KR20000070723A

KR20000070723A - 클라불란산 생산이 증가된 미생물

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Publication number: KR20000070723A
Application number: KR1019997006973A
Authority: KR
Inventors: 베리 바톤; 존 패트릭 그리핀; 로이 헨리 모셔; 아시시 수드하카르 파라드카르; 수잔 젠센; 세실리아 앤더스
Original assignee: 피터 기딩스; 스미스클라인비이참피이엘시이; 노르우드 데이비드 씨.; 더 거버너스 오브 더 유니버시티 오브 알버타
Priority date: 1997-02-04
Filing date: 1998-02-02
Publication date: 2000-11-25
Also published as: SK105499A3; BG103704A; US7344869B2; JP5042186B2; KR20050053794A; UY24874A1; WO1998033896A2; BR9807144A; US6936458B1; EP0970198A2; TR199901862T2; AP1320A; CN1192107C; DE69832783D1; EA003773B1; AR018304A2; EP1405913A3; NO993758L; AU735782B2; HUP0001048A2

Abstract

본 발명은 신규 세균 유전자, 미생물 및 5R 클라밤, 예를 들어 클라불란산의제조를 개선시키는 방법을 제공한다.

Description

클라불란산 생산이 증가된 미생물 {Microorganisms with Increased Production of Clavulanic Acid}

본 발명은 신규 세균 유전자 및 클라밤, 예를 들어 클라불란산 제조의 개선된 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 증가된 양의 클라불란산을 생산할 수 있는 신규 유기체를 제공한다.

미생물, 특히 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.)은 클라불란산 및 다른 클라밤, 세팔로스포린, 폴리케티드, 세파마이신, 투니카마이신, 홀로마이신 및 페니실린을 포함하여 많은 항생제를 생산한다. 상기 미생물에 의해 생산되는 상기 항생제의 절대량 및 상대량을 조작할 수 있는 방법에 대해 상당한 관심이 존재하고, 이에 따라 생합성 경로의 대사적 및 유전적 메카니즘을 조사하는 매우 많은 연구가 이루어져 왔다 [Domain, A.L. (1990) "Biosynthesis and regulation of beta-lactam antibiotics" In: 50 years of Penicillin applications, history and trends]. 대사 경로에서 상이한 단계를 수행하는 많은 효소 및 이 효소를 코딩하는 유전자가 알려져 있다.

클라밤은 그의 고리 입체 화학에 따라 2개의 군(5S 및 5R 클라밤)으로 임의로 분류할 수 있다. 5S 및 5R 클라밤의 생합성을 위한 생화학적 경로는 아직 충분히 규명되지 않았지만, 이들이 동일한 출발 단위 (아직 미확인된 3 탄소 화합물) [Townsend, C.A. and Ho, M.F. (1985) J. Am. Chem. Soc. 107(4), 1066-1068 및 Elson, S.W. and Oliver, R.S. (1978) J. Antibiotics XXXI No. 6, 568] 및 아르기닌 [Valentine, B.P. et al (1993) J. Am Chem. Soc. 15, 1210-1211]으로부터 유도되고 몇개의 공통적인 중간체를 공유함을 시사하였다 [Iwata-Reuyl, D. and C.A. Townsend (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:2762-63, and Janc, J.W. et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:2313-16].

5S 클라밤의 예로는 클라밤-2-카르복실레이트 (C2C), 2-히드록시메틸클라밤 (2HMC), 2-(3-알라닐)클라밤, 발클라밤 및 클라바민산을 들 수 있다 [GB 1585661, Rohl, F. et al. Arch. Microbiol. 147:315-320, US 4,202,819]. 그러나, 5R 클라밤의 예는 극소수이고 지금까지 가장 잘 알려진 것은 스트렙토마이세스 클라불리게러스 (Streptomyces clavuligerus)의 발효에 의해 생산되는 베타 락타마제 억제제 클라불란산(clavulanic acid)이다. 클라불란산은 클라불란산칼륨의 형태로 항생제 AUGMENTIN (상표명, 스미스클라인 비참)에서 베타-락탐 아목시실린(amoxycillin)과 조합된다. 상업적 유용성 때문에, 클라밤 생합성에 대한 이해를 위한 연구는 에스. 클라불리게러스에 의한 5R 클라밤의 일종인 클라불란산의 생합성에 대해 집중되었다. 클라불란산의 생합성에 관여하는 많은 효소 및 이들의 유전자가 동정되고 문헌에 발표되었다. 상기 문헌의 예는 Hudgson, J.E. et al., Gene 166, 49-55 (1995), Aidoo, K.A. et al., Gene 147, 41-46 (1994), Paradkar, A.S. et al., J. Bact. 177(5), 1307-14 (1995)이다. 이와 달리, 에스. 클라불리게러스에서 클라불란산 생합성 경로에서 클라바민산 신타제의 작용에 의해 생산되는 클라불란산 전구체인 클라바민산 외의 다른 5S 클라밤의 생합성 및 유전학에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.

