TW200307041A - Clavulanic acid and the composition thereof - Google Patents

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200307041 A7 B7 五、發明説明（1 ) 絮-- (請先閱讀背面之注意事項^木頁) 本發明係有關新穎細菌基因及製造克拉凡素 (clavams)，例如：克拉弗酸（ciavUlanic acid)之改良方法。 本發明亦提供可提高克拉弗酸產量之新穎生物體。 微生物，特定言之鏈黴菌屬，可產生許多種抗生素， 包括：克拉弗酸及其他克拉凡素、頭孢素、聚乙醯 (polyketides)、頭黴素、衣徽素、全黴素、及青黴素。由 微生物生產此等抗生素之絕對量及相對量之處理上有相 當大利益，因此有許多研究探討其生合成途徑之代謝與 遺傳機制〔A丄·道明（Domain)(1990)，、、冷-内醯胺抗生 素之生合成與調節 ”（Biosynthesis and regulation of beta-lactam antibiotics·)，述於五十年來青黴素之應用、 歷史及趨勢"（50 years of Penicillin applications，history and trends)〕。已知許多種在代謝途徑中進行各種步驟之 酵素，及編碼此等酵素之基因。 暴 克拉凡素依其環之立體化學，大致可分成兩類（5S 及5R克拉凡素）。5R與5S克拉凡素生合成之生化途徑 尚未完全了解，但有人認為其係衍生自相同起始單位（係 尚未鑑定出之3個碳之化合物〔C.A·湯森(Townsend)與 M.F·何（Ho)(1985)，J· Am. Chem· Soc· 107(4)，1066-1068 及 S.W·艾森（Elson)及 R.S·奥利佛（〇liver)(1978) J. Antibiotics XXXI Νο·6,568〕及精胺酸〔Β·Ρ·華倫坦 (Valentine)等人（1993) J. Am. Chem. Soc. 15, 1210〜1211〕且共同出現一些中間物〔D·伊華特（Iwacta)-洛伊（Reuyl)及 C.A.湯森(Townsend)(1992) J· Am· Chem· 本紙张尺度逍用中國國家榡冷·（ CNS ) Λ4規格（210X297公茇） 200307041 A7 _____ B7 五、發明説明（2 )

Soc· 1 14:2762-63 及 J.W·詹克（janc)等人（1993)，Bioorg. Med. Chem· Lett. 3:2313-16〕。 5S克拉凡素實例包括：克拉凡素-2_羧酸酯（C2C)、2-&曱基克拉凡素（2HMC)、2-(3-丙胺酿基）克拉凡素、瓦 克拉凡素（valcalavam)及克拉凡酸（ciavaminic acid)〔GB 1585661，F·洛爾（Rohl)等人，八^11.1^(^〇131〇1.147:315-320, US 4,202,819〕。然而有少數幾種5R克拉凡素實例， 且目前最熟知者為；5 -内醯胺酶抑制劑克拉弗酸，其係由 克拉弗鏈黴菌（Streptomyces clavuligerus)潑酵產生。克拉 弗酸，係呈克拉弗酸鉀之形式與点-内醯胺經胺苄青黴素 組合成抗生素奥美丁（AUGMENT1N)〔史密克萊畢強藥廠 (Smith Klein Beecham)之商標名〕。由於此商業利益，克 拉凡素生合成方面之研究則著重於克拉弗鏈黴菌之5R 克拉凡素（克拉弗酸）之生合成。現已鑑定出許多種與 克拉弗酸有關之酵素及其基因，且已公開。此等文獻實 例包括：J.E·赫德森（Hodgson)等人，Gene 166，49-55(1995)，Κ·Α.艾都（Aidoo)等人，Gene 147，41-46(1994)，A.S·帕拉卡（Paradkar)等人，J· Bact. 177(5)， 1307-14(1995)。反之，對克拉凡酸(clavaminic acid)以外 之5S克拉凡素之生合成及$傳學則完全未知，克拉凡酸 為克拉弗鏈黴菌之克拉弗酸生合成途徑中，克拉凡酸合 成酶作用產生之克拉弗酸前體。 基因選殖實驗已鑑別出克拉弗鏈黴菌含有二種克拉 凡酸合成酶之同功異構酶，cas 1及cas2[ Ε·Ν·馬希（Marsh) -4- 本紙认尺度通用中S囡家標攻·（ CNS ) Λ4规格（210X297公势·） 200307041 A7 五、發明説明（3 ) 等人，Biochemistry 31，12648-657(1992)，此二者均可在 某些營養條件下產生克拉弗酸(A.S.帕拉卡（Paradkar)， J. Bact. 177(5)，1307-14(1995)〕。在其他生產克拉弗酸 之微生物中，亦即尤木琴鏈黴菌（S.jumonjinensis)〔C.M. 韋達（Vidal)，ES 550549，（1987)〕與卡蘇漢鏈黴菌（S. katsurahamanus) [ K.奇塔諾（Kitano)等人，JP53- 104796(1978)〕及抗生鏈黴菌（s· antibiotics)(係 5S 克拉 凡素，瓦克拉凡素之生產菌）〔j.E·巴德溫（Baldwin)，

Tetrahedron Letts· 35(17)，2783-86(1994)〕，亦檢測到克 拉凡酸合成酶活性。後項文獻亦報告了抗生鏈黴菌具有 原克拉凡酸脎基水解酶活性，其係另一種已知涉及克拉 凡酸生合成之酵素。已有文獻指出克拉弗鏈黴菌中所鑑 別出之所有涉及克拉凡素生合成之其他基因為克拉弗酸 生^成所必要者〔J.E.赫格森(Hodgson)等人，Gene 166, 49 55(1995)，κ·Α·艾都（Aid〇〇)等人，Gene 147，41_ 46(1994)〕’但尚無文獻指出專門用於5s克拉凡素生合 成之基因。

Μ*#·部中决標羋局兵τ,消於合竹d印Y 吾等現已鑑別出專用於58克拉凡素生合成之某些基 因’其實例為克拉弗鏈黴菌之C2C與2HMC。因此本發 明提供包含克拉弗鏈黴菌專用於5S克拉凡素生合成但 不一疋為5R克拉凡素（例如：克拉弗酸）生合成所必需 之種或多種基因之DNA。 本文所採用 >基因〃亦包括任何基因功能或表現所 必而之任何調節區。較佳方面，DNA之鑑定結果示於圖 本纸狀㈣财 200307041

1 較佳者，DNA 包括圖 1 中以 orfup 3、orfUp 2、orfUp 1、orfdwn 1、orfdwn2與〇rfdwn3代表之核苷酸序列。 本發明亦提供由該D N A編碼之蛋白質。本發明亦提供包 含本發明DNA之載體及含此等載體之宿主。 吾等已驚人地發現，當至少一種根據本發明基因有 缺時生物體之克拉弗酸產量增加。因此本發明亦提 供利用6適之微生物提咼克拉弗酸產量之方法。本發明 一方面，可操作所鑑別之基因產生可提高克拉凡素（以 克拉弗酸較合適）之生物體。本研究之發現結果亦可改 良鑑別較鬲克拉弗酸產量之生物體之方法，其包括初步 篩選5S克拉凡素產量低或無之生物體（例如··依本文實 例所述進行hplc與/或克拉凡素生物分析法）。 本發明5S克拉凡素基因宜由一般選殖法（如： PCR)，根據本文提供之序列製得。可採用基因技術， 如·基因瓦解〔Κ·Α·艾都等人 〇994)，Gene，147,41-46〕、 ^機誘變法、定位誘變法及反義RNA，來干擾或消除/ 刪除基因功能。

本名X月另方面係挺供含有一個或多個缺陷基因之 貝體，較佳質體為如下述之PCEC 060、PCEC _、PDES 3、pCEC 056與pCEC〇57。該等基因可依多種方式製成 缺陷。例如：嵌插一段完全廢除該基因活性之編碼抗生 素抗性基因之DNA片段。或者，可採用其它方法生產缺 陷基因，包括嵌插不編碼抗生素抗性基因之DNA，刪除 伤基因刪除所有基因或經由增加與/或取代一個或 __ -ό- 國家制μ - (請先閱讀背面之注意事項_寫本頁) 裝 訂 200307041 A7 B7

¾¾部中央標準局β_τ消贽合竹杉印V 五、發明説明（5 )多個核苷酸來改變基因之核苷酸序列。根據本發明之缺 陷基因之缺陷程度可能各異。其缺陷處可能在於活性完 全廢除或保留一部份原有活性。 本發明之質體宜用於轉化如：克拉弗鏈黴菌之生物 體，例如：菌株ATCC 27064 (其相當於克拉弗鏈黴菌 NRRL 3585 ) ^合適之轉化法可參見相關文獻’包括· J· 山布魯克（Sambrook)、E.F.弗立奇（Fritsch)與T.馬尼狄 斯（Maniatis)(1989)，、、分子選殖法··實驗室手冊' (Molecular cloning:a laboratory manual)，第 2 版，紐約冷 泉港冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y·) ; D.A.哈普伍德（Hopwood)等人 (1985)，''鏈黴菌之基因操作法。選殖手冊// (Genetic Manipulation of Streptomyces· A Cloning Manual)及 A.S· 帕拉克（Paradkar)與 S.E.傑森（Jensen)(1995)，J. Bacteriol. 177(5):1307-1314 〇 工業上使用克拉弗鏈黴菌菌株來生產克拉弗酸（克 拉弗酸鉀）。在英國與美國藥典（British and United States Pharmacopoeias)中有關克拉弗酸鉀部份（英國藥典 1993,附冊1994, Ρ·1362-3及美國藥典官方專題論文(u s. Pharmacopeia Official Monographs) 1995, USP 23 NF 18 P.384-5 )，明確控制毒性5S-克拉凡素，克拉凡素_2一叛 酸酯之含量。因此本發明另一方面係提供可生產高量克拉弗酸， 但無法製造C2C或可生產高量克拉弗酸但僅可製造低量 (請先閱讀背面之注意事項本頁) 裝· 、1Τ 線 本紙认尺度適川家桴次-U、NS ) Λ4規格（210X29?公犮） 200307041 A7 -----~__B7____ 五、發明説明（6 ) C2C之生物體±產克拉弗酸之合適生物體含有一個或 多個缺陷克拉凡素基因，較佳者為如下說明之克拉弗鏈 徽菌菌株 56-1A、56-3A、57-2B、57-1C、6(MA、60-2A、 60-3A、61-1A、61-2A、61-3A、及 61-4A。此等生物體 適合生產克拉弗酸，不會生產5S克拉凡素、克拉凡素_ 2-叛酸酯，或顯著降低克拉凡素羧酸酯產量。 實例 實例中，所有方法均如j·山布魯克，E F•弗立奇與τ· 馬尼狄斯（1989)之a分子選殖法··實驗室手冊/，（第2 版）或D.A.哈普伍德等人（1985)之、鏈黴菌之基因操作 法。選殖手冊//，及A.S·帕拉卡與S.E.傑森（1995)之J. Bacteriol，177(5):1307-1314，除非另有說明。 I*克拉弗鏈黴鐘染色體克拉凡酸酯合成酶基因casi上 游及下游之DNA序列分妍 A. casl之分離

