JPH07255481A - プラスミドベクター - Google Patents
プラスミドベクターInfo
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- JPH07255481A JPH07255481A JP6079951A JP7995194A JPH07255481A JP H07255481 A JPH07255481 A JP H07255481A JP 6079951 A JP6079951 A JP 6079951A JP 7995194 A JP7995194 A JP 7995194A JP H07255481 A JPH07255481 A JP H07255481A
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- bifidobacterium
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来し、
図１に示される制限酵素認識部位を有する約２.９kbの
大きさのプラスミドｐＢＬ５９５。前記プラスミドｐＢ
Ｌ５９５と、細菌由来の複製単位と、マーカー遺伝子と
から構成されるプラスミドベクター。前記プラスミドベ
クターは、シャトルベクターとしての使用に適してい
る。 【効果】 本発明のプラスミドは、ビフィドバクテリウ
ム・ロンガム中での複製効率が高く、シャトルベクター
を構築するために有用である。また、本発明のプラスミ
ドベクターは、大腸菌とビフィドバクテリウム・ロンガ
ム中でのコピー数が高く、ビフィドバクテリウム・ロン
ガムの分子育種に有用である。
図１に示される制限酵素認識部位を有する約２.９kbの
大きさのプラスミドｐＢＬ５９５。前記プラスミドｐＢ
Ｌ５９５と、細菌由来の複製単位と、マーカー遺伝子と
から構成されるプラスミドベクター。前記プラスミドベ
クターは、シャトルベクターとしての使用に適してい
る。 【効果】 本発明のプラスミドは、ビフィドバクテリウ
ム・ロンガム中での複製効率が高く、シャトルベクター
を構築するために有用である。また、本発明のプラスミ
ドベクターは、大腸菌とビフィドバクテリウム・ロンガ
ム中でのコピー数が高く、ビフィドバクテリウム・ロン
ガムの分子育種に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビフィドバクテリウム
・ロンガム（Bifidobacterium longum）由来の新規プラ
スミド、前記プラスミドを用いて調製される新規プラス
ミドベクター及び前記プラスミドベクターの調製方法に
関する。本発明のプラスミドベクターは、ビフィドバク
テリウム・ロンガムと他の宿主のシャトルベクターとし
て使用することができる。
・ロンガム（Bifidobacterium longum）由来の新規プラ
スミド、前記プラスミドを用いて調製される新規プラス
ミドベクター及び前記プラスミドベクターの調製方法に
関する。本発明のプラスミドベクターは、ビフィドバク
テリウム・ロンガムと他の宿主のシャトルベクターとし
て使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】ビフィドバクテリウム属は、昆虫からヒ
ト腸内まで幅広く存在する細菌である。ヒト腸内より検
出されるものとしては、ビフィドバクテリウム・ロンガ
ム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテ
リウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファ
ンティス等が知られている。これらの細菌はヒト腸内で
優勢な菌叢を形成しており，ヒトの健康維持に大きく関
わっていると考えられている。中でも、ビフィドバクテ
リウム・ロンガムは発酵乳の製造に用いられている有用
なビフィダス菌であり、ヒト腸内定着性を有するグラム
陽性細菌である。このような菌株を有効利用するために
は、遺伝子組換え技術を応用して、分子育種することが
考えられる。即ち、ビフィドバクテリウム・ロンガムに
導入した異種有用遺伝子により、宿主菌であるビフィド
バクテリウム・ロンガムを育種改良することができれ
ば、その応用価値は大きい。その場合、菌体そのものを
食する発酵乳等では、発酵に使用する微生物の安全性が
問題となるが、ヒト腸内に定着し、ヒトの健康維持に関
与しているビフィドバクテリウム・ロンガムは、その安
全性もよく知られており、さらにビフィドバクテリウム
・ロンガム由来のプラスミドも、安全性が高いと考えら
れる。
ト腸内まで幅広く存在する細菌である。ヒト腸内より検
出されるものとしては、ビフィドバクテリウム・ロンガ
ム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテ
リウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファ
ンティス等が知られている。これらの細菌はヒト腸内で