유전자 클로닝 실험은 에스. 클라불리게러스가 특정 영양 조건 하에서 클라불란산 생산에 공헌할 수 있는 [Paradkar, A.S. et al., J. Bact. 177(5), 1307-14 (1995)] 2개의 클라바민산 신타제 이소엔자임인 cas1 및 cas2 [Marsh, E.N. et al Biochemistry 31, 12648-657, (1992)]를 함유한다는 것을 확인하였다. 또한, 클라바민산 신타제 활성은 다른 클라불란산 생성 미생물, 즉 에스. 주모니넨시스 (S. jumonjinensis) [Vidal, C.M., ES 550549, (1987)] 및 에스. 카추라하마너스 (S. katsurahamanus) [Kitano, K. et al., JP 53-104796 (1978)] 및 5S 클라밤인 발클라밤의 생성 미생물인 에스. 안티비오티코스(S. antibioticos) [Baldwin, J.E. et al., Tetrahedron Letts. 35(17), 2783-86, (1994)]에서 검출되었다. 또한, 발드윈 (Baldwin, J.E.) 등의 문헌은 에스. 안티비오티코스가 클라불란산 생합성에 관련되는 것으로 알려진 다른 효소인 프로클라바민산 아미디노 히드롤라제 활성을 갖는다고 보고하였다. 클라밤 생합성에 관련되는 에스. 클라불리게러스에서 동정된 모든 다른 유전자가 클라불란산 생합성에 필요한 것으로 보고되었지만[Hodgson, J.E. et al., Gene 166, 49-55 (1995), Aidoo, K.A. et al., Gene 147, 41-46 (1994)], 아직까지 어느 것도 5S 클라밤의 생합성에 특이적인 것으로 보고되지 않았다.

본 발명자들은 에스. 클라불리게러스에서 C2C 및 2HMC로 예시되는 5S 클라밤의 생합성에 특이적인 특정 유전자를 동정하였다. 따라서, 본 발명은 에스. 클라불리게러스에서 5S 클라밤의 생합성에 특이적이지만 5R 클라밤 (예를 들어 클라불란산)의 생합성에 필수적이지 않은 1 이상의 유전자를 포함하는 DNA를 제공한다.

본원에서 "유전자"는 유전자 기능 또는 발현에 필요한 임의의 조절 영역을 포함한다. 바람직한 면에서, DNA는 도 1에 나타낸 것이다. 바람직하게는, DNA는 orfup3, orfup2, orfup1, orfdwn 1, orfdwn 2 및 orfdwn3으로서 명명된 도 1에 도시한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 DNA를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 함유하는 숙주를 제공한다.

본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 1 이상의 유전자가 결함을 가질 경우 유기체에 의해 생산되는 클라불란산의 양이 증가한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 적합한 미생물에 의해 생산되는 클라불란산의 양을 증가시키는 방법도 제공한다. 본 발명의 다른 면에서, 동정된 유전자는 증가된 양의 클라밤, 적합하게는 클라불란산을 생산할 수 있는 유기체를 생산하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 발견은 5S 클라밤을 적게 생산하거나 전혀 생산하지 않는 유기체의 예비 스크리닝(예를 들어 본원의 실시예에서 기술되는 HPLC 및(또는) 클라밤의 생물학적 분석에 의한)을 포함하는, 클라불란산 생산이 보다 높은 유기체의 개선된 동정 방법을 가능하게 한다.

적합하게는, 본 발명의 5S 클라밤 유전자는 본원에서 제공되는 서열을 기초로 하여 통상의 클로닝 방법(예를 들어 PCR)에 의해 수득할 수 있다. 유전자의 기능은 유전자 붕괴(disruption) [Aidoo, K.A. et al., (1994), Gene, 147, 41-46], 랜덤 변이 유발, 부위 지정 변이 유발 및 안티센스 RNA와 같은 유전자 기술에 의해 방해되거나 제거/결실될 수 있다.

본 발명의 다른 면에서, 1 이상의 결함 유전자를 함유하는 플라스미드, 바람직하게는 후술되는 플라스미드 pCEC060, pCEC061, pDES3, pCEC056 및 pCEC057이 제공된다. 유전자는 다양한 방법으로, 예를 들어, 유전자의 활성을 완전히 제거하는 항생제 내성 유전자를 코딩하는 DNA 단편의 삽입에 의해 결함을 갖도록 만들 수 있다. 또는, 항생제 내성 유전자를 코딩하지 않는 DNA의 삽입, 유전자 일부의 결실, 유전자 전체의 결실 또는 1 이상의 뉴클레오티드의 부가 및(또는) 치환에 의한 유전자의 뉴클레오티드 서열의 변형을 포함한 다른 전략을 사용하여 결함 유전자를 생성시킬 수 있다. 본 발명에 따른 결함 유전자는 상이한 정도로 결함을 갖도록 만들 수 있다. 이 유전자는 그 활성이 완전히 제거되거나 본래 활성의 일정 비율을 보유할 수 있도록 결함을 갖게 할 수 있다.

적합하게는, 본 발명의 플라스미드는 에스. 클라불리게러스, 예를 들어 균주 ATCC 27064 (에스. 클라불리게러스 NRRL 3585에 해당함)와 같은 유기체의 형질전환에 사용된다. 적합한 혈질전환 방법은 Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; Hopwood, D.A. et al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning Manual, and Paradkar, A.S. and Jensen, S.E. (1995), J. Bacteriol. 177(5): 1307-1314를 포함하여 관련 자료에 기재된 방법을 사용할 수 있다.

종 에스. 클라불리게러스의 균주는 클라불란산 (클라불란산칼륨)의 생산에 산업적으로 이용된다. 클라불란산칼륨에 대한 영국 및 미국 약전 (British Phamacopoeia 1993, Addendum 1994, p1362-3 및 U.S. Pharmacopeia Official Monographs 1995, USP 23 NF18 p384-5)에 독성 5S 클라밤인 클라밤-2-카르복실레이트의 양이 구체적으로 통제되고 있다.

