RU2652877C1 - Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом, и способ микробиологического синтеза молочной кислоты - Google Patents
Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом, и способ микробиологического синтеза молочной кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2652877C1 RU2652877C1 RU2016150251A RU2016150251A RU2652877C1 RU 2652877 C1 RU2652877 C1 RU 2652877C1 RU 2016150251 A RU2016150251 A RU 2016150251A RU 2016150251 A RU2016150251 A RU 2016150251A RU 2652877 C1 RU2652877 C1 RU 2652877C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- transformant
- chromosome
- marker gene
- pombe
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 title claims abstract description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims 5
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 title description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 66
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 55
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 49
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims abstract description 28
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 28
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims abstract description 23
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims abstract description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 101150104734 ldh gene Proteins 0.000 claims description 27
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims description 21
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims description 21
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims description 21
- 101150021974 Adh1 gene Proteins 0.000 claims description 18
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 12
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 claims description 8
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 claims description 8
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 claims description 8
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 claims description 7
- 241000186713 Lactobacillus amylovorus Species 0.000 claims description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 7
- 101100240657 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) swoF gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100536883 Legionella pneumophila subsp. pneumophila (strain Philadelphia 1 / ATCC 33152 / DSM 7513) thi5 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100240662 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gtt-1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150043338 Nmt1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100001031 Acetobacter aceti adhA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000000428 Lactate Dehydrogenases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010080864 Lactate Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims 5
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 4
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 101150096292 Ppme1 gene Proteins 0.000 description 4
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 4
- 101150052859 Slc9a1 gene Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 4
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 101150069091 nae1 gene Proteins 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 2
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- -1 succinic Chemical compound 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
- C12N1/185—Saccharomyces isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен способ модификации дрожжей S. pombe, включающий трансформацию в клетку гена, кодирующего Cre-рекомбиназу, под контролем индуцибельного промотора совместно с маркерным геном, интеграцию экспрессионной кассеты, содержащей фрагмент ДНК и маркерный ген, фланкированный loxP сайтами, выщепление маркерного гена по loxP-сайтам за счет индукции синтеза Cre-рекомбиназы. При трансформации ген, кодирующий Cre-рекомбиназу, совместно с маркерным геном интегрируют в состав хромосомы, при этом маркерный ген фланкирован lохР сайтами, а после трансформации до интеграции кассеты дополнительно осуществляют выщепление маркерного гена по loxP-сайтам. Предложен также трансформант для получения молочной кислоты, полученный указанным способом и в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов алкогольдегидрогеназ, а в хромосому интегрированы один или несколько генов лактатдегидрогеназ рода Lactobacillus. С использованием указанного трансформанта осуществляют способ микробиологического синтеза молочной кислоты. Предложены также штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4248, штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4249, штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4250, являющиеся вариантами указанного трансформанта и продуцентами молочной кислоты. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии, а именно к способам конструирования штаммов Schizosaccharomyces pombe.
Разработка способов генной и метаболической инженерии для новых объектов биотехнологии - штаммов промышленно-значимых микроорганизмов представляется актуальной задачей. Дрожжи S. pombe являются перспективным микроорганизмом для конструирования на их основе штаммов-продуцентов белков, органических кислот, в частности янтарной и молочной, и других соединений [US 2015232895, US 20120214214, RU 2268304, RU 2539092].
Известен способ модификации штаммов путем последовательного многократного введения фрагментов ДНК в хромосому клеток с использованием Cre-loxP системы. Система состоит из фермента Cre-рекомбиназы, которая рекомбинирует пару коротких выбранных последовательностей, называемых loxP-последовательностями. Cre-lox система известна как сайт-специфическая рекомбинантная технология, которая позволяет многократно вводить фрагменты ДНК в хромосому микроорганизмов, используя два маркерных гена, и широко применяется для внесения делеций, вставок, транслокаций и инверсий в специфические сайты клеточной ДНК [Journal of Biotechnology 131 (2007) 20-26; Nucleic Acids Research, 2002, V. 30, No. 6, p 2-8].
Ближайшим аналогом заявляемого способа является способ, описанный в [Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (3), 545-550, 2004] и предусматривающий использование Cre-lox системы бактериофага Р1 для введения множественных делеций в штамм S. pombe.
