JPS6291185A - Ｌ−スレオニン生産を司る遺伝子を含む組換え体ｄｎａおよびその製造法 - Google Patents
Ｌ−スレオニン生産を司る遺伝子を含む組換え体ｄｎａおよびその製造法Info
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- JPS6291185A JPS6291185A JP60230994A JP23099485A JPS6291185A JP S6291185 A JPS6291185 A JP S6291185A JP 60230994 A JP60230994 A JP 60230994A JP 23099485 A JP23099485 A JP 23099485A JP S6291185 A JPS6291185 A JP S6291185A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はＬ−スレオニンの生産を司る遺伝子を含む組換
え体ＤＮＡおよびその製造法に関する。
え体ＤＮＡおよびその製造法に関する。
［従来の技術］
プロビデンシア レットゲリ（Ｐ ｒｏｖｉｄｅｎｃｉ
ａｒｅｔｔｇｅｒｉ、以下Ｐ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉと略
す）の突然変異株を用いたＬ−スレオニン発酵法が知ら
れている。
ａｒｅｔｔｇｅｒｉ、以下Ｐ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉと略
す）の突然変異株を用いたＬ−スレオニン発酵法が知ら
れている。
これらのＬ−スレオニン発酵菌株に遺伝子操作を適用す
ればＬ−スレオニンの生産性の向上が期待される。
ればＬ−スレオニンの生産性の向上が期待される。
［発明が解決しようとする問題点］
本発明者らは、かかる状況に鑑み創意工夫を成し、Ｐ
、ｒｅｔｔＯｅｒｉのプラスミドを用いてＬ−スレオニ
ン発酵生産を司る遺伝子をセルフクローニングし、し−
スレオニン発酵生産を司る遺伝子を有する複合プラスミ
ドを作製し、この複合プラスミドでプロビデンシア（ｐ
ｒＯＶｉｄｏｎｃｉａ）属の菌もしくはエシェリヒヤ
（Ｅ ｃｈｅｒｉｈｉａ）属の菌を形質転換し、この形
質転換体を用いてＬ−スレオニンの発酵生産能を向上さ
せることに成功し、かくして本発明を完成させるに至っ
た。
、ｒｅｔｔＯｅｒｉのプラスミドを用いてＬ−スレオニ
ン発酵生産を司る遺伝子をセルフクローニングし、し−
スレオニン発酵生産を司る遺伝子を有する複合プラスミ
ドを作製し、この複合プラスミドでプロビデンシア（ｐ
ｒＯＶｉｄｏｎｃｉａ）属の菌もしくはエシェリヒヤ
（Ｅ ｃｈｅｒｉｈｉａ）属の菌を形質転換し、この形
質転換体を用いてＬ−スレオニンの発酵生産能を向上さ
せることに成功し、かくして本発明を完成させるに至っ
た。
［問題を解決する手段］
すなわち本発明は、ｐ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉの１−スレ
オニン生産を司る遺伝子を含有する相換え体ＤＮＡ１お
よびその製造法を提供するものである。
オニン生産を司る遺伝子を含有する相換え体ＤＮＡ１お
よびその製造法を提供するものである。
以下本発明に関し逐次詳細に説明する。
ベクターとして使用するプラスミドはｐ、ｒｅｔｔｇｅ
ｒｉ由来のものを用いる。例えばＰ 、ｒｅｔｔａｅｒ
ｉＡＴＣＣ２５９３２、ＡＴＣＣ９９１９、ＡＴＣＣ２
９９４４から抽出できるが、Ｐ、ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ａ
ＴＣＣ２５９３２から抽出したプラスミドｐＹＵ３００
によりＰ、ｒｅｔｔｇｅｒｉ ２１１１８を形質転換し
ｒ １１られたＰ、ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ａ Ｔ ＣＣ２
１１１８（ｐＹＵ３００）（微工研菌寄第８４７５号）
からプラスミドｐＹ Ｕ ３００を抽出し使用する方が
便利である。
ｒｉ由来のものを用いる。例えばＰ 、ｒｅｔｔａｅｒ
ｉＡＴＣＣ２５９３２、ＡＴＣＣ９９１９、ＡＴＣＣ２
９９４４から抽出できるが、Ｐ、ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ａ
ＴＣＣ２５９３２から抽出したプラスミドｐＹＵ３００
によりＰ、ｒｅｔｔｇｅｒｉ ２１１１８を形質転換し
ｒ １１られたＰ、ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ａ Ｔ ＣＣ２
１１１８（ｐＹＵ３００）（微工研菌寄第８４７５号）