따라서, 본 발명의 또다른 면에서, 다량의 클라불란산을 생산할 수 있지만 C2C를 만들 수 없도록 처리되거나 또는 다량의 클라불란산을 생산할 수 있지만 C2C를 매우 낮은 수준으로만 생산할 수 있는 유기체가 제공된다. 적합하게는, 클라불란산 생산 유기체는 1 이상의 결함 클라밤 유전자를 함유하고, 후술되는 바와 같은 에스. 클라불리게러스 균주 56-1A, 56-3A, 57-2B, 57-1C, 60-1A, 60-2A, 60-3A, 61-1A, 61-2A, 61-3A 및 61-4A가 바람직하다. 상기 유기체는 5S 클라밤인 클라밤-2-카르복실레이트를 생산하지 않거나 상당히 감소된 양으로 생산하면서 클라불란산을 생산하는 목적에 적합하다.

실시예에서, 모든 방법은 다른 언급이 없으면 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd Edition), Hopwood, D.A. et al. (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning Manual, 및 Paradkar, A.S. and Jensen, S.E. (1995) J. Bacteriol. 177(5): 1307-1314]에 기재된 방법에 따라 수행하였다.

I. 클라바미네이트 신타제 유전자 cas1의 상류 및 하류의 스트렙토마이세스 클라불리게러스 염색체의 DNA 서열 결정

A. cas1의 단리

클라바미네이트 신타제 이소자임 1 (cas1)의 유전자를 코딩하는 스트렙토마이세스 클라불리게러스 NRRL 3585로부터 염색체 DNA 단편을 단리하기 위해서, 이미 서열결정된 cas1 유전자(Marsh, E.N., Chang, M.D.T. and Townsend, C.A. (1992) Biochemistry 31: 12648-12657)의 뉴클레오티드 9-44를 기초로 하여 올리고뉴클레오티드 프로브 RMO1을 합성하였다. 올리고뉴클레오티드는 Applied Biosystems 391 DNA Synthesiser를 사용하여 표준 방법으로 제조하였다. 36-mer인 RMO1의 서열은 Marsh 등의 상기 문헌 (1992)에 기재된 것의 안티센스 서열로 합성하였다. RMO1은 DNA 올리고뉴클레오티드의 말단 표지를 위한 표준 기술[Sambrook 등의 상기 문헌, 1989]을 사용하여³²P로 방사선 표지하고, 문헌 [Stahl and Amann, Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Ed. E. Stackebrandt and M. Goodfellon. Toronto: John Wiley and Sons, p. 205-248, 1991]에 기재된 서던 혼성화에 의한 스트렙토마이세스 클라불리게러스 게놈 DNA의 코스미드 뱅크(bank) 스크리닝에 사용하였다. 코스미드 pLAFR3에서 제조된 에스. 클라불리게러스 DNA의 게놈 뱅크는 문헌[Doran, J.L et al., (1990), J. Bacteriol. 172 (9), 4909-4918]에 기재된 바와 같았다.

에스. 클라불리게러스 코스미드 뱅크의 콜로니 블롯을 5x SSC, 5x Denhardt 용액 및 0.5% SDS (1x SDS: 0.15M NaCl + 0.015M Na₃시트레이트; 1x Denhardt 용액: 0.02% BSA, 0.02% Ficoll 및 0.02% PVP)으로 이루어진 용액 중에서 60℃에서 방사선 표지된 RMO1과 함께 철야 인큐베이션하였다. 이어서, 블롯을 68℃에서 30분 동안 0.5x SSC + 0.1% SDS 용액으로 세척하였다. RMO1에 강하게 혼성화하고, 제한 엔도뉴클레아제 SacI 및 EcoRI을 사용한 분해시에, 에스. 클라불리게러스 게놈 DNA를 분해한 유사한 실험에서 검출되는 혼성화 신호에 일치하는 혼성화 신호를 제공하는 한개의 코스미드 클론 10D7을 단리하였다.

B. cas1에 인접하는 에스. 클라불리게러스 염색체의 DNA 서열 결정

제한 엔도뉴클레아제 SacI, NcoI 및 KpnI을 사용하여 코스미드 10D7의 부분 제한 지도를 제조하였다. RMO1과 10D7 DNA의 상이한 분해물 사이의 서던 혼성화 실험은 cas1이 7 kb의 SacI-SacI DNA 하위단편의 한 말단에 위치할 가능성이 가장 높다는 것을 나타내었다. 이 단편은 cas1 개방 해독 프레임(orf) 및 약 6kb의 상류 DNA로 이루어졌다. 7 kb 단편을 10D7의 SacI 분해물로부터 파지미드 벡터 pBluescriptII SK+ (2.96 kb; Stratagene)에 서브클로닝하여 재조합 플라스미드 pCEC007을 생성시켰다.

cas1의 상류 염색체의 서열을 결정하는 방법을 용이하게 하기 위하여, 7 kb SacI-SacI 단편의 3 kb NcoI-NcoI 하위 단편을 양 방향으로 pUC120 (3.2 kb; Vieirra and Messing, Methods Enzymol. 153, 3-11, 1987)에 서브클로닝하여 재조합 플라스미드 pCEC026 및 pCEC027을 제조하였다. 3 kb 하위 단편은 cas1의 아미노 말단 코딩 부분 및 약 2.6 kb의 상류 DNA로 이루어졌다.