Описанный способ включает следующие стадии:
- трансформация клеток S. pombe репликативной плазмидой, содержащей ген Cre-рекомбиназы под индуцибельным ослабленным промотором nmt 41 совместно с маркерным геном;
- совместная интеграция фрагмента ДНК, гомологичного к выбранному участку хромосомы, и другого маркерного гена, окруженного loxP сайтами, в состав хромосомы дрожжей S. pombe;
- выщепление второго маркерного гена по loxP-сайтам за счет индукции синтеза Cre-рекомбиназы, что приводит к делеции выбранного участка хромосомы.
Для делеций другого участка хромосомы снова проводят совместную интеграцию фрагмента ДНК гомологичного к выбранному участку и второго маркерного гена с последующим его выщеплением при индукции работы Cre-рекомбиназы.
Недостатками такого способа являются:
- необходимость использования двух маркерных генов, что часто предъявляет дополнительные специальные требования к модифицируемому штамму и существенно усложняет генетическую работу;
- необходимость выщепления репликативной плазмиды с локализованным на ней геном Cre-рекомбиназы при конструировании штаммов-продуцентов (в противном случае штамм несет ген устойчивости к антибиотику, что осложняет его использование в промышленности, а присутствие плазмиды приводит к снижению выхода целевого продукта);
- необходимость использования ослабленных синтетических промоторов, что требует дополнительных затрат на их синтез (использование природных индуцибельных промоторов невозможно из-за сильного подавления роста клеток).
Задачей данного изобретения является расширение арсенала способов модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe, а также расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих молочную кислоту.
Поставленная задача решена путем разработки способа модификации дрожжей S. pombe, включающего в себя:
- трансформацию дрожжей интегративной экспрессионной кассетой, содержащей ген Cre-рекомбиназы под индуцибельным промотором и маркерный ген, фланкированный loxP сайтами (при этом ген Cre-рекомбиназы совместно с маркерным геном, фланкированным loxP сайтами, интегрируется в состав хромосомы);
- выщепление маркерного гена по loxP-сайтам за счет индукции синтеза Cre-рекомбиназы;
- интеграцию кассеты, содержащей фрагмент ДНК и маркерный ген, фланкированный loxP сайтами, при этом маркерным геном может являться тот же ген, который используется для интеграции гена Cre-рекомбиназы, а фрагментом ДНК может являться не только последовательность для гомологичной интеграции, но и ген для экспрессии;
- выщепление маркерного гена по loxP-сайтам за счет индукции синтеза Cre-рекомбиназы.
В результате получают трансформант, несущий в составе хромосомы интегрированный фрагмент ДНК.
В качестве индуцибельного промотора может быть использован любой подходящий для работы в S. pombe промотор, например nmt1, nmt41, nmt81, или другие [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/vectortable.html].
Последовательное многократное введение фрагментов ДНК в состав хромосомы дрожжей S. pombe осуществляют путем повторной совместной интеграции необходимого фрагмента ДНК и выбранного маркерного гена с последующим его выщеплением.
Способ применим для конструирования штаммов, продуцирующих органические кислоты, ферменты и другие биологически-активные соединения путем многократного введения необходимых фрагментов ДНК.
Поставленная задача также решена путем конструирования предложенным способом трансформантов дрожжей Schizosaccharomyces pombe, в которых инактивирован или делетирован один или несколько генов алкогольдегидрогеназ, а в хромосому интегрированы один или несколько генов лактатдегидрогеназ. Полученные трансформанты продуцируют молочную кислоту.
В приведенных примерах в качестве гена для инактивации используют ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в качестве ДНК фрагментов - гены ldh, кодирующие аминокислотные последовательности лактатдегидрогеназ Lactobacillus plantarum [GenBank: ACJ15334.1], Lactobacillus acidophilus [NCBI: WP 003549000.1], Lactobacillus amylovorus [NCBI: WP 013437112.1].
Задача решена также тем, что заявлен способ микробиологического синтеза молочной кислоты, включающий культивирование в подходящих условиях заявленного трансформанта дрожжей Schizosaccharomyces pombe, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов алкогольдегидрогеназ, а в хромосому интегрированы один или несколько генов лактатдегидрогеназ.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:
Фиг. 1 Экспрессионная интегративная плазмида padh1-nmt1-Cre.
Фиг. 2 Экспрессионная интегративная плазмида pCMV-pla-Tf1.
Фиг. 3 Экспрессионная интегративная плазмида pCMV-aci-Tf1.
Фиг. 4 Экспрессионная интегративная плазмида pCMV-amy-Tf1.
