JPH11507546A - クラバム抗生物質の産生を強化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はセファロスポリン経路においてＬ−リジンのＬ−α−アミノアジピン酸への変換を妨げることにより、クラバム経路またはその一部およびセファロスポリン経路またはその一部の両方の経路を有する生物により産生されるクラバムの量を増加させる方法を提供する。欠陥ＬＡＴ（リジンアミノトランスフェラーゼ）遺伝子を含有するプラスミドおよびかかるプラスミドを含有する生物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 クラバム抗生物質の産生を強化する方法 本発明は、強いβ−ラクタマーゼ阻害活性を有する化合物を含め、増殖性生物 からのクラブラン酸および他のクラバムの産生を強化する方法に関する。本発明 はまた、多量のこれらのクラバムを産生する能力を有する新規な生物を提供する ものである。 微生物、特にストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）種は、クラブラン酸およ び他のクラバム（clavam）、セファロスポリン、セファマイシン、ツニカマイシ ン、ホロマイシンおよびペニシリンを含め、多くの抗生物質を産生する。これら 抗生物質の絶対的および相対的産生量の操作にはかなりの興味がもたれており、 そのためこれらの経路の代謝および遺伝的機構を調査することに多大な研究がな されてきた［Ｄomain,Ａ.Ｌ．(1990)「β−ラクタム抗生物質の生合成および調 整」：50年間のペニシリン使用、歴史および傾向］。代謝経路の種々の工程に関 与する酵素の多くおよびこれら酵素をコードする遺伝子が知られている。 例えば、ストレプトマイセス・クラブリゲラス（Ｓtreptomyces vlavuligerus ）のセファロスポリン代謝経路において、３種の重要な抗生物質、すなわち、ペ ニシリン、Ｎ,Ｏ−カルバモイルデアセチルセファロスポリンＣおよびセファロ マイシンＣを産生できる。これらの抗生物質はトリペプチド先駆体ｄ−（Ｌ−ａ −アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン（ＡＣＶ）より合成される ［Ｊ.Ｆ.Ｍartinら（1990），「ペニシリンおよびセファロスポリン生合成に関 与する遺伝子の菌株群」：50年間のペニシリン使用、歴史および傾向］。 ストレプトマイセス・クラブリゲラスのペニシリンおよびセファロスポリンの 両方の生合成において認識されている第１工程には、酵素、リジン−ε−アミノ トランスフェラーゼ（ＬＡＴ）が関与する。ストレプトマイセス・クラブリゲル スｌａｔ遺伝子のヌクレオチド配列および誘導アミノ酸配列が知られている［Ｔ obin,Ｍ.Ｂ.ら、（1991）Ｊ.Ｂacteriol.，173,6223-6229］。 米国特許第5474912号（1995年12月12日公開）は、一またはそれ以上のＬＡＴ 遺伝子のコピーを生物の染色体に挿入することでストレプトマイセス・クラブリ ゲラスにて多量のセファロスポリンを生産する方法を記載する。β−ラクタム抗 生物質に対する作用が特許請求されているが、ストレプトマイセス・クラブリゲ ラスにおけるセファロスポリン経路の産物についての効果が開示されているにす ぎず、クラバム産生についての効果は何も測定または記載されていない。 クラブラン酸および他のクラバムは、３炭素化合物［Ｔownsend,Ｃ.Ａ.および Ｈo,Ｍ.Ｆ.（1985）Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc．