoペニシリナーゼ上のクロマトグラフィのバイオアッ
セイによって、37℃で一夜培養後に、エス・リビダンス
66:pBROC 137酵素エキストラクトはペニシリンＮをデ
アセトキシセファロスポリンＣに形質転換するが、エス
・リビダンス66:pIJ 702からの酵素のエキストラクトは
この形質転換を行わないことが分かった。デアセチルセ
ファロスポリンＣがいずれかの細胞エキストラクトによ
ってペニシリンＮから合成されるということは全く確認
されなかった（デアセトキシセファロスポリンＣのＲｆ
＝0.55，デアセチルセファロスポリンＣのＲｆ＝0.3
9）。（ペニシリンＮはペニシリナーゼが存在するので
検出されない）（ｂ）イソ−ペニシリンＮの、イー・コリＥＳＳに対し
てより活性な化学形態への変換 Jesen,S.Eらによって開発されたイソ−ペニシリンＮエ
ピメラーゼアッセイを用いて［Can.J.Microbiol.(1983)
29(11),1526-1531］、エス・リビダンス66:pBROC 137か
らの細胞と粒子の存在しない酵素エキストラクト（製造
例７ａと同様）が、イソ−ペニシリンＮを、イソペニシ
リンＮ自体よりもイー・コリＥＳＳに対する活性が少な
くとも１０倍の化学的形態に変換できるということを例
証することができた。エス・リビダンス66:pIJ702から
の同様のエキストラクトはこのような変換ができなかっ
た。 （ｃ）エス・リビダンス66:pBROC 303の、細胞の存在し
ない製剤による、Ｏ−カルバモイル・デスアセチル・セ
ファロスポリンＣとセファロスポリンＣの、それぞれの
７−ヒドロキシ誘導体への変換 エス・リビダンス66:pBROC 303の、細胞なしの製剤（0.
9ml）を、アスコルビン酸ナトリウム（2.8ｍＭ）、硫酸
第一鉄（0.045ｍＭ）、α−ケトグルタレート（１ｍ
Ｍ）、塩化カリウム（7.5ｍＭ）、硫酸マグネシウム
（7.5ｍＭ）、トリス−塩酸pH7.0（0.05M)およびＯ−カ
ルバモイル・デスアセチル・セファロスポリンＣ（0.5
ｍＭ）もしくはセファロスポリン(0.5ｍＭ）とともに、
最終容積1.2mlとし、22℃で培養した。 【００４４】２時間培養後、振盪しながら25μｌの氷酢
酸を添加し、次いで遠心分離（10,000G,５分間）して蛋
白を除去した上澄液を得た。この液体をＱＡＥ−セファ
デックスカラム（１ml容積）に吸収させた。この樹脂を
250μｌの水と200μｌの0.2MNaClで洗浄した。さらに25
0μｌの0.2M NaClによって前記樹脂からセファロスポリ
ン類を溶離させた。 【００４５】これらを濃縮した反応生成物の試料20μｌ
をＣ18逆相マイクロボンダパックカラムを用いる高速液
体クロマトグラフィによって分析した。Ｏ−カルバモイ
ル・デスアセチル・セファロスポリンＣを７−ヒドロキ
シＯ−カルバモイル・デスアセチル・セファロスポリン
Ｃから分離するための移動相は0.1M NaH2PO4，pH3.2で
あった。セファロスポリンＣを７−ヒドロキシセファロ
スポリンＣから分離するために、移動相のpHを4.2まで
上昇させた。溶離は２ml／分の流速で260nmでの紫外吸
収で検出して行った。 【００４６】このようにして、Ｏ−カルバモイル・デス
アセチル・セファロスポリンＣ（保持時間5.7分）がそ
のヒドロキシ誘導体（保持時間3.0分）に約50％変換し
たこと、ならびにセファロスポリンＣ（保持時間18.2
分）が７−ヒドロキシセファロスポリンＣ（保持時間6.
6分）に約35％変換したことを証明することができた。
エス・リビダンス66：pIJ 702のエキストラクトはこの
ような形質転換を行えなかった。製造例８． エス・リビダンス66:pBROC 137とエス・リ
ビダンス66:pBROC 138とによって産生された蛋白質のナ
トリウムラウリルサルフェート／ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による分析 エス・リビダンス66:pBROC 137、エス・リビダンス66:p
BROC 138およびエス・リビダンス66:pIJ702の、細胞と
粒子のないエキストラクト（製造例７ａと同様）の５μ
ｌと10μｌとを、ナトリウムラウリルサルフェート（SL
S)で処理して溶解している蛋白質を変性し、Laemmliの
方法（英国、Nature,1970,227 680)を用いて、SLS/12％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるクロマトグラ
フイに付した。クーマシーブリリアントブルーで染色す
ることによって次のことが明らかになった。すなわち同
時にクロマトグラフに付した分子量が公知の蛋白質から
判断できたが、エス・リビダンス66:pBROC 137とエス・
リビダンス66:pBROC 138からのエキストラクトは約29,5
00ドルトンの蛋白質を示し、これはエス・リビダンス6
6:pIJ 702からのエキストラクトには存在しないか、ご
くわずかしか存在していないことが分かった。エス・リ
ビダンス66:pBROC 137からのエキストラクトも、大きさ
が約60,000ドルトンの著しくよく染まる蛋白質を示し
た。製造例９ pBROC 137とpBROC 138に含有されているＤＮ
Ａと隣接するエス・クラブリゲルス染色体からのＤＮＡ
の単離、特性表示およびサブクローニング ａ）ｐＨＣ79中のエス・クラブリゲルスATCC27064ＤＮ
Ａのライブラリイの組立て 10μｇのｐＨＣ79ＤＮＡ［Holm,B.およびCollins J.(19
80)Gene11,291-298)を、制限酵素のSalIとBamHIとによ
って完全に消化（digest)した。さらに10μｇのｐＨＣ7
9ＤＮＡをEcoRIとBamHIとで完全消化した。必要な“コ
スミドアーム(cosmid arms)”を単離するため、上記の
両消化物を、ショ糖勾配法（10〜40％）で分画した。各
コスミドアームの収量は５μｇを超える量であった。 【００４７】エス・クラブリゲルスATCC 27064の染色体
ＤＮＡの100μｇを、Sau 3AＩで部分的に消化し、ショ
糖勾配法(10〜40％）で分画した。30Kbを超え50Kbを超
えない制限フラグメントを含有するフラクションを集
め、この大きさの範囲のSau 3AＩによるフラグメントの
約10μｇを得た。これらのフラグメントを、1:1:1のモ
ル比で、前記コスミドアームに連結した（ＤＮＡ濃度20
0μｇ ml-1）。24時間後、この連結混合物をλファージ
に生体外でパッケージした（フアージλ・パッケージン
グ・エキストラクトとプロトコールは、Amersham Inter
national PLCが供給されている）。イー・コリＤＨＩを
トランスフェクションさせることによって［Low,B.(196
8)PNAS 60,161-167］、５×107のトランスフェクタント
（transfectant）／（μｇパッケージされたＤＮＡ）を
得た。ｂ）エス・クラブリゲルスATCC 27064 DNAライブラリイ
からのＤＮＡセグメント（Ｉ）の単離と、このＤＮＡの
pIJ 702へのサブクローニング エス・クラブリゲルスATCC 27064ＤＮＡの挿入体を有す
るpHC 79を保有するイー・コリＤＨＩの5000のコロニイ