からプラスミドｐＹ Ｕ ３００を抽出し使用する方が
便利である。
Ｌ−スレオニン発酵生産を司る遺伝子の供与筒として、
プロビデンシア属の菌を用いることができ、例えばＰ、
ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２１１１８を用いることが
できるがこの株に限定されるものではなく、またし−ス
レオニンの調節変異株など各種変異株も使用できる。染
色体ＤＮＡの抽出は、例えば文献１などの通常の方法に
従って行なうことができる。この場合溶菌過程は３０〜
６５℃、２０〜６０分で行なうと、ＤＮＡの収量を高め
ることができるが、これに限定はされない。
プロビデンシア属の菌を用いることができ、例えばＰ、
ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２１１１８を用いることが
できるがこの株に限定されるものではなく、またし−ス
レオニンの調節変異株など各種変異株も使用できる。染
色体ＤＮＡの抽出は、例えば文献１などの通常の方法に
従って行なうことができる。この場合溶菌過程は３０〜
６５℃、２０〜６０分で行なうと、ＤＮＡの収量を高め
ることができるが、これに限定はされない。
Ｌ−スレオニン発酵生産を司る遺伝子のセルフクローニ
ングは、例えば文献２の通常のオーキソトロフィ・コン
ブリメンテイシミン（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｌ／ Ｃ０Ｉ
Ｄ１ｅｌｌｅｎｔａｔｉＯｎ）を用いたショットガン（
Ｓｈｏｔ ｇｕｎ ）法で行なう。宿主としてはｐ 、
ｒｅｔｔｇａｒｉのＬ−スレオニン要求性変異株を用い
ることができ、染色体ＤＮＡの断片化やプラスミドのベ
クター化のための切断は、例えばｌ−１ｉｎｄｌｌＩの
ような制限酵素を用いた通常の酵素反応で行なうことが
できる。ＤＮＡの断片とベクターとの連結は例えばＴ４
ＤＮＡリガーゼのような酵素を用いた通常のライゲー
ション反応で行なうことができ、また、宿主のコンピテ
ント化と形質転換は例えば文献３のような通常の方法が
適用できる。形質転換体のスクリーニングは宿主のＬ−
スレオニン要求性のマーカー・レスキュー （ｍａｒｋ
ｅｒ ｒｅｓｃｕｅ ）を指標として行なえるが、ベク
ターの薬剤耐性の選択圧をもかけると能率が良い。また
ベクターの制限末端は、例えば文献４のようなアルカリ
フォスファターゼ処理をしておくと、ベクターの自己環
化を防げる。
ングは、例えば文献２の通常のオーキソトロフィ・コン
ブリメンテイシミン（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｌ／ Ｃ０Ｉ
Ｄ１ｅｌｌｅｎｔａｔｉＯｎ）を用いたショットガン（
Ｓｈｏｔ ｇｕｎ ）法で行なう。宿主としてはｐ 、
ｒｅｔｔｇａｒｉのＬ−スレオニン要求性変異株を用い
ることができ、染色体ＤＮＡの断片化やプラスミドのベ
クター化のための切断は、例えばｌ−１ｉｎｄｌｌＩの
ような制限酵素を用いた通常の酵素反応で行なうことが
できる。ＤＮＡの断片とベクターとの連結は例えばＴ４
ＤＮＡリガーゼのような酵素を用いた通常のライゲー
ション反応で行なうことができ、また、宿主のコンピテ
ント化と形質転換は例えば文献３のような通常の方法が
適用できる。形質転換体のスクリーニングは宿主のＬ−
スレオニン要求性のマーカー・レスキュー （ｍａｒｋ
ｅｒ ｒｅｓｃｕｅ ）を指標として行なえるが、ベク
ターの薬剤耐性の選択圧をもかけると能率が良い。また
ベクターの制限末端は、例えば文献４のようなアルカリ
フォスファターゼ処理をしておくと、ベクターの自己環
化を防げる。
得られた形質転換体から組換え体プラスミドを例えば文
献６の方法で抽出し、この組換え体プラスミドを用いて
Ｌ−スレオニン発酵性を有するＰ 、ｒｅｔｔｇａｒｉ
株を形質転換する。形質転換体はプラスミドの有する薬
剤耐性もしくは高Ｌ−スレオニン発酵性を指標として選
抜する。この場合の宿主は栄養要求性変異株やＬ−スレ
オニン合成系のフィードバック阻害や抑制が低減された
株あるいはＬ−スレオニン分解能が低減された株あるい
はこれら形質を備えた株を使うとＬ−スレオニン発酵性
をより高めることができる。
献６の方法で抽出し、この組換え体プラスミドを用いて
Ｌ−スレオニン発酵性を有するＰ 、ｒｅｔｔｇａｒｉ
株を形質転換する。形質転換体はプラスミドの有する薬
剤耐性もしくは高Ｌ−スレオニン発酵性を指標として選
抜する。この場合の宿主は栄養要求性変異株やＬ−スレ
オニン合成系のフィードバック阻害や抑制が低減された
株あるいはＬ−スレオニン分解能が低減された株あるい
はこれら形質を備えた株を使うとＬ−スレオニン発酵性