107（4），1066-1068およびＥlson,Ｓ. Ｗ.およびＯliver,Ｒ.Ｓ.（1978）Ｊ.Ａntibiotics XXXI Ｎo.６，568］および アルギニン［Ｖa1entine,Ｂ.Ｐ.ら（1993）Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc．15，1210-1211 ］より誘導される。 セファロスポリンおよびクラブラン酸の生合成を決定する遺伝子菌株群は、ス トレプトマイセス・クラブリゲラス染色体上で相互に隣接しているが[Ｗard,Ｊ. Ｍ.およびＨodgson,Ｊ.Ｅ.（1993）ＦＥＭＳ Ｍicrobiol.Ｌett．110，239-242] 、共通する生合成構造遺伝子を共有しない。したがって、その経路の間に明らか な生合成の関係はない。 本発明者らは、意外にも、生物のセファロスポリン経路の少なくとも一工程が 妨げられると、生物により産生される量のクラバムが増加することを見いだした 。 したがって、本発明は、セファロスポリン経路においてＬ−リジンのＬ−α− アミノアジピン酸への変換を妨げることにより、クラバム経路またはその一部と セファロスポリン経路またはその一部の両方の経路を有する生物により産生され るクラバムの量を増加させる方法を提供するものである。 クラバムはβ−ラクタマーゼ阻害活性を有することが好ましく、該クラバムは クラブラン酸であることがさらに好ましい。 本発明の好ましい態様において、Ｌ−リジンのＬ−α−アミノアジピン酸に変 換する方法は、ＬＡＴ酵素またはｌａｔ遺伝子の機能を変えることにより妨げら れる。例えば、酵素を（例えば、非代謝性基質またはアナログを用いることによ り）阻害さもなければ遮断することができる。 適当には、ＬＡＴ遺伝子は、公開されている配列に基づき、従来のクローニン グ方法（ＰＣＲなど）により得ることができる。該遺伝子の機能は、遺伝子分裂 ［Ａidoo,Ｋ.Ａ.ら（1994）、Gene，147，41-46］、任意突然変異誘発、部位定 方向性突然変異およびアンチセンスＲＮＡなどの技術により妨げ、または排除／ 削除することができる。 Ｍahro,Ｂ.およびＤemain,Ａ.（1987）、Ａppl.Ｍicrobiol.Ｔechnol．27，27 2-275は、セファロスポリンを産生せず、ｌａｔ、ａｃｖｓおよびｉｐｎｓ酵素 活性を欠いていると証明されたストレプトマイセス・クラブリゲラスの自発性突 然変異株を記載した。Ｈ.Ｙuら（1994）［Ｍicrobiology，140，3367-3377］は これら３種の酵素の活性が突然変異体を完全なＬＡＴ遺伝子（ｌａｔ）および上 半分のａｃｖｓ遺伝子（ｐｃｂＡＢ）をコードするＤＮＡのフラグメントで形質 転換することにより回収できることを明らかにした。しかし、クラブラン酸また は他のクラバムの産生に関するこの突然変異体の作用について何の教示もない。 本発明のさらなる態様において、ｌａｔ遺伝子、好ましくは以下に記載のプラ スミドｐＣＦ００２およびｐ４８７ｌａｔａｐを含有するプラスミドが提供され る。適当には、該プラスミドを用いてストレプトマイセス・クラブリゲラス・ｅ ｇ株ＡＴＣＣ２７０６４（ストレプトマイセス・クラブリゲラスＮＲＲＬ３５８ ５の同等物）などの生物を形質転換する。 本発明のさらなる態様において、欠陥ｌａｔ遺伝子を含有する生物が提供され る。 実施例 実施例中の方法はすべて、特記しない限り、Ｓambrook，Ｊ.、Ｆritsch，Ｅ. Ｆ.およびＭaniatis、Ｔ.（1989）Ｍolecular Ｃloning Ａ Ｌaboratory Ｍanua l（第２版）にあるとおりである。 