を、ニトロセルロースのフィルターに固定化して溶解し
た。pBROC137由来の1.2Kb BClI−KpnIエンデットフラグ
メントを単離してニックトランスレートした。このフラ
グメントを、標準コロニイハイブリット形成技法によっ
てフィルターをプローブ（probe)した。７つのハイブリ
ッドを形成しているコロニイが得られ、そのうちのひと
つが第１(a)図に示すＤＮＡセグメント（Ｉ）を保有し
ていた。 【００４８】ＤＮＡセグメント（Ｉ）のフラグメントの
サブクローニングを、このクローンされたＤＮＡの10μ
ｇをBamHIで消化することから開始した。ベクターのpIJ
702の５μｇをBglIIで消化し、CIAPで処理して再環化
するのを防止した。前記のBamHIで生成したフラグメン
トと、BglIIで消化しCIAPで処理したpIJ 702とを、2:1
のモル比で連結し、50μｇ／mlのＤＮＡ濃度とした。15
℃で24時間培養後、0.5μｇの連結混合物をエス・リビ
ダンス66に形質転換し、２×105形質転換細胞／μｇを
得た。この形質転換細胞をスクリーニングすることによ
って、他のBamHIフラグメントクローンを有するpBROC 3
03を単離することができた。
分子類、特に、β−ラクタム抗生物質類、ことにペニシ
リン類とセファロスポリン類の生合成に関与する１以上
の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有するＤ
ＮＡフラグメントが挿入されこれを保有する微生物宿主
を形質転換するのに用いる組換え体ベクター類で形質転
換された宿主から産生される蛋白に関する。 【０００２】 【従来技術】ストレプトミセス・クラブリゲルス（Stre
ptomyces clavuligerus）のごとき微生物によって産生
されるβ−ラクタム抗生物質の生合成の解釈については
進展は遅々としたものであった。それにもかかわらず、
ある種のペニシリン類とセファロスポリン類（セファマ
イシン類を含む）の生合成経路が密接に関連しているこ
とが立証されたのである。 【０００３】イソペニシリンＮは、前記両グループの化
合物を生合成する場合の中間体であり、トリペプチドの
δ（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ
−バリン（ＬＬＤ−ＡＣＶと呼称される場合もあるが、
この明細書ではさらに簡単にＡＣＶと呼称する）にサイ
クラーゼ(cyclase）酵素を作用させて製造される。中間
体のイソペニシリンＮはペニシリンＧに変換することが
できるが、エピメラーゼ酵素の作用でペニシリンＮにも
変換することができる。そして、後者のペニシリンＮか
ら、最初の、エクスパンダーゼ(expandase）酵素による
環拡大反応(ring expansion）とこれに続く多段の経路
によって、種々のセファロスポリン類やセファマイシン
類が誘導される。この技術の水準を最近要約したもの
が、J. F.MartinおよびP. Liras, Trend in Biotechnol
ogy, 1985, 3,39-44に記載されている。セファマイシン
Ｃを生合成する場合、まずペニシリンＮがデアセトキシ
セファロスポリンＣに変換され、次いでこのデアセトキ
シセファロスポリンＣがジオキシゲナーゼ酵素によって
デスアセチルセファロスポリンＣに変換される。このデ
スアセチルセファロスポリンＣはＯ−カルバモイル化さ
れてＯ−カルバモイルデスアセチルセファロスポリンＣ
に変換され、ついでこのカルバモイル化物がセファマイ
シンＣに変換される。セファマイシンＣの７α−メトキ
シ基は、次の２工程によって、すなわち、Ｏ−カルバモ
イルデスアセチルセファロスポリンＣに７−ヒドロキシ
ラーゼ酵素を作用させて、その７α−ヒドロキシ誘導体
を得、次いでメチル化反応に付することによって誘導さ
れるということは、J. D. Hoodらの研究（J. Chem. So
c. Chem. Commun, 1983, 第1187−1188頁およびその引
用文献）に照らして可能であろう。 【０００４】現在よく知られているように、組換え体Ｄ
ＮＡ技術によって、あるベクターが有するＤＮＡを宿主
細胞に挿入することによって、形質転換された宿主に、
挿入ＤＮＡが有する遺伝子がエンコード(encode）する
どんな蛋白質や酵素でも合成する性能を付与することが
可能である（組換え体ＤＮＡ方法論の充分な検討、この
明細書に用いる用語の辞典については、R. W. OldとS.
B. Primrose著、第３版、Blackwell Scientific Public
ations. 1985の“Principles of gene manipulation ”
を参照のこと）。 【０００５】シイ・アクレモニウム(C. acremonium）由
来のイソペニシリンＮシンテターゼ（サイクラーゼ）遺
伝子のイー・コリ(E. coli）における分離と発現は最
近、S.M. Samsonらによって報告された（Nature, 1985,
318, 191-194）。 【０００６】 【発明の実施の形態】この発明を明確にするため、下記
の図面が参照される。第１（ａ）図は、ペニシリンとセ
ファロスポリンの生合成に関与する遺伝子の遺伝情報を
指定するエス・クラブリゲルスATCC 27064染色体ＤＮＡ
（Ｉ）のエンドヌクレアーゼ制限地図である。 【０００７】第１（ｂ）図は、プラスミドpBROC 138内
に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ
制限地図である。第１（ｃ）図は、プラスミドpBROC 13
7内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレア
ーゼ制限地図である。第１（ｄ）図は、プラスミドpBRO
C 303内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌク
レアーゼ制限地図である。 【０００８】第２図は、プラスミドpBROC 137とpBROC 1
38のエンドヌクレアーゼ制限地図である。第３図は、プ
ラスミドpBROC 303のエンドヌクレアーゼ制限地図であ
る。したがって、この発明は、ペニシリンとセファロス
ポリンのβ−ラクタム化合物の生合成に関与する１以上
の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子を有する、
第１（ａ）図に示す制限座位の配置を有するＤＮＡ
（Ｉ）またはそのＤＮＡ由来のフラグメントを提供する
ものである。 【０００９】さらにこの発明は、ペニシリンおよびセフ
ァロスポリンのβ−ラクタム化合物類の生合成に関与す
る１つ以上の酵素の遺伝情報を指定する１以上の遺伝子
を有する挿入ＤＮＡもしくはこのＤＮＡ由来の制限フラ
グメントを有し、前記ＤＮＡが第１（ａ）図に示す制限
座位の配置を有する、宿主細胞を形質転換できる組換え
体ベクターを提供するものである。 【００１０】したがて、この発明は他の態様として、こ
の発明の組換え体ベクターによって形質転換された宿主
細胞を提供するものである。かような宿主細胞として適
切なのは微生物であり、好ましいのは、イー・コリ(E.
