KR0165907B1

KR0165907B1 - 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 다제내성을 지정하는 dna 단편

Info

Publication number: KR0165907B1
Application number: KR1019940016394A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 김종우; 한재진; 최영내; 이경재; 허용; 윤제인; 서주원
Original assignee: 이우용; 동화약품공업주식회사
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 1999-01-15

Abstract

본 발명은 스트렙토알로타이쿠스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus, ATCC 31219)의 게놈으로부터 분리된 아미노글라이코사이드계 항생제에 대한 다제내성을 지정하는 DNA 단편, 그로부터 번역되는 아미노산 서열, 전기 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드 및 그것으로 형질전환된 미생물을 제공한다. 본 발명의 아미노글라이코사이드계 항생제에 다제내성을 지정하는 DNA 단편은 항생제 생산균주로부터 항생제의 수율 증가 및 항생제 생합성 유전자의 분리에 사용될 수 있을 것이다.

Description

아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 다제내성을 지정하는 DNA 단편

제1도는 본 발명의 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 다제내성을 지정하는 DNA 단편이 삽입된 재조합 플라스미드 pTMR32를 작제하는 과정을 나타내는 도식이다.

제2도는 본 발명의 재조합 플라스미드 pTMR32에 제한효소를 처리하여 아가로스 젤에서 전기영동한 사진이다.

제3도는 본 발명의 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 다제내성을 지정하는 DNA 단편의 서브클로닝에 이용된 각 플라스미드가 포함하고 있는 유전자의 위치를 나타내는 그림이다.

제4(a)도는 스트렙토알로타이쿠스 힌두스타누스(ATCC 31219)의 게놈 DNA를 제한효소로 절단하여 아가로스 젤에서 전기영동하나 결과를 나타내는 사진이다.

제4(b)도는 제4(a)도에서 분리된 DNA의 혼성화 실험 결과를 나타내는 사진이다.

제5도는 본 발명의 다제내성 유전자(amr)의 염기서열을 확인하기 위해 제조한 재조합 플라스미드 pGA32의 유도체들을 아가로스 젤에서 전기영동한 사진이다.

제6도는 본 발명의 다제내성 유전자(amr)의 염기서열을 나타낸다.

제7도는 본 발명의 다제내성 유전자(amr)의 GC%를 나타내는 그래프이다.

제8도는 제6도의 다제내성 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

제9도는 본 발명의 다제내성 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열과 다른 유전자(kamB)로부터 번역되는 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

제10도는 본 발명의 다제내성 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열과 다른 유전자(fmrT)로부터 번역되는 아미노산 서열을 비교한 결과이다.

제11도는 본 발명의 다제내성 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열을 바탕으로 한 단백질의 소수성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

제12도는 본 발명의 다제내서 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열을 바탕으로 한 단백질의 등전점 분석 결과이다.

본 발명은 아미노글라이코사이드계 항생제애 대하여 다제내성을 지정하는 DNA 단편, 그로부터 번역되는 아미노산 서열 및 그를 대량으로 발현시키는 미생물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 스트렙토알로타이쿠스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus)의 게놈으로부터 분리된 아미노글라이코사이드계 항생제에 대한 다제내성을 지정하는 DNA 단편, 그로부터 번역되는 아미노산 서열, 전기 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드 및 그것으로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

항생물질을 생산하는 균주는 자신이 생산하는 항생제에 대한 내성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 세균의 항생제에 대한 내성은 다음 세가지 방법 중 한가지 이상의 기작을 통하여 내성을 나타내며, 아미노글라이코사이드계 항생제에 대한 내성 또한 이들 세가지 기작에 의하는 것으로 알려져 있다: 첫째는 항생제를 변형시키는 기작; 둘째는 항생제의 작용부위를 변환시키는 기작; 및, 세째는 항생제의 출입을 제한함으로써 내성을 나타내는 기작이다. 이중, 아미노글라이코사이드계 항생제를 변형시킴으로써 내성을 나타내는 기작의 경우, 아세틸화(acetylation), 아데닐화(adenylation), 인산화(phosphorylation)의 3가지로 다시 분류할 수 있으며, 이들은 또 다시 치환되는 위치에 따라 매우 다양해질 수 있으며, 이에 따른 내성패턴도 다양해질 수 있다.