엑소뉴클레아제 III 및 S1 뉴클레아제 분해(Sambrook 등의 상기 문헌, 1989)를 사용하여 pCEC026 및 pCEC027 모두에 대해 네스티드(nested) 중복 결실을 발생시키고, Taq dye-deoxy^aterminator 키트 및 Applied Biosystems 373A Sequencer를 사용하여 디데옥시 사슬 종결법 (Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467)에 의해 3 kb NcoI-NcoI 단편의 DNA 서열을 양 가닥 상에서 결정하였다.

cas1의 바로 하류에 존재하는 염색체의 DNA 서열을 결정하기 위하여, 4.3 kb KpnI-EcoRI DNA 단편을 코스미드 클론 10D7로부터 pBluescriptII SK+에 서브클로닝하여 pCEC018을 생성시켰다. pCEC018로부터 3.7 kb SacI-SacI 하위 단편을 pSL1180 (3.422 kb, Pharmacia)에 클로닝하였다. 상기 단편의 한 SacI 말단은 cas1의 TGA 정지 코돈과 부분적으로 중복되고, 다른 말단은 벡터에서 코딩된 것이다. 서브클로닝 동안에 3.7 kb 단편의 양 방향 삽입체가 수득되고, 생성되는 재조합 플라스미드를 pCEC023 및 pCEC024로 명명하였다. 두 플라스미드에 네스티드 중복 결실을 발생시키고, 3.7 kb 단편의 DNA 서열을 양 가닥 상에서 결정하였다. cas1 서열 및 이에 인접하는 서열을 포함하여 상기 실험에서 생성된 에스. 클라불리게러스 염색체의 뉴클레오티드 서열을 도 1에 나타내었다.

II. cas1에 인접하는 개방 해독 프레임의 기능 분석

cas1의 상류 DNA 서열의 컴퓨터 분석은 2개의 완전한 orf 및 1개의 불완전한 orf의 존재를 예측하였다. 3개의 orf는 모두 cas1의 반대 DNA 가닥 상에 위치하여 반대 방향으로 배향되었다. 제1 개방 해독 프레임 orfup1은 cas1의 579 bp 상류에 위치하고 344 아미노산 (aa)의 폴리펩티드를 코딩하였다. 제2 개방 해독 프레임 orfup2는 orfup1의 3' 말단의 437 bp 상류에 위치하고 151 aa 폴리펩티드를 코딩하였다. orfup2의 상류에는 orfup3이 존재한다. orfup3의 출발 코돈은 orfup2의 번역 정지 코돈과 중복되고, 이것은 2개의 orf가 번역상 연관됨을 시사한다. orfup3에 대한 번역 정지 코돈은 3 kb NcoI-NcoI 단편에 존재하지 않았다.

cas1 하류의 DNA 서열의 유사한 분석은 2개의 완전한 orf 및 1개의 불완전한 orf의 존재를 예측하였다. 2개의 orf는 cas1의 반대 DNA 가닥 상에 위치하여 cas1을 향하여 배향되었다. 제3 orf는 cas1과 동일한 가닥에 위치하여 cas1로부터 멀리 떨어져 위치하였다. 제1 하류 개방 해독 프레임 orfdwn1은 cas1의 373 bp 하류에 위치하고 328 aa의 폴리펩티드를 코딩하였다. 제2 개방 해독 프레임 orfdwn2는 orfdwn1의 55 bp 상류에 위치하고 394 aa 폴리펩티드를 코딩하였다. orfdwn2의 315 bp 상류의 반대 가닥상에 orfdwn3이 존재하였다. orfdwn3에 대한 정지 코돈이 3.7 kb 단편에서 관찰되지 않았기 때문에, orfdwn3은 219 aa의 불완전한 폴리펩티드를 코딩하였다.

orfup 및 orfdwn 개방 해독 프레임의 유전자 붕괴

에스. 클라불리게러스에 의해 생산되는 클라불란산 및 다른 클라밤의 생합성에서 cas1에 인접하는 개방 해독 프레임의 가능한 기능을 평가하기 위해서, 삽입 불활성화 또는 결실 변이체를 유전자 대체에 의해 생성시켰다. 유전자 붕괴 및 대체를 위해 사용된 방법은 Paradkar and Jensen의 상기 문헌 (1995)에 기재된 바와 본질적으로 동일하였다.

A. orfup1

Paradkar and Jensen의 상기 문헌 (1995)에 기재된 바와 같이 제조한 아프라마이신 내성 유전자 (apr^r)를 보유하는 1.5 kb NcoI-NcoI 단편을 클레나우 단편으로 처리하여 블런트(blunt) 말단을 생성시키고[Sambrook et al., 1989 상기 문헌], BsaBI로 분해되고 클레나우 단편으로 처리된 pCEC026에 라이게이션시켰다. pCEC026은 번역 개시 코돈으로부터 636 bp에서 orfup1 내에 위치한 BsaBI 부위를 갖는다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이(E. coli) GM 2163 (미국 New England Biolabs로부터 구입가능, Marinus, M. G. et al., M G G (1983) vol 122, p288-9)의 수용성 세포를 아프라마이신 내성이 되도록 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체로부터, 플라스미드 pCEC054 및 pCEC055를 함유하는 2개의 클론을 단리하고, 제한 분석에 의해 pCEC054가 orfup1과 동일한 방향으로 삽입된 apr^r단편을 보유하고, pCEC055는 반대 방향으로 삽입된 상기 단편을 보유하는 것으로 밝혀졌다.