をより高めることができる。
こうして得た再形質転換体をＬ−スレオニン発酵培地中
で培養することにより、好収率でＬ−スレオニンを培地
中に蓄積せしめることが可能となる。培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じアミノ酸を
含む通常のもので良い。ただし、プラスミドの脱落を抑
えるため、前培養時には薬剤を加え選択圧をかけておく
ことが望ましい。炭素源としてはグルコース、ショ糖等
およびこれらを含有する澱粉加水分解物、糖密加水分解
物等が用いられる。窒素源としてはアンモニア水、アン
モニア塩等が使用できる。培養は好気条件下で培地のｐ
Ｈおよび温度を適宜調節しつつ行なえばよい。
で培養することにより、好収率でＬ−スレオニンを培地
中に蓄積せしめることが可能となる。培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じアミノ酸を
含む通常のもので良い。ただし、プラスミドの脱落を抑
えるため、前培養時には薬剤を加え選択圧をかけておく
ことが望ましい。炭素源としてはグルコース、ショ糖等
およびこれらを含有する澱粉加水分解物、糖密加水分解
物等が用いられる。窒素源としてはアンモニア水、アン
モニア塩等が使用できる。培養は好気条件下で培地のｐ
Ｈおよび温度を適宜調節しつつ行なえばよい。
培養液中に生成蓄積したＬ−スレオニンの分解、Ｍｖ＃
は通常の方法が適用できる。
は通常の方法が適用できる。
本発明の形質転換体微生物を用いることにより、従来知
られているｐ 、ｒｅｔｔｇｅｒ＋のＬ−スレオニン生
産菌を用いる場合に比べ、Ｌ−スレオニンの蓄ｔａ ｍ
度が高いばかりでなく、培養時間が短縮できる。
られているｐ 、ｒｅｔｔｇｅｒ＋のＬ−スレオニン生
産菌を用いる場合に比べ、Ｌ−スレオニンの蓄ｔａ ｍ
度が高いばかりでなく、培養時間が短縮できる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例１
（１）プラスミドの抽出分離
Ｐ、＋゛ｅｔｔｇｃｒｉ Ａ ＴＣＣ２１１１８＜
ｐＹＵ３００）（微工研菌奇第８４７５号）をＩ
Ｂ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナ
トリウム１％、Ｉ）ｌ−１７，５＞１１２中３７℃、１
７時間好気培養した菌体を１５ｍｏリゾチーム塩酸塩を
含んだ３１の０．５ＭＮａ Ｃ１−０，ＩＭＥＤＴＡ−
５０ｍＭＴｒｉｓ ・ＭＣＩ （ｐｌ−＋ｓ） に
懸濁し、３７℃、１５分間インキュベートした後、凍結
融解し次ニ２５ｍ１の０．１ＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ＜ｐ
Ｈ９）−１％ ５Ｏ８−０，１Ｍ Ｎａ Ｃ
１を加え６０℃、２０分インキュベートし溶解した。
ｐＹＵ３００）（微工研菌奇第８４７５号）をＩ
Ｂ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナ
トリウム１％、Ｉ）ｌ−１７，５＞１１２中３７℃、１
７時間好気培養した菌体を１５ｍｏリゾチーム塩酸塩を
含んだ３１の０．５ＭＮａ Ｃ１−０，ＩＭＥＤＴＡ−
５０ｍＭＴｒｉｓ ・ＭＣＩ （ｐｌ−＋ｓ） に
懸濁し、３７℃、１５分間インキュベートした後、凍結
融解し次ニ２５ｍ１の０．１ＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ＜ｐ
Ｈ９）−１％ ５Ｏ８−０，１Ｍ Ｎａ Ｃ
１を加え６０℃、２０分インキュベートし溶解した。
溶菌液を３０．ＯＯＯｒｐｍ 、３０分間遠心して１ｑ
た上清に１０ｕ／ｎ＋ｌ ＲＮａｓｅ△の１０μ＋を
添加し、３７℃、１時間インキュベートした後、フェノ
ール抽出、エタノール沈澱により粗ＤＮＡを（りた。こ
れをバイオゲル・カラムクロマトグラフィーとセシウム
クロライド−エチジウムブロマイド密度勾配平衡遠心に
かけ、５５μｇのプラスミドＤＮＡ （＋）ＹＬＪ３０
０）を得た。
た上清に１０ｕ／ｎ＋ｌ ＲＮａｓｅ△の１０μ＋を
添加し、３７℃、１時間インキュベートした後、フェノ
ール抽出、エタノール沈澱により粗ＤＮＡを（りた。こ
れをバイオゲル・カラムクロマトグラフィーとセシウム
クロライド−エチジウムブロマイド密度勾配平衡遠心に
かけ、５５μｇのプラスミドＤＮＡ （＋）ＹＬＪ３０
０）を得た。
プラスミドＤＹＵ３００の長さは４．２Ｋｂで薬剤耐性
はＴＯ１ｃｍ であった。またｐＹ Ｌ１２００の制
限地図は第１図に示す通りである。
はＴＯ１ｃｍ であった。またｐＹ Ｌ１２００の制
限地図は第１図に示す通りである。
（２）染色体ＤＮＡの抽出