전술한 아미노글라이코사이드계 항생제의 작용부위를 수식함으로써 내성을 나타내는 기작의 경우는, 아미노글라이코사이드계 항생제가 단백질 합성을 저해하므로, 단백질 합성에 관여하는 부분을 수식하게 된다. 에릭 쿤드리프(Eric Cundliffe) 등에 의하면, 수식되는 부위는 대부분 16s rRNA인 것으로 보고되고 있다(참조: Cundliffe E. et al., J. Mol. Biol., 193:661-671(1987)). 예를 들면, 가나마이신(kanamycin)과 아프라마아신(apramycin)에 대한 내성을 나타내는 수식부위는 16s rRNA의 1408번 구아닌(G)으로서, 구아닌이 메틸구아닌으로 수식됨으로써 내성이 획득된다. 또한, 가나마이신과 젠타마이신(gentamicin)의 경우, 16s rRNA의 1405번 아데닌(A)이 메틸아데닌으로 수식됨으로써 내성이 획득되며, 하이그로마이신(hygromycin)의 경우 1495번 우라실(U)의 수식, 파로모마이신(paromomycin)의 경우는 1409번 시토신(C)과 1489번 구아닌(G)의 수식으로 내성이 획득된다.

현재까지 항생제 내성기작에 대한 연구는 내성 균주의 증가에 의한 내성의 전이나 그 기작의 규명을 위한 의학적 기초연구의 필요에 의해서 진행되어 왔다. 그러나, 최근 방선균의 분자생물학적 연구가 진전됨에 따라, 대부분의 항생제를 생산하는 방선균에 있어서는 자신이 생산하는 항생제에 대한 내성은 항생제 생산의 조절 메카니즘과 관련이 있을 것으로 예상되어 많은 관심이 집중되고 있다. 특히, 여러가지 항생제 합성의 기작 연구결과에 의하여, 항생제 내성유전자는 대부분 항생제 생합성 유전자와 염색체상에서 밀접하게 연관되어 있다는 사실이 밝혀짐으로써(참조: Juan, F. et al., Bio/Technology, 1:63-74(1984)), 항생제 내성 유전자는 생합성 유전자 분리의 수단으로서 더욱 관심의 대상이 되고 있다.

따라서, 항생제를 생산하는 방선균으로부터 내성 유전자의 클로닝에 대한 관심은 점차로 고조되고 있으며, 이를 이용하여 생합성 유전자를 클로닝한 연구 결과도 증가되고 있다. 예를 들면, 스트렙토마이신(streptomycin) 및 에리스로마이신(erythromycin) 내성유전자를 이용하여 이들 항생제의 생합성 유전자를 클로닝한 것이 보고되었다(참조: Stanzak, R. et al., Bio/Technology, 4:229-232(1986)).

또한, 항생제 생산수율이 높은 균주의 개발을 위하여, 지금까지는 생산수율이 높은 돌연변이체를 제조하거나, 배지조성을 변화시키면서 발효조건을 최적화시키는 방법을 이용하였다. 한편, 최근에 항생제를 생산하는 균주에 그 항생제에 대한 내성유전자를 증폭·도입하는 경우, 항생제 생산이 상당한 수준까지 증가한다는 것이 보고되었는데, 예를 들면, 스트렙토마이신 생산균주인 스트렙토마이세스 그리시우스(Streptomyces griseus)에 내성 유전자(strR)을 도입한 결과, 스트렙토마이신의 생산이 약 5 내지 7배 증가되었다는 보고가 있다(참조: Ohuniki, T. et al., J. Bacteriol., 164:85-94(1985)).

이에, 본 발명의 발명자들은 항생제에 대한 내성유전자를 증폭시킴으로써 항생제의 생산성을 증가시키기 위한 연구의 일환으로서, 스트렙토알로타이쿠스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus, ATCC 31219)의 균종이 여러가지 아미노글라이코사이드계 항생제에 대하여 내성을 가지는 것을 확인하고, 그로부터 이들 항생제에 대한 다제내성(multi-drug resistance)을 지정하는 유전자를 분리하여 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫번째 목적은 아미노글라이코사이드계 항생제에 대한 다제내성을 지정하는 유전자 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 전기의 유전자를 발현시키는 재조합 플라스미드 및 그것으로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 세번째 목적은 전기의 유전자를 이용하여 항생물질 생산균주로부터 항생물질을 고수율로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서는 항생제 네브라마이신 복합체를 생산하는 스트렙토알로타이쿠스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus, 이하 'Stall. hindustanus'라 함, ATCC 31219)의 게놈으로부터, 아미노글라이코사이드계 항생제에 대한 다제내성을 지정하는 약 1.8kb DNA 단편을 분리하고, 그 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드 pTMR32를 제조하여 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans, 이하 'S. lividans'라 함, ATCC 1326)를 형질전환시켰다. 이 형질전환체를 가지고 여러가지 아미노글라이코사이드 항생제에 대한 내성을 검정한 결과, 아프라마이신, 가나마이신, 리보스타마이신(ribostamycin), 시소마이신(sisomicin)에 대하여는 강한 내성을 나타내며, 네오마이신(neomycin), 아미카마이신(amikamycin), 토브라마이신(tobramycin)에 대해서는 이들의 농도가 낮을 경우 내성을 나타낸다는 사실을 확인하였다.