優勢な菌叢を形成しており，ヒトの健康維持に大きく関
わっていると考えられている。中でも、ビフィドバクテ
リウム・ロンガムは発酵乳の製造に用いられている有用
なビフィダス菌であり、ヒト腸内定着性を有するグラム
陽性細菌である。このような菌株を有効利用するために
は、遺伝子組換え技術を応用して、分子育種することが
考えられる。即ち、ビフィドバクテリウム・ロンガムに
導入した異種有用遺伝子により、宿主菌であるビフィド
バクテリウム・ロンガムを育種改良することができれ
ば、その応用価値は大きい。その場合、菌体そのものを
食する発酵乳等では、発酵に使用する微生物の安全性が
問題となるが、ヒト腸内に定着し、ヒトの健康維持に関
与しているビフィドバクテリウム・ロンガムは、その安
全性もよく知られており、さらにビフィドバクテリウム
・ロンガム由来のプラスミドも、安全性が高いと考えら
れる。
【０００３】しかしながら、分子育種を行なうために
は、目的の菌株に適合したベクターとそれを導入する形
質転換法、即ち、宿主ーベクター系の開発が必要であ
る。大腸菌、枯草菌、酵母などのプラスミドベクターは
多数開発され、実際に利用されている。また、発酵乳や
チーズに利用されている乳酸桿菌や乳酸球菌について
も、多くのプラスミドベクターが報告されている。しか
し、ビフィドバクテリウム属のプラスミドベクターにつ
いては、ほとんど報告がない。これは、遺伝子組換え操
作に使用するためのシャトルベクターとしての使用に適
したビフィドバクテリウム属のプラスミドが見出されて
いないためである。現在のところ、遺伝子組換え操作に
使用することができるビフィドバクテリウム由来のプラ
スミドとしては、特開昭６３−１２３３８４号公報に開
示されているｐＴＢ４由来のプラスミド及び特開平５−
１３０８７６号公報に開示されているｐ１１２のみが知
られている。しかし、これらのプラスミドはビフィドバ
クテリウム・ロンガム中でのコピー数が低く、ビフィド
バクテリウム・ロンガムの遺伝子操作において使用する
には、効率が悪く、適していない。
は、目的の菌株に適合したベクターとそれを導入する形
質転換法、即ち、宿主ーベクター系の開発が必要であ
る。大腸菌、枯草菌、酵母などのプラスミドベクターは
多数開発され、実際に利用されている。また、発酵乳や
チーズに利用されている乳酸桿菌や乳酸球菌について
も、多くのプラスミドベクターが報告されている。しか
し、ビフィドバクテリウム属のプラスミドベクターにつ
いては、ほとんど報告がない。これは、遺伝子組換え操
作に使用するためのシャトルベクターとしての使用に適
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いないためである。現在のところ、遺伝子組換え操作に
使用することができるビフィドバクテリウム由来のプラ
スミドとしては、特開昭６３−１２３３８４号公報に開
示されているｐＴＢ４由来のプラスミド及び特開平５−
１３０８７６号公報に開示されているｐ１１２のみが知
られている。しかし、これらのプラスミドはビフィドバ
クテリウム・ロンガム中でのコピー数が低く、ビフィド
バクテリウム・ロンガムの遺伝子操作において使用する
には、効率が悪く、適していない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明はビフ
ィドバクテリウム属の細菌、特にビフィドバクテリウム
・ロンガム由来の新規高コピー数プラスミド、及びその
プラスミドを用いて調製されシャトルベクターとして使
用され得る高コピー数プラスミドベクターを提供するこ
とを課題とする。
ィドバクテリウム属の細菌、特にビフィドバクテリウム
・ロンガム由来の新規高コピー数プラスミド、及びその
プラスミドを用いて調製されシャトルベクターとして使
用され得る高コピー数プラスミドベクターを提供するこ
とを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ビフィド
バクテリウム・ロンガムに属する菌株の中でも、ビフィ
ドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９５株から単離さ
れた新規プラスミドｐＢＬ５９５は、同株中でのコピー
数が高く、前記株から大量に回収され得ることを見出
し、さらに、そのプラスミドを用いて、プラスミドベク
ターを製造する方法を見出し、本発明を完成させた。即
ち、本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来
し、図１に示される制限酵素認識部位を有する約２.９
０kbの大きさのプラスミドｐＢＬ５９５に関する。前記
ビフィドバクテリウム・ロンガムは、ビフィドバクテリ
ウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＢＴ０５
９５株（工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１６２）である。本発明は、また、前
記プラスミドｐＢＬ５９５と、細菌由来の複製単位と、