에스. 클라불리게러스에 pCEC054를 도입하기 위해서, 플라스미드 DNA를 BamHI 및 HindIII로 분해하고 고카피수의 스트렙토마이세스 벡터 pIJ486 (6.2 kb; Ward et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 203: 468-478)에 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 GM2163 수용성 세포를 형질전환시켜 아프라마이신 내성이 되도록 만들었다. 생성된 형질전환체로부터 셔틀 플라스미드 pCEC061을 갖는 1개의 클론을 단리하였다. 이 플라스미드를 사용하여 에스. 클라불리게러스 NRRL 3585를 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체를 비선택 배지에서 2회 연속 포자를 형성시킨 후, 복제물을 항생제 함유 배지에 플레이팅시켜 아프라마이신 내성 및 티오스트렙톤 감수성 형질전환체를 동정하였다. 이 과정에서 4개의 추정 변이체 (61-1A, 61-2A, 61-3A 및 61-4A)를 추가 분석을 위해 선택하였다.

상기 추정 변이체에서 orfup1이 붕괴되었는지를 확인하기 위해서, 게놈 DNA를 단리물 61-1A 및 61-2A로부터 제조하여 SacI로 분해하고 서던 블롯 분석을 실시하였다. 서던 블롯 결과는 이중 교차 발생과 일치하고 상기 변이체가 orfup1의 붕괴 대체 변이체임을 입증하였다.

변이체 61-1A, 61-2A, 61-3A 및 61-4A를 Soya-Flour 배지에서 성장시키고 클라불란산 및 클라밤 생성의 확인을 위해 배양 상등액을 HPLC에 의해 분석하였다. Soya-Flour 배지의 조성 및 HPLC에 의한 클라밤 분석 방법은 HPLC 분석용 완충액이 0.1 M NaH₂PO₄+ 6% 메탄올, pH 3.68 (빙초산으로 조정)로 구성된 것을 제외하고는 문헌(Paradkar and Jensen, 1995, 상기 문헌)에 보고된 바와 같았다. HPLC 분석은 어느 변이체도 검출가능한 수준의 클라밤-2-카르복실레이트 또는 2-히드록시메틸클라밤을 생산하지 않았음을 나타내었다. 또한, 문헌[Pruess and Kellett, 1983, J. Antibiot. 36: 208-212]의 방법을 사용하여 배양 상등액을 바실러스 종(Bacillus sp.) ATCC 27860에 대해 생물학적으로 분석한 결과, 어느 변이체도 검출가능한 수준의 알라닐클라밤을 생산하지 않았다. 이와 달리, 배양 상등액의 HPLC 분석 결과, 변이체가 야생형에 비해 매우 우수한 수준의 클라불란산을 생산하는 것으로 밝혀졌다 (표 1).

진탕 플라스크 시험에서 orfup1 변이체의 클라불란산 (CA) 역가
균주	70시간	70시간	93시간	93시간
	CA μg/ml	CA μg/ml DNA	CA μg/ml	CA μg/ml DNA
NRRL 3585 #1	87	915	166	1963
NRRL 3585 #2	66	790	159	1842
61-1A	272	2894	439	6113
61-2A	199	2148	225	2928
61-3A	54	692	221	2585
61-4A	0	0	226	2422

orfup1 결실

orfup1의 AatII 부위들 사이에 654개 뉴클레오티드의 유전자 결실을 생성시키기 위해 클로닝 실험을 수행하였다. 하기 나열한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주형으로서 상기한 pCEC061을 사용하여 PCR 생성물을 생성시켰다. 본래의 뉴클레오티드 서열은 올리고 11에 PstI을, 올리고 14에 SphI 부위가 도입되도록 변형되었다.

PCR 생성물 1을 생성시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드쌍 1

프라이머 11 5'dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC3'

프라이머 12 5'dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC3'

PCR 생성물 2를 생성시키기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드쌍 2

프라이머 13 5'dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC3'

프라이머 12 5'dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG3'

표준 PCR 반응은 GRI사 (영국 CM6 3LD 에섹스 던모우 펠스티드 소재)의 PTC-200 Peltier 열 순환기를 사용하여 수행하였다.

프라이머 11 및 12를 사용하여 PCR 생성물 1을 생성시켰다. 이 생성물은 약 1 kb이고, 제2 AatII 부위로부터의 orfup1의 카르복시 말단 및 하류 영역을 함유한다.

프라이머 13 및 14를 사용하여 PCR 생성물 2를 생성시켰다. 이 생성물은 약 1.1 kb이고, 제1 AatII 부위로부터의 orfup1의 아미노 말단 및 상류 영역을 함유한다.

PCR 생성물 2를 제조자(영국 CB4 4GF 캠브리지 밀톤 로드 캠브리지 사이언스 파크 소재의 Strategene Ltd)의 지시에 따라 SrfI로 분해한 pCR-Script Amp SK(+)에 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 에피쿠리안(Epicurian) 이. 콜라이 XL1-Blue MRF' Kan 초수용성 세포 (Strategene사)를 (제조자의 지시에 따라) 암피실린 내성이 되도록 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 생성 형질전환체로부터 단리하고, DNA 제한 분석을 실시하여 7개의 클론이 PCR 생성물 2가 라이게이션된 플라스미드를 함유함을 알았다. 이중 하나의 플라스미드를 pDES1로 명명하였다.