１ＱのＬＢ培地で培養したＰ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉＡＴ
ＣＣ２１１１８の菌体を第１項の方法で溶解した後、５
ａｉｔｏ −Ｍ １ｕｒａの方法（文献１）を用いて４
ｍａの染色体ＤＮＡを得た。
ＣＣ２１１１８の菌体を第１項の方法で溶解した後、５
ａｉｔｏ −Ｍ １ｕｒａの方法（文献１）を用いて４
ｍａの染色体ＤＮＡを得た。
（３）制限酵素によるＤＮＡの消化と分画文献５の反応
条件下０．２５μｇ／μＩの（２）で取１フしたＤＮＡ
を０．１２ｕｎｉｔ／μｍの制限酵素１−（ｉｎｄ［［
で２時間分解した分解物（ＤＮＡｆｆｉで１２５μｏ）
を１２ｍ１の１０− ’） Ｏ％シヨ糖密度勾配中遠心
し０．５ｍｌずつ分画採取した。
条件下０．２５μｇ／μＩの（２）で取１フしたＤＮＡ
を０．１２ｕｎｉｔ／μｍの制限酵素１−（ｉｎｄ［［
で２時間分解した分解物（ＤＮＡｆｆｉで１２５μｏ）
を１２ｍ１の１０− ’） Ｏ％シヨ糖密度勾配中遠心
し０．５ｍｌずつ分画採取した。
遠心は日立ＲＰＳ４０Ｔローターを用い、２０℃、２５
、ＯＯＯｒｐｍ ２４時間行なった。電気泳動で各画分
のＤＮＡの長さを測定し、２〜１０Ｋｂの両分をプラス
ミドに連結した。制限酵素は宝酒造■製を用い、活性単
位は付属説明書の定義によった。
、ＯＯＯｒｐｍ ２４時間行なった。電気泳動で各画分
のＤＮＡの長さを測定し、２〜１０Ｋｂの両分をプラス
ミドに連結した。制限酵素は宝酒造■製を用い、活性単
位は付属説明書の定義によった。
（４）ベクターＤＮＡの調製
プラスミド・ベクターｐＹＵ３００は大腸菌ＭＭ２９４
内で複製した。複製ならびに菌体からの抽出精製は文献
７に従い、３０１１１（１／ ｌのクロラムフェニコー
ルを含むＬＢ培地で培養したプラスミド含有菌体をリゾ
チーム・ＳＤＳで溶菌した後、フェノール抽出し、セシ
ウムクロライド−エチジウムブロマイド密度勾配平衡遠
心とバイオグル・カラムクロマトグラフィーで精製した
。培地１α当り、ｐＹＵ３００が５０μ９得られた。
内で複製した。複製ならびに菌体からの抽出精製は文献
７に従い、３０１１１（１／ ｌのクロラムフェニコー
ルを含むＬＢ培地で培養したプラスミド含有菌体をリゾ
チーム・ＳＤＳで溶菌した後、フェノール抽出し、セシ
ウムクロライド−エチジウムブロマイド密度勾配平衡遠
心とバイオグル・カラムクロマトグラフィーで精製した
。培地１α当り、ｐＹＵ３００が５０μ９得られた。
ベクターとして供するため、制限酵素１−１ｉｎｄｌｌ
を用い文献４の反応条件下完全分解した後、文献４に従
いアルカリフォスファターゼ処理を施した。
を用い文献４の反応条件下完全分解した後、文献４に従
いアルカリフォスファターゼ処理を施した。
（５）宿主の作製
５ｍｌのＬＢ培地中で３７℃、３時間培養した対数期（
Ｄ Ｐ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉ△ＴＣＣ２１１１８とＥ
、ｃｏｌｉ ＭＭ ２９４とを文献８に従い、ＴＭ緩衝
液中で１００μｇ／ｍｌのＮＴＧを用いて変異誘発した
後、両菌株のスレオニン要求性変異株を単離した。
Ｄ Ｐ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉ△ＴＣＣ２１１１８とＥ
、ｃｏｌｉ ＭＭ ２９４とを文献８に従い、ＴＭ緩衝
液中で１００μｇ／ｍｌのＮＴＧを用いて変異誘発した
後、両菌株のスレオニン要求性変異株を単離した。
（６）ＤＮＡの連結と形質転換
（３）で得たＤＮＡ断片１０μ９と、
（４〉で得たベクターＤＮＡ１０μｇとを、文献４の方
法を塁に０．５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼと共に１０
０μｌの６ ｍＭＭｇＣＩ ２−６ ｍＭβ−メルカプ
トエタノール− ｍＭＴｒｉｓ −ｌ−ＩＣＩ （ ｐｉ−１’７．
６）中で１４℃−晩インキユベートした後、この反応液
の１０μｍを（５〉で作製したＰ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉ
の宿主を文献３の方法でコンピテント化した菌液２００
μｍと混１４℃、４５分間、次いで４２℃、９０秒間、
そして４℃、１分間インキュベートした後、ＬＢ培地を
加えて１１とし、３７℃、１時間１辰どう培養して形質
転換を行なった。
法を塁に０．５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼと共に１０
０μｌの６ ｍＭＭｇＣＩ ２−６ ｍＭβ−メルカプ
トエタノール− ｍＭＴｒｉｓ −ｌ−ＩＣＩ （ ｐｉ−１’７．