マーカー遺伝子とから構成されるプラスミドベクターに
関する。本発明は、また、前記細菌が大腸菌である前記
プラスミドベクターに関する。前記プラスミドベクター
は、ビフィドバクテリウム・ロンガムと前記細菌のシャ
トルベクターとして使用することができる。
バクテリウム・ロンガムに属する菌株の中でも、ビフィ
ドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９５株から単離さ
れた新規プラスミドｐＢＬ５９５は、同株中でのコピー
数が高く、前記株から大量に回収され得ることを見出
し、さらに、そのプラスミドを用いて、プラスミドベク
ターを製造する方法を見出し、本発明を完成させた。即
ち、本発明は、ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来
し、図１に示される制限酵素認識部位を有する約２.９
０kbの大きさのプラスミドｐＢＬ５９５に関する。前記
ビフィドバクテリウム・ロンガムは、ビフィドバクテリ
ウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＢＴ０５
９５株（工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１６２）である。本発明は、また、前
記プラスミドｐＢＬ５９５と、細菌由来の複製単位と、
マーカー遺伝子とから構成されるプラスミドベクターに
関する。本発明は、また、前記細菌が大腸菌である前記
プラスミドベクターに関する。前記プラスミドベクター
は、ビフィドバクテリウム・ロンガムと前記細菌のシャ
トルベクターとして使用することができる。
【０００６】本発明は、また、前記プラスミドｐＢＬ５
９５と、大腸菌由来のｐＢＲ３２９のＡｖａＩ・Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片と、エンテロコッカス・フェカリス（Ente
rococcus faecalis）由来のｐＡＭβ１のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ・ＡｖａＩ断片とから構成され、図２に示される制限
酵素認識部位を有する約６.１０kbの大きさのプラスミ
ドベクターｐＢＬＥＭ１００に関する。
９５と、大腸菌由来のｐＢＲ３２９のＡｖａＩ・Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片と、エンテロコッカス・フェカリス（Ente
rococcus faecalis）由来のｐＡＭβ１のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ・ＡｖａＩ断片とから構成され、図２に示される制限
酵素認識部位を有する約６.１０kbの大きさのプラスミ
ドベクターｐＢＬＥＭ１００に関する。
【０００７】以下、本発明について詳しく説明する。前
記ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９５株
は、ヒト糞便から分離されたものである。このＳＢＴ０
５９５株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１６２号として寄託されてお
り、入手可能である。本発明のプラスミドｐＢＬ５９５
は、新規プラスミドであり、図１に示すような制限酵素
切断部位を有し、約２.９０kbの大きさである。本発明
のプラスミドｐＢＬ５９５は、ビフィドバクテリウム・
ロンガム中で、高頻度にコピーされて、大量に回収する
ことができる。本発明のプラスミドｐＢＬ５９５のコピ
ー数は、従来のビフィドバクテリウム・ロンガム由来の
プラスミドと比較すると非常に高い。例えば、上記特開
昭６３−１２３３８４号公報では、Ｂｒｉｇｇｓ培地５
００mlを用いて培養した場合に回収されるビフィドバク
テリウム・ロンガムＢＫ２５株またはＢＫ５１株由来の
プラスミドは、わずか０.２〜０.５μｇである。また、
特開平５−１３０８７６号公報に記載されているビフィ
ドバクテリウム・ロンガムＭＯ９１０１株においては、
ＧＡＭブイヨン培地１０００mlを用いて培養した場合に
回収されるプラスミドは、わずか２０μｇである。それ
に対し、下記実施例において証明されるように、本発明
のプラスミドｐＢＬ５９５は、培地１.５ml当たり４μ
ｇもの量が回収され、コピー数が非常に高い。
記ビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９５株
は、ヒト糞便から分離されたものである。このＳＢＴ０
５９５株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１６２号として寄託されてお
り、入手可能である。本発明のプラスミドｐＢＬ５９５
は、新規プラスミドであり、図１に示すような制限酵素
切断部位を有し、約２.９０kbの大きさである。本発明
のプラスミドｐＢＬ５９５は、ビフィドバクテリウム・