Фиг. 5 Электрофореграмма ПЦР-анализа трансформантов по примерам 1-3
Пример 1. Получение трансформанта дрожжей S. pombe с инактивированным геном adh1, в хромосому которого интегрировано несколько копий гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum.
1.1 Трансформация дрожжей интегративной экспрессионной кассетой, содержащей ген Cre-рекомбиназы
Методом клонирования [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.] генетических элементов в коммерческий вектор pUC19 получают экспрессионную интегративную плазмиду padh1-nmt1-Cre (фиг. 1). В качестве источника гена Cre-рекомбиназы используют ДНК бактериофага Р1 (ВКПМ РН-1029). Синтезируют ДНК гена cre методом ПЦР с использованием праймеров pr-cre-1 и pr-cre-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1, соответственно:
pr-cre1 
pr-cre-2 
Плазмида (фиг. 1) содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Ген Cre-рекомбиназы фага Р1 под контролем nmt1 промотора.
3. Область для интеграции - фрагменты нуклеотидной последовательности гена алкогольдегидрогеназы adh1 дрожжей S. pombe.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду padh1-nmt1-Cre обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Sac1, Kpn1. Полученные фрагменты плазмиды разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают фрагмент плазмиды, размером 6024 п.о. Полученный фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген Cre-рекомбиназы под контролем nmt1 промотора; маркерный ген kanMX, фланкированный сайтами lох 66 и lох 71 и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику G418; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют фрагменты гена adh1, что позволяет его (ген adh1) инактивировать.
Дрожжи S. pombe трансформируют указанной интегративной экспрессионной кассетой методом электропорации. (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html)
Для получения трансформантов используют штамм S. pombe ВКПМ Y-3106, который предварительно выращивают в жидкой питательной среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) до концентрации 1×108 клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут, затем промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1М сорбитола.
Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YES (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html) с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°C. В качестве селективного агента добавляют антибиотик G418 в количестве 130 мкг/мл. Отбирают трансформанты с отключенным геном adh1 по стандартной методике [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/disruptions.html].
1.2 Выщепление маркерного гена
Выщепление маркерного гена по loxP-сайтам осуществляют за счет индукции синтеза Cre-рекомбиназы. Трансформанты выращивают в течение 24 ч в жидкой питательной среде YPD с добавлением 2% глюкозы. Дрожжевые клетки отмывают трижды в равном объеме стерильной дистиллированной воды от тиамина, присутствующего в среде и ингибирующего работу nmt1 промотера. Далее клетки помещают в минеральную среду YNB (Himedia), без содержания тиамина, и инкубируют в течение 8 часов. Далее клетки высевают на агаризованную питательную среду YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %). Инкубируют в течение 48 ч при 30°С. Полученные колонии реплицируют на чашку с агаризованной средой YPD и 2% глюкозой без селективного давления и аналогичную чашку с антибиотиком G418. Отбирают колонии, не способные к росту на чашке, содержащей антибиотик G418. Полученные таким образом трансформанты не содержат маркерный ген kanMX.
1.3 Интеграция кассеты, содержащей фрагмент ДНК (ген ldh Lactobacillus plantarum) и маркерный ген, в хромосому дрожжей S. pombe
Интегративную экспрессионную плазмиду pCMV-pla-Tf1, представленную на фиг. 2, получают методом клонирования. В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus plantarum ВКПМ В-7636. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-pla-1 и pr-pla-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1, соответственно:
pr-pla-1 
pr-pla-2 
Экспрессионная интегративная плазмида pCMV-pla-Tf1 (фиг. 2) содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Фрагмент ДНК (ген ldh Lactobacillus plantarum) под контролем CMV промотора.
3. Область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Tf1.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-pla-Tf1 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1. Полученные фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают фрагмент, размером 5320 п.о. Полученный фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе фрагмент ДНК, кодирующий аминокислотную последовательность гена ldh Lactobacillus plantarum, под контролем CMV промотора; маркерный ген kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71 и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику G418; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1.
Трансформацию дрожжей S. pombe указанной интегративной экспрессионной кассетой и селекцию трансформантов осуществляют, как описано в п. 1.1.
Продукцию молочной кислоты трансформантами оценивают в чашечном тесте с добавлением мела по зонам гидролиза. В тесте используют агаризованную среду YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %) и мела (0,5 мас. %). В качестве контроля используют штамм Schizosaccharomyces pombe Y-3106.