為了自克拉弗鏈黴菌NRRL 3585分離編碼克拉凡酸 酯合成酶同功異構型l(casl)之染色體DNA片段，根據 已先分析序列之casl基因（Ε·Ν·馬希（MaΓsh))、M·D·T· 張（Chang) 及 C.A· 湯森 （Townsend)(1992) Biochemistry 红:12648-12657)之核苷酸9-44，合成寡核苷酸探針 RM01。寡核苷酸係於應用生物系統公司（Applied Bi〇systems)391 DNA合成儀上，採用標準方法構築。所 合成之RM01 (36聚體）之序列與上述馬希所公開之序 列（1992,上述文獻）呈反向平行意義。RM〇l係採用DNA -8 - 木紙张尺度^中囡國（CNS)Λ4ί兄格（2丨0x297公^ (讀先Μ讀背而之注意事項本頁) •裝· 訂 200307041 A7 ___ B7_ 五、發明説明（7 ) 寡核苷酸末端標識標準技術（上述山布魯克等人， 1989)，以32P進行放射性標識，並用於依史塔爾（Stau) 與阿曼（Amann)所述之南方雜交法〔'細菌分類學之核酸 技術夕（Nucleic acid techniques in bacterial systematics〕， E.史塔克布蘭特（Stackbrandt)與M.古菲洛（Goodfellow) 編輯，多倫多市強威利父子公司（John Wiley & Sons)， P.205-248, 1991)，篩選克拉弗鏈黴菌基因組DNA粘接質 體庫。於粘接質體PLAFR3中製備之克拉弗鏈黴菌DNA 之基因組庫說明於J.L.杜倫（Doran)等人（1990)，J. Bacterial· 172(9)，4909-4918 ° 由克拉弗鏈黴菌钻接質體庫之菌落點與標識放射性 之RMOl於60°C下，於含5XSSC，5χ登哈特氏溶液 (Denhardt’s solution)與 0.5% SDS (lxSDS : 0·15Μ NaCl + 0.015M檸檬酸三鈉；lx登哈特氏溶液：0.02% BSA， 0.02% FicoU，及0.02% PVP)溶液中培養一夜。吸墨點於 68°C下，於〇.5xSSC + 0.1% SDS溶液中洗滌30分鐘。 分離一株粘接質體純系10D7,其會與RM01強力雜交， 當接受限制内切核酸酶Sac I與EcoRI分解時，產生之雜 交訊號與克拉弗鏈黴菌基因組DNA之類似分解實驗時 檢測之雜交訊號一致。 Β·复包企錢黴菌側接casl之DNA序列分析 採用限制内切核酸酶SacI、NcoI及ΚρηΙ產生粘接質 體10D7之部份限制圖譜。由RM〇l與l〇D7 DNA之各 種不同分解物之間之南方雜交實驗顯示，casl最可能位 -9- 本紙张尺度通用中( CNS ) A4«L格（210X297公釐) ---------装-- (請先Μ讀背面之注意事項本頁) 、1Τ 4 200307041 A7 B7 五、發明説明（8 ) 於7 kb SacI-SacI DNA次片段之一端，此片段由casl開 放讀碼框及約6 kb上游DNA組成。再自噬菌質體載體 pBluescriptll SK+(2.96 kb;史塔金公司（Stratagene))中 10D7之SacI分解物次選殖出7-kb片段，因而產生重組 質體 pCEC007。 為了有利於分析casl之染色體上游之序列，在PUC 120(3.2 kb ;菲拉（Vieirre)與梅辛（Messing)，Methods Enzymol. 153, 3-11，1987)中，依兩個方向，次選殖出7 kb SacI-SacI片段之3 kb Ncol-Ncol次片段，產生重組質體 pCEC026與pCEC027。該3 kb次片段係由casl之編碼 胺基末端部份與上游DNA約2.6 kb組成。 採用外切核酸酶ΙΠ與S1核酸酶分解法（上述山布魯 克等人，1989 )，在pCEC026與pCEC027中產生集中 重疊刪除，並利用Tag染料-去氧a終結子套組及應用生 物系統373 A序列分析儀進行二去氧鏈終結法（F.山格 (Sauger) ，S·尼克倫（Nicklen)與 A.R·庫森 (Coulson)(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467)，在兩股上決定3 kbNcoI-NcoI片段之DNA序列。 為了決定緊接cas 1下游染色體之DNA序列，自 pBluescdtpn SK+中粘接質體純系10D7次選殖出4.3 kb KpnI-Eco RI DNA 片段，產生 pCEC018。自 pCEC018 中，選殖 3_7 kb SacI-SacI 次片段至 pSL1180 中（3,422 kb， 法馬藥廠（Pharmacia));此片段SacI末端之一與casl之 TGA停止字碼子部份重疊，其他部份則編碼載體。次選 -10 本牴认尺度適用中國國家標挲（CNS ) Λ4规格（210X297公犮） 200307041 A7 B7 五、發明説明（9 ) 殖期間則得到兩個方向之3·7 kb片段，所得重組質體分 別稱為PCEC023及PCEC024。在兩個質體中進行集中重 璧刪除，並於兩股上決定3.7 kb片段之ONA序列。此等 貫驗產生之克拉弗鏈黴菌染色體之核苷酸序列（包括測 接casl序列）示於圖1。 Η開.寒..成屋想側接cas 1之功能分折法 casl上游之DNA序列之電腦分析法預測到兩個完整 之orfs及個不元整之〇rf之存在。所有三個〇rf均位在 casl之相反〇^^股上，因此呈反向排列。第一個開放讀 碼框orfupl位於casl上游之579 bp，且編碼344個胺基 酸（aa)之多肽，第二個開放讀碼框〇rfup：z，位於〇rfupl 之3’末端上方437 bp，且編碼151 J aa之多肽。〇rfup2 上方為orfup3。orfup3之起始字碼子與orfUp2之轉譯停 止字碼子重疊，表示這二個〇rfs在轉譯上偶合。3 kb Ncol-Ncol片段上沒有orfup3之轉譯停止字碼子。 casl下游之Dna序列之類似分析法預測到二個完整 0Γ&及一個不完整orf之存在。這二個orf均位在casl 之反向DNA股上，因此其方向係向著casl。第三個orf 位於casl之相同股上，因此其方向係遠離casi。第一個 下游開放讀碼枢orfdwnl位於casl下游373 bp，且編碼 328個aa之多肽。第二個開放讀碼框〇rfdwn2位於 orfdwnl上游55 bp，且編碼394個aa之多肽。0rfdwn3 則位於〇rfdwn2上游315匕口，且在反向股上。由於3.7 1<^ 片段上未發現orfdwn3之停止字碼子，因此其編碼219 -π - 本纸张尺心削，關CNS ) Λ4· ( 21(): 297公^7 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本貪)

200307041 Μ ____ Β7 _ 五、發明説明（10 ) 個aa之不完整多肽。 orfup與orfdwn開放讀碼框之某因瓦解法 為了分析開放讀碼框側接casl於克拉弗鏈黴菌生產 克拉弗酸及其他克拉凡素之生合成作用中之可能角色， 利用基因置換法，產生嵌插之不活化或刪除突變株。用 於基因瓦解及置換之方法基本上已說明於帕拉卡 (Paradkar)與傑森（Jensen)之上述文獻（1995)中。 A. orfup 1 經满部中决摞枣局貝工消费合作社印¾ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依帕拉克與傑森（上述文獻1995)所述構築帶有阿 伯拉黴素（apramycin)抗性基因（aprr)之 1.5 kb Ncol-Ncol-片段’以克倫片段（Klenow fragment)處理，產生鈍端（山 布魯克等人，1989上述文獻），粘接至經BsaBI分解之 PCEC026，同樣以克倫片段處理。PCEC026擁有一個 BsaBI位置，位於離轉譯起始字碼子636 bpi〇rfupl内。 採用枯接混合物轉化大腸桿菌GM 2163可勝任之細胞 (得自美國新英格蘭生物實驗室（New Eng丨and Biolabs， USA)，M.G·馬里諾斯(Marinus)等人，MGG(1983)，vol. 122’Ρ·288β)，使之具有阿伯拉黴素抗性。自所形成之 轉化體中分離出二株含有質體PCEC054及PCEC055之 純系；經限制酶分析，發現PCEC054擁有aprr-片段嵌在 會 與orfupl之相同方向上，而pCEC〇55則呈相反方向。 為了將PCEC054引入克拉弗鏈黴菌中，以BamHI 及Hind ΠΙ分解質體DNA，並粘接高套數鏈黴菌載體 PIJ486 (6·2 kb ;華德（Ward)等人，（1986) Mol· Gen· Genet. -12- 张尺—财關 ----- 200307041 經滴部中央標率局貝工消费合作社印^ A7 B7 五、發明説明（n ) —

203.468-478)。然後採用粘接混合物來轉化大腸桿菌gM 2163可勝任之細胞，使之具有阿伯拉黴素抗性。由所得 之轉化體中分離一株擁有往返質體pCEC〇61之純系。此 質體再用於轉化克拉弗鏈黴菌NRRL 3585。所得轉化體 則於非選擇性培養基上連續進行兩回芽胞形成作用，然 後重覆塗佈在含抗生素之培養基上，以鑑別具阿伯拉黴 素抗性及硫鍵絲菌肽敏感性之轉化體。由此方法再選拔 四株推斷可能之突變株（61-1八、-2八、-3八與-4八），進一 步分析。 為了證實此等推斷之突變株會在〇rfupl中瓦解，因 此自分離株61-1A及61-2A中製備基因組DNA，以SacI 分解，並進行南方墨點分析。南方墨點分析結果與所出 現之又重父叉現象一致’證明此等突變株為〇rfUpl中之 真正瓦解置換突變株。 由犬變株61-1A、-2A、-3A與-4A於大豆粉培養基中 生長’以HPLC分析其培養物上澄液之克拉弗酸與克拉 凡素產量。大豆粉培養基之組成份及HPLC分析克拉凡 素之方法均如先前技藝之說明（帕拉克與傑森，1995上 述文獻），但HPLC分析法之流動緩衝液則改由〇·1 Μ

NaH2P04+6%甲醇，pH 3·68組成（以冰醋酸調pH)。 ♦

HPLC分析法顯示’突變株均未產生可檢測量之克拉凡 素-2-緩酸酿或2-經曱基克拉凡素。此外，當培養物上澄 液採用普魯士（pruess)與克里特（Kellett)之方法（1983，J. Antibiot· g·· 208-212)，針對桿菌屬（Bacillus sp·) ATCC -13- 本紙張尺度適用中國國家榡率（CNS ) ( 210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 、-=0 經漭部中央標率局貝工消费合作社印¾ 200307041 五、發明説明（12 ) 27860進行生物分析時，突變株均未產生可檢測量之丙 -胺醢基克拉凡素。反之，培養物上澄液之HPLC、分析法 則顯示突變株之克拉弗酸產量似乎優於野生型（表1)。 奉1 orfiipl突變株於振盪燒瓶試驗中之克拉弗酸效價(C@ 菌 種 70小時 70小時 93小時 93小時 CA微％毫升 CA微克/毫克DNA CA微毫升 CA微克/毫克DNA NRRL 3585 #1 87 915 166 1963 NRRL 3585 U2 66 790 159 1842 6J-JA 272 2894 439 6113 61-2A 199 2148 225 2928 61-3A 54 692 221 2585 61-4A 0 0 226 2422 orfupl刪除法 進行選殖實驗，在orfupl之Aat Π位置之間刪除654 個核苷酸。採用下列寡核苷酸引子並以上述PCEC061為