ロンガム中で、高頻度にコピーされて、大量に回収する
ことができる。本発明のプラスミドｐＢＬ５９５のコピ
ー数は、従来のビフィドバクテリウム・ロンガム由来の
プラスミドと比較すると非常に高い。例えば、上記特開
昭６３−１２３３８４号公報では、Ｂｒｉｇｇｓ培地５
００mlを用いて培養した場合に回収されるビフィドバク
テリウム・ロンガムＢＫ２５株またはＢＫ５１株由来の
プラスミドは、わずか０.２〜０.５μｇである。また、
特開平５−１３０８７６号公報に記載されているビフィ
ドバクテリウム・ロンガムＭＯ９１０１株においては、
ＧＡＭブイヨン培地１０００mlを用いて培養した場合に
回収されるプラスミドは、わずか２０μｇである。それ
に対し、下記実施例において証明されるように、本発明
のプラスミドｐＢＬ５９５は、培地１.５ml当たり４μ
ｇもの量が回収され、コピー数が非常に高い。
【０００８】本プラスミドｐＢＬ５９５は、ビフィドバ
クテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９５株を培養し、培養
後、菌体を回収して、菌体を破砕後、アガロースゲル電
気泳動方法や、密度勾配遠心方法等の一般的な方法で分
離することができる。また本プラスミドｐＢＬ５９５
は、制限酵素による切断、リガーゼによるライゲーショ
ンも、公知のプラスミドと同様の方法により行うことが
できる。
クテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９５株を培養し、培養
後、菌体を回収して、菌体を破砕後、アガロースゲル電
気泳動方法や、密度勾配遠心方法等の一般的な方法で分
離することができる。また本プラスミドｐＢＬ５９５
は、制限酵素による切断、リガーゼによるライゲーショ
ンも、公知のプラスミドと同様の方法により行うことが
できる。
【０００９】本発明のプラスミドｐＢＬ５９５に、細菌
由来の複製単位及びマーカー遺伝子を挿入することによ
り、プラスミドベクターを調製することができる。前記
細菌由来の複製単位としては、ｐＢＲ３２９やｐＢＲ３
２２等の公知の大腸菌プラスミドの複製開始配列や、酵
母や枯草菌等のその他の細菌の複製開始配列を挙げるこ
とができる。これらの例としては、ＹＥｐ２４、ＹＩｐ
５、ｐＵＢ１１０、ｐＶＡ８３８、ｐＳＨ７１等が挙げ
られる。また、マーカー遺伝子としては、エリスロマイ
シン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子を挙げることができる。本発
明のプラスミドベクターは、前記ビフィドバクテリウム
・ロンガムと前記細菌宿主のシャトルベクターとして使
用することができる。
由来の複製単位及びマーカー遺伝子を挿入することによ
り、プラスミドベクターを調製することができる。前記
細菌由来の複製単位としては、ｐＢＲ３２９やｐＢＲ３
２２等の公知の大腸菌プラスミドの複製開始配列や、酵
母や枯草菌等のその他の細菌の複製開始配列を挙げるこ
とができる。これらの例としては、ＹＥｐ２４、ＹＩｐ
５、ｐＵＢ１１０、ｐＶＡ８３８、ｐＳＨ７１等が挙げ
られる。また、マーカー遺伝子としては、エリスロマイ
シン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子を挙げることができる。本発
明のプラスミドベクターは、前記ビフィドバクテリウム
・ロンガムと前記細菌宿主のシャトルベクターとして使
用することができる。
【００１０】本発明者らは、図３に示す手順により、前
記プラスミドｐＢＬ５９５に、大腸菌用プラスミドｐＢ
Ｒ３２９とエンテロコッカス・フェカリス由来のｐＡＭ
β１由来のエリスロマイシン耐性遺伝子領域とを連結し
たｐＢＥＭ３２９（９）を連結することにより、プラス
ミドベクターｐＢＬＥＭ１００を得た。このプラスミド
ベクターｐＢＬＥＭ１００は、ビフィドバクテリウム・
ロンガムの分子育種を行なうために有用である。尚、前
記ｐＡＭβ１は、Enterococcus faecalis ATCC14058と
して寄託されており、入手可能である（D.J.LeBlanc,et
al.,Proc. Natl.Acad. Sci. USA,Vol.75,384,1978）。
図３に示される本発明において使用されるその他のプラ
スミドは、公知のプラスミドであり、市場で購入するこ
とができる。
記プラスミドｐＢＬ５９５に、大腸菌用プラスミドｐＢ
Ｒ３２９とエンテロコッカス・フェカリス由来のｐＡＭ
β１由来のエリスロマイシン耐性遺伝子領域とを連結し
たｐＢＥＭ３２９（９）を連結することにより、プラス
ミドベクターｐＢＬＥＭ１００を得た。このプラスミド
ベクターｐＢＬＥＭ１００は、ビフィドバクテリウム・
ロンガムの分子育種を行なうために有用である。尚、前
記ｐＡＭβ１は、Enterococcus faecalis ATCC14058と
して寄託されており、入手可能である（D.J.LeBlanc,et
al.,Proc. Natl.Acad. Sci. USA,Vol.75,384,1978）。