Наиболее продуктивные трансформанты, показавшие наибольшее соотношение диаметра зоны гидролиза к диаметру колонии на чашках с мелом, отбирают и используют для выщепления маркерного гена по способу, описанному в п. 1.2.
Трансформанты, потерявшие маркерный ген, культивируют в жидкой питательной среде для определения продукции молочной кислоты.
Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке с 250 об/мин. Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10 об.
Ферментацию проводят при 30°С на качалке с 150 об/мин в питательной среде состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное, с добавлением глюкозы (18 мас. %) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Ферментацию продолжают в течение 48 часов.
Концентрацию молочной кислоты определяют согласно методу ВЭЖХ [Acta Biotechnol. 1990. v. 10(5) p. 459-468]. Концентрацию этанола определяют согласно методу ГХ [Chromatogr. Sci. 2009. v. 47(4). p. 272-278].
По результатам ферментации отбирают трансформант №1, который при культивировании в пробирках позволяет получить молочную кислоту в количестве 39 г/л культуральной жидкости, продукция побочного продукта этанола составляет 25 г/л культуральной жидкости.
1.4 Последовательное многократное введение фрагментов ДНК в состав хромосомы дрожжей S. pombe.
Для повторного введения фрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность гена ldh Lactobacillus plantarum, в состав хромосомы дрожжей S. pombe используют трансформант №1. Клетки трансформанта №1 готовят для трансформации и трансформируют интегративной экспрессионной кассетой, полученной из плазмиды pCMV-pla-Tf1, как описано в п.п. 1.1 и 1.3. Отбирают наиболее продуктивные трансформанты, как описано в п. 1.3. Далее проводят выщепление маркерного гена kanMX, как описано в п. 1.2.
В результате повторного введения фрагмента ДНК (ген ldh Lactobacillus plantarum) в состав хромосомы дрожжей S. pombe отбирают трансформант №2, способный продуцировать молочную кислоту в количестве 53 г/л, продукция побочного продукта этанола составляет 19 г/л за 48 ч культивирования. Условия культивирования описаны в п. 1.3.
Для последующего введения в хромосому гена ldh Lactobacillus plantarum используют трансформант №2 и вышеописанную последовательность действий. В результате получают трансформанты, в которых инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрировано несколько копий гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum. Отбирают трансформант №3, способный продуцировать молочную кислоту.
Пример 2. Получение трансформанта дрожжей S. pombe с инактивированным геном adh1, в хромосому которого интегрирован ген ldh Lactobacillus plantarum и ген ldh Lactobacillus acidophilus.
Получают интегративную экспрессионную плазмиду pCMV-aci-Tf1, представленную на фиг. 3. Плазмиду pCMV-aci-Tf1 получают методом клонирования генетических элементов в коммерческий вектор pUC19. В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-4625. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-aci-1 и pr-aci-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1, соответственно:
pr-aci-1 5'-aaagctagcatggcaagagttgaaaaa-3',
pr-aci-2 5'-aaagtttaaacttattgacgaaccttaacgc-3'.
Экспрессионная интегративная плазмида pCMV-aci-Tf1 (фиг. 3) содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Фрагмент ДНК (ген ldh Lactobacillus acidophilus) под контролем CMV промотора
3. Область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Tf1.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-aci-Tf1 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1. Полученные фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают фрагмент, размером 5326 п.о. Полученный фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген ldh Lactobacillus acidophilus под контролем CMV промотора; маркерный ген kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71 и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику G418; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1.
Для введения гена ldh Lactobacillus acidophilus в состав хромосомы дрожжей S. pombe используют клетки трансформанта №3 (см. пример 1). Клетки готовят для трансформации, трансформируют интегративной экспрессионной кассетой, полученной из плазмиды pCMV-aci-Tf1, и отбирают трансформанты, как описано в п. 1.1. Выщепление маркерного гена по loxP-сайтам осуществляют, как описано в п. 1.2. Получают трансформанты, в которых инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрирован ген ldh Lactobacillus plantarum и ген ldh Lactobacillus acidophilus.
Продукцию молочной кислоты трансформантами оценивают по п. 1.3.
По результатам ферментации (условия культивирования описаны в п. 1.3) отобраны трансформанты №4 и №5, которые при культивировании в пробирках позволяют получить молочную кислоту в количестве 93 г/л и 91 г/л культуральной жидкости за 48 ч, соответственно, причем содержание побочного продукта - этанола - не превышает 10 г/л культуральной жидкости.
