ES2233969T3 - Procedimiento para aumentar la produccion de antibioticos clavam. - Google Patents
Procedimiento para aumentar la produccion de antibioticos clavam.Info
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Abstract
UN PROCESO PARA AUMENTAR LA CANTIDAD DE CLAVAM PRODUCIDO POR UN ORGANISMO QUE TIENE TANTO UNA TRAYECTORIA DE CLAVAM O UNA PORCION DE LA MISMA Y UNA TRAYECTORIA DE CEFALOSPORINA O UNA PORCION DE LA MISMA A BASE DE INTERFERIR EN LA CONVERSION DE L LISINA EN ACIDO L LA CEFALOSPORINA. TAMBIEN SE PRESENTAN PLASMIDOS QUE CONTIENEN UN GEN LAT (AMINOTRANSFERASA DE LISINA) DEFECTUOSO Y ORGANISMOS QUE CONTIENEN TALES PLASMIDOS.
Description
Procedimiento para aumentar la producción de
antibióticos clavam.
La presente invención se refiere a procesos para
aumentar la producción de ácido clavulánico y otros clavam,
incluyendo aquellos con fuerte actividad inhibidora de la
\beta-lactamasa de organismos productores. La
presente invención también proporciona nuevos organismos capaces de
producir cantidades aumentadas de estos clavam.
Los microorganismos, en particular
Sterptomyces spp., producen varios antibióticos, incluyendo
ácido clavulánico y otros clavam, cefalosporinas, cefamicinas,
tunicamicina, holomicina y penicilinas. Hay un gran interés en
poder manipular las cantidades absolutas y relativas de estos
antibióticos producidos y consecuentemente ha habido un gran número
de estudios que investigan los mecanismos metabólicos y genéticos
de estas vías [Domain, A. L. (1.990) "Biosynthesis and
regulation of beta-lactam antibiotics". En:
50 years of Penicillin applications, history and trends]. Se
conocen muchas de las enzimas que realizan las diferentes etapas en
las vías metabólicas y los genes que codifican para estas
enzimas.
En la vía metabólica de la cefalosporina en, por
ejemplo, Streptomyces clavuligerus se pueden producir tres
importantes antibióticos, principalmente penicilina N,
O-carbamoildesacetilcefalosporina C y cefamicina C.
Estos antibióticos se sintetizan a partir del precursor
tripeptídico
d-(L-a-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina
(ACV) [J. F. Martin et al. (1.990), "Clusters of genes
involved in Penicillin and cephalosporin biosynthesis". En:
50 years of Penicillin applications, history and trends].
La etapa identificada en primer lugar dedicada a
la biosíntesis tanto de penicilinas como de cefalosporinas en S.
clavuligerus implica la enzima
lisina-\varepsilon-amino
transferasa (LAT). Se conoce la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos derivada del gen lat de S.
clavuligerus [Tobin, M. B. et al. (1.991) J.
Bacteriol. 173, 6.223-6.229].
En el documento Malmberg et al. (1.993)
J. Bacteriol. 175 (21), págs. 6.916-6.924 [y
en la patente estadounidense 5.474.912 (publicada el 12 de
diciembre de 1.995)] se describe un procedimiento para producir
cantidades aumentadas de cefalosporina en S. clavuligerus
mediante la inserción de una o más copias de un gen LAT en el
cromosoma del organismo. Aunque se reivindican efectos sobre los
antibióticos de \beta-lactamas, sólo se describen
efectos sobre productos de la vía de la cefalosporina en S.
clavuligerus, es decir no se midieron o describieron efectos
sobre la producción de clavam.
El ácido clavulánico y otros clavam proceden de
un compuesto de 3 átomos de carbono [Townsend, C. A. y Ho, M. F.
(1.985) J. Am. Chem. Soc. 107 (4),
1.066-1.068 y Elson, S. W. y Oliver, R. S. (1.978)
J. Antibiotics XXXI, No 6, 568] y arginina [Valentine, B. P.
et al. (1.993) J. Am. Chem. Soc. 15,
1.210-1.211].
Los agrupamientos de genes que determinan la
biosíntesis de las cefalosporinas y el ácido clavulánico, aunque
son adyacentes en el cromosoma del S. clavuligerus [Ward, J.
M. y Hodgson J. E. (1.993) FEMS Microbiol. Lett. 110,
239-242] no comparten genes estructurales
biosintéticos comunes. Por lo tanto, no hay uniones bioquímicas
evidentes entre ambas vías.