아울러, 다제내성을 지정하는 약 1.8kb DNA 단편을 서브클로닝(subcloning)하기 위하여, 전기에서 제조된 재조합 플라스미드 pTMR32를 제한효소 PstI+SphI, SphI+EcoRV, EcoRV+PstI 및 BglII+EcoRV으로 각각 이중절단하고 DNA 단편들을 분리하였다. 분리된 각각의 DNA 단편을 벡터에 삽입하고 이를 S. lividans 원형질체에 도입한 다음, 아미노글라이코사이드계 항생제에 대한 내성을 검정한 결과, 전기에서 분리된 약 1.8kb DNA중에 다제내성을 지정하는 유전자가 포함된 부분은 BglII+EcoRV로 절단되는 약 1.1kb DNA 단편임을 확인할 수 있었다.

한편, Stall. hindustanus(ATCC 31219)의 게놈 DNA를 여러가지 제한효소로 절단하고 나일론 막으로 옮겨, 다제내성을 지정하는 유전자의 기원을 확인하였다. 재조합 플라스미드 pTMR32를 PstI으로 절단하여 얻은 약 1.8kb의 DNA 단편을 변성 및 DIG(digoxigenin)로 표지시켜 이를 탐침자(probe)로 하였다. 그런 다음, 나일론 막으로 옮겨진 DNA와 탐침자와의 혼성화 실험을 하여, 다제내성을 지정하는 유전자의 기원은 Stall. hindustanus(ATCC 31219)임을 확인하였다.

이러한 다제내성 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 결정하기 위하여, 대장균 플라스미드 pGEM-3Zf(+)에 다제내성 유전자 약 1.8kb 단편을 삽입하여 재조합 플라스미드 pGA32를 제조하였다. 그런 다음, 재조합 플라스미드 pGA32에 삽입되어 있는 다제내성 유전자의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 결정하였다. 스트렙토마이세스 테네브라리우스(Streptomyces tenebrarius, NCIB 11028)로부터 클로닝되어 가나마이신과 아프라마이신에 강한 내성을 지정하는 유전자(kamB)의 단백질은 16s rRNA를 수식하는 것으로 에릭 쿤들리프(Eric Cundliffe) 등에 의해 보고되었고, 스트렙토마이세스 텐지마리엔시스(Streptomyces tenjimariensis, ATCC 31602)로부터 클로닝되어 가나마이신과 아프라마이신에 강한 내성을 지정하는 유전자(fmrT)의 단백질 또한 16s rRNA를 수식하는 것으로 하세가와(Hasegawa) 등에 의해 보고되었는데(참조: Hasegawa et al., Mol. Gen. Genet., 229:229-137(1991)), 전기 kamB 유전자의 아미노산 서열과 fmrT 유전자의 아미노산 서열을 본 발명에서 분리한 유전자(amr)의 아미노산 서열을 비교한 결과, 고도의 상동성(homology)을 보였다. 따라서, 본 발명에서 클로닝한 유전자는 16s rRNA을 수식하는 효소를 암호화하고 있는 것으로 예상되었으며, DNA의 GC% 역시 전형적인 스트렙토마이세스의 GC%(68 내지 82%)와 비슷한 72.9%를 가지고 있음을 확인하였다. 본 발명에서 사용한 균주 Stall. hindustanus(ATCC 31219)는 아미노글라이코사이드계 항생제 중 네브라마이신 복합체를 생산하는 균주로 아프라마이신, 토브라마이신 생산에 유용한 균주이다. 따라서, 이 균주로부터 최초로 분리된 다제내성 유전자는 전술한 바와 같이, 항생제 수율 증가 및 항생제 생합성 유전자의 분리에 사용될 수 있을 것이다.