模板，產生PCR產物。改變原有之核苷酸序列，使pstI 納入寡核苷酸11中，及使SphI位置納入寡核苷酸14 ♦ 中〇 用於產生PCR產物1之寡核苷酸對1 ' 引子 i! 5’ dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC 3’ μ 5, dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC 3’ 弓1子12 -14- 本紙张尺度適用中國國家標率（CNS ) A4現格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) •裝·

1T 200307041 A7 __B7_ 五、發明説明（13 ) 用於產生PCR產物2之寡核苷酸對2 ……ο 5, dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC3， -引子13 5，dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG 3， 〜 引子14 採用來自 GRI(Felsted，Dunmow，Essex，CM6 3LD)之 PTC-200普利特(Peltier)熱循環機進行標準PCR反應。 採用引子11及12產生PCR產物1。此產物約1 kb， 且包含由第二個Aatn位置開始之orfupl之羧基末端及 下游區。 PCR產物係採用引子13與14產生。此產物約1.1 kb，且包含由第一個Aat Π位置開始之orfup 1之胺基末 端及上游區。 經消部中央標準局負工消费合作社印¾ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依指導手冊（史塔金公司（Strategene Ltd，Cambridge Science Park，Milton Road，Cambridge CB4 4GF)，由 PCR 產物2與SrfI分解之PCR-Script Amp SK(+)粘接。採用 此粘接混合物轉化Epicurian大腸桿菌 XL 1-Blue MRF’Kan具超勝任能力之細胞（來自史塔金公司），使 之具胺苄青黴素抗性（依製造商指導手冊進行）。自所 得轉化體中分離質體DNA，由DNA之限制酶分析結果 顯示，有7株含有已粘接PCR產物2之質體之純系。其 中一個質體稱為pDESl。 ♦ 以PstI及Aat Π分解PCR產物，所得DNA經琼脂糖 凝膠電泳分離。切下1 kb片段，採用Sephaglas條帶最 備套組（band prep kit)(法馬公司（Pharmacia，St Albans, Herts, ALI3AW)，自凝膠上溶離出。分離之片段再粘接 -15- 本紙张尺度適汛中國國家標準（CNS〉A4規格（21〇X：297公楚1 ~' 200307041 A7 B7 經滴部中央標隼局貝工消费合作社印絮 五、發明説明（14

Aat Π與PstI分解之pDES 1。採用此枯接混合物來轉化大 腸桿菌XLl-Blue可勝任之細胞（來自史塔金公司），使 之具胺T青黴抗性（依製造商之指示）。自所得之轉化 體中分離質體DNA，由限制酶分析結果顯示有丨株含有 已粘接PCR產物之質體純系。此質體稱為p〇ES2。 為了將pDES2引入克拉弗鏈黴菌中，進一步修飾質 體，使之含有可於鏈黴菌中運轉之複製起點。為了達成 此目的，以EcoRI與HindDI分解pDES2之質體DNA， 並枯接至亦經EcoRI及Hind ΠΙ分解之南套數鍵徽菌載體 pIJ486(6.2 kb :華特等人（1986) Mol. Gen. Genet. 203:468-478)中。採用粘接混合物來轉化大腸桿菌（JM1〇9) 可勝任之細胞（史塔金公司），使之具胺苄青黴抗性。 自所得轉化體中分離質體DNA，由限制酶分析結果顯示 6株具有含PIJ486之PDES2之純系。其中一個質體稱為 pDES3。採用質體pDES3轉化一株克拉弗鏈黴素菌菌 株，其中orfupl基因已因嵌插阿伯拉黴素抗性基因而瓦 解（如上述）。選拔硫鏈絲菌肽抗性轉化體，此等轉化 體再於非選擇性培上進行三回芽㈣成作用，並筛 選阿伯拉黴素抗性之喪失。由此方法鑑別出45株已喪失 阿作拉黴素抗性之突變株 '然後利用HpLC分析證實此 等菌株，例如：❹柳1瓦解株61-1A、61-2A、61-3A及 61-4A當於通常生產克拉凡素之條件下醋酵時 ，無法生 產克拉凡素-2-羧酸酯及孓羥甲基克拉凡素。 B· 〇rfdwnJ^〇rfdwn2 (讀先閱讀背面之注意事填寫本頁) -裝. 線 -16. 200307041 經滴部中央標率局貝工消费合作社印繁 A7 B7 五、發明説明（15 ) 先以Ncol分解pCEC018(7.3 kb)，並釋出含大多數 orfdwnl及一部份orfdwn2之1 kb次片段，製成在 orfdwnl及orfdwn2中刪除/置換之突變株。分解物經琼 月曰糖凝膠電泳分離’切下6 · 3 kb片段，自凝膠上溶離。 此片段再粘接帶有aprr之Ncol-Ncol DMA片段，用來轉 化大腸桿菌XL卜Blue，使之具阿伯拉徽素抗性。由此實 驗得到一株純系，但所得到重組質體之限制酶分析結果 顯示，已有二套阿伯拉黴素抗性片枯接至刪除質體中。 為了消去aprr片段之多餘套數，以Ncol分解質體，並自 體粘接。採用粘接混合物來轉化大腸桿菌GM2163，使 之具阿伯拉黴素抗性。自此等轉化體中分離二株含有質 體pCEC052與pCEC053之純系，此二質體均僅具有一 套aprr-片段；pCEC052具有aprr-片段與orfdwni及2呈 相反方向，而pCEC053具有之apf片段則依orfdwnl與 2之相同方向欲插。 pCEC052之往返質體之構築法為粘接BamHI-分解之 pCEC052與依類似方法分解之pIJ486，並轉化大腸桿菌 GM2163，使之具阿伯拉黴素抗性。由此實驗中分離出一 株含有往返質體PCEC060之純系。此質體用來轉化野生 型克拉弗鏈黴菌3585，使之具阿伯拉黴素與硫鏈絲菌肽 岭 抗性。所得轉化體於非選擇條件下進行兩回芽胞形成作 用，然後重覆塗佈在含抗生素之培養基中，以鑑別阿伯 拉黴素抗性，硫鏈絲菌肽敏感性菌落。選拔三株推斷可 能之突變株(60-1八、-2八及-3八)作進一步分析。 -17- (請先閲讀背面之注意事項 寫本頁) -裝 、=口 本紙张尺度適财關家辟（C$) ( 210X 297公楚)~ 200307041

B 五、發明説明（16 ) 為了鑑別此等推斷之突變株，自菌株6〇qA及6〇_2A -中分離基因組DNA，並以SacI或BstEJI分解，進行南 方墨點分析。由此實驗產生之雜交帶與出現雙重交叉現 象之兩個菌株結果一致，證實此等突變株為〇rfdwnl/2 中之真正瓦解置換突變株。 當此等突變株於大豆粉培養基中培養且以HPLC分 析其培養物上澄液時，所有突變株均無法產生可檢測量 之克拉凡素-2-羧酸酯或2-羥甲基克拉凡素。培養物上澄 液之生物分析法顯示該等突變株亦無法產生可檢測量之 丙胺醢基克拉凡素。如同orfupl突變株，orfdwnl/2突變 株之克拉弗酸產量亦優於野生型（表2) ---------裝-- (請先閲讀背面之注意事項 ^^寫本頁) 、-口 經消部中央標枣局貝Η消资合作社印絮 表2 orfdwpl/2突變兹爸择盈燒瓶試驗中之克拉弗酸效價(CA) 菌 種 70小時 70小時 93小時 93小時 CA微以毫升 CA微克/毫克DNA CA微t毫升 CA微克/毫克DNA NRRL 3585 H1 87 915 166 1963 NRRL 3585 #2 66 790 159 1842 60-IA 164 1872 260 2911 60-2A 187 2013 108 1320 60-3A 79 994 Φ 214 2161 orfdwn3 -18 - ·線 本紙張尺度適用中國國家彳票卒（CNS ) Α4说格（210X297公釐） 200307041 A7 __B7_ 五、發明説明（17 ) 為 了瓦解 orfdwn3,由 pCEC3023(由 casl 下游 DNA 3.7-kb片段次選殖至pSL 1180中組成）經

Ncol分解，然後自體粘接。經此粘接混合物轉化 大腸桿菌後，分離一株具有質體PCEC03 1之純 系。此質體僅保留編碼一部份〇ΓίΜλνη2及不完整 orfdwn3 之 1.9kb NcoI-EcoRI 片段。檢視 DNA 序 列顯示PCEC03 1具有一個獨特之BstE Π位置位於

orfdwn3轉譯起始位置之1 58bp處。因此，以BstE Π分解pCEC03 1，經克倫片段處理，形成鈍端， 然後與已呈鈍端之阿伯拉黴素抗性匣粘接。採用此 粘接混合物來轉化大腸桿菌GM2 1 63，使之具有阿 伯拉黴素抗性及胺苄青黴素抗性。選拔二株分別含 有pCEC05 0及pCEC051之轉化體，由限制酶分析 結果顯示，阿伯拉黴素抗性匣之方向亦與pCEC050 中之orfdwn3之方向相同，但與pCEC051之方向 相反。這二個質體再經Hind Π分解，並與依類似 方式分解之piJ486粘接。該粘接混合物再分別用 於轉化大腸桿菌GM2 163，使之具阿伯拉黴素及胺 經满部中央標準局貝工消费合作社印^ 苄青黴素抗性。自所得之轉化體中分離往返質體 pCEC05 6(pCEC0 5 0 + pIJ4 86)^ pCEC05 7(pCEC05 1 + ♦ pIJ486)。這二個質體再用於轉化克拉弗鏈黴菌 NRRL 3585。 自轉化實驗中選拔一株轉化體，並於非選擇性 培養基上連續進行兩回芽胞形成作用，然後重覆塗 -19- 本紙张尺度適用中國國家標牟（CMS ) A4规格（210X297公釐） 200307041 A7 B7 五、發明説明（18 佈在含抗生素之培養基上，以鑑別阿伯拉黴素抗性 及硫鏈絲菌肽敏感性轉化體。由此方法，自各初級 轉化體之後代分離出兩株推斷可能之突變株 (pCEC056 之 56-1A 與 56-3A，及 pCEC057 之 57-1C 與 57-2B)。 為了鑑別此等推斷之突變株，自此等菌株中分 離出基因組DNA，以SacI或Acc65I分解，進行南 方墨點分析。由此實驗產生之雜交帶與這兩株菌株 之雙重交叉現象一致，證實此等突變株為orfdwn3 中真正瓦解置換突變株。 當此等菌株於大豆粉培養基中培養並以HPLC 分析其培養物上澄液時，所產生之突變株大幅降低 克拉凡素-2-羧酸酯或2-羥曱基克拉凡素之產量。 培養物上澄液之生物分析顯示，該等突變株亦無法 生產可檢測量之丙胺醢基克拉凡素。如同or flip 1 及orfdwnl/2突變株，orfdwn3突變株之克拉弗酸 產量優於野生型（表3)。 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經漭部中央標準局員工消费合竹社印來 20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） 200307041 SEQIDNo 1 : SEQ ID No 2 SHQ ID No. 3 SEQ ID No 4 SEQIDNo. 5 . SEQIDNo. 6 : SEQ ID No. 7 . SEQ ID No. 8 ; SEQIDNo. 9 . SEQIDNo. 10: SEQIDNo. 11: Α7 Β7 五、發明説明（19·) 表3

