KR19990022760A - 클라밤 항생물질의 생성을 증가시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세팔로스포린 경로에서 L-라이신을 L-α-아미노아디프산으로 전환시키는 것으로 중재함으로써 클라밤 경로 또는 이의 일부경로 및 세팔로스포린 경로 또는 이의 일부 경로를 지니는 유기체에 의해 생성된 클라밤의 양을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 결함 LAT(라이신 아미노 트랜스페라제) 유전자를 함유하는 플라스미드 및 그러한 플라스미드를 함유하는 유기물이 제공된다.
Description
본 발명은 유기물의 생성에 의한 강한 β-라타마제 억제활성을 지니는 클라블란산(clavulanic acid) 및 이들을 포함한 그밖의 클라밤(clavam)의 생성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 증가된 양의 상기 클라밤을 생성시킬 수 있는 신규한 유기물을 제공하는데 있다.
미생물, 특히, 스트렙토마이세스 sp.(Streptomyces sp.)는 클라블란산 및 그밖의 클라밤, 세팔로스포린(cephalosporin), 세파마이신(cephamycin), 투니카마이신(tunicamycin), 홀로마이신(holomycin) 및 페니실린(penicillin)을 포함한 다수의 항생물질을 생성한다. 생성되는 상기 항생물질의 절대량 및 비교량이 조작될 수 있다는 흥미로운 사실이 있으며, 그에 따라서, 이러한 경로의 대사 및 유전 메카니즘을 조사하는 많은 연구가 있었다[문헌: Domain, A.L. (1990) Biosynthesis and regulation of beta-lactam antibiotics. In: 50 years of Penicillin applications, history and trends]. 대사 경로에서 다양한 단계를 수행하는 많은 효소 및 상기 효소를 암호화하는 유전자가 공지되어 있다.
예를 들어, 스트렙토마이세스 클라블리게루스(Streptomyces clavuligerus)에서의 세팔로스포린 대사 경로에서, 세가지의 중요한 항생물질이 생성되는데, 그 세가지의 항생물질은 페니실린 N, O-카르바모일데아세틸세팔로스포린 C 및 세파마이신 C이다. 이러한 항생물질은 트리펩티드 전구체 d-(L-a-아미노아디필)-L-시스테이닐-D-발린 (ACV)으로부터 합성된다[문헌: J.F. Martin et al(1990)., Clusters of genes involved in Penicillin and cephalosporin biosynthesis In : 50 years of penicillin applications history and trends].
에스. 클라블리게루스중의 페니실린 및 세팔로스포린의 생합성에서의 인식된 제 1 전용 단계는 효소 라이신-ε-아미노 트렌스페라제(LAT)와 연관된다. 에스. 클라블리게루스 lat 유전자의 누클레오티드 서열 및 유도된 아미노산 서열이 공지되어 있다[문헌: Tobin, M.B et al., (1991) J. Bacteriol, 173, 6223-6229].
미합중국 특허 제5,474,912호(1995년 12월 12일 공개)에는 하나 이상의 LAT 유전자의 복제물을 유기물의 염색체에 삽입함으로써 에스. 클라블리게루스에서 증가된 양의 세팔로스포린을 생성시키는 방법이 기재되어 있다. β-락탐 항생물질에 대한 효과가 청구되어 있지만, 에스. 클라블리게루스에서의 세팔로스포린 경로 생성물에 대한 효과만이 기재되어 있다. 즉, 클라밤 생성에 대한 효과는 측정되지도 기재되지도 않았다.
클라블란산 및 그밖의 클라밤은 3 탄소 화합물[문헌: Townsend, C.A. and Ho, M.F. (1985) J. Am. Chem. Soc. 107(4), 1066-1068, 및 Elson, S. W and Oliver, R.S.(1978) J. Antiobiotics XXXI No. 6,568] 및 아르기닌[문헌: Valentine, B.P et al(1993) J. Am Chem. Soc. 15 1210-1211]으로부터 유도된다.
에스. 클라블리게루스 염색체에서 서로 인접하여 있지만 세팔로스포린 및 클라블란산의 생합성을 결정하는 유전자 클러스터[문헌: Ward, J.M. and Hodgson, J.E(1993) FEMS Microbiol. Lett. 110, 239-242]는 공통의 생합성 구조 유전자를 공유하지 않는다. 따라서, 경로사이의 명백한 생화학적인 연결 고리가 없다.