６）中で１４℃−晩インキユベートした後、この反応液
の１０μｍを（５〉で作製したＰ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉ
の宿主を文献３の方法でコンピテント化した菌液２００
μｍと混１４℃、４５分間、次いで４２℃、９０秒間、
そして４℃、１分間インキュベートした後、ＬＢ培地を
加えて１１とし、３７℃、１時間１辰どう培養して形質
転換を行なった。
（７）スクリーニング
前項（６）で調製した形質転換体ミクスチャーの菌を７
．５μ９／ｍ１のクロラムフェニコールを含む最小培地
（０．２％グルコース、０。
．５μ９／ｍ１のクロラムフェニコールを含む最小培地
（０．２％グルコース、０。
１％硫酸アンモニウム、０．２％Ｋｆ−１２ＰＯ４、０
、 ７％に２ ＨＰＯ＋ 、 ０． ０ １
％ＭＣＩ ８０４ ・７Ｈ２０，０．０５％クエン
Ｍソーダ、２ ０ ｐｐｍイソロイシン）上に撒き、３
７℃での静置培養で形質転換体の選択培養を行なった。
、 ７％に２ ＨＰＯ＋ 、 ０． ０ １
％ＭＣＩ ８０４ ・７Ｈ２０，０．０５％クエン
Ｍソーダ、２ ０ ｐｐｍイソロイシン）上に撒き、３
７℃での静置培養で形質転換体の選択培養を行なった。
培養３１」目で生じたコロニーを再度クロラムフェニコ
ールを含む最小培地に移植して増殖能を再確認した後、
文献６の方法に従いプラスミドを抽出し、ト１ｉｎｄｌ
［Ｉの消化物を電気泳動にかけた。プラスミド中のイン
サートＤＮＡの長さが８．７ＫｂであるｐＹＵ３００の
複合体プラスミドには第２図に示ずようにインサートＤ
ＮＡの挿入方向が互に逆向きである２種類の存在が確め
られ、図のようにｐＹＵ３０２、ｐＵ Ｙ ３ ０ ２
と名づけだ。
ールを含む最小培地に移植して増殖能を再確認した後、
文献６の方法に従いプラスミドを抽出し、ト１ｉｎｄｌ
［Ｉの消化物を電気泳動にかけた。プラスミド中のイン
サートＤＮＡの長さが８．７ＫｂであるｐＹＵ３００の
複合体プラスミドには第２図に示ずようにインサートＤ
ＮＡの挿入方向が互に逆向きである２種類の存在が確め
られ、図のようにｐＹＵ３０２、ｐＵ Ｙ ３ ０ ２
と名づけだ。
（８）遺伝子の確認
ｐＹ Ｕ ３ ０ ２の８． ７Ｋｂ ｌ−ｆｉｎｄ
ＩＩＩ断片をｐＢＲ３２２のｌ−４ｉｎｄＩ［［に組込
んで作製した複合プラスミドはＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＳＣ
５０７５、同５０７６、同５０７７株を形質転換し、い
ずれの株のスレオン要求性マーカーをレスキューした。
ＩＩＩ断片をｐＢＲ３２２のｌ−４ｉｎｄＩ［［に組込
んで作製した複合プラスミドはＥ．ｃｏｌｉ ＣＧＳＣ
５０７５、同５０７６、同５０７７株を形質転換し、い
ずれの株のスレオン要求性マーカーをレスキューした。
従ってこの複合プラスミドはｔｈｒＡ Ｓｔｈｒ３ 、
ｔｈｒＣ遺伝子を遺伝子を有していると推定された
。
ｔｈｒＣ遺伝子を遺伝子を有していると推定された
。
（９）スレオニン発酵生産性
（７）項の方法で作製したｐＹＬＪ３０２を含有する形
質転換体Ｐ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ２
１１１８王ｈｒ （ ｐｙ ｕ ３ ０ ２ ）
を１０ｍｑ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地
で培養し、文献７の方法で、培養液４００ｍｌ当りｐＹ
Ｕ３０２を１０μｇ得た。これを用いて実施例２（５）
項の方法でＰ，ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２ １ １
１ ８を形質転換した侵、１０ｍｇ／ ！のクロラム
フェニコールを含むＬＢ培地上に生育するクローンを取
得した。
質転換体Ｐ 、ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ２
１１１８王ｈｒ （ ｐｙ ｕ ３ ０ ２ ）
を１０ｍｑ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地
で培養し、文献７の方法で、培養液４００ｍｌ当りｐＹ
Ｕ３０２を１０μｇ得た。これを用いて実施例２（５）
項の方法でＰ，ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２ １ １
１ ８を形質転換した侵、１０ｍｇ／ ！のクロラム
フェニコールを含むＬＢ培地上に生育するクローンを取
得した。
菌体内含有プラスミドがｐＹ Ｕ ３ ０ ２であるこ
とを制限分析により確認しｐＹＬＪ３０２がｐ．ｒｅｔ
ｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２ １ １ １ ８に入った事を
確認した。
とを制限分析により確認しｐＹＬＪ３０２がｐ．ｒｅｔ
ｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２ １ １ １ ８に入った事を
確認した。
１０１１１（］／ＩのりＯラムフェニコールを含む５０
０ｍｌの坂ロフラスコに、培地（８％グルコース、２％
硫酸アンモニウム、０．１％ＫＨ２Ｐ０４、０．０４％
ＭｇＳＯ＋・７Ｈ２０、１０ｐＤＩｌｌ Ｆｅ ８０４
・７Ｈ２ ０、７ｐｐｍ Ｍｎ ｃ＋ ２ 。
０ｍｌの坂ロフラスコに、培地（８％グルコース、２％
硫酸アンモニウム、０．１％ＫＨ２Ｐ０４、０．０４％
ＭｇＳＯ＋・７Ｈ２０、１０ｐＤＩｌｌ Ｆｅ ８０４
・７Ｈ２ ０、７ｐｐｍ Ｍｎ ｃ＋ ２ 。
４ １−１ ２ ０、５０１）Ｉ）ｍＬ−イソロイシン
、４％ＣａＣ０３、ＤＨ７）５０ｍｌ中３０℃５３時間
培養し、培養液中のスレオニン含量をアミノ酸自動分析
機で定量したと．：口Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ
２ １ １ １８のスレオニン含量は０． ２０ （Ｊ
／ｌ 、一方ｐＹＵ３０２を含むＰ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ
Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ２ １ １ １ ８（ ｐＹＵ３０
２）（微工研菌奇第８４７６号）は０、６８ ｑ／ｌで
あり、スレオニン発酵生産性が３、４倍だった。
、４％ＣａＣ０３、ＤＨ７）５０ｍｌ中３０℃５３時間
培養し、培養液中のスレオニン含量をアミノ酸自動分析
機で定量したと．：口Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ
２ １ １ １８のスレオニン含量は０． ２０ （Ｊ
／ｌ 、一方ｐＹＵ３０２を含むＰ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ
Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ２ １ １ １ ８（ ｐＹＵ３０
２）（微工研菌奇第８４７６号）は０、６８ ｑ／ｌで
あり、スレオニン発酵生産性が３、４倍だった。
実施例２
Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ ２ １ １ １ Ｂ
（１）スＩノｔニンアナログＡＨＶ耐性変異株（微工研
菌奇第８０７９号）の染色体ＤＮＡを用い、実施例１に
示したオーキソトロフイ・コンプリメンティジョン法に
基づき、宿主のスレオニン要求性を相補する遺伝子をセ
ルフクローニングした。この時できた複合プラスミドｌ
）ＹＵ３１０、ｐｌＪＹ３１０は第３図に示す大きさと
制限地図を有していた。これら両複合プラスミドはイン
サートＤＮＡの挿入方向が互いに逆向きであった。
（１）スＩノｔニンアナログＡＨＶ耐性変異株（微工研
菌奇第８０７９号）の染色体ＤＮＡを用い、実施例１に
示したオーキソトロフイ・コンプリメンティジョン法に
基づき、宿主のスレオニン要求性を相補する遺伝子をセ
ルフクローニングした。この時できた複合プラスミドｌ
）ＹＵ３１０、ｐｌＪＹ３１０は第３図に示す大きさと
制限地図を有していた。これら両複合プラスミドはイン
サートＤＮＡの挿入方向が互いに逆向きであった。
Ｐ 、 ｒｅｔｔｇｅｒ ｉのＡ Ｉ−Ｉ Ｖ耐性菌（
微工研菌奇第８０７９号）のｐＹＵ３１０による形質転
換体につき、実施例１第（９）項の方法で４５時間培養
しスレオニンの発酵生産性をみたところ、非形質転換体
の生産性が２．３１（］／Ｉであるのに対し、３．１４
ｑ／ｌ となり１．４倍だった。
微工研菌奇第８０７９号）のｐＹＵ３１０による形質転
換体につき、実施例１第（９）項の方法で４５時間培養
しスレオニンの発酵生産性をみたところ、非形質転換体
の生産性が２．３１（］／Ｉであるのに対し、３．１４
ｑ／ｌ となり１．４倍だった。
実施例３
（１）ベクターＤＮＡの調製
宝酒造■製のｐＢＲ３２２を制限酵素Ｈｉｎｄ■で完全
分解した後、文献４に従いアルカリフォスターゼ処理を
施した。
分解した後、文献４に従いアルカリフォスターゼ処理を
施した。
（２）Ｌ−スレオニン遺伝子のクローニング実施例１の
方法に従い、Ｐ、ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２１１１
８のｌ−１ｉｎｄｌ［［染色体ＤＮＡ断片を（１）項で
