KR100468932B1 - 과량의 클라밤 항생제를 생성하는 생물체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세팔로스포린 경로에서 L-리신의 L-α-아미노아디프산으로의 전환과정을 방해함에 의해 클라밤 경로 또는 이의 부분 경로 및 세팔로스포린 경로 또는 이의 부분 경로를 가지는 생물체에 의해 생성되는 클라밤의 양을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 결함이 있는 LAT (리신 아미노 트랜스퍼라아제) 유전자를 함유하는 플라스미드 및 이러한 플라스미드를 함유하는 생물체를 제공한다.
Description
본 발명은 생성 생물체로부터 강한 β-락타마제 억제 활성을 지니는 클라블란산(clavulanic acid) 및 이들을 포함하는 그 밖의 클라밤(clavam)의 생성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 클라밤을 증가된 양으로 생성시킬 수 있는 신규한 생물체를 제공한다.
미생물, 특히, 스트렙토마이세스 종(Streptomycessp.)은 클라블란산 및 그 밖의 클라밤, 세팔로스포린(cephalosporin), 세파마이신(cephamycin), 투니카마이신(tunicamycin), 홀로마이신(holomycin) 및 페니실린(penicillin)을 포함하는 수많은 항생제를 생성한다. 생성되는 상기 항생제들의 절대량 및 상대량을 조작할수 있다는 사실에 상당한 관심을 가지게 되었고, 따라서, 이러한 경로의 대사적 메카니즘 및 유전학적 메카니즘을 조사하는 많은 연구가 있었다[참조: Domain, A.L. (1990) "Biosynthesis and regulation of beta-lactam antibiotics." In: 50 years of Penicillin applications, history and trends]. 대사 경로에서 다양한 단계를 수행하는 많은 효소 및 상기 효소를 코딩하는 유전자는 공지되어 있다.
예를 들어,스트렙토마이세스 클라블리게루스(Streptomyces clavuligerus)의 세팔로스포린 대사 경로에서, 세 가지의 중요한 항생제가 생성될 수 있는데, 이 세 가지의 항생제는 페니실린 N, O-카바모일디아세틸세팔로스포린 C 및 세파마이신 C이다. 상기 항생제들은 트리펩티드 전구체 d-(L-a-아미노아디필)-L-시스테이닐-D-발린(ACV)으로부터 합성된다[참조: J.F. Martin et al(1990)., "Clusters of genes involved in Penicillin and cephalosporin biosynthesis" In : 50 years of penicillin applications history and trends].
스트렙토마이세스 클라블리게루스에서의 페니실린 및 세팔로스포린 둘 모두의 생합성에서 인식되는 제 1 전용 단계는 효소 리신-ε-아미노 트랜스퍼라제(LAT)와 연관되어 있다.스트렙토마이세스 클라블리게루스lat 유전자의 누클레오티드 서열 및 유도된 아미노산 서열은 공지되어 있다[참조: Tobin, M.B et al., (1991) J. Bacteriol, 173, 6223-6229].
미국 특허 제 5,474,912호(1995년 12월 12일 공개됨)에는 LAT 유전자의 하나 이상의 복사체(copy)를 생물체의 염색체내로 삽입함으로써스트렙토마이세스 클라블리게루스에서 세팔로스포린을 증가된 양으로 생성시키는 방법이 기술되어 있다.β-락탐 항생제에 대한 효과가 청구되어 있지만,스트렙토마이세스 클라블리게루스에서의 세팔로스포린 경로의 생성물에 대한 효과만이 기술되어 있다. 즉, 클라밤 생성에 대한 효과는 측정되거나 기술되어 있지 않다.
클라블란산 및 그 밖의 클라밤은 3 탄소 화합물[참조: Townsend, C.A. and Ho, M.F. (1985) J. Am. Chem. Soc. 107(4), 1066-1068 and Elson, S. W and Oliver, R.S. (1978) J. Antiobiotics XXXI No. 6,568] 및 아르기닌[참조: Valentine, B.P et al(1993) J. Am Chem. Soc. 15, 1210-1211]으로부터 유도된다.
세팔로스포린 및 클라블란산의 생합성을 결정하는 유전자 클러스터가스트렙토마이세스 클라블리게루스염색체상에 서로 인접하여 있지만[문헌: Ward, J.M. and Hodgson, J.E (1993) FEMS Microbiol. Lett. 110, 239-242], 공통의 생합성 구조 유전자를 공유하지는 않는다. 따라서, 상기 경로들간에 명백한 생화학적인 연결 고리는 없다.