〇rftiwn3突變株於振盪燒瓶試驗中之克拉弗酸效價(C 菌 種 70小時 70小時 93 λ! CA微克/毫升 CA微克/毫克DMA CA微3 NRRL 3585 U1A 780 1580 193 NRRL 3585 iUB 179 1640 266 56-1A 34 110 235 56-3A 225 2140 274 57-1C 253 2910 57-2B 242 2240 193 本申請案揭示下列核苷酸序列： 圖1之DNA序列 orfop3序歹丨j orfiip2序列 orftipl序列 orfdwnl 序列 orfdwn2 序列 orfdwn3 序列 寡核苷酸引子11序列 募核苷酸引子12序列 寡核苷酸引子I3·序列 寡核苷酸引子Η序列 -21.- 本紙张尺度適用中國國家榡嗥（CNS ) Μ说格U10X297公漦）

200307041 A7 B7 五、發明説明（⑽） 圖1克拉弗鏈黴g染色體（包括側接casl)之核苷酸序列 ^COI, ...... 1 GGTACCGCCCGCCGCCGACGGGGCCTCGGAGCCGGCCTGGCCACTGGTCCTGGTGGGGCC 60 "mapppqgpaeapgtvlvvg * * · ♦ * 61 ACCCTATCACCGGGCGGTGGGCCGCGTCGTCTGAGGGCCTGTGCCTGGGCACCCACACGC 120

TPYHGAVRRLLSGSVSGHTH , . <orfup3 . . . 121 GCCTTTCCGGGCCTCCGGCCCAGTGTCGGTGCCCATTGCGCGCCACAGGAACGGGCGCAT 180

★ LWPYRATDKGAY ASLGPPRTM 181 TAGCCCCAGGTCTATCTGCTTCCGGGCCACCTGCTCCTTCAGGGCGTGGAGCATCTGGCA 240

DPDLYVFARHVLFDRVEYVT 241 CG'TGGTCGCGGGCCGCCGGGTGAGCCCCAGTGGGCGGGCGGTGCCGGGCAGGGCCACGAG 300

CWRGAAWEPDGARWPGDRHE 301 TGGCACCCACCACGGGAGGCGCCGCTCCTCAAGCCAGGGCCAGTCTTAGGTCAACTGCCT 360

GHTTGEAALLETGTLIWNVS 361 GGTGTCTACCACCCACTAGCTCGCCTACCACGGGGGCTCCAGCAGCTTCTCGGCCCGCTA 420

WLHHTISRITGGLDDFLRAI 421 GAGCCTGAACGGGGCCCGGTCTGGGGTGAACCCCTTCTTCTTCTGGCGCAGGAGCCGCTT 480

ESKGRALGWKPFFFVADEAF 481 CATCAGCTAGCGCCCCCACGGCAGCGACGGCTGCGGCGGCAACAGCTTGCGGAACTTCAT 540

YDIAPTGDSGVGGNDFAKFY I . . . . <orfup2 541 GCGCCACTACTGGCGGAACGCGACGAGCAGGCAGtATGGCCGGCTACGGTGCCTGTACTT 600

ATIVAKRQEDTMGASAV^M 601 TGCTGGAGGTCTCTAAGGCCCACCGACACGACCCCGACGCCTTCCCCACAGGGGGCGCTT 660 -2Z - (請先閲讀背面之注意事項 --裝-- 本黃) 、·ιτ 纣滅部中^it^^^J消费合作ii印欠 200307041 A7 B7 五、發明説明（>1 ) 661 CCTGCCGCCTGCGGCGCCTGCGGCGCCGGCAGAGGGGCCGCCTGCCCAGGGTCGCAGGAC 720 7 21 CTCTCCCGAACCGCCGCCGAACTGCGGCACGACAGGGCGCCGAACGCCTTGCGCTTCATG 780 781 GCCGGTGGCATGCCCGCAACGTGGCCTGCACATGCGGCCAGCCCTGGGGAGCATGGGGGC 840 841 CTCGGCCGGCTGGGGCCGCCGAGGCCCCCATGCCTGCGCGGCCTGGCCGGGCTCGCTCGG 900 901 CCTGCCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCTGCCTGGCCTGCC 960 961 ACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCIX3CCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCC 1020 1021 GTGCGGCCTGCCCAGTCAACGGCTAGTACCGCTCGTTACGGCCCCACATGGCGAGGGGCC 1080

*NGIMALLAPTYREG

1081 TGTGGCCCACCCTCTAGCGCCGGCAGTGGAGGCGCTCCCTGGCCAGCAGGTCGGCCTAGC 1140 SVPHS IAATVEALSRDDLRI

1141 TCCGCCGCCGCTCTAACAGGCGCTCTACCCGGCCCAAGCGCCACGGGCCCTAGCCCTGCT 1200 SAAALNDALHAPNATGPIPV

1201 GCAGGAGCGGGGCCACCACGTCGGTCCGCTCGCGCTCGACACGGTCCCAGTCGGGGTCTG 1260 VDEGRHHLWALALQALTLGL

1261 GCAGGCGCTGGCCCGCGTCGGCCACGTCGTTGCTCGCCAACGCGCGCTCCCGGCCTCGCG 1320 GDAVPRLRHLLSRNRALAPA

1321 ACTTGGCCCCGACCGGGGCCGCCTTCAGGAGCAGGGGGTCTAGCAGCCACCACGCCTACC 1380 SFRPQGRRFDEDGLDDTTRI ♦ « * ' · ·

1381 ACGGCCACTCTTTTGGGGCAGGGTCTCCCCGCATTCGCTGCTAGGGCTAGGGGTCGAGGG 1440 TGTLFGRGLPAYAVIGIGLE • « · · ·

1441 CCGTCTGCCC^STGGTGGAGCAGGAGCTAGGGCGCGCTGGTGTCCGAGGTGAGCGAGACGT 1500-RCVPVVEDEI G R SWLSWESQ * ♦ · · * ·

1501 GGCGGCAGTGGCCCACGTGGCGCAGGCGGGCCGCGTCGCACCGGCGCCTCCCGAGCCTCT 1560 VATVPHVADARRLTAASPES -23.- ^紙浓尺度述州屮囚《家榡彳（（，NS M4現招（2丨〇〆297公势） 200307041 A7 ____ _B7 五、發明説明（>> ) 1561 CTGGCTCGGACGCCTGGAACGGGAGCGCGTGGTCGAGCCGGTGGCGTGGGTGCCAGAGGA 1620

LGLRrvKGERVLEAVAGVTE 1621 GCTAGCCGTGGCGGCCCAGGCAGGTCACGACCATCATGTCCAGCTACGCCAGCCACGGCT 1680 eipvapdtwhqyyldirdtg 1681 CTGCTGCGTCCCTGGCAAGCGTCCGGCGCGCCTGCATCCTGCCGAGCGGCGTGTTCGGGA 174 0 lrrlsrecaarvyspegclg 1741 CCCTCCGCGGCAGCCTGCTCGCGTGGTACGGCTTGAACCACCGCTAGTCGTGGAGCAGGG 1800

QSAGDSSRVMGFKTAILVED 18 01 CCGCCGGGCGCTGGCGGGCAGGCTCGTCGAGGAG1X3GCCGCGGCTCGGGGACCTGCAGCC 1860

RRGAVARGLLEEGAGLGQVD 1861 GCCACAGGTCGTCCCACTGGGGCCGCAGCTGCCGCCGCGCCTACCACCGGCAGCGGGCCC 1920 atdlltvgadvaaritatar 1921 GCGCCAGGCCCGCAGGCATCTTCAGCCACCAGCCGTCCGTCGGCTCGGGGACCCGTGACT 1980 ardprgyfdttplcglgqas 1981 GGCCTTCCAGGGCGTCCCGCGCCTGGCCGCCTGCGCCTTGGCGCCGCCTGTGCCTTGGCC 2040

VPLDRLARVPPRPVAASVSG . . <〇rfupl . - 2041 CCGGGGACTCGGGCGGAGAGCGGGACATACGGAACCTCCACAGGCGGAGCCGGGAACGGG 2100

GGCCCCTGAGCCCGCCTCTCGCCCTGTATGCCTTGGAGGTGTCCGCCTCGGCCCTTGCCC APSEPPSRSM • · · · · · 2101 ACGAGGGCGAGGACGGGACGGAACGAAGGAGAGGACGGGACGGACAGCACGGACGGGACG 2160

TGCTCCCGCTCCTGCCCTGCCTTGCTTCCTCTCCTGCCCTGCCTGTCGTGCCTGCCCTGC ♦ · ♦ * - · 2161 GACGGAACGGftGTCGGGAACCGGGGGGGGTGACCGGAACCGGGCCGTCCTTGGCCCTCCC 222 0一 CTGCCTTGCCTCAGCCCTTGGCCCCCCCCACTGGCCTTGGCCCGGCAGGAACCGGGAGGG • · · * * · 2221 CCGTCCTCCCCGCCATCCGCCGTTCTCCCCCGTTCCCTCTCCCGTCCTCCAGCCAACACC 2280

GGCAGGAGGGGCGGTAGGCGGCAAGAGGGGGCAAGGGAGAGGGCAGGAGGTCGGTTGTGG -24.- 紙张尺度迸川中阁殴家榀彳（（、NS ) Λ4说将（210X297公釐） 200307041 A7 B7 五、發明説明Ud ) 2281 GCCGCCCTTTCCAAGCGCTTGACACGGCACCGACAGCCGCCGCCGGGCGCCCGATGGGGA 2340 CGGCGGGAAAGGTTCGCGAACTGTGCCGTGGCTGTCGGCGGCGGCCCGCGGGCTACCCCT ; · · · 2341 CCCGTGCCCGCCGGTGAGCGGCGGTGAGCGCCGGTACGGGACCCCACGCGCCGCCGCCCG 2400

GGGCACGGGCGGCCACTCGCCGCCACTCGCGGCCATGCCCTGGGGTGCGCGGCGGCGGGC 2401 GGCGCCCGCCAGGGCCCGCGCGGCCACCCCGGCCCGCCCCGGCCGGAGCGGCGATCCGGG 2460

CCGCGGGCGGTCCCGGGCGCGCCGGTGGGGCCGGGCGGGGCCGGCCTCGCCGCTAGGCCC 2461 CCGCTCGCTGCAAGAGGAACATCCACAGCCGCACAAGGAGCGCTCCGCACAGTGGGCACC 2520

GGCGAGCGACGTTCTCCTTGTAGGTGTCGGCGTGTTCCTCGCGAGGCGTGTCACCCGTGG 2521 ACGTCCGCCCCGTCCCCCACACCGTGGCCGGTCCCCACCGGACAGCACAGCACCGCACAG 2580

TGCAGGCGGGGCAGGGGGTGTGGCACCGGCCAGGGGTGGCCTGTCGTGTCGTGGCGTGTC 2581 CACCACATCGCACGGCACAGCACAGCACCACCGGCACGAGGAACCAAGGAAAGGAACCAC 2640

GTGGTGTAGCGTGCCGTGTCGTGTCGTGGTGGCCGTGCTCCTTGGTTCCTTTCCTTGGTG casl > MTSVDCTAYGPELRALAA 2641 ACCACCATGACCTCAGTGGACTGCACCGCGTACGGCCCCGAGCTGCGCGCGCTCGCCGCC 2700

TGGTGGTACTGGAGTCACCTGACGTGGCGCATGCCGGGGCTCGACGCGCGCGAGCGGCGG 2 7 01 CGGCTGCCCCGGACCCCCrGGGCCGACCTGTACGCCTTCCTGGACGCCGCGCACACAGCC 2^60