図３に示される本発明において使用されるその他のプラ
スミドは、公知のプラスミドであり、市場で購入するこ
とができる。
【００１１】本発明のプラスミドベクターｐＢＬＥＭ１
００は、大腸菌とビフィドバクテリウム・ロンガムに導
入することが可能なシャトルベクターである。ｐＢＬＥ
Ｍ１００は、図２に示す制限酵素切断部位を有し、約
６.１０kbの大きさのプラスミドである。本発明のｐＢ
ＬＥＭ１００を保有する大腸菌（Escherichia coli Ｓ
ＢＴ３４４８）は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１０２として寄託されて
いる。
００は、大腸菌とビフィドバクテリウム・ロンガムに導
入することが可能なシャトルベクターである。ｐＢＬＥ
Ｍ１００は、図２に示す制限酵素切断部位を有し、約
６.１０kbの大きさのプラスミドである。本発明のｐＢ
ＬＥＭ１００を保有する大腸菌（Escherichia coli Ｓ
ＢＴ３４４８）は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１０２として寄託されて
いる。
【００１２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。 実施例１ （プラスミドｐＢＬ５９５の分離）下記に示す組成を有
するＴＧＡＭ培地を用いて、ビフィドバクテリウム・ロ
ンガムＳＢＴ０５９５株を培養した。 ＴＧＡＭ培地の組成 トマトジュース抽出液 ４００ml （市販のトマトジュースに等量の蒸留水を加え、コッホ
釜で１時間半加熱した後、残渣を濾別し、pHを７に調整
したもの） ペプトン １０ｇ 酵母エキス ５ｇ 肝臓エキス末 １.２ｇ グルコース ３ｇ 可溶性澱粉 ５ｇ 塩化ナトリウム ３ｇ Ｔｗｅｅｎ８０ １ｇ L−システイン−ＨＣｌ・Ｈ2Ｏ ０.３ｇ ダイズペプトン ３ｇ プロテオースペプトン １０ｇ 消化血清末 １３.５ｇ 肉エキス ２.２ｇ
明する。 実施例１ （プラスミドｐＢＬ５９５の分離）下記に示す組成を有
するＴＧＡＭ培地を用いて、ビフィドバクテリウム・ロ
ンガムＳＢＴ０５９５株を培養した。 ＴＧＡＭ培地の組成 トマトジュース抽出液 ４００ml （市販のトマトジュースに等量の蒸留水を加え、コッホ
釜で１時間半加熱した後、残渣を濾別し、pHを７に調整
したもの） ペプトン １０ｇ 酵母エキス ５ｇ 肝臓エキス末 １.２ｇ グルコース ３ｇ 可溶性澱粉 ５ｇ 塩化ナトリウム ３ｇ Ｔｗｅｅｎ８０ １ｇ L−システイン−ＨＣｌ・Ｈ2Ｏ ０.３ｇ ダイズペプトン ３ｇ プロテオースペプトン １０ｇ 消化血清末 １３.５ｇ 肉エキス ２.２ｇ
【００１３】上記組成からなる組成物のpHを７.３に調
整した後、蒸留水により１０００mlに定容し、１１５℃
で１５分間滅菌した。このＴＧＡＭ培地１.５mlに、常
法によりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９
５株を５％接種し、３７℃で一晩静置培養した。培養終
了後、遠心分離（10,000rpm、５分）によって、ビフィ
ドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９５の菌体を回収
した。
整した後、蒸留水により１０００mlに定容し、１１５℃
で１５分間滅菌した。このＴＧＡＭ培地１.５mlに、常
法によりビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９
５株を５％接種し、３７℃で一晩静置培養した。培養終
了後、遠心分離（10,000rpm、５分）によって、ビフィ
ドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ０５９５の菌体を回収
した。
【００１４】次いで、プラスミドを下記の方法により単
離した。回収した菌体を、１０mMトリス−マリエイト緩
衝液（pH 6.5）で１回洗浄した。洗浄した菌体を、１Ｍ
サッカロースを含む１０mMトリス−マリエイト緩衝液
（pH 6.5）０.１ml中に懸濁した後、５０μg／mlとなる
ようにＮ−アセチルムラミダーゼＳＧ（生化学工業社
製）を加え、３７℃に保持した。３０分後、０.２Ｎ水
酸化ナトリウム中に溶解した１％ＳＤＳ０.２mlを加
え、３７℃に保持した。１５分後、３Ｍ酢酸ナトリウム
（pH 4.8）０.１５mlを加え、氷中で１時間保持した。
遠心分離（15,000rpm、２０分、４℃）により得られた
上清液に、ＴＥ（１０mMトリス塩酸緩衝液、１mM ＥＤ
ＴＡ、pH 6.8）飽和フェノール０.４mlとクロロフォル
ム／イソアミルアルコール（２４：１）８０μlを加
え、フェノール抽出を行った。３回抽出後、クロロフォ
ルム／イソアミルアルコール（２４：１）０.４mlを加
え、１回抽出した。これに、エタノール（−20℃に冷却
したもの）１mlと３Ｍ酢酸ナトリウム４０μlを加え、
−８０℃で１０分間冷却した後、遠心分離（15,000 rp
m、２０分、４℃）して得られた沈澱物を、７０％エタ