놀랍게도, 본 발명자들은 생물체의 세팔로스포린 경로에서 하나 이상의 단계가 간섭되는 경우, 생물체에 의해 생성되는 클라밤의 양이 증가한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 세팔로스포린 경로에서 L-리신이 L-α-아미노아디프산으로 전환되는 것을 간섭함으로써 클라밤 경로 또는 이의 부분경로 및 세팔로스포린 경로 또는 이의 부분경로 둘 모두를 가진 생물체에 의해 생성되는 클라밤의 양을 증가시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 클라밤은 β-락타마제 억제 활성을 가지며, 더욱 바람직하게는, 클라밤은 클라블란산이다.
도 1a는 아프라마이신 내성 단편의 삽입에 의해 분해된 LAT 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pCF002의 구조를 도시한다.
도 1b는 pCF002를 EcoRI 및 HindIII로 효소분해시키고 효소분해물을 효소분해된 pIJ486과 연결시켜 제조된 재조합 플라스미드 p486latap의 구조를 도시한다.
본 발명의 바람직한 일면에 있어서, L-리신을 L-α-아미노아디프산으로 전환시키는 과정은 LAT 효소 또는 lat 유전자의 기능을 변경시킴으로서 간섭된다. 예를 들어, 상기 효소는 억제되거나 그렇지 않으면 차단될 수 있다(예를 들어, 비대사성 기질 또는 유사체을 사용함으로써).
적합하게는, LAT 유전자는 공개된 서열을 기본으로 하여 통상적인 클로닝 방법(PCR과 같은)에 의해 수득될 수 있다. 상기 유전자의 기능은 유전자 분해(gene disruption)[참조: Aidoo, K.A. et al., (1994), Gene, 147, 41-46], 무작위 돌연변이유발, 특정부위 돌연변이유발 및 안티센스(antisense) RNA와 같은 유전자 기술에 의해 간섭 또는 제거/결실될 수 있다.
문헌[참조 : Mahro, B. and Demain, A (1987), Appl. Microbiol. Technol. 27, 272-275]에는스트렙토마이세스 클라블리게루스의 자발적인 돌연변이체 균주(NP1)가 기술되어 있는데, 상기 균주는 세파마이신을 생성하지 않으며, lat, acvs 및 ipns 효소 활성에 결함이 있는 것으로 입증되었다. 문헌[참조 : H. Yu et al(1994), Microbiology, 140, 3367-3377]은 상기 세 가지의 효소의 활성이 전체 LAT 유전자(lat)를 엔코딩하는 DNA의 단편 및 acvs 유전자(pcbAB)의 업스트림 절반을 사용하여 돌연변이체를 형질전환시킴으로써 회복될 수 있음을 입증하였다. 그러나, 클라블란산 또는 그 밖의 클라밤의 생성에 관한 이러한 돌연변이체에서의 어떠한 효과에 대한 교시는 없었다.
본 발명의 추가적인 일면에 있어서, 본 발명은 결함 lat 유전자, 바람직하게는 하기 기술하는 플라스미드 pCF002 및 p486latap를 포함하는 플라스미드를 제공한다. 적합하게는, 상기 플라스미드는 스트렙토마이세스 클라블리게루스, 예컨대, 균주 ATCC 27064(스트렙토마이세스 클라블리게루스 NRRL 3585와 동등함)와 같은 생물체를 형질전환시키기 위해 사용된다.
본 발명의 추가적인 일면에 있어서, 본 발명은 결함 lat 유전자를 포함하고 있는 생물체를 제공한다.
실시예
실시예에서 달리 설명하지 않는 한, 모든 방법은 문헌[참조 : Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd Edition)]에 기재된 방법에 따른다.
실시예
1 - 분해된
lat
유전자의 조립
실험을 시작하기 위해, pA2/119[참조: Thesis by A.K. Petrich(1993) Transcriptional analysis of the Isopenicillin N synthetase gene ofStreptomyces clavuligerus; University of Alberta]를 KpnI으로 효소분해시켜 이의 0.688 kb 삽입물을 유리시켰다. 이 효소분해물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분별시키고 0.688kb 단편을 용리시키고 클레노우 처리(Klenow-treat)를 수행하였다. 그런 다음, 평활말단을 가지는 단편을 HincII로 효소분해된 pUC119에 연결시키고 대장균 MV1193이 암피실린 내성이 되도록 형질전환시키기 위해 사용하였다. 하기에 pELK004로 명명되는 재조합 플라스미드를 함유하는 형질전환체를 단리하고, 이를 제한 분석에 의해 확인하였다. pELK004를 BamHI 및 KpnI으로 효소분해시키고 BamHI-KpnI aprr-단편에 연결시켰다. 상기 연결 혼합물을 대장균 MV1193이 아프라마이신 내성이 되도록 형질전환시키기 위해 사용하였다. 생성된 형질전환체를 스크리닝하여 0.688-kb 3'-lat 단편에 대해 역배향되어 있으면서 상기 단편의 상류가 삽입된 aprr-단편을 포함하는 재조합 플라스미드 pCF001A를 단리하고 제한 분석에 의해 확정하였다.