En el documento Romero et al. (1.988)
Appl. Microbiol. Biotechnol. 27: 510-516, se
describen varios mutantes de Streptomyces clavuligerus y los
efectos de las mutaciones realizadas por estos organismos sobre la
biosíntesis de la cefamicina C (una cefalosporina) y del ácido
clavulánico. Varios de estos mutantes fueron defectuosos en
actividades enzimáticas que se sabe que son esenciales para la
biosíntesis de la cefamicina C. Por ejemplo, la cepa mutante
ncc1 carece de actividad LAT y también de actividad
isopenicilina N sintetasa (IPNS), que son ambas absolutamente
necesarias para sintetizar de la cefamicina C. Este mutante no
produce cefamicina C ni ácido clavulánico. Sin embargo, se encontró
que un mutante carente sólo de IPNS, nce2, conservaba la
capacidad para producir ácido clavulánico a niveles superiores a los
que presenta el tipo natural.
Sorprendentemente se ha encontrado que cuando el
gen de la LAT en la vía de la cefalosporina de un organismo está
impedido, la cantidad de clavam producida por el organismo
aumenta.
Consecuentemente, la presente invención
proporciona un procedimiento para aumentar la cantidad de clavam
producida por un organismo que tiene tanto una vía del clavam, o
una de sus porciones, como una vía de la cefalosporina, o una de
sus porciones, impidiendo la conversión de la
L-lisina a ácido
L-\alpha-aminadípico en la vía de
la cefalospo-
rina.
rina.
Preferiblemente, el clavam presenta actividad
inhibidora de la \beta-lactamasa, y más
preferiblemente el clavam es ácido clavulánico.
En un aspecto preferido de la invención, el
procedimiento de conversión de la L-lisina en ácido
L-\alpha-aminoadípico se impide
alterando la función de la enzima LAT o el gen lat. Por ejemplo, la
enzima se puede inhibir o, en caso contrario, bloquear (por ejemplo
utilizando un sustrato no metabolizable o análogo).
El gen lat se puede obtener de forma adecuada,
por métodos convencionales de clonación (tales como la PCR) basados
en la secuencia publicada. La función del gen puede ser impedida o
eliminada/borrada por técnicas genéticas, tales como disrupción
genética [Aidoo, K. A. et al. (1.994) Gene, 147,
41-46], mutagénesis fortuita, mutagénesis dirigida
a un emplazamiento y RNA antisentido.
En el documento Mahro, B. y Demain, A. (1.987),
Appl. Microbiol. Technol. 27, 272-275 se
describe una cepa mutante espontánea de S. clavuligerus
(NP1) que no produjo cefamicina y se demostró que era
defectuosa en actividades enzimáticas lat, acvs e ipns. H. Yu et
al. (1.994) [Microbiology 140,
3.367-3.377] demostraron que la actividad de estas
tres enzimas se puede recuperar transformando el mutante con un
fragmento de DNA que codifica el gen lat completo y la mitad
anterior del gen acvs (pcbAB). Sin embargo, no se muestra ningún
efecto en este mutante con respecto a la producción de ácido
clavulánico u otros clavam.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporcionan plásmidos que contienen un gen lat defectuoso,
preferiblemente los plásmidos pCF002 y p486latap descritos a
continuación. De forma adecuada, los plásmidos se utilizan para
transformar un organismo tal como S. clavuligerus, por
ejemplo la cepa ATCC 27064 (equivalente a la S. clavuligerus
NRRL 3585).
En un aspecto adicional de la invención se
proporciona un organismo que contiene un gen lat defectuoso.
En los ejemplos, todos los métodos son según
Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1.989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición), a menos que se
especifique lo contrario.
Para iniciar el procedimiento, se digirió el
pA2/119 (Tesis Doctoral de A. K. Petrich (1.993) Transcriptional
analysis of the Isopenicillin N synthetase gene of Streptomyces
clavuligerus; Universidad de Alberta) con KpnI para liberar su
inserción de 0,688 kb. El producto de la digestión se fraccionó por
electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de 0,688 kb se eluyó
y se trató con Klenow. El fragmento se unió entonces con pUC119
digerido con HincII y se utilizó para transformar la E. Coli
MV1193 en resistente a la ampicilina. Se aisló un tranformante que
contenía el plásmido recombinante, denominado en la parte siguiente
de este texto pELK004, y su identidad se confirmó mediante análisis
de restricción. El pELK004 se digirió con BamHI y KpnI y se ligó con
un fragmento apr^{r} BamHI-KpnI. La mezcla de
unión se utilizó para transformar la E. Coli MC1193 en
resistente a la apramicina. Se examinaron los transformantes
resultantes y se aisló y se confirmó por análisis de restricción un
plásmido recombinante pCF001A que contenía el fragmento apr^{r}
insertado en la dirección de y con orientación inversa al fragmento
3'-lat de 0,688 kb.