ノールで洗浄し、真空乾燥後、ＴＥ（１０mMＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ）５０μl中に溶解し、粗プラス
ミドＤＮＡ溶液を得た。
離した。回収した菌体を、１０mMトリス−マリエイト緩
衝液（pH 6.5）で１回洗浄した。洗浄した菌体を、１Ｍ
サッカロースを含む１０mMトリス−マリエイト緩衝液
（pH 6.5）０.１ml中に懸濁した後、５０μg／mlとなる
ようにＮ−アセチルムラミダーゼＳＧ（生化学工業社
製）を加え、３７℃に保持した。３０分後、０.２Ｎ水
酸化ナトリウム中に溶解した１％ＳＤＳ０.２mlを加
え、３７℃に保持した。１５分後、３Ｍ酢酸ナトリウム
（pH 4.8）０.１５mlを加え、氷中で１時間保持した。
遠心分離（15,000rpm、２０分、４℃）により得られた
上清液に、ＴＥ（１０mMトリス塩酸緩衝液、１mM ＥＤ
ＴＡ、pH 6.8）飽和フェノール０.４mlとクロロフォル
ム／イソアミルアルコール（２４：１）８０μlを加
え、フェノール抽出を行った。３回抽出後、クロロフォ
ルム／イソアミルアルコール（２４：１）０.４mlを加
え、１回抽出した。これに、エタノール（−20℃に冷却
したもの）１mlと３Ｍ酢酸ナトリウム４０μlを加え、
−８０℃で１０分間冷却した後、遠心分離（15,000 rp
m、２０分、４℃）して得られた沈澱物を、７０％エタ
ノールで洗浄し、真空乾燥後、ＴＥ（１０mMＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ）５０μl中に溶解し、粗プラス
ミドＤＮＡ溶液を得た。
【００１５】これを、１％アガロースゲル電気泳動によ
り分離し，目的のプラスミドのバンドをゲルより切り出
し、ＤＮＡ抽出キット（ファルマシア社製）により精製
プラスミドを調製した。培地１.５ml当り約４μgのプラ
スミドｐＢＬ５９５を得た。これは、大腸菌用プラスミ
ドであるｐＢＲ３２２に匹敵するプラスミド量（コピー
数）であった。因みに、このような高いコピー数を有す
るプラスミドがビフィドバクテリウム・ロンガムから分
離されたという報告は未だない。本プラスミドｐＢＬ５
９５の各種制限酵素による切断パターン解析の結果は、
図１に示す通りである。本プラスミドｐＢＬ５９５は、
約２.９０kbのかなり小さなプラスミドであり、一か所
切断部位として、BamHI、EcoRI、PvuII、StuI、SacI、N
coI、KpnI、AvaI及びScaIを有することが判明した。
り分離し，目的のプラスミドのバンドをゲルより切り出
し、ＤＮＡ抽出キット（ファルマシア社製）により精製
プラスミドを調製した。培地１.５ml当り約４μgのプラ
スミドｐＢＬ５９５を得た。これは、大腸菌用プラスミ
ドであるｐＢＲ３２２に匹敵するプラスミド量（コピー
数）であった。因みに、このような高いコピー数を有す
るプラスミドがビフィドバクテリウム・ロンガムから分
離されたという報告は未だない。本プラスミドｐＢＬ５
９５の各種制限酵素による切断パターン解析の結果は、
図１に示す通りである。本プラスミドｐＢＬ５９５は、
約２.９０kbのかなり小さなプラスミドであり、一か所
切断部位として、BamHI、EcoRI、PvuII、StuI、SacI、N
coI、KpnI、AvaI及びScaIを有することが判明した。
【００１６】実施例２ （プラスミドベクターｐＢＬＥＭ１００の構築） （１）ｐＢＬ５９５のクローニング 制限酵素BamHIで切断したプラスミドｐＢＬ５９５を、
制限酵素BamHIで切断した大腸菌用プラスミドｐＵＣ１
９に連結した後、ハナハン（Hanahan）の方法により、
大腸菌ＮＭ５２２に形質転換し、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド及び５０
μg／mlのアンピシリンを含むＬＢプレート上で、白色
のコロニーを選択した。得られた形質転換体よりプラス
ミドを単離し、ｐＢＬＢ２００と命名した。
制限酵素BamHIで切断した大腸菌用プラスミドｐＵＣ１
９に連結した後、ハナハン（Hanahan）の方法により、
大腸菌ＮＭ５２２に形質転換し、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド及び５０
μg／mlのアンピシリンを含むＬＢプレート上で、白色
のコロニーを選択した。得られた形質転換体よりプラス
ミドを単離し、ｐＢＬＢ２００と命名した。
【００１７】（２）エリスロマイシン遺伝子の導入 エンテロコッカス・フェカリス由来のｐＡＭβ１を、Av
aIとHindIIIで切断した後、０.７％アガロースゲル電気
泳動にかけ、エリスロマイシン耐性遺伝子を含む断片を
ゲルより切り出し、フェノール抽出により精製した。こ
の断片１００ngとAvaIとHindIIIで切断した大腸菌用プ
ラスミドｐＢＲ３２９ ５０ngに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（ライゲーションキット；宝酒造社製）で連結した。こ