본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다 :

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

Stall. hindustanus(ATCC 31219)의 항생제 내성유전자의 클로닝

Stall. hindustanus(ATCC 31219)은 네브라마이신 복합체를 생산하는 균주(참조: USP 4032404)로서 여러종류의 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 강한 내성을 가지고 있음을 확인하고, Stall. hindustanus(ATCC 31219)의 항생제 내성유전자를 다음과 같이 클로닝하였다. Stall. hindustanus(ATCC 31219)를 배양하고 용균시켜 염색체 DNA를 순수분리하여 PstI으로 부분절단하였고, 스트렙토마이세스 플라스미드인 pIJ702(KCTC 11043)를 제한효소 PstI으로 완전절단하였다. 그런 다음, 부분절단된 게놈 DNA와 완전절단된 플라스미드 pIJ702를 T₄DNA 연결효소(T₄DNA ligase)로 연결하였다(참조: T. Maniatis et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 제1도에 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 다제내성을 지정하는 DNA 단편이 삽입된 재조합 플라스미드 pTMR32를 제조하는 과정을 나타내었다. 재조합 플라스미드 pTMR32의 유전자 지도에 기재된 'amr'은 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 다제내성을 지정하는 유전자를 나타낸다. 실시예 2에서와 같이, 전기 재조합 플라스미드 pTMR32로, S. lividans(ATCC 1326)를 형질전환시킨 다음, 티오스트렙톤이 포함된 고체배지에서 배양하여 티오스트렙톤 내성(thiostrepton resistance)을 갖는 형질전환체를 얻었다. 이 형질전환체들을 50㎍/ml의 아프라마이신이 포함된 고체배지에서 평판반복법(replica plating method)으로 도말하여, 생장하는 형질전환체를 분리하였다. 이러한 형질전환체로부터 재조합 플라스미드 pTMR32를 분리하여 제한효소 PstI으로 절단한 다음, 아가로스 젤에서 전기영동하였다(참조: 제2도). 제2도에서, 제 A레인은 분자량 마커(Gibco Co., USA)을 나타내고, 제 B레인은 PstI으로 절단된 플라스미드 pIJ702를 나타내며, 제 C레인은 PstI으로 절단된 본 발명의 재조합 플라스미드 pTMR32를 나타낸다. 제2도에서 보듯이, 삽입된 DNA의 크기는 약 1.8kb로 확인되었다.

[실시예 2]

형질전환체의 제조 및 그로부터 다제내성 유전자의 발현 확인

합우드(Hopwood)의 방법(참조: Hopwood, Genetic Manipulation of Streptomyces, The John Innes Foundation, 1985)을 이용하여 전기에서 제조된 재조합 플라스미드 pTMR32로 S. lividans(ATCC 1326)를 다음과 같이 형질전환시켰다. S. lividans(ATCC 1326)를 10.3% 수크로스를 함유한 TSB(tryptic soy broth) 배지 50ml에 30시간 배양하고, 6000rpm에서 원심분리하여 얻은 침전물을 10.3% 수크로스 용액으로 세척한 다음, 다시 6000rpm에서 원심분리하였다. 침전물을 완충용액(3.68% CaCl₂·2H₂O, 5,73% TES(N-tris-methyl-2-aminoethane-sulfonic acid), 0.5g/ml KH₂PO₄로 구성된 완충용액, 이하 'P 완충용액'이라 함)에 현탁시키고, 라이소자임(lysozyme)을 최종농도가 3㎎/ml이 되도록 첨가하여 37℃에 한시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 현미경으로 관찰하여 원형질체의 생성유무를 확인하고, 6000rpm으로 원심분리하여 10⁹원형질체/ml이 되도록 침전물을 P 완충용액으로 현탁하였다. 이를 적은 부피 단위로 분주하여, 4℃에서 12시간, -20℃에서 12시간씩 각각 보관한 다음, 형질전환에 이용하기 전까지 -70℃에서 보관하였다.

전기에서 제조된 원형질체(10⁹/ml)에 재조합 플라스미드 pTMR32 및 완충용액(25% PEG1000을 함유한 P 완충용액, 이하 'T 완충용액'이라 함)을 첨가하였다. 이렇게 제조된 형질전환체는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 1326(pTMR32)으로 명명하였으며, 사단법인 한국종균협회(KFCC)에 수탁번호 KFCC-10822로 1994년 6월 10일자에 기탁되었다.