놀라웁게도, 본 발명자들은 유기물의 세팔로스포린 경로에서 한 단계이상이 중재되는 경우 유기물에 의해 생성되는 클라밤의 양이 증가한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 세팔로스포린 경로에서 L-라이신의 L-α-아미노아디프산으로의 전환을 중재함으로써 클라밤 경로 또는 이의 일부 및 세팔로스포린 경로 또는 이의 일부를 지니는 유기물에 의해 생성되는 클라밤의 양을 증가시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 클라밤은 β-락타마이즈 억제활성을 지니며, 더욱 바람직하게는 클라밤은 클라블란산이다.
본 발명의 바람직한 관점에 있어서, L-라이신을 L-α-아미노아디프산으로 전환시키는 과정은 LAT 효소 또는 lat 유전자의 기능을 변경시킴으로서 중재된다. 예를 들어, 효소는 억제되거나 달리 차단될 수 있다(예를들어, 비대사성 기질 또는 유사체을 사용함으로써).
적합하게는, LAT 유전자는 공지된 서열을 기본으로 하여 통상의 클로닝 방법(예: PCR)으로 얻을 수 있다. 유전자의 기능은 유전자 분해[문헌: Aidoo, K.A. et al., (1994), Gene, 147, 41-46], 무작위 돌연변이, 부위 유도된 돌연변이 및 안티센스(antisense) RNA와 같은 유전자 기술에 의해 중재 또는 제거/삭제될 수 있다.
문헌[Mahro, B. and Demain, A (1987), Appl. Microbiol. Technol. 27, 272-275]에는 세파마이신을 생성하지 않으며, lat, acvs 및 ipns 효소 활성에 결함이 있는 것으로 입증되는 에스. 클라블리게루스(NP1)의 자발적인 돌연변이 스트레인을 기재하고 있다. 문헌[H. Yu et al(1994), Microbiology, 140, 3367-3377]은 이러한 세가지의 효소의 활성이 전체 LAT 유전자(lat)를 암호화하는 DNA의 단편 및 acvs 유전자(pcbAB)의 상부 절반으로 돌연변이체를 형질전환시킴으로써 회복될 수 있다는 것을 입증하고 있다. 그러나, 클라블란산 또는 그밖의 클라밤의 생성에 관한 이러한 돌연변이에서의 어떠한 효과에 대한 교시는 없다.
본 발명의 또 다른 관점으로써, 본 발명은 결함 lat 유전자, 바람직하게는 이하 기재되는 플라스미드 pCF002 및 p486latap를 함유하는 플라스미드를 제공한다. 적합하게는, 플라스미드는 에스. 클라블리게루스 eg 스트레인 ATCC 27064(에스. 클라블리게루스 NRRL 3585와 등가)와 같은 유기물을 형질전환시키는데 사용된다.
본 발명의 또 다른 관점으로써, 본 발명은 결함 lat 유전자를 함유하는 유기물을 제공한다.
실시예
실시예에서, 달리 설명하지 않는 한 모든 방법은 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd Edition)]에 기재된 방법에 따른다.
실시예 1 - 분해된 lat 유전자의 조립
과정의 개시시키기 위해서, pA2/119[문헌: Thesis by A.K. Petrich(1993) Transcriptional analysis of the Isopenicillin N synthetase gene of Streptomyces clavuligerus; University of Alberta]를 KpnI로 다이제스트(digest)시켜 이의 0.688 kb 삽입물을 유리시켰다. 이 다이제스트를 한천 겔 전기영동으로 분별하고 0.688kb 단편을 용리시켜 클레노우 처리(Klenow-treat)를 수행시켰다. 이어서, 블런트화된 단편을 HincII-다이제스트된 pUC119에 결찰시키고 E.coli MV1193을 암피실린 내성물로 형질전환시키는데 사용하였다. 재조합 플라스미드, 즉, pELK004를 함유하는 형질전환체를 분리하고, 이를 제한 분석으로 확인하였다. pELK004를 BamHIalc KpnI로 다이제스트시켜 BamHI-KpnI aprr-단편으로 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 E. coli MV1193을 아프라마이신 내성물(apramycin resistance)로 형질전환시키는데 사용하였다. 생성된 형질전환체를 스크리닝하고, 0.688-kb 3'-lat 단편으로 역으로 배향시키고 상기 단편의 상부에 삽입된 aprr-단편을 함유하는 재조합 플라스미드 pCF001A를 분리하여 제한 분석으로 확인하였다.