実施例１：分裂したｌａｔ遺伝子のアセンブリー化 該方法を開始するのに、ｐＡ２／１１９（Ａ.Ｋ.Ｐetrichの論文（1993）；ス トレプトマイセス・クラブリゲラスのイソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子の転 写分析；アルバータ大学）をＫpnＩで消化し、その０.６８８ｋｂ挿入体を遊 離させた。消化物をアガロースゲル電気泳動により分画し、０.６８８ｋｂのフ ラグメントを溶出させてクレノー処理に付した。ついで、その平滑末端フラグメ ントをＨincII消化ｐＵＣ１１９にライゲーションし、それを用いてイー・コリ （Ｅ.coli）ＭＶ１１９３をアンピシリン耐性に形質転換させた。以下、ｐＥＬ Ｋ０４４と称される組換えプラスミドを含有する形質転換体を単離し、その同一 性を制限分析により確認した。ｐＥＬＫ００４をＢamＨＩおよびＫpnＩで消化し 、ＢamＨＩ−ＫpnＩ ａｐｒ^r−フラグメントにライゲーションした。そのライゲ ーション混合物を用いてイー・コリＭＶ１１９３をアプラマイシン耐性に形質転 換させた。得られた形質転換体をスクリーニングに付し、０.６８８ｋｂの３’ −ｌａｔフラグメントの上流で、逆方向に挿入された、ａｐｒ^r−フラグメント を含有する組換えプラスミドｐＣＦ００１Ａを単離し、制限分析により確認した 。 次の工程においては、ｐＡ２／１１９をＰＣＲ反応にて鋳型として用い、ｌａ ｔ遺伝子の上流領域をｐＵＣ１１９にサブクローンさせた。ＤＮＡプライマーは 、Ｍ１３逆スクリーニングプライマーおよびＤＮＡ配列５’ＣＡＴＧＣＧＧＡＴ ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＡＴＡＴＧＣ−３’を有するプライマーであり、標 準条件［ＤＮＡ増幅についてのＰＣＲ技術の原理および適用、Ｈ Ａ Ｅhrlich編 （1989）］および９２℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で６０秒のサイ クルの下で使用した。ＰＣＲ産物を１.２５％アガロースゲルのゲル電気泳動で 単離した。増幅したＤＮＡフラグメントをゲル精製し、制限エンドヌクレアーゼ ＥcoＲ１およびＢamＨ１で消化し、同様に消化したｐＵＣ１１９にライゲーショ ンした。その後、イー・コリＭＶ１１９３形質転換体を制限エンドヌクレアーゼ 処理により分析し、つづいてゲル電気泳動およびＤＮＡ配列分析に付し、正しい フラグメントがクローンされ、意図しない突然変異がＰＣＲ増幅の間に導入され ていないことを確認した。ｌａｔの上流にＤＮＡ領域を有するｐＵＣ１１９構築 物をｐＬ／１１９と命名した。 次の工程では、ｐＬ１／１１９をＥcoＲ１およびＫpn１で消化し、その１.０ ８ｋｂフラグメントを遊離させた。消化物をアガロースゲル電気泳動で分画し、 その１.０８ｋｂフラグメントを溶出し、ＥcoＲ１およびＫpn１−消化ｐＣＦ０ １１Ａにライゲーションした。そのライゲーション混合物を用い、ＭＶ１１９３ をアパラマイシン耐性に形質転換させた。得られた形質転換体をスクリーニング に付し、共に同方向であるが、逆に配向されたａｐｒ^rフラグメントで相互に分 けられている、３’−ｌａｔフラグメントの上流に１.０８ｋｂの５’−ｌａｔ フラグメントを有する組換えプラスミドｐＣＦ００２［図１（ａ）］を含有する クローンを単離した。ｐＣＦ００２の同定は制限分析により確認した；その結果 より、ａｐｒ^rフラグメントが、開始コドンから８５２ｂｐおよび停止コドンか ら５２１ｂｐにあるｌａｔ遺伝子の中の、Ｋpn１部位で挿入されたことがわかっ た。 