다음 단계에서, pA2/119를 PCR 반응에서 주형으로서 사용하여 lat 유전자의 업스트림 영역을 pUC119내로 서브클로닝하였다. 사용된 DNA 프라이머는 M13 역방향 서열 프라이머 및 DNA 서열 5' CATGCGGATCCCGTCGACGAGCATATGC-3'을 가진 프라이머였고 표준 반응 조건[참조: PCR technology Principles and Applications for DNA amplification, Ed. H A Ehrlich (1989)] 하에서 30초 동안 92℃, 30초 동안 55℃ 및 60초 동안 72℃로 구성된 사이클하에서 수행하였다. PCR 생성물을 1.25% 아가로오스 겔상에서 겔 전기영동에 의해 단리하였다. 증폭된 DNA 단편을 겔 정제하고, 제한 엔도누클레아제 EcoRI 및 BamHI으로 효소분해시켰으며, 유사하게 효소분해된 pUC119와 연결시켰다. 생성된 대장균 MV1193 형질전환체를 제한 엔도누클레아제 처리에 이어서 겔 전기 영동 및 DNA 서열 분석에 의해 분석함으로써 PCR에 의한 증폭 동안에 올바른 단편이 클로닝되었고 의도되지 않은 어떠한 돌연변이도 도입되지 않았음을 확정하였다. lat의 DNA 영역 업스트림을 포함하는 pUC119 구성물을 pL/119로 명명하였다.
다음 단계는 pL1/119를 EcoRI 및 KpnI으로 효소분해시켜 이의 1.08kb 단편 삽입물을 유리시키는 것과 관련된다. 상기 효소분해물을 아가로오스 전기영동으로 분별시키고, 1.08kb 단편을 용리시키고 EcoRI 및 KpnI으로 효소분해된 pCF001A에 연결시켰다. 연결 혼합물을 MV1193이 아프라마이신 내성이 되도록 형질전환시키기 위해 사용하였다. 생성된 형질전환체를 스크리닝하고, 재조합 플라스미드 pCF002(여기서, 재조합 플라스미드 pCF002는 3'-lat 단편의 상류에 1.08 kb 5'-lat 단편을 포함하고 있는데, 둘 모두는 동일하게 배향되어 있지만, 역으로 배향된 aprr단편에 의해 서로 분리되어 있다)(도 1a 참조)를 함유하는 클론을 단리하였다. pCF002를 제한 분석에 의해 확인하였다; 상기 결과는 aprr단편이 개시 코돈으로부터의 852bp 및 정지 코돈으로부터의 521bp에서 lat 유전자내의 KpnI 부위에 삽입된 것으로 나타났다.
실시예
2 -
스트렙토마이세스
클라블리게루스
내로의
분해된
lat
유전자의 도입
pCF002를 EcoRI 및 HindIII로 효소분해시키고(분해된 lat 유전자를 지닌 DNA 단편이 유리되도록), 효소분해물을 유사하게 효소분해된 pIJ486과 연결시켜 p486latap를 생성시킴으로써 분해된 lat 유전자를 서브클로닝하였다(도 1b 참조). 연결 혼합물을스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans) 원형질체가 아프라마이신 내성이 되도록 형질전환시키기 위해 사용하였다[참조: Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory manual (1985) D.A. Hopwood et al.]. 재조합 플라스미드 p486latap를 함유한 클론을 선별하였다; 그런 다음, 제한 분석을 이용하여 p486latap내에서 분해된 lat 유전자의 존재를 확정하였다.
p486latap를 야생형 스트렙토마이세스 클라블리게루스(NRRL 3585)의 원형질체가 아프라마이신 내성이 되도록 형질전환시키기 위해 사용하였다[참조: Bailey, C.R and Winstanley, D.J J. Gen. Microbiol. (1986) 132, 2945-2947]. 하나의 형질전환체만 수득되었는데, 이것은 티오스트렙톤 및 아프라마이신이 보충된 MYM[참조: Paradkar, A.S. and Jensen, S.E.(1994) J. Bact. 177, 1307-1314]상에 계대배양되는 경우에 잘 성장하였다. 그런 다음, 상기 형질전환체를 IPS 배지 #3 아가(agar)(비보충됨)[참조: Paradkar and Jensen, ibid]에 계대배양하여, 28℃에서 포자를 형성시켰다. 포자를 수거한 다음, 비보충된 ISP 배지 #3 아가 및 MYM 아가상에 단일 콜로니를 형성시키기 위해 다시 플레이팅하였다. 포자를 형성시킨 다음, 티오스트렙톤이 보충된 MYM, 아프라마이신이 보충된 MYM 및 MYM(비보충됨)상에 연속하여 레플리카-플레이팅하였다. 28℃에서 3일이 지난 후에, 아프라마이신이 보충된 플레이트 및 비보충된 플레이트상에 콜로니가 나타났지만, 티오스트렙톤 플레이트상에서는 어떠한 콜로니도 성장하지 않았다. 아프라마이신 내성이면서 티오스트렙톤 감수성인 4가지의 콜로니(lat#2, lat#5, lat#7 및 lat#11)를 추가적인 조사를 위해 선별하였다.