형질전환체로부터 다제내성 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 형질전환체의 일부를 R2YE 배지(1l당 수크로스 103g, K₂SO₄0.25g, MgCl₂·6H₂O 10.12g, 포도당 10g, 카사놈산 0.1g, 효모추출물 5g, TES 5.73g, 아가 17g 및 미량원소로 구성된 배지)에 도말하고, 12시간 후에 항생제가 포함된 R2YE 배지 3ml에 적층하였다. 30℃에서 36시간 이상 배양한 다음 생장하는 집락을 선별하여, 여러가지 아미노글라이코사이드 항생제에 대한 내성을 검정하였다(참조: 표 1). 내성의 검정은 항생제가 포함된 YEME 배지(1L당 3g 효모추출물, 5g 펩톤, 3g 맥아즙(malt extract) 및 1g 포도당으로 구성된 배지)에 형질전환된 S. lividans 1326을 접종하고, 30℃에서 36 내지 42시간 배양하여 형질전환된 S. lividans 1326의 생장 유무로 판정하였다.

상기 표 1에서 보듯이, 재조합 플라스미드 pTMR32로 형질전환된 S. lividans 1326은 아프라마이신, 아미카마이신, 가나마이신, 네오마이신, 리보스타마이신, 시소마이신, 토브라마이신에 대하여 내성을 나타냄을 알 수 있다.

[실시예 3]

다제내성을 지정하는 DNA 단편의 서브클로닝

Stall. hindustanus(ATCC 31219)의 염색체 DNA로부터 분리된 약 1.8kb DNA 단편에서 항생제 다제내성을 지정하는 부위를 확인하기 위하여 다음과 같이 서브클로닝하였다. 재조합 플라스미드 pTMR32를 제한효소 PstI+SphI, SphI+EcoRV, EcoRV+PstI 및 BglII+EcoRV으로 각각 이중절단한 다음, 아가로스 젤상에서 전기영동하고 DNA 단편이 포함된 젤을 절단하여, 아가로스 젤과 DNA를 분리하는 퀴아젠 젤 추출 키트(QIAGEN Gel Extraction Kit, QIAGEN Inc., USA)을 이용하여 각각의 DNA 단편들을 분리하였다. 분리된 각각의 DNA 단편과 분리된 DNA와 동일한 제한효소로 절단된 벡터 pIJ702를 TDNA 연결효소로 연결하였다. 실시예 1에서와 같은 방법으로, 이렇게 제조된 재조합 플라스미드로 S. lividans 원형질체를 형질전환시키고 티오스트렙톤 내성을 보이는 각각의 형질전환체들로부터 재조합 플라스미드를 분리하였다. PstI+SphI으로 절단된 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 pTMR321; SphI+EcoRV로 절단된 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 pTMR322; EcoRV+PstI으로 절단된 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 pTMR323; 및, BglII+EcoRV로 절단된 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 pTMR324로 각각 명명하였다(참조: 제3도). 각각의 플라스미드로 형질전환된 S. lividans에 대하여 실시예 2에서와 같은 방법으로 아미노글라이코사이드계 항생제에 대한 내성을 검정한 결과, 재조합 플라스미드 pTMR324로 형질전환된 S. lividans만이 항생제에 대한 내성을 나타내었다. 따라서, 실시예 1에서 분리된 약 1.8kb DNA중에 다제내성을 지정하는 유전자가 포함된 부분은 BglII+EcoRV로 절단되는 약 1.1kb DNA 단편임을 알 수 있었다.

[실시예 4]

혼성화 실험에 의한 다제내성 유전자 기원의 확인

분리된 다제내성 유전자의 기원을 확인하기 위해서, Stall. hindustanus(ATCC 31219)의 게놈 DNA를 여러가지 제한효소(BglII, NotI, PstI, SphI 및 XhoI)로 절단하여 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 그런 다음, 공지의 방법(참조: T. Maniatis et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 따라, 모세관 현상을 이용하여 나일론 막에 DNA를 옮기고 85℃에서 30분간 방치하여 나일론 막에 DNA가 완전히 결합하도록 하였다.