実施例２：分裂したｌａｔ遺伝子のストレプトマイセス・クラブリゲラスへの導 入 ｐＣＦ００２をＥcoＲ１およびＨindIIIで消化することで分裂したｌａｔ遺伝 子をサブクローンし（分裂したｌａｔ遺伝子を有するＤＮＡフラグメントを遊離 させる）、その消化物を同様に消化したｐＩＪ４８６にライゲーションし、ｐ４ ８６ｌａｔａｐ［図１（ｂ）］を形成させた。そのライゲーション混合物を用い 、エス・リビダンス（Ｓ.lividans）プロトプラストをアプラマイシン耐性に形 質転換させた（ストレプトマイセスの遺伝的操作；Ａ Ｌaboratory manual（198 5）Ｄ.Ａ.Ｈopwoodら）。組換えプラスミドｐ４８６ｌａｔａｐを含有するクロ ーンを選択し；ついで制限分析を用い、ｐ４８６ｌａｔａｐ中に分裂したｌａｔ 遺伝子があることを確認した。 ｐ４８６ｌａｔａｐを用いて野生型ストレプトマイセス・クラブリゲラス（Ｎ ＲＲＬ３５８５）のプロトプラストをアプラマイシン耐性に形質転換させた［Ｂ ailey,Ｃ.Ｒ.およびＷinstanley,Ｄ.Ｊ., Ｊ.Ｇen.Ｍicrobiol.（1986）132,294 5−2947］。チオストレプトンおよびアパラマイシンを補足したＭＹＭ［Ｐaradk ar,Ａ.S.およびＪensen,Ｓ.Ｅ.（1994），Ｊ.Bact., 177,1307-1314］上でサブ クローンした場合に増殖が良好である形質転換体を１種だけ得た。その形質転換 体をＩＰＳ培地＃３寒天（補足体なし）［ＰaradkarおよびＪensen、同書］に培 養し、２８℃で胞子形成させた。胞子を収穫し、ついで単コロニーを ＩＳＰ培地＃３寒天およびＭＹＭ寒天（共に補足体なし）上に平板培養させた。 これらを胞子形成させ、ついで逐次、チオスレプトンを補足したＭＹＭ、アラマ イシンを補足したＭＹＭおよびＭＹＭ（補足体なし）上にレプリカ平板培養させ た。２８℃で３日経過した後、アラマイシン補足および補足していない平板上に コロニーが出現したが、チオストレプトン平板ではコロニーは増殖しなかった。 アラマイシン耐性で、チオストレプトン感受性の４つのコロニー（ｌａｔ＃２、 ｌａｔ＃５、ｌａｔ＃７およびｌａｔ＃１１）をさらなる研究のために選択した 。 これらの単離体はａｐｒ^r、ｔｉｏ^sであるため、二重乗換事象がｐ４８６ｌａ ｔａｐとストレプトマイセス・クラブリゲラス染色体の間に生じたと仮定した。 この仮定はサザン・ハイブリダイゼーション分析により確認された。 実施例３：ｌａｔ−分裂突然変異体によるセファマイシンおよびクラブラン酸生 成 抗生物質の産生における推定されるｌａｔ分裂変異の効果を測定するためにマ ４つのすべての株（分裂体）を澱粉−アスパラギン（ＳＡ）液体培地(Ｐaradkar ,Ａ.Ｓ.およびＪesen,Ｓ.Ｅ.（1995）、Ｊ.Ｂacteriol.，177,1307-1314)に２８ ℃で６６時間培養した。上澄を調整して、種々の増殖速度を説明し、イー・コリ ＥＳＳ（ＰaradkarおよびＪensen、同書）に対してバイオアッセイに付し、野生 型ストレプトマイセス・クラブリゲラスの培養物由来の同様に調整した上澄と比 較した。ｌａｔ−分裂体はすべて、約０.０４５μｇ／ｍｌ／セファロスポリン に相当する非常に小さな領域の阻害を生じ；同様の条件下で、野生型株は３.１ ８μｇ／ｍｌ／セファロスポリンをもたらした。 同じ上澄のサンプルをクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋlebsiella pneumoniae ）に対するクラブラン酸産生についてバイオアッセイに付した（Ｂailey，Ｃ.Ｒ .ら、（1984）Ｂio／Ｔechnology ２（9）808-811）。