coli）、ストレプトミセス属の微生物の、例えばエス・
リビダンス 66（S. lividans 66)(ＤＳＭ寄託番号第15
67号）である。 【００１１】当業者によって容易に認識されることであ
るが、式Ｉ（ａ）に示す全ＤＮＡセグメント（Ｉ）をこ
の発明の組換え体プラスミドに利用することは不便で望
ましくないことである。したがって、式Ｉ（ａ）に示す
全長のＤＮＡ（Ｉ）由来の適切な制限フラグメントは、
ペニシリン類とセファロスポリン類の生合成に関与する
１以上の完全な遺伝子を有する場合、挿入ＤＮＡとして
用いることができる。 【００１２】この発明の制限フラグメントは、公知の方
法により、適切な制限酵素で開裂することによってＤＮ
Ａセグメント（Ｉ）から得ることができる。特に好まし
いＤＮＡフラグメントとしては、前記第１（ｂ）図、第
１（ｃ）図および第１（ｄ）図に示す制限座位の配置を
有するＤＮＡフラグメントが挙げられる。 【００１３】第１〜３図において、略記号ClaI、BclIな
どは制限エンドヌクレアーゼ類の通常の略記号であり
（OldおよびPrimroseの前記文献参照）、アガロースゲ
ル電気泳動法で行ったサイジング実験によって測定した
ものであるがＤＮＡのおよその長さ〔キロベース（K
b）〕を示した。第１〜３図は、前記サイジング実験に
よって測定された、制限酵素開裂座位の近似の位置を示
すもので、図示したＤＮＡに存在する可能性のあるすべ
ての制限座位を、示そうと必ずしも意図するものではな
いと解されるべきである。 【００１４】第１（ａ）図に示されるＤＮＡまたは第１
（ｂ）、１（ｃ）および１（ｄ）図に示すフラグメント
のような前記ＤＮＡ由来の適切な制限フラグメントは、
ペニシリン類もしくはセファロスポリン類の生合成に関
与する酵素の遺伝子情報を指定する遺伝子を発現できる
いずれの宿主細胞でも形質転換しうるいずれのベクター
にも連結することができる。 【００１５】この発明のＤＮＡを発現できる適切な宿主
細胞としては、イー・コリ、ペニシリウム（Penicilliu
m）種、セファロスポリウム（Cephalosporium）種、ま
たはエス・クラブリゲルスおよびエス・リビダンスのよ
うなストレプトミセスの種（スペシーズ）が挙げられ
る。通常、この発明のＤＮＡがクローンされるベクター
は、プラスミドであり、例えばストレプトミセス属の菌
(Streptomycete）由来のプラスミド、またはテンペレー
トファージもしくはビルレントファージである。 【００１６】適切なベクターの例は、pIJ702（分子量8.
9メガドルトン）であり、すなわちKatz, E. ら、J. Ge
n. microbiol. 1983, 129, 2703-2714に記載された高コ
ピイ数プラスミドでJohn Innes Institute, Norwich,
英国より入手可能である。適切なテンペレート ファー
ジの例はφＣ31として知られているファージであり、Lo
movskaya, N. D.,Chater, K. F.,Mkrtumian, N. M.,Bac
heriol. Rev.,1980, 44, 206〜229に記載されている。 【００１７】この発明の組換え体ベクターは、第１
（ａ）図に示す挿入ＤＮＡもしくはこのＤＮＡ由来の制
限フラグメントを、選択された〔線形化（linearize
d）〕ベクターに、任意の便利な方法、例えば付着端の
直接接合法、ホモポリマー・テーリング法（tailing）
またはリンカーもしくはアダプター分子により、連結す
ることによって製造することができる。 【００１８】上記の方法によって製造された組換え体ベ
クターは、２つの可能な配向のうちの一つの配向の挿入
ＤＮＡを有していることが分かる。両方の配向を有する
組換え体ベクターもこの発明の権利範囲に含まれる。適
切な組換え体ベクターは、上記の第１（ｂ）、１（ｃ）
および１（ｄ）図に示す制限座位の配置を特徴とするＤ
ＮＡフラグメントを有するプラスミドである。好ましい
組換え体分子は： （ｉ） 第１（ｂ）図に示すＤＮＡフラグメントがpIJ70
2のBglII座位に挿入されているか（その構造物は以下に
pBROC 138と呼称されている）、（ii） 第１（ｃ）図に
示すＤＮＡフラグメントがpIJ702のBglII座位に挿入さ
れているか（その構造物は以下にpBROC 137と呼称され
る）、または（iii）第１（ｄ）図に示すＤＮＡフラグ
メントがpIJ702のBglII座位に挿入されている（その構
造物は以下にpBROC 300と呼称されている）分子であ
る。 【００１９】この発明のＤＮＡを作製するために、ラン
ダム配列のＤＮＡフラグメントをエス・クラブリゲルス
（ATCC 27064）の全細胞ＤＮＡを任意の便利な制限酵素
で部分消化することによって生成させることができる。
エンドヌクレアーゼSau 3AI（以下Sau 3Aと略記する）
とそのアイソシゾマー類は、この目的に特に適してい
る。 【００２０】次いでこのＤＮＡフラグメントは、ショ糖
勾配法でサイズの分画がなされ、３Kbを超え、好ましく
は15Kbを超えない長さのフラグメントが分離される。好
ましいフラグメントは大きさが４〜１４Kbのものであ
る。次いでそのＤＮＡフラグメントは、適切に開裂され
たベクター、例えばpIJ702に通常の“ショット・ガン”
法によって連結され、再環化した後、その組換え体ベク
ターは、セファマイシンＣを産生する性能の欠如してい
るエス・クラブリゲルスの菌株に形質転換される。 【００２１】この目的のために適切なエス・クラブリゲ
ルスの菌株は、エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５であ
り、これは、Beecham Culture Collectionに1986年１月
29日付けで寄託番号BCC1で寄託され、その後the Nation
al Collection of Industrialand Marine Bacteria, Ab
erdeen, Scotlandに移され、その寄託（NCIB 12208, 19
86 年２月19日付で寄託）は、特許手続上の微生物の寄
託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて行わ
れた。 【００２２】したがって、エス・クラブリゲルスＮＣＩ
Ｂ 12208はこの発明の他の態様を形成する。エス・クラ
ブリゲルスＮＣＰ−５（エス・クラブリゲルスＮＣＩＳ
12208）の派生と特性は次のとおりである。エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の派生（derivation） エス・クラブリゲルス（ATCC 27064）の試料の密封アン
プルを開いたところ種々の形態を示した。１４の異なる
タイプが認められた。これらの一つを、エス・クラブリ
ゲルスＳＣ−２として分離した。これを培養すると、エ
ス・クラブリゲルスＳＣ−２自体が種々の形態を示し
た。“小さな”変種の一例から、“大きな”コロニイの
変異細胞が自然に得られ、エス・クラブリゲルスＮＣＰ
−５と命名された。エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の分類 エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５の分類学的および形態
学的性質は、エス・クラブリゲルス（ATCC 27064）のそ
れに本質的に類似していることが見出された。これらの
性質については、米国特許第3,862,008号やHiggins, C.
E.およびKastner, R. E.のInt. J. Systematic Bacter
iol., 1971, 21, 326-331にも記載されている。エス・
クラブリゲルスＮＣＰ−５の培養法は、英国特許第1,50
8,977号明細書に、エス・クラブリゲルス（ATCC 2706
4）について記載された方法と類似している。 【００２３】前記“ショット・ガン”法によって得られ
た形質転換細胞は、セファマイシンＣに感受性の微生物
に接触させてその微生物の増殖特性を試験することによ
って、セファマイシンＣの産生能についてスクリーニン
グされる。この目的に適切な微生物はエイ・フェカリス
（A. faecalis）である（the National Collection of
Industrial and Marine Bacteria にＮＣＩＳ 8156の寄
託番号で寄託されており、また請求があればいつでもth
e Beecham Culture Collection（寄託番号BCC2）から誰
でも入手しうる）。スクリーニングのために、エイ・フ
ェカリースは、寒天プレート上で便利に培養され、次い
で相補性試験が、当該技術分野で公知の通常の方法で形
質転換細胞類のプラグを寒天プレートに挿入することに
よって行われる。 【００２４】エイ・フェカリスのようなセファマイシン
感受性微生物を新たに接種した培地に成育阻害領域を生
成する性能によって陽性と確認された形質転換細胞が単
離され、これに保有されている組換え体ベクターが“陽
性”の各コロニイから通常の方法で単離される。その組
換え体ベクターを適切な制限酵素で消化することによっ
て、各ベクターに挿入されたエス・クラブリゲルスＤＮ
Ａは、この発明のＤＮＡを保有しているということを調
べるために通常の方法で種々の制限酵素で開裂すること
によって確認され、大きさを測定し地図にされる。 【００２５】かようにして単離された２以上の“重複”
挿入体は、全部もしくは部分的にこの発明のＤＮＡに含
まれているが、小さすぎてペニシリン類およびセファロ
スポリン類の生合成に関与する完全な遺伝子（intact g
ene）を入れることができないので、通常のしかたで、
共通の制限座位を開裂し、次いで連結する（例えばＤＮ
Ａリガーゼによって）ことによってしばしば融合され
て、例えばpBROC 137とpBOC 138の挿入ＤＮＡもしくは
前記定義のこれらのＤＮＡ由来の適切な制限フラグメン
トが得られる。 【００２６】ＤＮＡセグメントＩは、pBROC 137もしく
はpBROC 138のエス・クラブリゲルスＤＮＡを用い、エ
ス・クラブリゲルスの全細胞ＤＮＡとpHC 79〔Hohn, B.