다음 단계에서, pA2/119를 PCR 반응에서 주형으로 사용하여 lat 유전자의 상부 영역을 pUC119로 서브클로닝시켰다. 사용된 DNA 프라이머는 M13 역 서열화 프라이머, 및 표준 반응조건[문헌: PCR technology Principles and Applications for DNA amplification, Ed. H A Ehrlich (1989)], 및 92℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 60초의 사이클 조성하에서 DNA 서열 5' CATGCGGATCCCGTCGACGAGCATATGC-3'을 지니는 프라이머였다. PCR 생성물은 1.25% 한천 겔상에서 겔 전기영동으로 분리하였다. 증폭된 DNA 단편을 겔 정제하고, 제한 엔도누클레아제 EcoR1 및 BamH1으로 다이제스트시켰으며, 유사하게 다이제스트된 pUC119로 결찰시켰다. 생성된 E. coli MV1193 형질 감염체가 제한 엔도누클레아제 처리에 이어지는 겔 전기 영동으로 분석되었고, DNA 서열 분석은 올바른 단편이 클로닝되고 의도하지 않은 돌연변이가 PCR 증폭 동안에 도입되지 않았음을 입증하고 있다. lat의 DNA 영역 상부를 함유하는 pUC119구성은 pL/119로 명명되었다.
다음 단계는 pL1/119를 EcoR1 및 Kpn1으로 다이제스트시켜 1.08kb 단편을 삽입시킴과 관련된다. 이러한 다이제스트는 한천 전기영동으로 분별되고, 1.08kb 단편은 EcoR1 및 Kpn1-다이제스트된 pCF001A로 용리되고 결찰되었다. 결찰 혼합물은 MV1193을 아프라마이신 내성물로 형질전화시키는데 사용하였다. 생성된 형질전환체를 스크리닝하고, 재조합 플라스미드 pCF002를 함유하는 클론을 분리하였다(도 1a 참조). 상기 재조합 플라스미드 pCF002는 동일한 배향으로 3'-lat 단편의 1.08kb 5'-lat 단편 상부를 지니지만, 역으로 배향된 aprr단편에 의해 서로 분리되었다. PCF002는 제한 분석으로 동정하였다; 그 결과는 aprr단편이 개시 코돈으로부터의 852bp 및 정지 코돈으로부터의 521bp에서의 lat 유전자내의 Kpn1에서 삽입됨을 나타냈다.
실시예 2 - 분해된 lat 유전자의 에스. 클라블리게루스내로의 도입
분해된 lat 유전자를, pCF002를 EcoR1 및 HindIII으로 다이제스트시키고(분해된 lat 유전자를 지닌 DNA 단편을 생성하도록), 다이제스트를 유사하게 다이제스트된 pIJ486으로 다이제스트시켜 p486latap를 생성시킴으로써 서브 클로닝시켰다(도 1b 참조). 결찰 혼합물을 에스. 리비단스(S. lividans) 원형질체를 아프라마이신 내성물로 형질전환시키는데 사용하였다[문헌: Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory manual (1985) D.A. Hopwood et al.]. 재조합 플라스미드 p486latap를 함유한 클론을 선별하였다; 이어서, 제한 분석을 이용하여 p486latap내의 분해된 lat 유전자의 존재를 확인하였다.
p486latap는 야생형 에스. 클라블리게루스(NRRL 3585)의 원형질체를 아프라마이신 내성물로 형질전화시키는데 사용하였다[문헌: Bailey, C.R and Winstanley, D.J J. Gen. Microbiol. (1986) 132, 2945-2947]. 티오스트렙톤 및 아프라마이신으로 보충된 MYM[문헌: Paradkar, A.S. and Jensen, S.E.(1994) J. Bact. 177, 1307-1314]상에서 서브 배양되는 경우에 잘 성장하는 단지 한가지의 형질전환체를 수득하였다. 이어서, 형질전환체를 IPS 매질 #3 한천(비보충됨)[문헌: Paradkar and Jensen, ibid]에서 서브 배양하여, 28℃에서 포자를 형성시켰다. 포자를 수거하여 비보충된 ISP 매질 #3 한천 및 MYM 한천 상으로 단일 콜로니를 재평판배양시켰다. 이를 포자 형성시키고, 이어서, 티오스트렙톤으로 보충된 MYM, 아프라마이신으로 보충된 MYM 및 MYM(비보충됨)상으로 연속하여 재평판배양시켰다. 28℃에서 3일후에, 콜로니가 아프라마이신 보충된 및 비보충된 판상에서 나타났지만, 티오스트렙톤 판상에서는 콜로니가 성장하지 않았다. 4가지의 아프라마이신 내성의 티오스트렙톤 감작성 콜로니(lat#2, lat#5, lat#7 및 lat#11)를 각각의 조사에서 선별하였다.