이러한 단리물이 aprr, 티오r이었기 때문에, 이중 크로스오버(cross-over) 사건이 p486latap와 스트렙토마이세스 클라블리게루스 염색체 사이에서 일어났다고 가정하였다. 상기 가정을 서던 하이브리드화 분석에 의해 확정하였다.
실시예
3 -
lat
-분해된
돌연변이체에
의한 세파마이신 및
클라블란산
생성
항생제 생성에 대한 추정된 lat 분해 돌연변이의 효과를 결정하기 위해서, 4 가지 균주(분해체: disruptant) 전부를 28℃에서 66시간 동안 전분-아스파라긴(SA) 액체 배지[참조 : Paradkar, A.S. and Jensen, S.E(1995), J. Bacteriol. 177, 1307-1314]중에서 성장시켰다. 상이한 성장 속도를 나타내도록 상층액을 조절한 다음, 대장균 ESS(참조 : Paradkar and Jensen ibid.)에 대하여 생검정하고, 야생형 스트렙토마이세스 클라블리게루스의 배양물로부터의 유사하게 조절된 상층액과 비교하였다. 모든 lat-분해물은 약 0.045 ㎍/㎖/세팔로스포린에 상응하는 아주 작은 억제영역을 생성시켰다; 유사한 조건하에서, 야생형 균주는 3.18 ㎍/㎖/세팔로스포린을 생성하였다.
동일한 상층액의 샘플을크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)에 대하여 클리블란산 생성에 대해 생검정하였다[참조: Bailey, C.R. et al.(1984) Bio/Technology 2(9) 808-811]. 4가지의 분해물 전부는 생검정에 의해 판단된 바와 같이 야생형에 비해 2 내지 3배 양의 클라블란산을 생성시키는 것으로 나타났다.
4가지의 lat 분해물 전부는 클라블란산 생성에 관하여 유사한 표현형을 나타내는 것 같고, 4가지 모두가 하나의 일차 형질전환체로부터 유도되었기 lat#2를 추가적인 조사를 위해 선별하였다. 시간 경과 실험을 수행하였는데, lat#2의 진탕 배양물 및 야생형 스트렙토마이세스 클라블리게루스를 28℃에서 SA 배지중에 3중으로 진탕배양시켜, 접종한 지 48시간, 72시간 및 99시간에 샘플링하였다. 크렙시엘라 뉴모니애에 대한 생검정에서는, 48시간에, lat#2가 야생형의 약 4배 양의 클라블란산을 생성시킨 것으로 나타났다. 그러나, 99시간까지, lat#2 배양물은 야생형에 비해 2배가 약간 넘는 클라블란산을 생성시켰다. 대장균 ESS에 대한 동일한 시간에 대한 동일한 배양물의 동시 생검정에서는 lat#2가 검출 가능한 항균 활성을 생성시키지 않은 것으로 나타났다. 야생형 배양물은 중간 정도의 양이지만, 용이하게 검출할 수 있는 양의 세팔로스포린(최대역가 6.5㎍/㎖)을 생성시켰다.
본 발명에서 lat 분해 돌연변이체가 생성되었다. 상기 실험에서 클라블란산 외에 무시될 수 있는 양의 β-락탐 항생제가 생성되는 것으로 나타났다. 클라블란산의 경우, lat 분해 돌연변이체는 전분 아스파라긴 배지중에서 진탕 플라스크 조건하에 성장된 야생형 스트렙토마이세스 클라블리게루스에 의해 생성된 클라블란산의 2 내지 3배 이상의 양을 생성하였다.
Claims (4)
- 아프라마이신 내성 단편의 삽입에 의해 분해(disruption)된 lat 유전자를 함유하는 플라스미드.
- 제 1항에 있어서, 도 1a에 도시된 제한 부위의 배치(configuration)를 가지는 pCF002로 명명되는 재조합 플라스미드, 및 도 1b에 도시된 제한 부위의 배치를 가지는 p486latap으로 명명되는 재조합 플라스미드로부터 선택됨을 특징으로 하는 플라스미드.
- 클라밤 생합성 경로 및 세팔로스포린 생합성 경로 둘 모두를 가지고, 아프라마이신 내성 단편의 삽입에 의해 분해된 lat 유전자가 염색체에 도입되어 있는 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.).
- 제 3항에 있어서,스트렙토마이세스 클라블리게루스(Streptomyces clavuligerus)임을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 종.
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