調製したベクターにライゲーションした後、ライゲーシ
ョンミクスチャーで宿主Ｅ、ＧＯＩｉＭＭ２９４のＬ−
スレオニン要求性変異株を形質転換した後、Ｌ−スレオ
ニン・マーカーがレスキューされた形質転換体クローン
を得た。菌体内プラスミドのうち最小のものは、外来遺
伝子断片は８．７Ｋｂだった。
方法に従い、Ｐ、ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２１１１
８のｌ−１ｉｎｄｌ［［染色体ＤＮＡ断片を（１）項で
調製したベクターにライゲーションした後、ライゲーシ
ョンミクスチャーで宿主Ｅ、ＧＯＩｉＭＭ２９４のＬ−
スレオニン要求性変異株を形質転換した後、Ｌ−スレオ
ニン・マーカーがレスキューされた形質転換体クローン
を得た。菌体内プラスミドのうち最小のものは、外来遺
伝子断片は８．７Ｋｂだった。
（３）Ｌ−スレオニン発酵生産菌の作成前項（２）で１
９だ８．７Ｋｂ断片を、実施例１第（６）項の方法に従
い、ρＹ ＬＪ ３００のＨｉｎｄｎ［部位に入れて複
合プラスミドｐＹＵ３０２を成し、これヲｐ、ｒｅｔｔ
ｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２１１１８に導入した。
９だ８．７Ｋｂ断片を、実施例１第（６）項の方法に従
い、ρＹ ＬＪ ３００のＨｉｎｄｎ［部位に入れて複
合プラスミドｐＹＵ３０２を成し、これヲｐ、ｒｅｔｔ
ｇｅｒｉ ＡＴＣＣ２１１１８に導入した。
実施例１第（９）項に記した方法でこの複合プラスミド
を有する形質転換体を４８時間培養し、し−スレオニン
の発酵生産性をみたところ、非形質転換体の生産性が、
０．１８（］／ｌであるのに対し、０．７０ （Ｊ／ｌ
となり３．９倍だった。
を有する形質転換体を４８時間培養し、し−スレオニン
の発酵生産性をみたところ、非形質転換体の生産性が、
０．１８（］／ｌであるのに対し、０．７０ （Ｊ／ｌ
となり３．９倍だった。
参考文献
１、斉藤日向：蛋白質・核酸・Ｍ素 １１，４４６〜４
５０ （１９６６） ２ 、 ■ 、 ト１ｃｒｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ
ａｌ ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
５０ （１９６６） ２ 、 ■ 、 ト１ｃｒｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ
ａｌ ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
△ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７１．ｐ ３４５５〜
３、重定勝哉：細胞工学２，６１６〜６２６４、Ｒ，Ｗ
、ＤａＶｉＳら編： Ａ ｄｖａｎｃｃｄ ８ ａｃｔ
ｅｒｉａｌ （３ｅｎｅｔｉｃｓ、 Ａ ｔｖｌ
ａｎｕａｌ ｆｏｒ ＱｅｎｅｔｉｃＥｒ＋ｏｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ ｐ７３８〜７３９ （１９８０）５、
同上ｐ２２７〜２３０ ６、 ｌ−１，Ｃ，Ｂ ｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ
Ｊ 、 Ｄｏｌｙ ： Ｎｕｃｆｅｔｅ Ａｃ１
ｄ Ｒｅｓ ７．１５１３〜１５２３ （１７、
ＴｏＭａｎｉａｔｉｓら編： Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃ１ｏｎｉｎｑ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ ｐ８６〜９６ （１９８２）
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔ−１ａｒｂｏｒ Ｌ ａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ。
３、重定勝哉：細胞工学２，６１６〜６２６４、Ｒ，Ｗ
、ＤａＶｉＳら編： Ａ ｄｖａｎｃｃｄ ８ ａｃｔ
ｅｒｉａｌ （３ｅｎｅｔｉｃｓ、 Ａ ｔｖｌ
ａｎｕａｌ ｆｏｒ ＱｅｎｅｔｉｃＥｒ＋ｏｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ ｐ７３８〜７３９ （１９８０）５、
同上ｐ２２７〜２３０ ６、 ｌ−１，Ｃ，Ｂ ｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ
Ｊ 、 Ｄｏｌｙ ： Ｎｕｃｆｅｔｅ Ａｃ１
ｄ Ｒｅｓ ７．１５１３〜１５２３ （１７、