PCR 생성물 1을 PstI 및 AatII로 분해하고, 생성된 DNA를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분획화하였다. 1Kb 단편을 절제하고, Sephaglas 밴드 제조 키트 (영국 ALI 3AW 허츠 세인트 알반스 소재의 Pharmacia사)를 사용하여 겔로부터 용출시켰다. 이어서, 단리된 단편을 AatII 및 PstI로 분해된 pDES1에 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 XL1-Blue 수용성 세포 (Strategene사)를 (제조자의 지시에 따라) 암피실린 내성이 되도록 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 생성 형질전환체로부터 단리하고, DNA 제한 분석을 실시하여 1개의 클론이 PCR 생성물 1이 라이게이션된 플라스미드를 함유함을 알았다. 이 플라스미드를 pDES2로 명명하였다.

pDES2를 에스. 클라불리게러스에 도입하기 위해서, 스트렙토마이세스에서 기능할 수 있는 복제 기점을 함유하도록 플라스미드를 추가 변형시켰다. 이를 달성하기 위해서, pDES2의 플라스미드 DNA를 EcoRI 및 HindIII로 분해하고, EcoRI 및 HindIII로 분해된 고카피수의 스트렙토마이세스 벡터 pIJ486 (6.2 kb; Ward et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 203: 468-478)에 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 (JM109) 수용성 세포(Strategene Ltd)를 형질전환시켜 암피실린 내성이 되도록 만들었다.

플라스미드 DNA를 생성된 형질전환체로부터 단리하고, 제한 분석을 실시하여 6개의 클론이 pDES2를 함유하는 pIJ486을 갖는다는 것을 알았다. 이 플라스미드 중의 하나를 pDES3으로 명명하였다. 플라스미드 pDES3을 사용하여 orfup1 유전자가 아프라마이신 내성 유전자(상기한 바와 같음)의 삽입에 의해 이미 붕괴된 에스. 클라불리게러스 균주를 형질전환시켰다. 티오스트렙톤 내성 형질전환체를 선발하여 비선택 배지에서 3회 연속 포자를 형성시킨 후, 아프라마이신 내성 상실 여부에 의해 스크리닝하였다. 이 과정을 통하여 45개의 변이체가 아프라마이신 내성을 상실한 것을 확인하였다. 이어서, 이들을 HPLC에 의해 분석하여, orfup1 붕괴체 61-1A, 61-2A, 61-3A 및 61-4A와 마찬가지로 이들 균주가 클라밤이 정상적으로 생산되는 조건 하에서 발효될 때 클라밤-2-카르복실레이트 및 2-히드록시메틸클라밤을 생산할 수 없음을 확인하였다.

B. orfdwn1 및 orfdwn2

먼저 pCEC018(7.3 kb)를 NcoI로 분해하여 대부분의 orfdwn1 및 일부의 orfdwn2를 함유하는 1 kb 하위 단편을 생성시켜 orfdwn1 및 orfdwn2의 결실/대체 변이체를 생성시켰다. 분해물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분획화시키고, 6.3 kb 단편을 절제하고, 겔로부터 용출시켰다. 이 단편을 apr^r을 보유하는 NcoI-NcoI DNA 단편에 라이게이션시키고, 이를 사용하여 이. 콜라이 XL1-Blue를 암피실린 내성이 되도록 형질전환시켰다. 하나의 클론을 상기 실험으로부터 수득하였지만, 생성된 재조합 플라스미드에 대해 제한 분석을 실시하여 2 카피의 아프라마이신 내성 단편이 결실 플라스미드에 라이게이션되었음을 알았다. 여분의 apr^r단편을 제거하기 위하여, 플라스미드를 NcoI으로 분해하고 자체 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 GM 2163을 아프라마이신 내성이 되도록 형질전환시켰다. 형질전환체로부터 플라스미드 pCEC052 및 pCEC053을 함유하는 2개의 클론을 단리하였는데, 상기 2개의 플라스미드는 오직 1 카피의 apr^r단편만을 보유하는 바, pCEC052는 orfdwn1 및 ofrdwn2에 대해 반대 방향으로 apr^r단편을 보유하는 반면에 pCEC053은 orfdwn1 및 ofrdwn2와 동일한 방향으로 삽입된 apr^r단편을 보유하였다.

pCEC052의 셔틀 플라스미드는 BamHI으로 분해된 pCEC052를 유사하게 분해된 pIJ486과 라이게이션시켜 제조하고, 이. 콜라이 GM2163을 형질전환시켜 아프라마이신 내성이 되도록 만들었다. 이 실험으로부터 셔틀 플라스미드 pCEC060을 함유하는 1개의 클론을 단리하였다. 이 플라스미드를 사용하여 야생형 에스. 클라불리게러스 3585를 형질전환시켜 아프로마이신 및 티오스트렙톤 내성이 되도록 만들었다. 생성된 형질전환체를 비선택 배지에서 2회 연속 포자를 형성시킨 후, 복제물을 항생제 함유 배지에 플레이팅시켜 아프라마이신 내성 및 티오스트렙톤 감수성 콜로니를 동정하였다. 3개의 추정 변이체 (60-1A, 60-2A 및 60-3A)를 추가 분석을 위해 선택하였다.