およびCollins, J.,（1980）, Gene, 11, 291〕とで作
製されたコスミドを保有するイー・コリ細胞を、コロニ
イ・ハイブリッド形成法によって、同定することによっ
て単離される。次いでプラスミドpBROC 303がpIJ702と
セグメントＩ（ｄ）のＤＮＡ（フラグメントＩから得ら
れる）とから、簡単なサブクローニング法によって組立
てられる。 【００２７】ペニシリン類とセファロスポリン類の生合
成に関与する酵素の生産は、この発明のＤＮＡを適切な
ベクター、例えばpIJ702に再挿入し、次いで適切な宿主
微生物、例えばエス・リビダンス66（ＤＳＭ1567）を、
前記のようにして作製した組換え体ベクターで形質転換
することによって達成される。このようにして製造され
た特に価値のある酵素には、“サイクラーゼ（cyclas
e）”、すなわちイソペニシリンＮシンテターゼ（ＡＣ
ＶをイソペニシリンＮに変換できる）、“エクスパンダ
ーゼ”、すなわちデアセトキシセファロスポリンＣシン
テターゼ（ペニシリンＮをデアセトキシセファロスポリ
ンＣに変換できる）、“エピメラーゼ”、すなわちペニ
シリンＮシンテターゼ（イソペニシリンＮをペニシリン
Ｎに変換できる）およびＯ−カルバモイルデスアセチル
セファロスポリンＣ−７−ヒドロキシラーゼ（Ｏ−カル
バモイルデスアセチルセファロスポリンＣとセファロス
ポリンＣとをそれぞれの７−ヒドロキシ誘導体に変換で
きる）として、当該技術分野で知られている酵素（J.
F. MartinおよびP. Lirasの前記文献）が含まれる。エ
ス・クラブリゲルスATCC 27064の前記酵素類やペニシリ
ン類とセファロスポリン類の合成をもたらす性能を有す
るいずれの他の蛋白類も、この発明の形質転換された宿
主によって産生される場合は、この発明の他の態様を形
成するものである。これら蛋白や酵素類は高純度の形態
で得ることが好ましい。 【００２８】かような蛋白や酵素は、通常の方法によっ
て単離・精製される。この発明のＤＮＡとこれを保有す
るベクターは、工業界の多くの分野で用途が見出されて
いる。このようなことは、前記ベクターで形質転換され
た宿主微生物およびその微生物が発現する酵素にもあて
はまる。例えばこのＤＮＡは、ハイブリッド形成プロー
ブとして利用して、エス・クラブリゲルス（ATCC 2706
4）や、類似の構造と特異性を有する酵素を産生する他
の微生物の全細胞ＤＮＡに存在する、関連もしくは重複
の遺伝子を同定・単離することができる。したがって、
この発明は微生物内でβ−ラクタム抗生物質の生合成に
関与する遺伝子を単離するために、β−ラクタム抗生物
質産生の微生物のＤＮＡにハイブリッド形成できるＤＮ
Ａ（Ｉ）もしくはそのフラグメントの使用を提供するも
のである。前記ＤＮＡを保有する組換え体ベクターは、
適切な宿主に形質転換されると、セファマイシンＣのよ
うな価値ある抗生物質を多量に合成する遺伝学的に改変
された微生物を製造したりまたは遺伝子転移法による新
規なもしくはハイブリッドの抗生物質を生成させる（例
えばD. A. Hopwoodら、Nature, 1985, 314, 642-644参
照）のに有用である。この発明のＤＮＡによってエンコ
ードされている酵素は特に、例えば公知のβ−ラクタム
抗生物質を、その天然の前駆体から製造したりまたは新
規なβ−ラクタム抗生物質を例えば化学合成法で得られ
た非天然の前駆体から製造したりするために適切な固体
の担体に固定化される場合、細胞の存在しない系で使用
することができる。 【００２９】この発明のＤＮＡもしくはそのフラグメン
ト（完全な遺伝子を必ずしももっていない）は、組換え
体ＤＮＡの技術もしくは天然の組換え工程によって、β
−ラクタム合成に関与する遺伝子のフラグメントと結合
され、ハイブリッド酵素の合成を命令しうるハイブリッ
ド遺伝子が製造される。かような酵素類は、前記方法と
類似の方法によって新規な抗生物質を製造するのに用い
られる。 【００３０】またこの発明のＤＮＡは、特定部位の突然
変異誘発法の公知の技術（例えば、G. Winterら、Natur
e, 1982, 299, 756-758又はZollerとSmith, Nucleic Ac
idsResearch, 1982, 10, 6487-6500に記載されたのと類
似のしかた）によって改変され、特異な突然変異および
／または欠失がなされたＤＮＡが得られる。その突然変
異ＤＮＡは、β−ラクタム抗生物質を産生することがす
でに知られている適切な宿主微生物から公知のβ−ラク
タム抗生物質を増大した収率（またはタイター）で得る
ために使用される。またこの突然変異ＤＮＡは、遺伝子
転移法によって新規もしくはハイブリッドの抗生物質を
得るのに用いられ、または上記記載の方法と類似の方法
によって新規な抗生物質を製造するのに用いうる突然変
異酵素（ミューテイン、mjutein）の産生に用いられ
る。かような突然変異ＤＮＡはこの発明の範囲内にある
と解される。 【００３１】この発明を下記実施例で説明するが、本願
発明を限定するものではない。実施例 製造例１ Sau 3Aで消化されたエス・クラブリゲルス27
064 ＤＮＡの４〜15Kbの大きさのピースの単離 （ａ）全細胞ＤＮＡ（total cellular DNA）をエス・ク
ラブリゲルス27064から下記の方法で製造した。 ｉ）エス・クラブリゲルス27064の胞子を、トリプトン
・ソヤ・ブロスマルトース増殖培地入りの２つの振盪フ
ラスコ（30ml／250mlスプリング振盪フラスコ；トリプ
トン・ソヤ・ブロス30g/ｌ，マルトース10ｇ／ｌ）に接
種し、26℃で48時間（240rpm）培養した。 ii）菌系体（mycelium)を、10,000Ｇで遠心分離して収
穫した。 iii)上澄フラクションを流出させ、ペレットを10mlの溶
解液（lysing solution;50mMトリスpH 8.5, 50mM Na2ED
TA, 15％庶糖、リゾチーム３mg／ml）に再懸濁させ、37
℃で１時間培養した。 iv）２mgのプロティナーゼＫ（SIGMA chemicals 社）含
有のナトリウムラウリルサルフェート（10％溶液）の0.