Трансформант №4 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Schizosaccharomyces pombe A4Km-plac1 - продуцент молочной кислоты - под регистрационным номером ВКПМ Y-4249.
Трансформант №5 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Schizosaccharomyces pombe A4Km-plac2 - продуцент молочной кислоты - под регистрационным номером ВКПМ Y-4250.
Штаммы Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4249 и ВКПМ Y-4250 характеризуются следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки
Для описания культурально-морфологических признаков использовали среды "Malt extract", "Malt agar" и картофельно-кукурузный агар [Amsterdam, Elsevier Sci. Publ. B.V., 1984, p. 421].
После трех дней культивирования на среде "Malt extract" культура образует клетки округлые, элипсоидальные и цилиндрические (3,0-5,0)×(5,0-15,0-24,0) мкм. Осадок формируется.
На среде "Malt agar" на 5 сутки образует некрупные колонии белого или слегка кремоватого оттенка. Поверхность колоний гладкая, край ровный. Вегетативное размножение - деление клетки пополам.
Физиолого-биохимические признаки
Культура способна сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу. Не способна к брожению галактозы, лактозы и мелибиозы. Ассимилирует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу, раффинозу. Не ассимилирует галактозу, целлобиозу, трегалозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, эритрит, рибитол, маннит, крахмал, янтарную, лимонную кислоты, инозит культура не ассимилирует нитраты, не способна расти на среде без витаминов.
Оптимальные условия для размножения штамма.
Температура 30°С, рН 6, полная дрожжевая среда [Захаров А. и др. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. - Л., Наука, 1984, стр. 144].
Штамм хранится в лиофилизированном виде или в парах жидкого азота.
Полученные штаммы Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4249 и ВКПМ Y-4250 сохраняют способность к образованию молочной кислоты после 18 последовательных пересевов на полноценной среде.
Заявляемые штаммы при выращивании в пробирках способны продуцировать молочную кислоту в количестве 93 г/л и 91 г/л культуральной жидкости, причем содержание побочного продукта - этанола - не превышает 10 г/л культуральной жидкости.
Пример 3. Получение трансформанта дрожжей S. pombe с инактивированным геном adh1, в хромосому которого интегрирован ген ldh Lactobacillus plantarum и ген ldh Lactobacillus amylovorus.
Получают интегративную экспрессионную плазмиду pCMV-amy-Tf1, представленную на фиг. 4. Плазмиду pCMV-amy-Tf1 получают методом клонирования генетических элементов в коммерческий вектор pUC19. В качестве источника гена ldh используют тотальную геномную ДНК Lactobacillus amylovorus, DSM 20531. Синтезируют ДНК гена ldh методом ПЦР с использованием праймеров pr-amy-1 и pr-amy-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции (выделены жирным шрифтом) для клонирования - Nhe1 и Pme1, соответственно:
pr-amy-1 
pr-amy-2 
Экспрессионная интегративная плазмида pCMV-amy-Tf1 (фиг. 4) содержит в своем составе следующие генетические элементы:
1. Дрожжевой селективный маркер kanMX, фланкированный сайтами lох 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора.
2. Ген ldh Lactobacillus amylovorus под контролем CMV промотора.
3. Область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Tf1.
4. Селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.
5. Бактериальный pUC origin.
Для получения интегративной экспрессионной кассеты плазмиду pCMV-amy-Tf1 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1. Полученные фрагменты разделяют в агарозном геле, выделяют и очищают фрагмент, размером 5319 п.о. Полученный ДНК фрагмент является интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген ldh Lactobacillus amylovorus под контролем CMV промотора; маркерный ген kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, и обуславливающий у дрожжей S. pombe устойчивость к антибиотику G418; и плечи для гомологичной интеграции в хромосому. В качестве плечей для интеграции используют нуклеотидную последовательность ретротранспозона Tf1.
Для введения гена ldh Lactobacillus amylovorus в состав хромосомы дрожжей S. pombe используют клетки трансформанта №3. Клетки готовят для трансформации, трансформируют интегративной экспрессионной кассетой, полученной из плазмиды pCMV-amy-Tf1, и отбирают трансформанты, как описано в п. 1.1. Выщепление маркерного гена по loxP-сайтам осуществляют, как описано в п. 1.2. Получают трансформанты, в которых инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрировано несколько копий гена ldh Lactobacillus plantarum и одна или несколько копий гена ldh Lactobacillus amylovorus.