RLPRTPRADLYAFLDAAHTA 2761 GCCGCCTCGCTCCCCGGCGCCCTCGCCACCGCGCTGGACACCTTCAACGCCGAGGGCAGC 2820

A A S LPGALATALDTFNAEGS 2821 GAGGACGGCCATCTGCTGCTGCGCGGCCTCCCGGTGGAGGCCGACGCCGACCTCCCCACC 2880

EDGHLLLRGLPVEADADLPT . . . . Ncol . . 聲 2881 ACCCCGAGCAGCACCCCGGCGCCCGAGGACCGCTCCCTGCTGACCATGGAGGCCATGCTC 2940 一 <

TPSSTPAPEDRSLLTMEAML . Kpnl. . . 2941 GGACTGGTGGGCCGCCGGCTCGGTCTGCACACGGGGTACCGGGAGCTGCGCTCGGGCACG 3000 -25.- ---------^-- (請先閲讀背面之注意事項本頁) 訂 200307041 A7 _B7__ 五、發明説明（>认）

GLVGRRLGLHTGYRELRSGT 3001 GTCTACCACGACGTGTACCCGTCGCCCGGCGCGCACCACCTGTCCTCGGAGACCTCCGAG 3060

VYHDVYPSPGAHHLSSETSE 3061 ACGCTGCTGGAGTTCCACACGGAGATGGCCTACCACCGGCTCCAGCCGAACTACGTCATG 3120

T-LLEFHTEMAYHRLQPNYVM 3121 CTGGCCTGCTCCCGGGCCGACCACGAGCGCACGGCGGCCACACTCGTCGCCTCGGTCCGC 3180

LACSRADHERTAATLVASVR 3181 AAGGCGCTGCCCCTGCTGGACGAGAGGACCCGGGCCCGGCTCCTCGACCGGAGGATGCCC 3240

KALPLLDERTRARLLD RRMP 3241 TGCTGCGTGGATGTGGCCTTCCGCGGCGGGGTGGACGACCCGGGCGCCATCGCCCAGGTC 3300

CCVDVAFRGGVDDPGAIAQV 3301 AAACCGCTCTACGGGGACGCGGACGATCCCTTCCTCGGGTACGACCGCGAGCTGCTGGCG 3360

KPLYGDADDPFLGYDRELLA 3361 CCGGAGGACCCCGCGGACAAGGAGGCCGTCGCCGCCCTGTCCAAGGCGCTCGACGAGGTC 3420

PEDPADKEAVAALSKALDEV 3421 ACGGAGGCGGTGTATCTGGAGCCCGGCGATCTGCTGATCGTCGACAACTTCCGCACCACG 3480

TEAVYLEPGDLLIVDNFRTT 3481 CACGCGCGGACGCCGTTCTCGCCCCGCTGGGACGGGAAGGACCGCTGGCTGCACCGCGTC 3540

HARTPFSPRWDGKDRWLHRV 3541 TACATCCGCACCGACCGCAATGGACAGCTCTCCGGCGGCGAGCGCGCGGGCGACGTCGTC 3600

YIRTDRNGQLSGGERAGDVV A F T P R G * Sad .... 3601 GCCTTCACACCGCGCGGCTGAGCTCCCGGGTfcCGACACCGCGCGGCTGAACCCACGGTCC 3660

CGGAAGTGTG<SCGCGCCGACTCGAGGGCCCAGGCTGTGGCGCGCCGACTTGGGTGCCAGG 3661 GGGGCCCACGGTCCGGCACCGCGCGGCTGAGCCCCCGGGTCCGGCAGCGGGCGGCTGAAC 3720

CCCCGGGTGCCAGGCCGTGGCGCGCCGACTCGGGGGCCCAGGCCGTCGCCCGCCGACTTG -26.- 尺度述川屮家⑹V ( (，NS ) 見枯（210X297公势） ---------^-- (讀先閲讀背面之注意事項再 本頁)

、1T 線 200307041 A7 ____B7五、發明説明（二5 ) 3721 CCCCGCCCCGGGCCACCGCCCGACCGCCCCCGCGCACCGGACGCGCCCGCCTGTACGGCG 3 7 8 0 GGGGCGGGGCCCGGTGGCGGGCTGGCGGGGGCGCGTGGCCTGCGCGGGCGGACATGCCGC 3781 GTCCCGCCCGGGCCCGTACACCTGAAGCGCCCGGCGGACCGCCGCCCCGCCGGGGGACGG 3840 CAGGGCGGGCCCGGGCATGTGGACTTGGCGGGCCGCCTGGCGGCGGGGCGGCCCCCTGCC 、----------------> <---------------- . · 3841 ACAGAGCCGGGTGCGGGAGGACGTCCTCCCGCACCCGGCTCCCACCGTTCCGCACCGACC 3900 TGTCTCGGCCCACGCCCTCCTGCAGGAGGGCGTGGGCCGAGGGTGGCAAGGCGTGGCTGG 3901 GCACCCGACCGTGCCGCAGGCGCCACCGGCACCGCACCGCCCGCGCCGGCAGCCACCACA 3960 CGTGGGCTGGCACGGCGTCCGCGGTGGCCGTGGCGTGGCGGGCGCGGCCGTCGGTGGTGT 3961 GGCGCCACGCCGCCCGCACGGTGCCCGCGCTGCTCAGCCCCCGTCCACCGGGCTGTCCAG 4020 CCGCGGTGCGGCGGGCGTGCCACGGGCGCGACGAGTCGGGGGCAGGTGGCCCGACAGGTC ♦GGDVPSDL 4021 GTCGGCGGCGTCGCGCGGGGGCTACTTGAGGGCCAGCCGCCGGCTGGGGGGCCTGGGGCG 4080 LRRLAGGIFERDAASGGSGA 4081 CTCTACGGGGGTGTGAGGGCCCTAGTGGAGGTCGCTCCGTATGCCGTCGTCTAGCCGGTG 4140 LHGWVGPIVELSAYPLLDAV 4 14 1 GGCGAAGAGCAGGAGCTGCCGCTTTGTGTGCAGGTCCCGCGGGCCGTCGTGGTGCCGGGC 4200 RKEDEVAFCVDLAGPLVVAR 4201 GCGGCACTGCCTCCGGTCGCGGCGGAGCTGCGAGGGGGGCCGGGGCCCACAGCGGGGGTG 4260 ATVSALAAEVSGGAGPTAGV . . Nc〇I . · . · 4 261 TAGGCACAAGAGGGTCCACGCGTGGTACCACTCGTCTAGGCGCCGCGGCCCGGGCCTCTC 4320 DTNEWTRVMTLLDAAGPGSL 4321 CTTCTGGACGAGGGTCTTCGGCCACTCCATGAGGAGCGCCCACCGCTTTGGGTCGAGGGC 4380 fvq^wfgtlyeertaVgler 4 3 81 CACCCGTGCCGCCCGGGTCTTCCTTGCGCTCCAGGGGGTGGGCCGCTTGTGGGCCGGGCG 4440 HARRAWFSRSTGWGAFVRGA -27.- (請先閲讀背而之注意事項再 —士卜_ 本頁

、1T 本紙张尺度迸川屮囡囡凑樣碑（（、NS > Λ4悦招（210X 297公漤〉 / 200307041 A7 B7 五、發明説明Ub ) 4441 GCGGAAGGCGGGGGCGAGGGGCCGCAGCCGCGACTCGCGGCGCCGGTCTGGCCTGTCGTC ;AKRGREGADASLAAALGSLL 4500 4501 CTGGTCCGACACGCCCGACGAGTGGCCGCGGGGCGTCTAGCCCCGCTAGGCCGCGTGGTA VLSHPSSVPAGCIPAIRRVM 4560 4561 GGGGCCTACGCTGTGCCGGGTGACCATCCGCACCCGGCGCGGGTAGCTGGTCGGGCACTG GPHSVAWQYAHAAGHSWGTV 4620 4621 GTCCCGGTCAAGGGCATGGGGGTCGAGGAGCCACTCGTCGGCCACGACGCGGCGCTGTAA LALERVGLEETLLRHQAAVN 4680 4681 CAGGACGCCTCACTAGTCGCCTTTCGCCCTGGGGCTGCCCACCAACGGCCCGCTCGACCT DQPTILPFRSGSPHNGPSSS 4740 4741 CTGGGGCAACGGCTTCTCAGGCCGCCACTGCTGCGTCATGGCGGCCCACAGGTCGCCGTC VGNGFLGATVVCYRRTDLPL 4800 4801 GGGGCGTGGCTAGTCGGTCAGCATGGGCCACACCAGGGCCGGCTTCTTGCTGCCTGTCTC GAG ILWDYGTHDRGFFSPCL 4860 4861 GTGGTGCAAGCAGGGCAGCCGCAAGCCGCACGGCATGTACCGCATTGGCTAGGCCCGCAG VVNTGDANPTGYMAYG I R A D 4920 4921 . . . . . <orfdwnl GGCGTCCTGGAGGGGCAGGTCGTTGCCGTCAAGCAGCTAGAGCTTATACGCCGTAAGGTG 4980 RLVEGDLLPLEDIEFIRCEM 4981 GCGACTGGAGGAACAAGCTAGGGGGGCCTGTTGTCCAGCCAGCACCGGCCTCTGAGTCTC ★ L 5040 5041 GGTCAACCCCCGCTAGAGCCACCGGGTGTCGAGGTCCGACGCGTCGACCTGTAGCACGCC WNPAIETAWIjELSRLQVDHP 5100 5101 CTAGTCGGGCGTCATGACCGTGACCTCGTCTATGAGGCCTAGCACGGCGAGGTGGTCGAA ILGSYQCQLLYEPDHREVLK 5160 5161 GAGCTAGTACGCCAACTACAGCAGGCCCCACGGCTGGGTGAGGTCGGGGGCCAGCTGGTC eimrniddptgvwelgrdvl 5220 -28,- 本紙汰尺度这力】中國ftmM (’NS ) Λ4说招（2丨〇/ 297公釐） 200307041 A7 B7 五、發明説明（>、7 ) 5221 CCAGAACATCAGGCTCGGCTAGCCTGGGCAGAGCGGCCAGCGCGCGTCGCGGAGCCACTT TKYDSGI PGTEGTARLAETF 5280 5281 Ncol ..... CGGGTACCCCGGCTTGGTCAAGAGCTTCTACTTCGGCGGCGGCGCCCTGCGGGTCACCAC GMPGFWNEFI FGGGRSAWHH 5340 5341 CCGGAGCGGCCTCAGGGCCCTCTGGTCCTGCAGGAAGTAGTGGGGCTGGGCGAGCGGGGC AEGSDRSVLVDKMVGVREGR 5400 5401 GGCGTCCCACGGCACCGGGCGGCGGAGCCGGAGGAGGGCCATCTACAGGTAGTCGGCCCG RLTGHGAAEAEERYIDMLRA 5460 5461 CTGCTAGACCAGCAGCCACAAGTAGTCCTAGCCGTGGTGCGGGAGGGCCCGTGTCTTGGC VIQDDTNMLIPVVGERACFR 5520 5521 CTTGCACAGGAGTGACTTCGACTTGCCGACCTTCTGCCCGCCCACCCCCGCGACCATCCC FTDESFS FPQFVPPHPRQYP 5580 5581 GAACCCGCGCTACGGGTGGAGCGCCTACTGCGGCAAGAGCAGCTCCGGGGCCGGCATCGC KPAIGVERIVGNEDLGRGYR 5640 5641 CGCGTGGCGGAGCATCCCCTTGAGGTCCAGGCCGTGGCCCTAGCAGGTGACGAGGGGCCT RVAEYPFELDPVPITWQEGS 5700 5701 CACCCACTTGCAGAGCCAGCAGGTGCGGAAGAACTACTAGAGGGTCACGAGGAGCTTCTC HTFTETTWAKKIIEWHEEFL 5760 5761 CCGTGCTAACGCGGCCAGGGCGAGGGGCCGCAGCCTGTCCCACGGCGGCTGGGGCATGTG ARNRRDREGADSLTGGVGYV 5820 5821 GACGGGGTACTACAGCCGGGTCGCGAAGACCTTGGGCGCGCGCTAGGGCTGCTTCCGCGC QGMIDAWRKQFGRAIGVFAR ♦ 5880 5881 \ CGGGGCCCAGTACACCAGCTCGTAGCGGTCTAGGAGCCGGTCGGCGTCGCCTAACACGTC GRTMHDLMALDEALRLPNHL 5940 5941 GCCGTCCTGCAACCGGTAGACCGGCTGGGCCTACACGGCCCAGACGTACGGCTCCATCTC 6000 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) ’裝_ 、11 -29.- 本紙沭尺度述州屮闽（（，NS )八4说将（210〆297公釐） 200307041 A7 ____B7 五、發明説明U?)