5mlを添加し、培養を15分間続け、さらにSLS/Prot K溶
液を加え培養をさらに15分間続けた。 ｖ）酢酸ナトリウム（0.3Mまで）と氷冷エタノール（２
容積）とを加えた後、ＤＮＡをガラス棒でまき取った。
これを数回繰返しＤＮＡの半透明粘性の製剤を得た。（ｂ）エス・クラブリゲルス27064からの染色体ＤＮＡ
のSau 3Aによる部分消化 180μｇの全細胞ＤＮＡを、推奨された緩衝液中、12単
位のSau 3A制限酵素（NEW ENGLAND BIOLABS 供給）とと
もに30分間37℃で培養した。酵素を70℃で変性させるこ
とによって反応を停止させた。ＤＮＡの消化の度合をア
ガロースゲル電気泳動法によって試験したところ、得ら
れたフラグメントは15Kb〜0.16Kbの大きさの範囲にある
ことが見出された。（ｃ）ショ糖勾配法（40〜10％W/v)によるSau 3Aによっ
て部分的に消化されたＤＮＡの分画 ショ糖の勾配法（40〜10％）を“Genetic Manipulation
of Streptomyces-A Laboratory Manual,著者：D.A.Hop
woodら，the John Innes Foundation発行 1985"に記載
してあるのと同様にして、ショ糖の勾配（40〜10％）を
13mlの遠心分離管内に作製した。 【００３２】エス・クラブリゲルス27064ＤＮＡのSau 3
Aによる部分消化物（0.5ml中100μｇ）を前記ショ糖勾
配の上面に注意深く積層し、その系を21時間30000rpm(1
05gav)で遠心分離した。遠心分離管を遠心分離器から取
り外し、該分離管の底部にあけた孔から、400μｌづつ
のフラクションを採取した。これらのフラクションの５
μｌ試料をゲル電気泳動法で試験し、大きさが４〜14Kb
のＤＮＡを含有することを示したフラクションを集め
た。 【００３３】このようにして、Sau 3Aで消化され、大き
さが４〜14KbのＤＮＡの12μｇを得た。製造例２ エス・クラブリゲルス27064ＤＮＡのSau 3A
によるフラグメントをクローンするのに適切なpIJ702ベ
クターＤＮＡの製造 （ａ）プラスミドＤＮＡの単離 エス・クラブリゲルス27064：pIJ702の胞子を振盪フラ
スコ中のＴＳＢ／マルトース培地［培地調製に関する製
造例1(a)参照］に接種した。プラスミドの安定性を保持
するためにチオストレプトンを2.5μｇ／mlまで添加し
た。微生物を48時間、26℃で培養した。pIJ702［Katz,
E.ら,J. Gen.Microbiol.(1983)129,2703-2714参照］プ
ラスミドを、中性溶菌法（the Neutral Lysis Procedur
e,Hopwoodら，1985の前記文献参照）を用いて菌系体か
ら単離した。このようにして、pIJ702 ＤＮＡの50μｇ
を単離した。（ｂ）エス・クラブリゲルス27064からのpIJ702ＤＮＡ
のBglIIによる消化 30μｇのpIJ 702 ＤＮＡを、推奨の
制限緩衝液（全容積400μｌ）中のBglII制 限酵素（Amersham Internationalにより供給された100
単位）で、30分間37℃で消化した。 【００３４】70℃で30分間培養することによって反応を
停止した。反応混合物の試料をアガロースゲル電気泳動
法（0.7％ゲル）で試験したところ、当初存在した共有
閉環状プラスミド［closed covalent circular (ccc) p
lasmid]はすべて直線形に変換していた。（ｃ）BglIIで消化されたpIJ 702 ＤＮＡの小牛の腸の
アルカリ性ホスファターゼ（CIAP）による処理 この処理は、“Molecular Cloning-A Laboratory Monua
l,“Maniatis,T.ら，cold Spring Harbour Laboratory
(1982)発行”に記載されているのと同様にして行った。 【００３５】Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、CIAPで処理
したＤＮＡを試験した結果、酵素によって脱リン酸化を
行った後は、もはや自己連結(self-ligate)しないこと
が分かった。製造例３． エス・クラブリゲルス27064の、3au 3Aで
消化された全細胞ＤＮＡと、BglIIで消化されCIAPで処
理されたpIJ702ＤＮＡとの連結 Sau 3Aで消化されたエス・クラブリゲルス27064の染色
体ＤＮＡ（4-14Kb）の１μｇを含有する15μｌの水を入
れた12の各容器に、BglIIで消化されCIAPで処理されたp
IJ702（0.5μｇ／ポット）含有の緩衝液100μｌを加え
て、最終濃度を1.5μｇＤＮＡ／150μｌ、トリス塩酸pH
7.5緩衝液（66mM）、MgCl2(6.6mM)、ジチオトレイトー
ル（10mM）およびアデノシントリホフエート（0.4mM)と
した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（0.1単位、Amersham Intern
ational社より供給）を各ポットに添加し、各系を15℃
で72時間培養し、必要な容器に移した。製造例４． エス・クラブリゲルスNCP-5:pIJ702/27064
クローンのライブラリイの作製 （ａ）pIJ702中に挿入されたＤＮＡの頻度とＤＮＡ挿入
体の大きさに関する、エス・リビダンス66内の連結ＤＮ
Ａの試験 1.5μｇの連結ＤＮＡ（エス・クラブリゲルス27064から
製造され、BglIIで消化されCIAPで処理されたPIJ702を
連結したエス・クラブリゲルス27064のSau 3Aによつて
得られた４〜14４Kbのフラグメント）を10μｌのＴＥ緩
衝液（１mM Na2EDTA, 10mMトリス塩酸ｐＨ8.2)に溶解
し、その５μｌづつの２つを、エス・リビダンス66（Ｄ
ＳＭ 1567)の原形質体［1010原形質体／ml，25％ポリエ
チレングリコール（平均分子量1000)の存在下、“Genet
ic Manipulation of Streptomyes-ALaboratory Mannua
l"に記載したのと同様にして製造］の100μｌづつの２
つの形質転換するのに用いた。 【００３６】形質転換した後、その原形質体の10-4まで
希釈した液を、プレート上のＲ２ＹＥ寒天に塗布した(H
opwoodらの前記文献参照）。32℃で24時間培養した後、
プレートを軟普通ブイヨン寒天（SNBA)［８ｇDifco普通
ブイヨン／ｌ、プラスミドが産生するコロニイを選択す
るためのチオストレプトン抗生物質（500μｇ／ｌ）