Продукцию молочной кислоты трансформантами оценивают по п. 1.3.
По результатам ферментации (условия культивирования описаны в п. 1.3) отобран трансформант №6, который при культивировании в пробирках позволяет получить молочную кислоту в количестве 89 г/л культуральной жидкости за 48 ч, причем содержание побочного продукта - этанола - не превышает 10 г/л культуральной жидкости.
Трансформант №6 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Schizosaccharomyces pombe A4Km-plam - продуцент молочной кислоты, регистрационный номер ВКПМ Y-4248.
Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4248 характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки
Для описания культурально-морфологических признаков использовали среды "Malt extract", "Malt agar" и картофельно-кукурузный агар [Amsterdam, Elsevier Sci. Publ. B.V., 1984, p.421].
После трех дней культивирования на среде "Malt extract" культура образует клетки округлые, элипсоидальные и цилиндрические (3,0-5,0)×(5,0-15,0-24,0) мкм. Осадок формируется.
На среде "Malt agar" на 5 сутки образует некрупные колонии белого или слегка кремоватого оттенка. Поверхность колоний гладкая, край ровный. Вегетативное размножение - деление клетки пополам.
Физиолого-биохимические признаки
Культура способна сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу. Не способна к брожению галактозы, лактозы и мелибиозы. Ассимилирует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу, раффинозу. Не ассимилирует галактозу, целлобиозу, трегалозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, эритрит, рибитол, маннит, крахмал, янтарную, лимонную кислоты, инозит культура не ассимилирует нитраты, не способна расти на среде без витаминов.
Оптимальные условия для размножения штамма.
Температура 30°С, рН 6, полная дрожжевая среда [Захаров А. и др. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. - Л., Наука, 1984, стр. 144].
Штамм хранится в лиофилизированном виде или в парах жидкого азота.
Полученный штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4248 сохраняет способность к образованию молочной кислоты после 18 последовательных пересевов на полноценной среде.
Заявляемый штамм при выращивании в пробирках способен продуцировать молочную кислоту в количестве 89 г/л культуральной жидкости за 48 ч культивирования, причем содержание побочного продукта - этанола - не превышает 10 г/л культуральной жидкости.
Важно отметить, что общей характеристикой для всех трансформантов, полученных по примерам 1-3, является следующее. Если для любого из полученных в примерах трансформантов при проведении ПЦР использовать его хромосому и проверочные селективные праймеры Pr-1 и Pr-2
Pr-1 5'-gacccaagctggctagccacc-3',
Pr-2 5'-tggctggcaactagaaggcacag-3',
то образующийся в ходе полимеразной цепной реакции ДНК фрагмент характеризуется размером, попадающим в интервал 1031-1050 п.н., что дает возможность осуществлять их идентификацию.
На фиг. 5 приведена электрофореграмма ПЦР-анализа полученных трансформантов (примеры 1-3, К-контроль). Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе используют молекулярный маркер O'GeneRuler 1000 bp DNA Ladder, размер фрагментов (сверху вниз) 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.
Пример 4. Способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием трансформанта с инактивированным геном adh1, в хромосому которого интегрирован ген ldh Lactobacillus plantarum.
В качестве посевной культуры используют клетки трансформанта №3 по примеру 1.
Посевную культуру выращивают при 30°С в течение 2 суток на чашках Петри на агаризованной среде YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %).
Для получения инокулята пробирки (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %) засевают посевной культурой. Пробирки инкубируют на качалке (250 об/мин) при 30°С в течение 24 ч.
Колбу, объемом 750 мл, содержащую 95 мл жидкой среды состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное с добавлением глюкозы (18 мас. %), засевают 5 мл инокулята.
Культивирование осуществляют на качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 30°С в течение 96 часов. Пробы отбирают каждые 12 часов стерильно по 1 мл для определения концентрации биомассы и молочной кислоты в культуральной жидкости, а также контроля стерильности. Трансформант секретирует молочную кислоту в количестве 100 г/л культуральной жидкости культивирования, продукция побочного продукта этанола составляет 8 г/л.