ＴｏＭａｎｉａｔｉｓら編： Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃ１ｏｎｉｎｑ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ ｐ８６〜９６ （１９８２）
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔ−１ａｒｂｏｒ Ｌ ａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ。
Ｎ ｅｗ Ｙ ａｒｋ
８、石川辰夫編パ微生物遺伝子学実験法′°ｐ８６〜８
８（１９８２）井守出版
８（１９８２）井守出版
第１図はプラスミドｐＹＵ３００の制限地図を、第２図
はプラスミドｐＹＵ３０２、プラスミドｐｔＪ Ｙ ３
０２の制限地図を、第３図はプラスミドｐＹＵ３１０．
ｐＵＹ３１０の制限地図を示す。 特許出願人 東 し 株 式 会 社第１図
はプラスミドｐＹＵ３０２、プラスミドｐｔＪ Ｙ ３
０２の制限地図を、第３図はプラスミドｐＹＵ３１０．
ｐＵＹ３１０の制限地図を示す。 特許出願人 東 し 株 式 会 社第１図
Claims (8)
- （１）プロビデンシア属の菌株由来であるＬ−スレオニ
ン生産を司る遺伝子を含むＤＮＡ。 - （２）プロビデンシア属の菌株がプロビデンシア レッ
トゲリである特許請求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ。 - （３）プロビデンシア属の菌株由来であるＬ−スレオニ
ン生産を司る遺伝子を含むＤＮＡによって組換えられた
組換え体ＤＮＡ。 - （４）組換え体ＤＮＡがＬ−スレオニン生産を司る遺伝
子を含むＤＮＡおよびプラスミドｐＹＵ３００の複合体
である特許請求の範囲第（３）項記載の組換え体ＤＮＡ
。 - （５）プロビデンシア属の菌株がプロビデンシア レッ
トゲリである特許請求の範囲第（３）項記載の組換え体
ＤＮＡ。 - （６）組換え体ＤＮＡがｐＹＵ３０２、ｐＵＹ３０２、
ｐＹＵ３１０またはｐＵＹ３１０である特許請求の範囲
第（３）項記載の組換え体ＤＮＡ。 - （７）プロビデンシア属の菌のＬ−スレオニン要求性変
異株を宿主とし、プロビデンシア属の菌内で複製するプ
ラスミドをベクターとし、プロビデンシア属の菌のＬ−
スレオニン発酵生産を司る遺伝子をオーキソトロフィー
・コンプリメンテイション法でセルフクローニングする
ことを特徴とする組換え体ＤＮＡの製造法。 - （８）大腸菌のＬ−スレオニン要求変異株を宿主とし、
大腸菌のプラスミドをベクターに用いてオーキソトロフ
ィー・コンプリメンテイション法で、プロビデンシア属
のＬ−スレオニン発酵生産を司る遺伝子をクローニング
し、該遺伝子をプロビデンシア属の菌株中で複製するプ
ラスミドに連結することを特徴とする組換え体ＤＮＡの
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60230994A JPS6291185A (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | Ｌ−スレオニン生産を司る遺伝子を含む組換え体ｄｎａおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60230994A JPS6291185A (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | Ｌ−スレオニン生産を司る遺伝子を含む組換え体ｄｎａおよびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6291185A true JPS6291185A (ja) | 1987-04-25 |
Family
ID=16916566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60230994A Pending JPS6291185A (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | Ｌ−スレオニン生産を司る遺伝子を含む組換え体ｄｎａおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6291185A (ja) |
-
1985
- 1985-10-18 JP JP60230994A patent/JPS6291185A/ja active Pending
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