と、これらのコロニイが産生する、pIJ702のmel遺伝子
に挿入体を持つプラスミドを検出するためのＬ−チロシ
ン（１ｇ／ｌ）とを含有する３ｇ寒天／ｌ］でオーバー
ボアーした（overpour)。 【００３７】数日の培養後、黒色コロニイの頻度（２％
を超えない）と連結ＤＮＡの形質転換効率（9.3×103形
質転換体／μｇＤＮＡ）を、カウンティング（countin
g)によって確認することができた。前記の方法（製造例
２ａ）で、エス・リビダンス66の10ケの白色コロニイか
らプラスミドを調製した。これらのプラスミド製剤をBc
lI制限酵素で消化し、次いでアガロースゲル電気泳動法
でＤＮＡ挿入体の大きさを測定した。 【００３８】このようにして測定した結果、クローンさ
れたＤＮＡの平均の大きさは５Kbであった。（ｂ）連結ＤＮＡ試料のエス・クラブリゲルスNCP-5
（エス・クラブリゲルスNCIB 12208）への形質転換 1.5μｇの連結ＤＮＡを、２×５μｌのＴ．Ｅ．緩衝液
内で、２×100μｌのエス・クラブリゲルスNCP−５原形
質体（1010原形質体／ml，前記のHopwoodら(1985)の文
献に記載されたのと同様にして製造］に形質転換した。
この形質転換された原形質体を、26℃でＲ5 寒天［100
ｇショ糖／ｌ、10ｇデキストリン／ｌ、5.1ｇMgCl2・6H
2O／ｌ，１ｇカザミノ酸／ｌ，0.05ｇMgSO4・7H2O／ｌ,
2.5gL −アルギニンHCl/ｌ，１ml微量元素／ｌ，20g O
xoid Technical Agar No.3/1, 0.05gKH2PO4 ／ｌ ,3.7g
CaCl2・2H2O／l, 5.7g TES緩衝液pH7.2/l］上で再生さ
せた。なお微量元素溶液は、FeSO4 ・7H2O 1g/l,MnCl2・4
H2O 1g/l,ZnSO4 ・7H2O 1g/lを含有している。48時間再
生させた後、チオストレプトン（50μｇ／ml）含有のSN
BA（製造例４ａに記載したのと同一）で覆うことによっ
てチオストレプトン耐性コロニイを選択した。さらに72
時間後、形質転換されたコロニイを個々にかきとって、
抗生物質生産に適切なひとつの普通寒天培地上に配列し
た。この寒天培地は、デキストリン10ｇ／ｌ、K2HPO4 1
g/l 、MgSO4・7H2O 1g/l、(NH4) 2SO4 1g/l 、Industria
l chalk 4g/l, 微量元素溶液１ml、寒天20g/l、酵母エ
キス２ｇ／ｌおよび細菌学的ペプトン2.5g/lを含有する
Ｍ５Ｄ+ 寒天培地である。またその微量元素溶液は、Fe
SO4・7H2O 0.1％、MnCl2・4H2O 0.1％およびZnSO4・7H2O
0.01％並びにチオストレプトン（2.5μｇ／ml）を含有
している。 【００３９】pIJ702：エス・クラブリゲルス27064ＤＮ
Ａプラスミドによって与えられたチオストレプトン耐性
を示した4500のＮＣＰ−５コロニイをこの方法で得た。製造例５． セファマイシンＣ産生のためのＮＣＰ−
５：pIJ 702/エス・クラブリゲルス27064ライブラリイ
のスクリーニング Ｍ５Ｄ+寒天培地上26℃で10日間培養した後、８mm径の
寒天プラグをそれぞれの菌糸体パッチから切りとり、ア
ルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)ATCC
8750/NCIB 8156を予め新たに接種したＤＳＴ寒天培地
（40g Oxoid DST寒天／ｌ水）上に置いた（Claridge,C.
A.およびJonson,D.L.(1962)Antimicrob.Ag.Chemother.6
82-686参照）。この生物は、セファロスポリンＣとセフ
ァマイシンＣのごときある種のセファロスポリン類に感
受性であるが、用いられる増殖条件下でＮＣＰ−５によ
って産生される低濃度のクラバラン酸の存在下でさえも
ペニシリンＮには感受性ではない。従ってペニシリンＮ
とクラバラン酸のみを産生したＮＣＰ−５は通常、エイ
・フェカリスNCIB 8156の増殖を阻害するゾーンを与え
ない。しかしその親のエス・クラブリゲルス菌株は上記
のゾーンを与える（この菌株は、ペニシリンＮ、クラバ
ラン酸およびセファマイシンＣを産生するからであ
る）。前記プラグからの抗生物質を、ＤＳＴ／エイ・フ
ェカリス寒天に拡散させ、37℃で一夜培養した後、エイ
・フェカリスの増殖状態を、抗生作用のゾーンについて
試験した。 【００４０】このようにして、クローンのライブラリー
の任意のメンバーによるセファロスポリン抗生物質類産
生の可能性を調べた。２つのクローンの、標識されたＮ
ＣＰ−5/36/5とＮＣＰ−5/10/7とは、エイ・フェカリス
に対して抗生作用のゾーンを与えることが見出された。製造例６．NCP-5/36/5とNCP-5/10/7のプラスミド含量の
試験 （ａ）プラスミドの物理試験 プラスミド製剤をNCP-5/36/5とNCP-5/10/7とから製造例
２ａに記載したのと同様にして作製した。ふたつのポジ
ティブ（positive)の各々の30ml培養物から、数μｇの
プラスミド物質を単離することができた。制限酵素座位
の地図を作成したところ、プラスミドの一つの種だけが
NCP-5/10/5に存在し、別のひとつの種のみがNCP-5/10/7
に存在するということを明確に示した。制限地図（第１
図参照）は、pIJ 702に、約5.7Kbと約5.8KbのＤＮＡ挿
入部をそれぞれを有するNCP-5/36/5とNCP-5/10/7から単
離されるということを示唆している。この二つのＤＮＡ
挿入体は、地図にされた制限酵素座位によって示唆され
ているように、ほぼ2.7Kbの共通フラグメントを有する
ようである。次いでこのことは、pBROC138の32Ｐで標識
された各フラグメントがpBROC137ＤＮＡの予測された部
分と広範なハイブリッドを形成するのをサザン分析法で
しめすことによって証明された。（ｂ）プラスミドpBROC 137とpBROC 138のＮＣＰ−５へ
の再導入 pBROC 137とpBROC 138とＤＮＡの100ノナグラムづつ
を、エス・クラブリゲルスＮＣＰ−５を再形質転換する
のに用いた。その形質転換されたコロニイを分離し、製
造例５に記載したのと同様にしてエイ・フェカリス バ
イオアッセイ・プレートで試験した。 【００４１】pBROC 137もしくはpBROC 138で形質転換さ
れたＮＣＰ−５のコロニイ全部の少なくとも90％が、エ
イ・フェカリスに抗生作用のゾーンを与えることができ
ることが明らかになった。このことは、pBROC 137とpBR
OC 138中に存在するＤＮＡが、ＮＣＰ−５の受ける突然