En la siguiente etapa, se utilizó un pA2/119 como
plantilla en una reacción PCR para subclonar la región anterior al
gen lat en el pUC119. Los iniciadores de DNA utilizados fueron el
iniciador de secuenciación inversa M13 y un iniciador con la
secuencia de DNA
5'-CATGCGGATCCCGTCGACGAGCATATGC-3'
en condiciones de reacción convencionales [PCR technology:
Principles and Applications for DNA Amplification, Ed. H. A.
Ehrlich (1.989)] y una composición cíclica de 92ºC durante 30 s,
55ºC durante 30 s y 72ºC durante 60 s. Los productos de la PCR se
aislaron por electroforesis en gel sobre un gel de agarosa al 1,25%.
El fragmento de DNA amplificado se purificó por gel, se digirió con
endonucleasas de restricción EcoR1 y BamH1 y se unieron con el
pUC119 digerido de igual manera. Subsiguientemente, los
transformantes de E. Coli MV1193 se analizaron por
tratamiento con endonucleasa de restricción seguido por
electroforesis en gel y análisis secuencial del DNA para asegurar
que se había clonado el fragmento correcto y que no se introdujeron
mutaciones no deseadas durante la amplificación por PCR. La
construcción pUC119 que contenía la región de DNA anterior al lat
se denominó pL/119.
La siguiente etapa incluyó digerir el pL1/119 con
EcoR1 y Kpn1 para liberar su inserción del fragmento de 1,08 kb. El
producto de la digestión se fraccionó por electroforesis en gel de
agarosa y el fragmento de 1,08 kb se eluyó y se ligó con pCF001A
digerido con EcoR1 y Kpn1. La mezcla de unión se utilizó para
transformar el MV1193 en resistente a la apramicina. Se examinaron
los transformantes resultantes y se aisló un clon que contenía un
plásmido recombinante pCF002 [véase la figura (1A)] que poseía el
fragmento 5'-lat de 1,08 kb anterior al fragmento
3'-lat, ambos con la misma orientación pero
separados por el fragmento apr^{r} orientado inversamente. La
identidad del pCF002 se confirmó por análisis de restricción; los
resultados indicaron que el fragmento apr^{r} estaba insertado en
la posición Kpn1, en el gen lat a 852 bp del codón de inicio y 521
bp del codón de terminación.
El gen lat generado por disrupción se subclonó
por digestión del pCF002 con EcoR1 y HindIII (para liberar el
fragmento de DNA que porta el gen lat generado por disrupción) y
unión del producto de la digestión con pIJ486 digerido de forma
similar para crear el p486latap [véase la figura 1(b)]. La
mezcla de unión se utilizó para transformar los protoplastos de
S. Lividans en resistente a la apramicina [Genetic
Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual (1.985) D. A.
Hopwood et al.]. Se eligió un clon que contenía el plásmido
recombinante p486latap; entonces se utilizó el análisis de
restricción para confirmar la presencia del gen lat generado por
disrupción en el p486latap.
Se utilizó el p486latap para transformar los
protoplastos de S. clavuligerus de tipo natural (NRRL 3585)
en resistentes a la apramicina [Bailey, C. R. y Winstanley D. J. J.
Gen Microbiol. (1.986) 132, 2.945-2.947].
Sólo se obtuvo un tranformante que crecía bien cuando se repicó en
MYM [Paradkar, A. S. y Jensen S. E. (1.995) J. Bact. 177,
1.307-1.314] complementado con tiostreptona y
apramicina. El transformante se repicó entonces sobre medio IPS de
agar #3 (sin suplemento) [Paradkar y Jensen ibid.] y se
permitió que esporulara a 28ºC. Se recolectaron las esporas y luego
se volvieron a poner en placas en colonias individuales sobre medio
IPS de agar #3 y agar MYM, ambos sin suplemento. Se permitió que
éstos esporularan y luego se replicaron en placas sucesivamente
sobre MYM suplementada con tiostreptona, MYM suplementada con
apramicina y MYM (sin suplemento). Después de tres días a 28ºC las
colonias fueron evidentes en las placas suplementadas con
apramicina o sin suplemento, pero no crecieron colonias en las
placas con tiostreptona. Se eligieron cuatro de las colonias
resistentes a la apramicina y sensibles a la tiostreptona (lat#2,
lat#5, lat#7 y lat#11) para la investigación posterior.