Таким образом, заявляемый способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe
- позволяет упростить последовательное введение различных фрагментов ДНК (в том числе и экспрессируемых) в состав хромосомы дрожжей, используя один и тот же маркерный ген, что существенно облегчает работу с прототрофными штаммами и не требует использования штаммов с ауксотрофными мутациями в ходе конструирования;
- не включает стадию выщепления плазмид помощников, содержащих ген Cre рекомбиназы, что существенно ускоряет и упрощает конструирование штаммов и позволяет получать штаммы-продуценты, не содержащие ген устойчивости к антибиотикам;
- в отличие от известного способа, позволяет в ходе конструирования использовать сильные природные индуцибельные промоторы, что избавляет от необходимости осуществлять синтез искусственных последовательностей.
Claims (13)
1. Способ модификации дрожжей S. pombe, включающий трансформацию в клетку гена, кодирующего Cre-рекомбиназу, под контролем подходящего для работы в S. pombe индуцибельного промотора совместно с маркерным геном, интеграцию экспрессионной кассеты, содержащей фрагмент ДНК и маркерный ген, фланкированный loxP сайтами, выщепление маркерного гена по loxP-сайтам за счет индукции синтеза Cre-рекомбиназы, отличающийся тем, что при трансформации ген, кодирующий Cre-рекомбиназу, совместно с маркерным геном интегрируют в состав хромосомы, при этом маркерный ген фланкирован lохР сайтами, а после трансформации до интеграции кассеты дополнительно осуществляют выщепление маркерного гена по loxP-сайтам.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве индуцибельного промотора используют природный nmt1 промотор.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для интеграции гена, кодирующего Cre-рекомбиназу, и интеграции фрагмента ДНК используют один и тот же маркерный ген.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что интегрируемый фрагмент ДНК экспрессируют в S. pombe.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что интеграцию кассеты и выщепление маркерного гена по loxP-сайтам проводят многократно.
6. Трансформант дрожжей S. pombe, для получения молочной кислоты, полученный способом по п.1, в котором инактивирован или делетирован один или несколько генов алкогольдегидрогеназ, а в хромосому интегрированы один или несколько генов лактатдегидрогеназ рода Lactobacillus.
7. Трансформант по п.6, в котором инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрирована одна или несколько копий гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus plantarum.
8. Трансформант по п.6, в котором инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрирована одна или несколько копий гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus plantarum и одна или несколько копий гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus acidophilus.
9. Трансформант по п.6, в котором инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрирована одна или несколько копий гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus plantarum и одна или несколько копий гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus amylovorus.
10. Штамм - трансформант Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4248 по пп.6 и 9, в котором инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрированы три копии гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus plantarum и одна копия гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus amylovorus - продуцент молочной кислоты.
11. Штамм - трансформант Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4249 по пп.6 и 8, в котором инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрированы три копии гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus plantarum и одна копия гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus acidophilus - продуцент молочной кислоты.
12. Штамм - трансформант Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4250 по пп.6 и 9, в котором инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрированы три копии гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus plantarum и одна копия гена лактатдегидрогеназы ldh Lactobacillus amylovorus - продуцент молочной кислоты.
13. Способ микробиологического синтеза молочной кислоты, включающий культивирование дрожжей Schizosaccharomyces pombe в питательной среде, отличающийся тем, что для культивирования используют трансформант по п.6.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016150251A RU2652877C9 (ru) | 2016-12-21 | 2016-12-21 | Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016150251A RU2652877C9 (ru) | 2016-12-21 | 2016-12-21 | Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015155000A Division RU2015155000A (ru) | 2015-12-22 | 2015-12-22 | Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2652877C1 true RU2652877C1 (ru) | 2018-05-03 |
| RU2652877C9 RU2652877C9 (ru) | 2018-06-26 |
Family
ID=62105292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016150251A RU2652877C9 (ru) | 2016-12-21 | 2016-12-21 | Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2652877C9 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020229677A1 (en) * | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Bifodan A/S | Inducible plasmid-self-destruction assited recombination |