変異を修復できる遺伝情報を有することを立証してい
る。製造例７． pBROC 137、pBROC 138およびpBROC 303に
よってストレプトミセス・リビダンス66に与えられる新
規な酵素活性の測定 100ナノグラムづつのpBROC 137ＤＮＡ、pBROC 138ＤＮ
ＡおよびpBROC 303ＤＮＡを、エス・リビダンス66に形
質転換した（製造例４ａに記載したのと同様にして）。 【００４２】エス・リビダンス66：pBROC137、エス・リ
ビダンス66：pBROC138およびエス・リビダンス66：pBRO
C 303の培養物を、YEME(30mlグルコース10ｇ／ｌ、ショ
糖340ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／ｌ、細菌学的ペプトン
５ｇ／ｌ、酵母エキス（Oxoid)3g/ からなり、チオスト
レプトン抗生物質を50μｇ／ml含有する）の振盪フラス
コ中で培養した。この培養物を、48時間、32℃、240rpm
で培養した。菌糸体を10,000gで遠心分離して収穫し、
トリス塩酸緩衝液pH7.0（0.05M)で洗浄した。菌糸体を
再び遠心分離し、ペレットを2.5mlのトリス緩衝液中に
再懸濁させた。1000psiでフレンチ・プレッシャー・セ
ルを用い細胞を破壊し、破壊細胞の製剤を10 5ｇで60分
間遠心分離し、細胞を含有せず粒子のない、溶解性酵素
製剤を得た。（ａ）エクスパンダーゼ酵素活性の例証 エス・リビダンス66:pIJ 702、エス・リビダンス66:pBRO
C 137およびエス・リビダンス66:pBROC138由来の酵素製
剤を、環拡大アセイシステムに用いて（Jensen,S.E.,We
stlake,D.W.S.およびWolfe,S.,(1983)Antimicrob.Ag.Ch
emother.24(3)307-312に記載してあるのと同様にし
て）、デアセトキシセファロスポリンＣシンテターゼの
存在を測定した。 【００４３】これらの著者によって記載された、イー・
コリＥＳＳ／ペニシリナーゼ（DIFCO Penicillinase Co
ncentrate 104 u/ml）バイオアセイシステムを利用する
ことによって、エス・リビダンス66:pIJ702エキストラ
クトはペニシリンＮをペニシリナーゼ耐性抗生物質に形
質転換できないが、一方エス・リビダンス66:pBROC 137
とエス・リビダンス66:pBROC 138からのエキストラクト
は前記形質転換を行うことができることを示すことがで
きた。エス・リビダンス66:pBROC 137酵素エキストラク
トは、前記アッセイシステム中のペニシリンＮをペニシ
リナーゼ耐性抗生物質に十分形質転換することができた
が、エス・リビダンス66:pBROC 138からの酵素エキスト
ラクトは、この点について著しく低い活性を示した。次
いで環拡大試験体を、ペニシリンＮ、デアセトキシセフ
ァロスポリンＣおよびデアセチルセファロスポリンＣの
標準試料とともに、セルロースの薄層クロマトグラフィ
用プレート上でクロマトグラフィ（ブタノール／酢酸／
水，3/1/1）に付した。寒天含有のイー・コリＥＳＳ／D
ifcoペニシリナーゼ上のクロマトグラフィのバイオアッ
セイによって、37℃で一夜培養後に、エス・リビダンス
66:pBROC 137酵素エキストラクトはペニシリンＮをデ
アセトキシセファロスポリンＣに形質転換するが、エス
・リビダンス66:pIJ 702からの酵素のエキストラクトは
この形質転換を行わないことが分かった。デアセチルセ
ファロスポリンＣがいずれかの細胞エキストラクトによ
ってペニシリンＮから合成されるということは全く確認
されなかった（デアセトキシセファロスポリンＣのＲｆ
＝0.55，デアセチルセファロスポリンＣのＲｆ＝0.3
9）。（ペニシリンＮはペニシリナーゼが存在するので
検出されない）（ｂ）イソ−ペニシリンＮの、イー・コリＥＳＳに対し
てより活性な化学形態への変換 Jesen,S.Eらによって開発されたイソ−ペニシリンＮエ
ピメラーゼアッセイを用いて［Can.J.Microbiol.(1983)
29(11),1526-1531］、エス・リビダンス66:pBROC 137か
らの細胞と粒子の存在しない酵素エキストラクト（製造
例７ａと同様）が、イソ−ペニシリンＮを、イソペニシ
リンＮ自体よりもイー・コリＥＳＳに対する活性が少な
くとも１０倍の化学的形態に変換できるということを例
証することができた。エス・リビダンス66:pIJ702から
の同様のエキストラクトはこのような変換ができなかっ
た。 （ｃ）エス・リビダンス66:pBROC 303の、細胞の存在し
ない製剤による、Ｏ−カルバモイル・デスアセチル・セ
ファロスポリンＣとセファロスポリンＣの、それぞれの
７−ヒドロキシ誘導体への変換 エス・リビダンス66:pBROC 303の、細胞なしの製剤（0.
9ml）を、アスコルビン酸ナトリウム（2.8ｍＭ）、硫酸
第一鉄（0.045ｍＭ）、α−ケトグルタレート（１ｍ
Ｍ）、塩化カリウム（7.5ｍＭ）、硫酸マグネシウム
（7.5ｍＭ）、トリス−塩酸pH7.0（0.05M)およびＯ−カ
ルバモイル・デスアセチル・セファロスポリンＣ（0.5
ｍＭ）もしくはセファロスポリン(0.5ｍＭ）とともに、
最終容積1.2mlとし、22℃で培養した。 【００４４】２時間培養後、振盪しながら25μｌの氷酢
酸を添加し、次いで遠心分離（10,000G,５分間）して蛋
白を除去した上澄液を得た。この液体をＱＡＥ−セファ
デックスカラム（１ml容積）に吸収させた。この樹脂を
250μｌの水と200μｌの0.2MNaClで洗浄した。さらに25
0μｌの0.2M NaClによって前記樹脂からセファロスポリ
ン類を溶離させた。 【００４５】これらを濃縮した反応生成物の試料20μｌ
をＣ18逆相マイクロボンダパックカラムを用いる高速液
体クロマトグラフィによって分析した。Ｏ−カルバモイ
ル・デスアセチル・セファロスポリンＣを７−ヒドロキ
シＯ−カルバモイル・デスアセチル・セファロスポリン
Ｃから分離するための移動相は0.1M NaH2PO4，pH3.2で
あった。セファロスポリンＣを７−ヒドロキシセファロ
スポリンＣから分離するために、移動相のpHを4.2まで
上昇させた。溶離は２ml／分の流速で260nmでの紫外吸
収で検出して行った。 【００４６】このようにして、Ｏ−カルバモイル・デス
アセチル・セファロスポリンＣ（保持時間5.7分）がそ
のヒドロキシ誘導体（保持時間3.0分）に約50％変換し
たこと、ならびにセファロスポリンＣ（保持時間18.2
分）が７−ヒドロキシセファロスポリンＣ（保持時間6.