のＤＮＡを用いて、大腸菌ＮＭ５２２を形質転換し、５
０μg／mlのアンピシリン及び２００μg／mlのエリスロ
マイシンを含むＬＢプレート上で選択し、エリスロマイ
シン耐性形質転換株を得た。この形質転換株よりプラス
ミドを単離し、ｐＢＥＭ３２９と命名した。次に、ｐＢ
ＬＢ２００中のｐＢＬ５９５断片の挿入部位として用い
るために、下記のようにして、ｐＢＥＭ３２９のEcoRI
部位をSmaI部位に変換した。
aIとHindIIIで切断した後、０.７％アガロースゲル電気
泳動にかけ、エリスロマイシン耐性遺伝子を含む断片を
ゲルより切り出し、フェノール抽出により精製した。こ
の断片１００ngとAvaIとHindIIIで切断した大腸菌用プ
ラスミドｐＢＲ３２９ ５０ngに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（ライゲーションキット；宝酒造社製）で連結した。こ
のＤＮＡを用いて、大腸菌ＮＭ５２２を形質転換し、５
０μg／mlのアンピシリン及び２００μg／mlのエリスロ
マイシンを含むＬＢプレート上で選択し、エリスロマイ
シン耐性形質転換株を得た。この形質転換株よりプラス
ミドを単離し、ｐＢＥＭ３２９と命名した。次に、ｐＢ
ＬＢ２００中のｐＢＬ５９５断片の挿入部位として用い
るために、下記のようにして、ｐＢＥＭ３２９のEcoRI
部位をSmaI部位に変換した。
【００１８】EcoRIで切断したｐＢＥＭ３２９ ５０ng
を、各０.２５mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTPを含むニッ
ク・トランスレーション緩衝液（５０mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.2）、１０mM硫酸マグネシウム、０.１mM硫酸マ
グネシウム、０.１mMジチオスレイトール及び５０μg／
mlウシ血清（BSA）より構成される）に加え、さらに１
Ｕのクレノウ・ラージフラグメントを加えて、３７℃で
３０分間処理することにより、EcoRI 部位を平滑末端化
した。この平滑末端化したＤＮＡ５０ngとリン酸化した
SmaIリンカー５０ngを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ライゲー
ションキット；宝酒造社製）で連結した。このＤＮＡを
用いて大腸菌ＮＭ５２２を形質転換し、５０μg／mlの
アンピシリン及び２００μg／mlのエリスロマイシンを
含むＬＢプレート上で選択した。得られた形質転換体よ
りプラスミドを単離し、ｐＢＥＭ３２９（９）と命名し
た。
を、各０.２５mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTPを含むニッ
ク・トランスレーション緩衝液（５０mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.2）、１０mM硫酸マグネシウム、０.１mM硫酸マ
グネシウム、０.１mMジチオスレイトール及び５０μg／
mlウシ血清（BSA）より構成される）に加え、さらに１
Ｕのクレノウ・ラージフラグメントを加えて、３７℃で
３０分間処理することにより、EcoRI 部位を平滑末端化
した。この平滑末端化したＤＮＡ５０ngとリン酸化した
SmaIリンカー５０ngを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ライゲー
ションキット；宝酒造社製）で連結した。このＤＮＡを
用いて大腸菌ＮＭ５２２を形質転換し、５０μg／mlの
アンピシリン及び２００μg／mlのエリスロマイシンを
含むＬＢプレート上で選択した。得られた形質転換体よ
りプラスミドを単離し、ｐＢＥＭ３２９（９）と命名し
た。
【００１９】ｐＢＬＢ２００をSmaIとPstIで切断した
後、０.７％アガロース電気泳動にかけ、ｐＢＬ５９５
を含む断片をゲルより切りだし、フェノール抽出により
精製した。この断片１００ngとSmaI及びPstIで切断した
ｐＢＥＭ３２９（９）５０ngをライゲーションキットを
用いて連結した。一方、このＤＮＡを用いて、大腸菌Ｎ
Ｍ５２２を形質転換し、２００μg/mlのエリスロマイシ
ンを含むＬＢプレート上で形質転換体を選択した。この
形質転換体より、プラスミドを単離し、ｐＢＬＥＭ１０
０と命名した。このプラスミドｐＢＬＥＭ１００は、約
６.１０kbの大きさを有していた。尚、この形質転換体
を、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１０２）。
後、０.７％アガロース電気泳動にかけ、ｐＢＬ５９５
を含む断片をゲルより切りだし、フェノール抽出により
精製した。この断片１００ngとSmaI及びPstIで切断した
ｐＢＥＭ３２９（９）５０ngをライゲーションキットを
用いて連結した。一方、このＤＮＡを用いて、大腸菌Ｎ
Ｍ５２２を形質転換し、２００μg/mlのエリスロマイシ
ンを含むＬＢプレート上で形質転換体を選択した。この