PLVNAMQGVRIHRTQMGLYL 6001 GGGGTCGTACTAGCCCAACAACCTCTGGAGCTTTGGGAGCCACACCTTCACCACGAGCCA 6060

GLMIPNNSVEFGETHFHHET 6061 CTTCCTGTCAGGGGTCATCGGCTCAAGCAGCCGGCGGACGCGGACGGCCCACTCGACGGC 6120

iSLGWYGLEDAAQAQRTLQR 6121 CTCGTACAAGACCATCAAGACGCCTAACTGGGGGCGGTATGGGGCGACCTGGACGCGTAC 6180

LMNQYNQPNVGAMGRQVQAH . . . <orfdwn2 . . 6181 ACTGCCGACCGTTGGCAGATAGAAGAGAATGGACTTCACCCTGGCTCCTCCGGTTCGCGG 6240

TGACGGCTGGCAACCGTCTATCTTCTCTTACCTGAAGTGGGACCGAGGAGGCCAAGCGCC SGVTPLYFLISKM 6241 CGCCCTCCATTGACGTGCGCCGAAAGCGGCTCGACCGTCCCACTCCGCCCTTGAGTTCCG 6300

GCGGGAGGTAACTGCACGCGGCTTTCGCCGAGCTGGCAGGGTGAGGCGGGAACTCAAGGC 6301 TCTGACGCCGCGCCAGTCGGCGGGCCGTCCGCCGGGGTGCCCGCCGGGGTCCGCACCCGC 6360

AGACTGCGGCGCGGTCAGCCGCCCGGCAGGCGGCCCCACGGGCGGCCCCAGGCGTGGGCG 6361 CGGACGGCACGGCGCGCACCGCGCGCGCGGCGCTTCGGGGCACCGGGCTCGACGGGGTGC 6420

GCCTGCCGTGCCGCGCGTGGCGCGCGCGCCGCGAAGCCCCGTGGCCCGAGCTGCCCCACG 6421 TCAGCGGGACGTCCAACGGAAGGCAAGCCCCCGTACCCAGCCTGGTCAAGGCGCTCATCG 6480

AGTCGCCCTGCAGGTTGCCTTCCGTTCGGGGGCATGGGTCGGACCAGTTCCGCGAGTAGC orfdwn3>

. . . . Μ P G 6481 CCATTCCCTGAGGAGGTCCCGCCTTGACCACAGCAATCTCCGCGCTCCCGACCGTGCCCG 6 54 0

GGTAAGGGACTCCTCCAGGGCGGAACTGGTGTCGTTAGAGGCGCGAGGGCTGGCACGGGC 6541 GCTCCGGACTCGAAGCACTGGACCGTGCCACCCTCATCCACCCCACCCTCTCCGGAAACA 6600

SGL^EALDRATLIHPTLSGNT 6601 CCGCGGAACGGATCGTGCTGACCTCGGGGTCCGGCAGCCGGGTCCGCGACACCGACGGCC 6660 aerivltsgsgsrvrdtdgr -30.- 本紙张尺度述川屮阈榡彳(('NS ) ( 210X 297^« ) / (請先閱讀背面之注意事項再本頁} —裝

*1T 200307041 A7 B7 五、發明説明（β ) 6661 GGGAGTACCTGGACGCGAGCGCCGTCCTCGGGGTGACCCAGGTGGGCCACGGCCGGGCCG 6 72 0

EYLDASAVLGVTQVGHGRAE 請 先 閲 讀 背 δ 冬 意 事 項 再 6721 AGCTGGCCCGGGTCGCGGCCGAGCAGATGGCCCGGCTGGAGTACTTCCACACCTGGGGGA 6780

LARVAAEQMARLEYFHTWGT 6 7 81 CGATCAGCAACGACCGGGCGGTGGAGCTGGCGGCACGGCTGGTGGGGCTGAGCCCGGAGC 6840

ISNDRAVELAARLVGLSPEP 6841 CGCTGACCCGCGTCTACTTCACCAGCGGCGGGGCCGAGGGCAACGAGATCGCCCTGCGGA 6900

LTRVYFTSGGAEGNEIALRM 6901 TGGCCCGGCTCTACCACCACCGGCGCGGGGAGTCCGCCCGTACCTGGATACTCTCCCGCC 6960

ARLYHHRRGESARTWILSRR 6961 GGTCGGCCTACCACGGCGTCGGATACGGCAGCGGCGGCGTCACCGGCTTCCCCGCCTACC 7020

SAYHGVGYGSGGVTGFPAYH 訂 7021 ACCAGGGCTTCGGCCCCTCCCTCCCGGACGTCGACTTCCTGACCCCGCCGCAGCCCTACC 7080

QGFGPSLPDVDFLTPPQPYR 7081 GCCGGGAGCTGTTCGCCGGTTCCGACGTCACCGACTTCTGCCTCGCCGAACTGCGCGAGA 714 0

RELFAGSDVTDFCLAELRET . . Sau

7141 CCATCGACCGGATCGGCCCGGAGCGGATCGCGGCGATGATCGGCGAGCCGATC

IDRIGPERIAAMIGEPI -31.- 本紙认尺度这川中阁Wdt彳（rNS ) Λ4規拮（210Χ 297公梦） /

Claims (1)