한편, 재조합 플라스미드 pTMR32를 PstI으로 절단하여 얻은 약 1.8kb의 DNA 단편을 100℃에서 10분간 방치하여 변성시킨 다음, DIG로 표지된 dGTP(deoxyguanosine triphosphate)를 포함하는 dNTP(deoxynucleoside triphosphate), 헥사뉴클레오타이드(hexanucleotide) 및 클레노우 효소(Klenow fragment)를 함유한 혼합물과 37℃에서 20시간 동안 반응시켜 DIG로 표지된 DNA 단편을 제조하고 이를 탐침자로 하였다.

그런 다음, 다음과 같이 전기에서 제조한 DNA가 결합된 나일론 막과 탐침자를 혼성화(hybridization)시켰다: 혼성화 용액(5x SSC, 1% blocking reagent, 0.1% N-lauroylsarcosine, 0.02% SDS) 10ml에 전기에서 제조한 DNA가 결합된 나일론 막을 68℃에서 1시간 동안 방치한 다음, 탐침자가 포함된 혼성화 용액 3ml에 옮기고 68℃에서 6시간 이상 방치하였다. 6시간 이상이 경과하면, 0.1% SDS를 함유한 2x SSC 용액으로 5분간 나일론 막을 세척하고, 0.1% SDS를 함유한 0.1x SSC 용액에 온도를 68℃로 하여 5분간 방치하였다. 그런 다음, 세척용액(0.3% Tween 20, 0.1M 말레산(maleic acid) 및 0.15M NaCl로 구성된 용액(pH 7.5))으로 20℃에서 1분동안 나이론 막을 세척하여, 완충용액(1% blocking solution, 0.1M 말레산 및 0.15M NaCl로 구성된 용액(pH 7.5); 이하, '완충용액 A'라 함)에 온도 20℃의 조건에서 15분간 방치하였다. 새로운 완충용액 A 10ml에 나일론 막을 옮긴 후, 항체접합용액(antibody donjugate solution) 5㎕를 첨가하여 30분동안 방치하고 세척용액으로 15분간 세척, 완충용액(100mM NaCl 및 50mM MgCl을 함유한 100mM Tris·HCl(pH 9.5)); 이하, '완충용액 B'라 함) 20ml에 2분동안 나일론 막을 방치하였다. 나일론 막의 혼성화를 검정하기 위하여, 칼라용액(45㎕ NBT(nitro blue tetrazolium salt) 및 35㎕ X-phosphate를 함유한 완충용액 B) 10ml에 나일론 막을 옮기고 10분 내지 1시간 사이에 혼성화 반응이 일어나는가를 확인하였다. 혼성화 반응이 완료되면, 완충용액(1mM EDTA을 함유한 10mM Tris·HCl(pH 8.0); 이하, '완충용액 C'라 함) 50ml로 나일론 막을 5분동안 세척하고 실온에서 건조시켰다. 전술한 혼성화 실험의 결과를 제4(a)도 및 제4(b)도에 나타내었다. 제4(a)도는 Stall. hindustanus(ATCC 31219)의 게놈 DNA를 제한효소로 절단하여 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동한 결과를 나타내며, 제4(b)도는 제4(a)도에서 분리된 DNA를 나일론 막에 옮기고 혼성화 실험한 결과를 나타낸다. 제4(a)도 및 제4(b)도에서, 제 A레인은 분자량 마커로서 제2도의 제 A레인과 동일하고; 제 B레인은 탐침자로 사용된 1.8kb DNA이며; 제 C레인은 제한효소 BglII; 제 D레인은 제한효소 NotI; 제 E레인은 제한효소 PstI; 제 F레인은 제한효소 SphI; 및, 제 G레인은 제한효소 XhoI로 절단된 게놈 DNA를 각각 나타낸다. 제4(a)도 및 제4(b)도에서 보듯이, 제한효소 BglII, NotI, PstI, SphI 및 XhoI으로 절단된 게놈 DNA에 탐침자가 혼성화되었음을 알 수 있다.