形質転換体より、プラスミドを単離し、ｐＢＬＥＭ１０
０と命名した。このプラスミドｐＢＬＥＭ１００は、約
６.１０kbの大きさを有していた。尚、この形質転換体
を、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１０２）。
【００２０】
【発明の効果】本発明により、ビフィドバクテリウム・
ロンガム由来の新規なプラスミドｐＢＬ５９５が提供さ
れる。このプラスミドはビフィドバクテリウム・ロンガ
ム中での複製効率が高く、シャトルベクターを構築する
ために有用である。さらに、本発明により、このｐＢＬ
５９５から構築されたプラスミドベクターｐＢＬＥＭ１
００が提供される。このプラスミドベクターは、ビフィ
ドバクテリウム・ロンガムと他の細菌宿主のシャトルベ
クターとして使用することができ、ビフィドバクテリウ
ム・ロンガムと宿主中でのコピー数が高く、ビフィドバ
クテリウム・ロンガムの分子育種に非常に有用である。
ロンガム由来の新規なプラスミドｐＢＬ５９５が提供さ
れる。このプラスミドはビフィドバクテリウム・ロンガ
ム中での複製効率が高く、シャトルベクターを構築する
ために有用である。さらに、本発明により、このｐＢＬ
５９５から構築されたプラスミドベクターｐＢＬＥＭ１
００が提供される。このプラスミドベクターは、ビフィ
ドバクテリウム・ロンガムと他の細菌宿主のシャトルベ
クターとして使用することができ、ビフィドバクテリウ
ム・ロンガムと宿主中でのコピー数が高く、ビフィドバ
クテリウム・ロンガムの分子育種に非常に有用である。
【図１】 ｐＢＬ５９５の制限酵素地図を示す。
【図２】 ｐＢＬＥＭ１００の制限酵素地図を示す。
【図３】 ｐＢＬＥＭ１００の構築手順を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (5)
- 【請求項１】 ビフィドバクテリウム・ロンガムに由来
し、図１に示される制限酵素認識部位を有する約２.９
０kbの大きさのプラスミドｐＢＬ５９５。 - 【請求項２】 前記ビフィドバクテリウム・ロンガム
が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacteriu
m longum）ＳＢＴ０５９５株（工業技術院生命工学工業
技術研究所受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１６２）である
請求項１記載のプラスミドｐＢＬ５９５。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のプラスミドｐＢ
Ｌ５９５と、細菌由来の複製単位と、マーカー遺伝子と
から構成されるプラスミドベクター。 - 【請求項４】 前記細菌が、大腸菌である請求項３記載
のプラスミドベクター。 - 【請求項５】 請求項１または２記載のプラスミドｐＢ
Ｌ５９５と、大腸菌由来のｐＢＲ３２９のＡｖａＩ・Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片と、エンテロコッカス・フェカリス由
来のｐＡＭβ１のＨｉｎｄＩＩＩ・ＡｖａＩ断片とから
構成され、図２に示される制限酵素認識部位を有する約
６.１０kbの大きさのプラスミドベクターｐＢＬＥＭ１
００。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP7995194A JP3421119B2 (ja) | 1994-03-26 | 1994-03-26 | プラスミドベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7995194A JP3421119B2 (ja) | 1994-03-26 | 1994-03-26 | プラスミドベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07255481A true JPH07255481A (ja) | 1995-10-09 |
| JP3421119B2 JP3421119B2 (ja) | 2003-06-30 |
Family
ID=13704621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7995194A Expired - Fee Related JP3421119B2 (ja) | 1994-03-26 | 1994-03-26 | プラスミドベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3421119B2 (ja) |
-
1994
- 1994-03-26 JP JP7995194A patent/JP3421119B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3421119B2 (ja) | 2003-06-30 |
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