1. 200307041

   ι· -種克拉㈣’其可由微生物發酵制，該微生物可 由操作一種包含一或多個專一於克拉弗鏈黴菌（s davuligerus)中進行5S克拉凡素（davam)生合成作 用，但並非5R克拉凡素生合成作用所必要之基因且 具有下列序列（SEQ ID No.l) iDNA並將其納入該 微生物中取得，其可產生5R克拉凡素且5S克拉凡素 之產量低或無： Ncol . 1 GGTACCGCCCGCCGCCGACGGGGCCTCGGAGCCGGCCTGGCCACTGGTCCTGGTGGGGCC 6 0 MAPPPQGPAEAPGTVLV'VG 61 accctatcaccgggcggtgggccgcgtcgtctgagggcctgtgcctgggcacccacacgc 12 0 tpyhgavrrllsgsvsghth • <orfup3 . . . 121 GCCTTTCCGGGCCTCCGGCCCAGTGTCGGTGCCCATTGCGCGCCACAGGAACGGGCGCAT 18 0 ★LWPYRATDKGAY ASLGPPRTM • - · - - · 181 TAGCCCCAGGTCTATCTGCTTCCGGGCCACCTGCTCCTTCAGGGCGTGGAGCATCTGGCA 24 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 dpdlyvfarhvlfdrveyvt • · * « 241 CGTGGTCGCGGGCCGCCGGGTGAGCCCCAGTGGGCGGGCGGTGCCGGGCAGGGCCACGAG 300 CWRGAAWEPDGARWPGDRHE • · . · · * 301 TGGCACCCACCACGGGAGGCGCCGCTCCTCAAGCCAGGGCCAGTCTTAGGTCAACTGCCT 360 GHTTGEAALLETGTLIWNVS -32 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） SMIALB87042-div-cclaim/WW 200307041 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 61 GGTGTCTACCACCCACTAGCTCGCCTACCACGGGGGCTCCAGCAGCTTCTCGGCCCGCTA 420 WLHHTISRITGGLDDFLRAI 4 21 GAGCCTGAACGGGGCCCGGTCTGGGGTGAACCCCTTCTTCTTCTGGCGCAGGAGCCGCTT 480 ESKGRALGWKPFFFVADEAF 4 81 CATCAGCTAGCGCCCCCACGGCAGCGACGGCTGCGGCGGCAACAGCTTGCGGAACTTCAT 540 Y D IAPTGDSGVGGNDFAKFY • . · . . < orfup2 541 GCGCCACTACTGGCGGAACGCGACGAGCAGGCAGTATGGCCGGCTACGGTGCCTGTACTT 600 A T IVAKRQEDTMGASAVSM 6 01 TGCTGGAGGTCTCTAAGGCCCACCGACACGACCCCGACGCCTTCCCCACAGGGGGCGCTT 660 661 CCTGCCGCCTGCGGCGCCTGCGGCGCCGGCAGAGGGGCCGCCTGCCCAGGGTCGCAGGAC 7 2 0 721 CTCTCCCGAACCGCCGCCGAACTGCGGCACGACAGGGCGCCGAACGCCTTGCGCTTCATG 7 8 0 781 GCCGGTCGCATGCCCGCAACGTGGCCTGCACATGCGGCCAGCCCTGGGGAGCATGGGGGC 840 841 CTCGGCCGGCTGGGGCCGCCGAGGCCCCCATGCCTGCGCGGCCTGGCCGGGCTCGCTCGG 900 901 CCTGCCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCTGCCTGGCCTGCC 960 961 ACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCTGCCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCC 1020 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1021 GTGCGGCCTGCCCAGTCAACGGCTAGTACCGCTCGTTACGGCCCCACATGGCGAGGGGCC 1080 ★NGIMALLAPTYREG 1081 TGTGGCCCACCCTCTAGCGCCGGCAGTGGAGGCGCTCCCTGGCCAGCAGGTCGGCCTAGC 1140 SVPHS IAATVEALSRDDLRI -33 -本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307041 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1141 TCCGCCGCCGCTCTAACAGGCGCTCTACCCGGCCCAAGCGCCACGGGCCCTAGCCCTGCT SAAALNDALHAPNATGPIPV 1200 1201 GCAGGAGCGGGGCCACCACGTCGGTCCGCTCGCGCTCGACACGGTCCCAGTCGGGGTCTG VDEGRHHLWALALQALTLGL 1260 1261 GCAGGCGCTGGCCCGCGTCGGCCACGTCGTTGCTCGCCAACGCGCGCTCCCGGCCTCGCG GDAVPRLRHLLSRNRALAPA 1320 1321 ACTTGGCCCCGACCGGGGCCGCCTTCAGGAGCAGGGGGTCTAGCAGCCACCACGCCTACC SFRPQGRRFDEDGLDDTTRI 1380 1381 ACGGCCACTCTTTTGGGGCAGGGTCTCCCCGCATTCGCTGCTAGGGCTAGGGGTCGAGGG TGTLFGRGLPAYAVIGIGLE 1440 1441 CCGTCTGCCCGTGGTGGAGCAGGAGCTAGGGCGCGCTGGTGTCCGAGGTGAGCGAGACGT RCVPVVEDEIGRSWLSWESQ 1500 1501 GGCGGCAGTGGCCCACGTGGCGCAGGCGGGCCGCGTCGCACCGGCGCCTCCCGAGCCTCT VATVPHVADARRLTAA SPES 1560 1561 暑 脅 · * * CTGGCTCGGACGCCTGGAACGGGAGCGCGTGGTCGAGCCGGTGGCGTGGGTGCCAGAGGA LGLRRVKGERVLEAVAGVTE 1620 1621 · · · * ♦ GCTAGCCGTGGCGGCCCAGGCAGGTCACGACCATCATGTCCAGCTACGCCAGCCACGGCT E I PVAPDTWHQYYLDIRDTG 1680 1681 • . · · · * CTGCTGCGTCCCTGGCAAGCGTCCGGCGCGCCTGCATCCTGCCGAGCGGCGTGTTCGGGA LRRLSRECAARVYSPEGCLG 1740 17 41 • · * * · CCCTCCGCGGCAGCCTGCTCGCGTGGTACGGCTTGAACCACCGCTAGTCGTGGAGCAGGG QSAGDSSRVMGFKTAILVED 1800 -34 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307041 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1801 CCGCCGGGCGCTGGCGGGCAGGCTCGTCGAGGAGTGGCCGCGGCTCGGGGACCTGCAGCC 1860 RRGAVARGLLEEGAGLGQVD 1861 GCCACAGGTCGTCCCACTGGGGCCGCAGCTGCCGCCGCGCCTACCACCGGCAGCGGGCCC 1920 ATDLLTVGADVAARITATAR 1921 GCGCCAGGCCCGCAGGCATCTTCAGCCACCAGCCGTCCGTCGGCTCGGGGACCCGTGACT 1980 ARDPRGYFDTTPLCGLGQAS 1981 GGCCTTCCAGGGCGTCCCGCGCCTGGCCGCCTGCGCCTTGGCGCCGCCTGTGCCTTGGCC 2040 VPLDRLARVPPRPVAASVSG . . <orfupl . . . 2041 CCGGGGACTCGGGCGGAGAGCGGGACATACGGAACCTCCACAGGCGGAGCCGGGAACGGG 2100 GGCCCCTGAGCCCGCCTCTCGCCCTGTATGCCTTGGAGGTGTCCGCCTCGGCCCTTGCCC APSEPPSRSM 2101 ACGAGGGCGAGGACGGGACGGAACGAAGGAGAGGACGGGACGGACAGCACGGACGGGACG 2160 TGCTCCCGCTCCTGCCCTGCCTTGCTTCCTCTCCTGCCCTGCCTGTCGTGCCTGCCCTGC 2161 GACGGAACGGAGTCGGGAACCGGGGGGGGTGACCGGAACCGGGCCGTCCTTGGCCCTCCC 2220 CTGCCTTGCCTCAGCCCTTGGCCCCCCCCACTGGCCTTGGCCCGGCAGGAACCGGGAGGG 2221 CCGTCCTCCCCGCCATCCGCCGTTCTCCCCCGTTCCCTCTCCCGTCCTCCAGCCAACACC 2280 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GGCAGGAGGGGCGGTAGGCGGCAAGAGGGGGCAAGGGAGAGGGCAGGAGGTCGGTTGTGG 22 81 GCCGCCCTTTCCAAGCGCTTGACACGGCACCGACAGCCGCCGCCGGGCGCCCGATGGGGA 2340 CGGCGGGAAAGGTTCGCGAACTGTGCCGTGGCTGTCGGCGGCGGCCCGCGGGCTACCCCT 2341 CCCGTGCCCGCCGGTGAGCGGCGGTGAGCGCCGGTACGGGACCCCACGCGCCGCCGCCCG 2400 GGGCACGGGCGGCCACTCGCCGCCACTCGCGGCCATGCCCTGGGGTGCGCGGCGGCGGGC -35 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200307041 六、申請專利範圍 2401 GGCGCCCGCCAGGGCCCGCGCGGCCACCCCGGCCCGCCCCGGCCGGAGCGGCGATCCGGG 2460 CCGCGGGCGGTCCCGGGCGCGCCGGTGGGGCCGGGCGGGGCCGGCCTCGCCGCTAGGCCC 2461 CCGCTCGCTGCAAGAGGAACATCCACAGCCGCACAAGGAGCGCTCCGCACAGTGGGCACC 2520 GGCGAGCGACGTTCTCCTTGTAGGTGTCGGCGTGTTCCTCGCGAGGCGTGTCACCCGTGG 2521 ACGTCCGCCCCGTCCCCCACACCGTGGCCGGTCCCCACCGGACAGCACAGCACCGCACAG 2580 TGCAGGCGGGGCAGGGGGTGTGGCACCGGCCAGGGGTGGCCTGTCGTGTCGTGGCGTGTC 2581 CACCACATCGCACGGCACAGCACAGCACCACCGGCACGAGGAACCAAGGAAAGGAACCAC 2640 GTGGTGTAGCGTGCCGTGTCGTGTCGTGGTGGCCGTGCTCCTTGGTTCCTTTCCTTGGTG casl> MTSVDCTAYGPELRALAA 2641 ACCACCATGACCTCAGTGGACTGCACCGCGTACGGCCCCGAGCTGCGCGCGCTCGCCGCC 2700 TGGTGGTACTGGAGTCACCTGACGTGGCGCATGCCGGGGCTCGACGCGCGCGAGCGGCGG 2701 CGGCTGCCCCGGACCCCCCGGGCCGACCTGTACGCCTTCCTGGACGCCGCGCACACAGCC 2760 RLPRTPRADLYAFLDAAHTA 2761 GCCGCCTCGCTCCCCGGCGCCCTCGCCACCGCGCTGGACACCTTCAACGCCGAGGGCAGC 2820 A A S LPGALATALDTFNAEGS 2821 GAGGACGGCCATCTGCTGCTGCGCGGCCTCCCGGTGGAGGCCGACGCCGACCTCCCCACC 2880 EDGHLLLRGLPVEADADLPT . . . . Ncol . . 2881 ACCCCGAGCAGCACCCCGGCGCCCGAGGACCGCTCCCTGCTGACCATGGAGGCCATGCTC 2940 TPS STPAPEDRSLLTMEAML . . Kpnl. . . 2941 GGACTGGTGGGCCGCCGGCTCGGTCTGCACACGGGGTACCGGGAGCTGCGGTCGGGCACG 3000 -36 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X297公釐）

   200307041 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GLVGRRLGLHTGYRELRSGT 3001 GTCTACCACGACGTGTACCCGTCGCCCGGCGCGCACCACCTGTCCTCGGAGACCTCCGAG VYHDVYPSPGAHHLSSETSE 3060 3061 ACGCTGCTGGAGTTCCACACGGAGATGGCCTACCACCGGCTCCAGCCGAACTACGTCATG TLLEFHTEMAYHRLQPNYVM 3120 3121 CTGGCCTGCTCCCGGGCCGACCACGAGCGCACGGCGGCCACACTCGTCGCCTCGGTCCGC LACSRADHERTAATLVASVR 3180 3181 AAGGCGCTGCCCCTGCTGGACGAGAGGACCCGGGCCCGGCTCCTCGACCGGAGGATGCCC KALPLLDERTRARLLDRRMP 3240 3241 TGCTGCGTGGATGTGGCCTTCCGCGGCGGGGTGGACGACCCGGGCGCCATCGCCCAGGTC CCVDVAFRGGVDDPGAIAQV 3300 3301 AAACCGCTCTACGGGGACGCGGACGATCCCTTCCTCGGGTACGACCGCGAGCTGCTGGCG KPLYGDADDPFLGYDRELLA 3360 3361 CCGGAGGACCCCGCGGACAAGGAGGCCGTCGCCGCCCTGTCCAAGGCGCTCGACGAGGTC PEDPADKEAVAALSKALDEV 3420 3421 ACGGAGGCGGTGTATCTGGAGCCCGGCGATCTGCTGATCGTCGACAACTTCCGCACCACG TEAVYLEPGDLLIVDNFRTT 3480 3481 CACGCGCGGACGCCGTTCTCGCCCCGCTGGGACGGGAAGGACCGCTGGCTGCACCGCGTC HARTPFSPRWDGKDRWLHRV 3540 3541 TACATCCGCACCGACCGCAATGGACAGCTCTCCGGCGGCGAGCGCGCGGGCGACGTCGTC YIRTDRNGQLSGGERAGDVV 3600 -37 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307041 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 A F T P R G * SacI .... 3601 GCCTTCACACCGCGCGGCTGAGCTCCCGGGTCCGACACCGCGCGGCTGAACCCACGGTCC 3660 CGGAAGTGTGGCGCGCCGACTCGAGGGCCCAGGCTGTGGCGCGCCGACTTGGGTGCCAGG 3661 GGGGCCCACGGTCCGGCACCGCGCGGCTGAGCCCCCGGGTCCGGCAGCGGGCGGCTGAAC 3720 CCCCGGGTGCCAGGCCGTGGCGCGCCGACTCGGGGGCCCAGGCCGTCGCCCGCCGACTTG 3721 CCCCGCCCCGGGCCACCGCCCGACCGCCCCCGCGCACCGGACGCGCCCGCCTGTACGGCG 3 78 0 GGGGCGGGGCCCGGTGGCGGGCTGGCGGGGGCGCGTGGCCTGCGCGGGCGGACATGCCGC 3781 GTCCCGCCCGGGCCCGTACACCTGAAGCGCCCGGCGGACCGCCGCCCCGCCGGGGGACGG 3 84 0 CAGGGCGGGCCCGGGCATGTGGACTTCGCGGGCCGCCTGGCGGCGGGGCGGCCCCCTGCC ----------------> <---------------- . . 3841 ACAGAGCCGGGTGCGGGAGGACGTCCTCCCGCACCCGGCTCCCACCGTTCCGCACCGACC 3 900 TGTCTCGGCCCACGCCCTCCTGCAGGAGGGCGTGGGCCGAGGGTGGCAAGGCGTGGCTGG 3901 GCACCCGACCGTGCCGCAGGCGCCACCGGCACCGCACCGCCCGCGCCGGCAGCCACCACA 3960 CGTGGGCTGGCACGGCGTCCGCGGTGGCCGTGGCGTGGCGGGCGCGGCCGTCGGTGGTGT 3961 GGCGCCACGCCGCCCGCACGGTGCCCGCGCTGCTCAGCCCCCGTCCACCGGGCTGTCCAG 4020 CCGCGGTGCGGCGGGCGTGCCACGGGCGCGACGAGTCGGGGGCAGGTGGCCCGACAGGTC ★GGDVPSDL 4021 GTCGGCGGCGTCGCGCGGGGGCTACTTGAGGGCCAGCCGCCGGCTGGGGGGCCTGGGGCG 4080 LRRLAGGIFERDAASGGSGA 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4081 CTCTACGGGGGTGTGAGGGCCCTAGTGGAGGTCGCTCCGTATGCCGTCGTCTAGCCGGTG 4140 LHGWVGPIVELSAYPLLDAV 4141 GGCGAAGAGCAGGAGCTGCCGCTTTGTGTGCAGGTCCCGCGGGCCGTCGTGGTGCCGGGC 4200 RKEDEVAFCVDLAGPLVVAR -38 -本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307041 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4201 GCGGCACTGCCTCCGGTCGCGGCGGAGCTGCGAGGGGGGCCGGGGCCCACAGCGGGGGTG ATVSALAAEVSGGAGPTAGV . . Ncol .... 4260 4261 TAGGCACAAGAGGGTCCACGCGTGGTACCACTCGTCTAGGCGCCGCGGCCCGGGCCTCTC DTNEWTRVMTLLDAAGPGSL 4320 4321 CTTCTGGACGAGGGTCTTCGGCCACTCCATGAGGAGCGCCCACCGCTTTGGGTCGAGGGC FVQEWFGTLYEERTAFGLER 4380 4381 CACCCGTGCCGCCCGGGTCTTCCTTGCGCTCCAGGGGGTGGGCCGCTTGTGGGCCGGGCG HARRAWFSRSTGWGAFVRGA 4440 4441 GCGGAAGGCGGGGGCGAGGGGCCGCAGCCGCGACTCGCGGCGCCGGTCTGGCCTGTCGTC AKRGREGADASLAAALGSLL 4500 4501 CTGGTCCGACACGCCCGACGAGTGGCCGCGGGGCGTCTAGCCCCGCTAGGCCGCGTGGTA VLSHPSSVPAGCIPAIRRVM 4560 4561 GGGGCCTACGCTGTGCCGGGTGACCATCCGCACCCGGCGCGGGTAGCTGGTCGGGCACTG GPHSVAWQYAHAAGMSWGTV 4620 4621 GTCCCGGTCAAGGGCATGGGGGTCGAGGAGCCACTCGTCGGCCACGACGCGGCGCTGTAA LALERVGLEETLLRHQAAVN 4680 4681 CAGGACGCCTCACTAGTCGCCTTTCGCCCTGGGGCTGCCCACCAACGGCCCGCTCGACCT DQPTILPFRSGSPHNGPSSS 4740 4741 CTGGGGCAACGGCTTCTCAGGCCGCCACTGCTGCGTCATGGCGGCCCACAGGTCGCCGTC VGNGFLGATVVCYRRTDLPL 4800 -39 -