이러한 분리물은 aprr, 티오s이기 때문에, 이중 크로스오버(cross-over) 현상이 p486latap 및 에스. 클라블리게루스 염색체 사이에서 발생되었음이 가정되었다. 이러한 가정은 써던 하이브리다이제이션 분석(Southern hybridisation analysis)으로 확인되었다.
실시예 3 - lat-분해된 돌연변이체에 의한 세파마이신 및 클라블란산 생성
항생물질에 대한 추정된 lat 분해 돌연변이의 효과를 측정하기 위해서, 모든 4 가지의 스트레인(분해체)을 전분 아스파라긴(SA) 액체 배지(Paradkar, A.S. and Jensen, S.E(1995), J. Bacteriol. 177, 1307-1314)에서 28℃에서 66시간 동안 성장시켰다. 상등액을 조절하여 상이한 성장 속도를 조절하고, E. coli ESS(Paradkar and Jensen ibid.)에 대하여 생검정하고, 야생형 에스. 클라블리게루스의 배양물로부터의 유사하게 조절된 상등물과 비교하였다. 모든 lat-분해물은 약 0.045 ㎍/㎖/세팔로스포린에 상응하는 아주 작은 억제영역을 생성시켰다; 유사한 조건하에서, 야생형 스트레인은 3.18㎍/㎖/세팔로스포린을 생성한다.
동일한 상등액의 샘플을 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에 대한 클리블란산 생성에 대하여 검정하였다[문헌: Bailey, C.R. et al.(1984) Bio/Technology 2(9) 808-811]. 모든 4가지의 분해물은 생검에서 검출되는 바에 의하면 야생형에 비해 2 내지 3배의 클라블란산을 생성시키는 것으로 나타났다. 4 가지 모든 lat 분해물은 클라블란산 생성에 관하여 유사한 표현형을 나타내는 듯하고, 4가지 모두가 하나의 일차 형질 전환체로부터 유도되기 때문에, lat#2를 추가의 조사를 위해 선별하였다. 시간 경과 시험은 lat#2의 삼중 진탕 배양물 및 야생형 에스. 클라블리게루스의 28℃의 SA 배지에서 성장시키고 접종 48시간, 72시간 및 99시간에 샘플링하는 실험으로 수행하였다. 케이. 뉴모니아(K. pneumoniae)에 대한 생검정에서는 48시간에 lat#2가 야생형의 4배의 클라블란산을 생성시킨 것으로 나타났다. 그러나, 99시간까지, lat#2배양물은 야생형에 비해 2배가 약간 넘는 클라블란산을 생성시켰다. E. coli ESS에 대한 동일한 시간에 대한 동일한 배양물의 동시 생검정에서는 lat#2가 검출 가능한 항박테리아 활성을 나타내지 않았음을 나타냈다. 야생형 배양물은 중간 정도의 양을 생성시켰지만, 용이하게 검출할 수 있는 양의 세팔로스포린(최대역가 6.5㎍/㎖)을 생성시켰다.
요약
본 발명에서는 lat 분해 돌연변이체가 생성된다. 실험에서는 클라블란산 이외에 무시될 만한 양의 β-락탐 항생물질이 생성되고 있음을 나타냈다. 실험에서는 전분 아스파라긴 배지중의 진탕 플라스크 조건하에 성장된 야생형 에스. 클라블리게루스에 의해 생성된 클라블란산의 2 내지 3배 이상의 양이 생성된다.
Claims (9)
- 세팔로스포린 경로에서 L-라이신의 L-α-아미노아디프산으로의 전환을 중재함으로써 클라밤 경로 또는 이의 일부경로 및 세팔로스포린 경로 또는 이의 일부 경로를 지니는 유기체에 의해 생성된 클라밤의 양을 증가시키는 방법.
- 제 1항에 있어서, 전환과정이 LAT 효소 또는 lat 유전자의 기능을 변경시킴으로써 중재됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, lat 유전자의 기능이 유전자를 분해시키고 제거함으로써 변경됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항중의 어느 한 항에 있어서, 클라밤이 β-라타마제 억제활성을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 클라밤이 클라블란산임을 특징으로 하는 방법.
- 분해되거나 돌연변이된 lat 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드.
- 제 6항에 있어서, pCF002 및 p486latap로부터 선택됨을 특징으로 하는 플라스미드.
- 분해되거나 삭제된 lat 유전자를 함유하는 제 1항의 유기물
- 제 8항에 있어서, 에스. 클라블리게루스임을 특징으로 하는 유기물.
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