상기 3개의 추정 변이체의 정체를 확인하기 위하여, 게놈 DNA를 균주 60-1A 및 60-2A로부터 단리하여 SacI 또는 BstEII로 분해하고 서던 블롯 분석을 실시하였다. 이 실험으로부터 생성된 혼성화 밴드는 2개의 균주 모두에서 이중 교차가 발생한다는 사실과 일치하고 이것은 상기 변이체가 orfdwn1/2의 진정한 붕괴 대체 변이체임을 입증하였다.

변이체를 Soya-Flour 배지에서 배양하고 그 배양 상등액을 HPLC에 의해 분석한 결과, 어느 변이체도 검출가능한 수준의 클라밤-2-카르복실레이트 또는 2-히드록시메틸클라밤을 생산하지 않았다. 또한, 배양 상등액에 대한 생물학적 분석 결과는 변이체가 검출가능한 수준의 알라닐클라밤도 생산하지 않았음을 보여주었다. orfup1 변이체와 마찬가지로, orfdwn1/2 변이체는 야생형에 비해 매우 우수한 수준의 클라불란산을 생산할 수 있었다 (표 2).

진탕 플라스크 시험에서 orfdwn1/2 변이체의 클라불란산 (CA) 역가
균주	70시간	70시간	93시간	93시간
	CA μg/ml	CA μg/ml DNA	CA μg/ml	CA μg/ml DNA
NRRL 3585 #1	87	915	166	1963
NRRL 3585 #2	66	790	159	1842
60-1A	164	1872	260	2911
60-2A	187	2013	108	1320
60-3A	79	994	214	2161

orfdwn3

orfdwn3을 붕괴시키기 위해 pCEC023 (pSL1180에 서브클로닝된 cas1 하류 DNA의 3.7 kb 단편으로 구성됨)을 NcoI으로 분해시킨 후 자체 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이를 형질전환시킨 후, 플라스미드 pCEC031을 함유하는 클론을 단리하였다. 상기 플라스미드는 일부의 orfdwn2 및 불완전한 orfdwn3을 코딩하는 1.9 kb NcoI-EcoRI만을 보유하였다. DNA 서열 조사 결과, pCEC031은 orfdwn3의 번역 개시 부위로부터 158 bp에서 특유한 BstEII 부위를 보유하였다. 따라서, pCEC031을 BstEII로 분해하고, 클레나우 단편으로 처리하여 블런트 말단을 생성시킨 후 블런트 말단을 갖는 아프라마이신 내성 카세트에 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 GM2163을 형질전환시켜 아프라마이신 내성 및 암피실린 내성이 되도록 만들었다. 각각 pCEC050 및 pCEC051을 함유하는 2개의 형질전환체를 선택하였다. 제한 분석 결과는 아프라마이신 내성 카세트가 pCEC050에서 orfdwn3과 동일한 방향으로 배향되고 pCEC051에서는 반대 방향으로 배향되었음을 보여주었다. 2개의 플라스미드를 HindIII로 분해하여 유사하게 분해된 pIJ486과 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 별개로 사용하여 이. 콜라이 GM2163을 형질전환시켜 아프라마이신 및 암피실린 내성이 되도록 만들었다. 셔틀 플라스미드 pCEC056(pCEC050 + pIJ486) 및 pCEC057(pCEC051 + pIJ486)을 생성된 형질전환체로부터 단리하였다. 이어서, 2개의 플라스미드를 사용하여 에스. 클라불리게러스 NRRL 3585를 형질전환시켰다.

각각의 형질전환 실험으로부터 1개의 형질전환체를 선택하고 비선택 배지에서 2회 연속 포자를 형성시킨 후, 복제물을 항생제 함유 배지에 플레이팅시켜 아프라마이신 내성 및 티오스트렙톤 감수성 형질전환체를 동정하였다. 이로부터, 2개의 추정 변이체를 각각의 1차 형질전환체의 자손으로부터 단리하였다 (pCEC056의 경우 56-1A 및 56-3A, pCEC057의 경우 57-1C 및 57-2B).

상기 추정 변이체의 정체를 확인하기 위하여, 게놈 DNA를 상기 균주로부터 단리하여 SacI 또는 Acc65I로 분해하고 서던 블롯 분석을 실시하였다. 이 실험으로부터 생성된 혼성화 밴드는 2개의 균주 모두에서 이중 교차가 발생한다는 사실과 일치하고 이것은 상기 변이체가 orfdwn3의 진정한 붕괴 대체 변이체임을 입증하였다.

상기 균주를 Soya-Flour 배지에서 배양하고 그 배양 상등액을 HPLC에 의해 분석한 결과, 변이체는 클라밤-2-카르복실레이트 또는 2-히드록시메틸클라밤을 크게 저하된 수준으로 생산하였다. 배양 상등액에 대한 생물학적 분석 결과는 변이체가 또한 검출가능한 수준의 알라닐클라밤도 생산하지 않았음을 보여주었다. orfup1 및 orfdwn1/2 변이체와 마찬가지로, orfdwn3 변이체는 야생형에 비해 매우 우수한 수준의 클라불란산을 생산할 수 있었다 (표 3).

진탕 플라스크 시험에서 orfdwn3 변이체의 클라불란산 (CA) 역가
균주	71시간	71시간	93시간	93시간
	CA μg/ml	CA μg/ml DNA	CA μg/ml	CA μg/ml DNA
NRRL 3585 #1A	180	1580	193	1790
NRRL 3585 #1B	179	1640	266	2310
56-1A	34	110	235	2160
56-3A	225	2140	274	2740
57-1C	253	2910	277	2920
57-2B	242	2240	193	1860

본 발명은 하기 뉴클레오티드 서열을 개시한다.