Como estos fragmentos aislados eran apr^{r},
tio^{s} se supuso que había ocurrido un evento de
entrecruzamiento doble entre el p486latap y el cromosoma de S.
clavuligerus. Esta suposición se confirmó por análisis de
hibridación de Southern.
Para determinar el efecto de la supuesta mutación
de ruptura (disruption) del lat sobre la producción de antibióticos
se cultivaron las cuatro cepas (disruptores) en un medio líquido de
almidón-aspargina (SA) [Paradkar A. S. y Jensen S.
E. (1.995), J. Bacteriol. 177, 1.307-1.314
durante 66 horas a 28ºC. Se ajustaron los sobrenadantes para tener
en cuenta las diferentes tasas de crecimiento y luego se realizaron
ensayos biológicos frente a E. Coli ESS (Paradkar y Jensen
ibid.) y se compararon con sobrenadantes ajustados de forma
similar de cultivos de S. Clavuligerus de tipo natural. Cada
uno de los disruptores del lat produjo zonas muy pequeñas de
inhibición que correspondían aproximadamente a 0,045
\mug/mL/cefalosporinas; en condiciones similares la cepa de tipo
natural produjo 3,18 \mug/mL/cefalosporinas.
Se realizó un ensayo biológico de la producción
de ácido clavulínico en muestras de los mismos sobrenadantes frente
a Klebsiella pneumoniae [Bailey, C. R. et al. (1.984)
Bio/Technology 2 (9), 808-811]. Los cuatro
disruptores produjeron de dos a tres veces la cantidad de ácido
clavulánico en comparación con el tipo natural a juzgar por el
ensayo biológico.
Como los cuatro disruptores del lat parecieron
exhibir similares fenotipos con respecto a la producción de ácido
clavulánico, y los cuatro habían sido obtenidos de un transformante
primario, se eligió el lat#2 para la investigación posterior. Se
realizó un experimento temporal en el que cultivaron por triplicado
cultivos con agitación del lat#2 y S. clavuligerus de tipo
natural en medio de SA a 28ºC y se tomaron muestras 48 horas, 72
horas y 99 horas después de inoculación. El ensayo biológico frente
a K. pneumoniae demostró que a las 48 horas el lat#2
producía aproximadamente cuatro veces la cantidad de ácido
clavulánico producida por el tipo natural. Un ensayo biológico
concurrente de los mismos cultivos con los mismos periodos de tiempo
frente a E. coli ESS demostró que el lat#2 producía una
actividad antibacteriana no detectable. Los cultivos de tipo
natural produjeron cantidades moderadas, pero fácilmente
detectables, de cefalosporinas (valoración máxima 6,5
\mug/mL).
Se ha creado un mutante generado por disrupción
del lat. Los experimentos han demostrado que produce cantidades
despreciables de antibióticos \beta-lactama,
excepto ácido clavulánico. De éste produce al menos dos o tres veces
la cantidad de ácido clavulánico producida por S.
clavuligerus de tipo natural cultivado en condiciones de vial
con agitación en medio de almidón-aspargina.
Claims (9)
1. Un procedimiento para aumentar la cantidad de
clavam producida por un organismo que tiene tanto una vía del
clavam, o una de sus porciones, como una vía de la cefalosporina, o
una de sus porciones, inhibiendo la conversión de la
L-lisina en ácido
L-\alpha-aminoadípico en la vía de
la cefalosporina y detectando dicho clavam.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el procedimiento de conversión se inhibe alterando la
función de la enzima lisina
\varepsilon-aminotransferasa, LAT, o del gen
lat.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en
el que la función del gen lat se altera por disrupción o eliminando
el gen.
4. Un procedimiento según las reivindicaciones 1
a 3, en el que el clavam tiene actividad inhibidora de la
\beta-lactamasa.
\beta-lactamasa.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el clavam es ácido clavulánico.
6. Un plásmido recombinante que contiene un gen
lat de Streptomyces clavuligerus generado por disrupción
mediante una inserción genética.
7. Un plásmido según la reivindicación 6 elegido
entre el plásmido recombinante denominado pCF002 que tiene un gen
lat generado por disrupción génica y la configuración de los sitios
de restricción mostrada en la figura 1(a) y el plásmido
recombinante denominado p486latap que tiene un gen lat generado por
disrupción génica y la configuración de los sitios de restricción
mostrada en la figura 1(b).
8. Un organismo que tiene tanto una vía del
clavam, o una de sus porciones, como una vía de la cefalosporina, o
una de sus porciones, y que contiene un gen lat generado por
disrupción mediante una inserción genética e introducido en el
cromosoma de manera que el gen lat cromosómico se hace no
funcional.
9. Un organismo según la reivindicación 8 que es
S. clavuligerus.
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