| RU2752896C1 (ru) * | 2020-12-04 | 2021-08-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий L-молочную кислоту, содержащий в составе хромосомы гены трех различных гетерологичных лактатдегидрогеназ |
| WO2023004336A1 (en) * | 2021-07-22 | 2023-01-26 | Archer Daniels Midland Company | A genetically engineered yeast producing lactic acid |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2268304C1 (ru) * | 2004-06-24 | 2006-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Способ микробиологического синтеза молочной кислоты и рекомбинантный штамм дрожжей schizosaccharomyces pombe для его осуществления |
| RU2539092C1 (ru) * | 2013-09-27 | 2015-01-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ |
| EP2468860B1 (en) * | 2009-08-21 | 2015-11-25 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
-
2016
- 2016-12-21 RU RU2016150251A patent/RU2652877C9/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2268304C1 (ru) * | 2004-06-24 | 2006-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Способ микробиологического синтеза молочной кислоты и рекомбинантный штамм дрожжей schizosaccharomyces pombe для его осуществления |
| EP2468860B1 (en) * | 2009-08-21 | 2015-11-25 | Asahi Glass Company, Limited | Transformant and process for production thereof, and process for production of lactic acid |
| RU2539092C1 (ru) * | 2013-09-27 | 2015-01-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| IWAKI T. A Set of loxP Marker Cassettes for Cre-mediated Multiple Gene Disruption in Schizosaccharomyces pombe // Biosci. Biotechnol. Biochem., 2004, 68 (3), 545-550. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020229677A1 (en) * | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Bifodan A/S | Inducible plasmid-self-destruction assited recombination |
| RU2752896C1 (ru) * | 2020-12-04 | 2021-08-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий L-молочную кислоту, содержащий в составе хромосомы гены трех различных гетерологичных лактатдегидрогеназ |
| WO2023004336A1 (en) * | 2021-07-22 | 2023-01-26 | Archer Daniels Midland Company | A genetically engineered yeast producing lactic acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2652877C9 (ru) | 2018-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5354672A (en) | Materials and methods for hypersecretion of amino acids | |
| JPS62104585A (ja) | ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾 | |
| JP7473137B2 (ja) | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 | |
| RU2652877C1 (ru) | Способ модификации дрожжей Schizosaccharomyces pombe с помощью Cre-lox системы бактериофага Р1, трансформант, полученный таким способом, и способ микробиологического синтеза молочной кислоты | |
| JPH09107981A (ja) | ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用 | |
| CN111117942B (zh) | 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| DE68924745T2 (de) | Methode zur Erhöhung der Produktion von sekundären Metaboliten mittels geclusterter biosynthetischer Gene. | |
| CN112280795A (zh) | 糖基转移酶基因的用途 | |
| US5426047A (en) | Plasmid pBUL1 derived from a lactobacillus and derivatives thereof | |
| Jaoua et al. | Transfer of mobilizable plasmids to Sorangium cellosum and evidence for their integration into the chromosome | |
| US5491079A (en) | Promoterless foreign gene integrated in Streptococcus thermophilus | |
| RU2539092C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ | |
| US6645767B1 (en) | Cells engineered to contain genes of interest without expressed bacterial sequences and materials and methods therefor | |
| KR101625898B1 (ko) | 메발로네이트 또는 메발로노락톤 생성능을 가지는 재조합 미생물, 및 이를 이용한 메발로네이트 또는 메발로노락톤의 제조방법 | |
| JP5069926B2 (ja) | 酢酸菌の発泡に関与する遺伝子、該遺伝子を修飾して育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 | |
| RU2650669C1 (ru) | Штамм Schizosaccharomyces pombe - продуцент молочной кислоты | |
| EP0974665A1 (en) | Recombinant yeast pdi and process for preparing the same | |
| JP2020500509A (ja) | 改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株およびその使用 | |
| RU2614233C1 (ru) | Трансформант дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий молочную кислоту (варианты), способ его получения (варианты), способ микробиологического синтеза молочной кислоты с использованием такого трансформанта | |
| JP3850557B2 (ja) | 新規遺伝子及びその遺伝子を保有する形質転換細胞 | |
| RU2788528C1 (ru) | Штамм дрожжей Komagataella phaffii с инактивированным геном LEU2 - реципиент для конструирования штаммов-продуцентов гетерологичных белков | |
| RU2752896C1 (ru) | Штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий L-молочную кислоту, содержащий в составе хромосомы гены трех различных гетерологичных лактатдегидрогеназ | |
| RU2787584C1 (ru) | Штамм дрожжей Komagataella phaffii с инактивированным геном HIS4 - реципиент для конструирования безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков | |
| CN110791509B (zh) | 片球菌素优化表达序列、表达载体及其制作方法和菌株 | |
| JPH11507546A (ja) | クラバム抗生物質の産生を強化する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Reissue of patent specification | ||
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL 13-2018 FOR INID CODE(S) (54) |