6分）に約35％変換したことを証明することができた。
エス・リビダンス66：pIJ 702のエキストラクトはこの
ような形質転換を行えなかった。製造例８． エス・リビダンス66:pBROC 137とエス・リ
ビダンス66:pBROC 138とによって産生された蛋白質のナ
トリウムラウリルサルフェート／ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による分析 エス・リビダンス66:pBROC 137、エス・リビダンス66:p
BROC 138およびエス・リビダンス66:pIJ702の、細胞と
粒子のないエキストラクト（製造例７ａと同様）の５μ
ｌと10μｌとを、ナトリウムラウリルサルフェート（SL
S)で処理して溶解している蛋白質を変性し、Laemmliの
方法（英国、Nature,1970,227 680)を用いて、SLS/12％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるクロマトグラ
フイに付した。クーマシーブリリアントブルーで染色す
ることによって次のことが明らかになった。すなわち同
時にクロマトグラフに付した分子量が公知の蛋白質から
判断できたが、エス・リビダンス66:pBROC 137とエス・
リビダンス66:pBROC 138からのエキストラクトは約29,5
00ドルトンの蛋白質を示し、これはエス・リビダンス6
6:pIJ 702からのエキストラクトには存在しないか、ご
くわずかしか存在していないことが分かった。エス・リ
ビダンス66:pBROC 137からのエキストラクトも、大きさ
が約60,000ドルトンの著しくよく染まる蛋白質を示し
た。製造例９ pBROC 137とpBROC 138に含有されているＤＮ
Ａと隣接するエス・クラブリゲルス染色体からのＤＮＡ
の単離、特性表示およびサブクローニング ａ）ｐＨＣ79中のエス・クラブリゲルスATCC27064ＤＮ
Ａのライブラリイの組立て 10μｇのｐＨＣ79ＤＮＡ［Holm,B.およびCollins J.(19
80)Gene11,291-298)を、制限酵素のSalIとBamHIとによ
って完全に消化（digest)した。さらに10μｇのｐＨＣ7
9ＤＮＡをEcoRIとBamHIとで完全消化した。必要な“コ
スミドアーム(cosmid arms)”を単離するため、上記の
両消化物を、ショ糖勾配法（10〜40％）で分画した。各
コスミドアームの収量は５μｇを超える量であった。 【００４７】エス・クラブリゲルスATCC 27064の染色体
ＤＮＡの100μｇを、Sau 3AＩで部分的に消化し、ショ
糖勾配法(10〜40％）で分画した。30Kbを超え50Kbを超
えない制限フラグメントを含有するフラクションを集
め、この大きさの範囲のSau 3AＩによるフラグメントの
約10μｇを得た。これらのフラグメントを、1:1:1のモ
ル比で、前記コスミドアームに連結した（ＤＮＡ濃度20
0μｇ ml-1）。24時間後、この連結混合物をλファージ
に生体外でパッケージした（フアージλ・パッケージン
グ・エキストラクトとプロトコールは、Amersham Inter
national PLCが供給されている）。イー・コリＤＨＩを
トランスフェクションさせることによって［Low,B.(196
8)PNAS 60,161-167］、５×107のトランスフェクタント
（transfectant）／（μｇパッケージされたＤＮＡ）を
得た。ｂ）エス・クラブリゲルスATCC 27064 DNAライブラリイ
からのＤＮＡセグメント（Ｉ）の単離と、このＤＮＡの
pIJ 702へのサブクローニング エス・クラブリゲルスATCC 27064ＤＮＡの挿入体を有す
るpHC 79を保有するイー・コリＤＨＩの5000のコロニイ
を、ニトロセルロースのフィルターに固定化して溶解し
た。pBROC137由来の1.2Kb BClI−KpnIエンデットフラグ
メントを単離してニックトランスレートした。このフラ
グメントを、標準コロニイハイブリット形成技法によっ
てフィルターをプローブ（probe)した。７つのハイブリ
ッドを形成しているコロニイが得られ、そのうちのひと
つが第１(a)図に示すＤＮＡセグメント（Ｉ）を保有し
ていた。 【００４８】ＤＮＡセグメント（Ｉ）のフラグメントの
サブクローニングを、このクローンされたＤＮＡの10μ
ｇをBamHIで消化することから開始した。ベクターのpIJ
702の５μｇをBglIIで消化し、CIAPで処理して再環化
するのを防止した。前記のBamHIで生成したフラグメン
トと、BglIIで消化しCIAPで処理したpIJ 702とを、2:1
のモル比で連結し、50μｇ／mlのＤＮＡ濃度とした。15
℃で24時間培養後、0.5μｇの連結混合物をエス・リビ
ダンス66に形質転換し、２×105形質転換細胞／μｇを
得た。この形質転換細胞をスクリーニングすることによ
って、他のBamHIフラグメントクローンを有するpBROC 3
03を単離することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１(a)図は、ペニシリンとセファロスポリン
の生合成に関与する遺伝子の遺伝情報を指定するエス・
クラブリゲルスATCC 27064染色体ＤＮＡ（Ｉ）のエンド
ヌクレアーゼ制限地図、第１(b)図は、プラスミドpBROC
138内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレ
アーゼ制限地図、第１(c)図は、プラスミドpBROC 137内
に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ
制限地図、第１(d)図は、プラスミドpBROC 303内に含ま
れるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地
図である。 【図２】プラスミドpBROC 137とpBROC 138のエンドヌク
レアーゼ制限地図である。 【図３】プラスミドpBROC 303のエンドヌクレアーゼ制
限地図である。
の生合成に関与する遺伝子の遺伝情報を指定するエス・
クラブリゲルスATCC 27064染色体ＤＮＡ（Ｉ）のエンド
ヌクレアーゼ制限地図、第１(b)図は、プラスミドpBROC
138内に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレ
アーゼ制限地図、第１(c)図は、プラスミドpBROC 137内
に含まれるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ
制限地図、第１(d)図は、プラスミドpBROC 303内に含ま
れるＤＮＡ（Ｉ）の一部分のエンドヌクレアーゼ制限地
図である。 【図２】プラスミドpBROC 137とpBROC 138のエンドヌク
レアーゼ制限地図である。 【図３】プラスミドpBROC 303のエンドヌクレアーゼ制
限地図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 9/02
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(Ｃ１２Ｎ 15/09
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(72)発明者 ジョン・エドワード・ハドソン
イギリス国、サリイ アールエイチ３
７エイジェイ、ベッチウオース、ブロッ
クハム・パーク（無番地)
(72)発明者 イアン・デイビッド・ノーマンセル
イギリス国、ウエスト・サセツクス ビ
イエヌ14 ８キューエイチ、ウワーシン
グ、クラランダン・ロード（無番地)
(56)参考文献 Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃ
ｏｍｍｕｎ．，（1983），ｐ．1187−
1188
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ストレプトミセス・クラブリゲルス DNAコスミドラ
イブラリーから Sau3A制限フラグメントとして得ること
ができ、ペニシリンとセファロスポリンのβ-ラクタム
化合物類の生合成に関与する１以上の酵素をコードする
１以上の遺伝子を含み、下記制限部位の立体配置； 【外１】を有し、ストレプトミセス属の菌由来のプラスミド又は
テンペレートファージ中にクローン化される DNAを含有
する少なくとも１つの組換えベクターで形質転換された
宿主から産生される、O-カルバモイルデスアセチルセフ
ァロスポリンＣ及びセファロスポリンＣの少なくとも１
つをその7-ヒドロキシ誘導体に変化することができるタ
ンパク質。 ２． Sau3A制限フラグメントをストレプトミセス・ク
ラブリゲルスATCC 27064のコスミドライブラリーから得
る請求項１記載のタンパク質。 ３．下記制限部位の立体配置； 【外２】 を有し、O-カルバモイルデスアセチルセファロスポリン
Ｃ7-ヒドロキシラーゼをエンコードする DNAからなる組
換えベクターを含む形質転換された宿主から産生される
請求項１記載のタンパク質。 ４．ストレプトミセス・クラブリゲルス DNAコスミドラ
イブラリーから Sau3A制限フラグメントとして得ること
ができ、ペニシリンとセファロスポリンのβ-ラクタム
化合物類の生合成に関与する１以上の酵素をコードする
１以上の遺伝子を含み、下記制限部位の立体配置； 【外３】 を有し、ストレプトミセス属の菌由来のプラスミド又は
テンペレートファージ中にクローン化される DNAを含有
する少なくとも１つの組換えベクターで宿主を形質転換
し、その形質転換された宿主からタンパク質を単離する
工程からなる、O-カルバモイルデスアセチルセファロス
ポリンＣ及びセファロスポリンＣの少なくとも１つをそ
の7-ヒドロキシ誘導体に変化することができるタンパク
質の製造方法。 ５． Sau3A制限フラグメントをストレプトミセス・ク
ラブリゲルスATCC 27064の DNAコスミドライブラリーか
ら得る請求項３記載のタンパク質の製造方法。 ６．形質転換される宿主が、ストレプトミセス・リビダ
ンスの菌である請求項３又は４項記載のタンパク質の製
造方法。
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| GB868602441A GB8602441D0 (en) | 1986-01-31 | 1986-01-31 | Compounds |
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