バイオアッセイにより判 断した場合、４つのすべての分裂体は、野生型との比較で、２ないし３倍量のク ラブラン酸を産生したのが明らかであった。４つのすべてのｌａｔ分裂体はクラ ブラン酸産生に関して同様の表現型を示すと考えられ、そのすべてが一つの一次 形質転換体より誘導されているため、さらに研究するために、ｌａｔ＃２を選択 し た。ｌａｔ＃２の混和培養を３回反復試験に付し、その野生型ストレプトマイセ ス・クラブリゲラスをＳＡ培地中、２８℃で培養し、接種の４８時間、７２時間 および９９時間後にサンプリングする経時的実験を行った。クレブシエラ・ニュ ーモニエに対するバイオアッセイでは、４８時間で、ｌａｔ＃２が野生型に比べ て略４倍量のクラブラン酸を産生することが明らかにされた。しかし、９９時間 では、ｌａｔ＃２培養体は野生型と比べて２倍よりもほんの少し多いだけのクラ ブラン酸を産生した。イー・コリＥＳＳに対する同じ期間の同じ培養体の同時バ イオアッセイは、ｌａｔ＃２が検出可能な抗生物質活性を生成しないことを明ら かにした。野生型培養体は容易に検出可能量であるが、中程度の量のセファロス ポリン（最大力価６.５μｇ／ｍｌ）を産生した。 要約 ｌａｔ分裂変異体を製造した。実験により該変異体がわずかな量のβ−ラクタ ム抗生物質（クラブラン酸を除く）を産生することがわかった。クラブラン酸に ついては、該変異体は、澱粉−アスパラギン培地中、振とうフラスコ条件下で増 殖させた野生型ストレプトマイセス・クラブリゲラスにより産生されるクラブラ ン酸の少なくとも２ないし３倍の量を産生した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ホームズ，ウイリアム・ヘンリー イギリス、ジー11・６エイキュー、グラス ゴー、ダンバートン・ロード54番 ロバー トソン・インスティテュート・オブ・バイ オテクノロジー、バイオフラックス・リミ テッド (72)発明者 パラドカール，アシシュ・サドハカール カナダ、ティ６ジー・２イー１、アルバー タ、エドモントン、ストリート8625−112 番 キャンパス・タワー222、ザ・ガバナ ーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ アルバータ (72)発明者 モシャー，ロイ・ヘンリー カナダ、ティ６ジー・２イー１、アルバー タ、エドモントン、ストリート8625−112 番 キャンパス・タワー222、ザ・ガバナ ーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ アルバータ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．セファロスポリン経路においてＬ−リジンのＬ−α−アミノアジピン酸へ の変換を妨げることにより、クラバム経路またはその一部およびセファロスポリ ン経路またはその一部の両方の経路を有する生物により産生されるクラバムの量 を増加させる方法。 ２．変換工程をＬＡＴ酵素またはｌａｔ遺伝子の機能を変えることで妨げる請 求項１記載の方法。 ３．ｌａｔ遺伝子の機能が該遺伝子を分裂または除去することにより変えられ る請求項２記載の方法。 ４．クラバムがβ−ラクタマーゼ阻害活性を有する請求項１ないし３に記載の 方法。 ５．クラバムがクラブラン酸である請求項４記載の方法。 ６．分裂または変異したｌａｔ遺伝子を含有する組換えプラスミド。 ７．ｐＣＦ００２およびｐ４８６ｌａｔａｐより選択される請求項６記載のプ ラスミド。 ８．請求項１に記載の生物であって、分裂または削除されたｌａｔ遺伝子を含 有する生物。 ９．ストレプトマイセス・クラブリゲラスである請求項８記載の生物。