서열 1: 도 1의 DNA 서열

서열 2: orfup3 서열

서열 3: orfup2 서열

서열 4: orfup1 서열

서열 5: orfdwn1 서열

서열 6: orfdwn2 서열

서열 7: orfdwn3 서열

서열 8: 올리고뉴클레오티드 프라이머 11 서열

서열 9: 올리고뉴클레오티드 프라이머 12 서열

서열 10: 올리고뉴클레오티드 프라이머 13 서열

서열 11: 올리고뉴클레오티드 프라이머 14 서열

Claims

에스. 클라불리게러스(S. clavuligerus)에서의 5S 클라밤 생합성에 특이적이고 5R 클라밤 생합성에는 필수적이지 않은 1 이상의 유전자를 포함하는 DNA.
제1항에 있어서, 도 1(서열 1)에 나타낸 DNA.
제1항에 있어서, orfup3, orfup2, orfup1, orfdwn 1, orfdwn 2 또는 orfdwn3(서열 2 내지 7)으로서 도 1에 도시한 서열을 갖거나 상기 서열을 실질적으로 갖는 DNA.
제1항에 있어서, orfup1(서열 4)로서 도 1에 도시한 서열을 갖거나 상기 서열을 실질적으로 갖는 DNA.
매우 엄격한 조건 하에서 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 DNA와 혼성화하는 DNA.
5S 클라밤 생합성에 특이적인 1 이상의 유전자가 붕괴되거나 결함된 제1항 내지 5항 중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 벡터.
제6항에 있어서, pCEC060, pCEC061, pCEC056, pCEC057 또는 pDES3인, 1 이상의 결함 유전자를 함유하는 벡터.
제7항에 있어서, pCEC061 또는 pDES3인 벡터.
제6항 내지 8항 중 어느 한 항의 벡터를 함유하는 숙주.
제9항에 있어서, 증가된 수준의 클라불란산(clavulanic acid)을 생산할 수 있는 숙주.
제9항 또는 10항에 있어서, 5S 클라밤을 낮은 수준으로 생산하거나 전혀 생산할 수 없는 숙주.
제9항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 에스. 클라불리게러스인 숙주.
cas1에 인접하는 개방 해독 프레임(open reading frame)에 대응하는, 붕괴되거나 결함이 있는 DNA를 포함하는 에스. 클라불리게러스.
제13항에 있어서, 개방 해독 프레임이 orfup3, orfup2, orfup1, orfdwn 1, orfdwn 2 또는 orfdwn3인 에스. 클라불리게러스.
제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 정의된 DNA의 조작 및 이 DNA의 적합한 미생물로의 도입을 포함하는, 상기 미생물에서의 5R 클라밤 생산을 개선시키기 위한 방법.
제15항에 있어서, 상기 적합한 미생물이 에스. 클라불리게러스인 방법.
cas1에 인접하는 DNA 영역을 붕괴시키거나 결함을 갖도록 만드는 것을 포함하는, 에스. 클라불리게러스에서 5R 클라밤의 생산을 개선시키기 위한 방법.
제15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 개방 해독 프레임 orfup3, orfup2, orfup1, orfdwn 1, orfdwn 2 또는 orfdwn3에 대응하는 것인 방법.
제15항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 개방 해독 프레임 orfup1에 대응하는 것인 방법.
제15항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5R 클라밤이 클라불란산인 방법.
5S 클라밤을 낮은 수준으로 생산하거나 전혀 생산하지 않는 미생물을 예비 스크리닝하는 것을 포함하는, 높은 수준의 5R 클라밤 생산에 적합한 미생물의 동정 방법.
제21항에 있어서, 미생물이 에스. 클라불리게러스인 방법.
제21항 또는 22항에 있어서, 5R 클라밤이 클라불란산인 방법.
제21항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 5S 클라밤의 생산에 특이적인 1 이상의 유전자가 결함이 있는 것인 방법.
제15항 내지 24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는, 5R 클라밤을 생산할 수 있지만 5S 클라밤을 낮은 수준으로 생산하거나 전혀 생산할 수 없는 미생물.
클라불란산을 생산할 수 있지만 클라밤-2-카르복실레이트 및(또는) 2-히드록시메틸클라밤을 생산하지 않는 25항의 방법에 의해 얻을 수 있는 미생물.
균주 56-1A, 56-3A, 57-2B, 57-1C, 60-1A, 60-2A, 60-3A, 61-1A, 61-2A, 61-3A 또는 61-4A인, 제15항의 방법에 의해 수득되는 미생물.
제25항 또는 26항에 정의된 미생물의 발효에 의해 수득할 수 있는 클라불란산.
제28항에 있어서, 클라밤-2-카르복실레이트가 없는 클라불란산.
제28항에 있어서, 그의 칼륨염 형태인 클라불란산.
5S 클라밤이 없는 클라불란산.
클라밤-2-카르복실레이트가 없는 클라불란산.
제30항에 따른 클라불란산칼륨을 베타-락탐 항생제와 조합하여 포함하는 조성물.
제33항에 있어서, 베타-락탐 항생제가 아목시실린(amoxycillin)인 조성물.
제25항에 따른 미생물로부터 클라불란산을 생산한 후에 이를 칼륨 염으로 전환시키고 칼륨염을 아목시실린과 조합하는 것을 포함하는, 클라불란산칼륨 및 아목시실린을 포함하는 조성물의 제조 방법.