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307041 六、申請專利範圍 4801 GGGGCGTGGCTAGTCGGTCAGCATGGGCCACACCAGGGCCGGCTTCTTGCTGCCTGTCTC 4860 GAGILWDYGTHDRGFFSPCL 4861 GTGGTGCAAGCAGGGCAGCCGCAAGCCGCACGGCATGTACCGCATTGGCTAGGCCCGCAG 4920 VVNTGDANPTGYMAYGIRAD . · . . <orfdwnl 4921 GGCGTCCTGGAGGGGCAGGTCGTTGCCGTCAAGCAGCTAGAGCTTATACGCCGTAAGGTG 4980 RLVEGDLLPLEDIEFIRCEM 4981 GCGACTGGAGGAACAAGCTAGGGGGGCCTGTTGTCCAGCCAGCACCGGCCTCTGAGTCTC 5040 ★ L 5041 GGTCAACCCCCGCTAGAGCCACCGGGTGTCGAGGTCCGACGCGTCGACCTGTAGCACGCC 5100 W N P A I ETAWLELSRLQVDHP 5101 CTAGTCGGGCCTCATGACCGTGACCTCGTCTATGAGGCCTAGCACGGCGAGGTGGTCGAA 5160 ILGSYQCQLLYEPDHREVLK 5161 GAGCTAGTACGCCAACTACAGCAGGCCCCACGGCTGGGTGAGGTCGGGGGCCAGCTGGTC 5220 EIMRNIDDPTGVWELGRDVL 5221 CCAGAACATCAGGCTCGGCTAGCCTGGGCAGAGCGGCCAGCGCGCGTCGCGGAGCCACTT 5280 TKYDSGIPGTEGTARLAETF 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Ncol ...... 5281 CGGGTACCCCGGCTTGGTCAAGAGCTTCTACTTCGGCGGCGGCGCCCTGCGGGTCACCAC 5 3 4 0 GMPGFWNEFI FGGGRSAWHH 5341 CCGGAGCGGCCTCAGGGCCCTCTGGTCCTGCAGGAAGTAGTGGGGCTGGGCGAGCGGGGC 5400 AEGSDRSVLVDKMVGVREGR -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X297公釐） 8 8 8 8 A B c D 200307041 六、申請專利範圍 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5401 GGCGTCCCACGGCACCGGGCGGCGGAGCCGGAGGAGGGCCATCTACAGGTAGTCGGCCCG RLTGHGAAEAEERYIDMLRA 5460 5461 CTGCTAGACCAGCAGCCACAAGTAGTCCTAGCCGTGGTGCGGGAGGGCCCGTGTCTTGGC VIQDDTNMLI PVVGERACFR 5520 5521 CTTGCACAGGAGTGACTTCGACTTGCCGACCTTCTGCCCGCCCACCCCCGCGACCATCCC FTDESFSFPQFVPPHPRQYP 5580 5581 GAACCCGCGCTACGGGTGGAGCGCCTACTGCGGCAAGAGCAGCTCCGGGGCCGGCATCGC KPAIGVERIVGNEDLGRGYR 5640 5641 CGCGTGGCGGAGCATCCCCTTGAGGTCCAGGCCGTGGCCCTAGCAGGTGACGAGGGGCCT RVAEYPFELDPVPITWQEGS 5700 57 01 CACCCACTTGCAGAGCCAGCAGGTGCGGAAGAACTACTAGAGGGTCACGAGGAGCTTCTC HTFTETTWAKKIIEWHEEFL 5760 5 7 61 CCGTGCTAACGCGGCCAGGGCGAGGGGCCGCAGCCTGTCCCACGGCGGCTGGGGCATGTG ARNRRDREGADSLTGGVGYV 5820 5821 GACGGGGTACTACAGCCGGGTCGCGAAGACCTTGGGCGCGCGCTAGGGCTGCTTCCGCGC QGMIDAWRKQFGRAIGVFAR 5880 5881 CGGGGCCCAGTACACCAGCTCGTAGCGGTCTAGGAGCCGGTCGGCGTCGCCTAACACGTC GRTMHDLMALDEALRLPNHL 5940 5941 GCCGTCCTGCAACCGGTAGACCGGCTGGGCCTACACGGCCCAGACGiACGGCTCCATCTC PLVNAMQGVRIHRTQMGLYL 6000 6001 GGGGTCGTACTAGCCCAACAACCTCTGGAGCTTTGGGAGCCACACCTTCACCACGAGCCA GLMI PNNSVEFGETHFHHET 6060 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307041 A8 B8 C8 D8_ 六、申請專利範圍 6061 CTTCCTGTCAGGGGTCATCGGCTCAAGCAGCCGGCGGACGCGGACGGCCCACTCGACGGC 6120 F S LGWYGLEDAAQAQRTLQR 6121 CTCGTAC7VAGACCATCAAGACGCCTAACTGGGGGCGGTATGGGGCGACCTGGACGCGTAC 6180 LMNQYNQPNVGAMGRQVQAH . <orfdwn2 · . 6181 ACTGCCGACCGTTGGCAGATAGAAGAGAATGGACTTCACCCTGGCTCCTCCGGTTCGCGG 6240 TGACGGCTGGC7VACCGTCTATCTTCTCTTACCTGAAGTGGGACCGAGGAGGCCAAGCGCC SGVTPLYFLISKM 6241 CGCCCTCCATTGACGTGCGCCGAAAGCGGCTCGACCGTCCCACTCCGCCCTTGAGTTCCG 6300 GCGGGAGGTAACTGCACGCGGCTTTCGCCGAGCTGGCAGGGTGAGGCGGGAACTCAAGGC 63 01 TCTGACGCCGCGCCAGTCGGCGGGCCGTCCGCCGGGGTGCCCGCCGGGGTCCGCACCCGC 6360 AGACTGCGGCGCGGTCAGCCGCCCGGCAGGCGGCCCCACGGGCGGCCCCAGGCGTGGGCG 6361 CGGACGGCACGGCGCGCACCGCGCGCGCGGCGCTTCGGGGCACCGGGCTCGACGGGGTGC 6420 GCCTGCCGTGCCGCGCGTGGCGCGCGCGCCGCGAAGCCCCGTGGCCCGAGCTGCCCCACG 6 4 21 TCAGCGGGACGTCCAACGGAAGGCAAGCCCCCGTACCCAGCCTGGTCAAGGCGCTCATCG 6480 AGTCGCCCTGCAGGTTGCCTTCCGTTCGGGGGCATGGGTCGGACCAGTTCCGCGAGTAGC orfdwn3> . . . . Μ P G 6481 CCATTCCCTGAGGAGGTCCCGCCTTGACCACAGCAATCTCCGCGCTCCCGACCGTGCCCG 6540 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GGTAAGGGACTCCTCCAGGGCGGAACTGGTGTCGTTAGAGGCGCGAGGGCTGGCACGGGC 6541 GCTCCGGACTCGAAGCACTGGACCGTGCCACCCTCATCCACCCCACCCTCTCCGGAAACA 6600 SGLEALDRATLIHPTLSGNT 6601 CCGCGGAACGGATCGTGCTGACCTCGGGGTCCGGCAGCCGGGTCCGCGACACCGACGGCC 6660 AERIVLTSGSGSRVRDTDGR -42 -本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x297公釐） 200307041 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 6 61 GGGAGTACCTGGACGCGAGCGCCGTCCTCGGGGTGACCCAGGTGGGCCACGGCCGGGCCG 6720 EYLDASAVLGVTQVGHGRAE 6 7 21 AGCTGGCCCGGGTCGCGGCCGAGCAGATGGCCCGGCTGGAGTACTTCCACACCTGGGGGA 6 7 8 0 LARVAAEQMARLEYFHTWGT 6 7 81 CGATCAGCAACGACCGGGCGGTGGAGCTGGCGGCACGGCTGGTGGGGCTGAGCCCGGAGC 6 8 4 0 I SNDRAVELAARLVGLS Ρ ,Ε P 6 841 CGCTGACCCGCGTCTACTTCACCAGCGGCGGGGCCGAGGGCAACGAGATCGCCCTGCGGA 6900 LTRVYFTSGGAEGNEIALRM 6 901 TGGCCCGGCTCTACCACCACCGGCGCGGGGAGTCCGCCCGTACCTGGATACTCTCCCGCC 6960 ARLYHHRRGESARTWILSRR 6 961 GGTCGGCCTACCACGGCGTCGGATACGGCAGCGGCGGCGTCACCGGCTTCCCCGCCTACC 7020 SAYHGVGYGSGGVTGFPAYH 7 021 ACCAGGGCTTCGGCCCCTCCCTCCCGGACGTCGACTTCCTGACCCCGCCGCAGCCCTACC 7 0 8 0 QGFGPSLPDVDFLTPPQPYR 7 081 GCCGGGAGCTGTTCGCCGGTTCCGACGTCACCGACTTCTGCCTCGCCGAACTGCGCGAGA 714 0 RELFAGSDVTDFCLAELRET • . . . Sau 7141 CCATCGACCGGATCGGCCCGGAGCGGATCGCGGCGATGATCGGCGAGCCGATC IDRIGPERIAAMIGEPI -43 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

   計 線

   200307041 A8 B8 C8 _D8_ 六、申請專利範圍 < 2. 根據申請專利範圍第1項之克拉弗酸，其係呈其鉀鹽 形式。 3. —種組合物，其包含根據申請專利範圍第2項之克拉 弗酸鉀與yS-内醯胺抗生素組合。 4. 根據申請專利範圍第3項之組合物，其中/5-内醯胺抗 生素為羥胺苄青黴素。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200307041 柒、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： (無） 捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）