[실시예 5]

다제내성 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열 과정

다제내성 유전자(amr)의 염기서열을 결정하기 위하여, 박테리오파아지 M13KO7에 의해 대장균내에서 이중나선 DNA의 한쪽 DNA(+ strand DNA)를 합성하는 대장균(Escherichia coli) 플라스미드 pGEM-3Zf(+)(Promega Co., USA)를 사용하였다. 이 pGEM-3Zf(+)를 제한효소 PstI으로 완전절단시킨 다음, PstI으로 절단된 다제내성 유전자 약 1.8kb 단편을 DNA 연결효소로 연결시켰다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드로 대장균 XL1-Blue를 형질전환시킨 다음, 선별용 배지(50㎕/ml의 앰피실린을 함유한 LB배지(1l당 5g 효모추출물, 10g 트립톤 및 5g NaCl로 구성된 배지))에서 생장하는 형질전환된 대장균 XL1-Blue를 1차 분리하였다. 또한, 플라스미드 pGEM-3Zf(+)의 베타갈락토시다제(beta-galactosidase) 유전자 내부에 다제내성 유전자가 삽입되면 베타갈락토시다제 유전자는 불활성화되므로, 0.5mM의 이소프로필 티오갈락토피라노사이드(isopropyl-thiogalactopyranoside 및 0.005%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-갈락토피라노사이드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactopyranoside)가 첨가된 LB배지에서 1차 분리된 대장균 XL1-Blue의 생장을 관찰하여, 흰색 군락을 형성하는 대장균을 2차 분리하였다. 이렇게 분리된 형질전환제 대장균 XL1-Blue로부터 공지의 방법에 따라 플라스미드를 분리·정제하고, 이를 제한효소 PstI으로 절단하여 다제내성 유전자 약 1.8kb의 단편이 존재함을 확인한 다음, 'pGA32'라 명명하였다.

재조합 플라스미드 pGA32의 다제내상 유전자(amr) 삽입부위와 근접한 부분과 수소결합할 수 있는 5'-dCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'를 시퀀싱 프라이머(sequencing primer)로 하여, 생거의 방법(F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463(1977))에 따라 pGA32에 삽입되어 있는 다제내성 유전자(amr)의 염기서열을 다음과 같이 확인하였다.

Erase-a-base 키트(Promega Co., USA)를 사용하여 약 200bp씩 차이가 나는 재조합 플라스미드 pGA32의 유도체를 제조하였다(참조: 제5도). 제5도에서, 제 A레인은 분자량 마커로서 제2도의 제 A레인과 동일하고; 제 B레인에서부터 제 J레인까지는 제조된 재조합 플라스미드 pGA32의 유도체들이 각기 약 200bp씩 차이가 남을 보여준다. 이들 유도체의 (+)가닥 DNA를 얻기 위해, 이들 유도체를 갖는 대장균을 헬퍼파아지(helper phage) M13KO7(Promega Col, USA)로 공지의 방법(참조: T. Maniatis et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 따라 감염시킨 다음, pGA32 유도체들의 (+)가닥 DNA를 분리 정제하였다. 이들 유도체의 (+)가닥 DNA를 클레노우 효소, dNTP 및 ddNTP(dideoxynucleoside triphophate)의 혼합액에 첨가하여 DNA 중합반응을 진행시키되, 진행도중에 반응을 차단시켜서 각기 다른 크기의 중합산물이 얻어지도록 하였다. 또한, 중합산물을 방사선 원소로 표지하기 위하여,P로 표지된 dATP를 사용하였다. 이와같이 중합반응에 의하여 생성된 산물을 6% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동한 다음, X-선 필름에 노출 및 감광시켜 각 밴드의 위치에 따라 염기서열을 결정하였다. 이렇게 결정된 다제내성 유전자(amr)의 염기서열을 제6도에 나타내었으며, 이 염기서열을 기초로 하여 헥산과 단백질의 분석 프로그램인 DNASIS와 PROSIS(Hitachi Software Engineering Co., Ltd., JAPAN)을 이용함으로써, 다제내성 유전자(amr)의 GC%(참조: 제7도) 및 다제내성 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열(참조: 제8도)을 결정하였다. 제8도에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다. 다제내성 유전자의 GC%은 전형적인 스트렙토마이세스의 GC%(68 내지 82%)와 비슷한 72.9%로 확인되었다. 에릭 쿤들리프 등에 의해 스트렙토마이세스 테네브라리우스(NCIB 11028)로부터 클로닝되어 가나마이신과 아프라마이신에 강한 내성을 지정하는 유전자(kamB) 및 하세가와(Hasegawa) 등에 의해 스트렙토마이세스 텐지마리엔시스(ATCC 31602)로부터 클로닝되어 가나마이신과 아프라마이신에 강한 내성을 지정하는 유전자(fmrT)로부터 번역되는 아미노산 서열을 본 발명에서 분리한 다제내성 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열과 비교한 결과, 58%의 상동성(homology)을 보였다(참조: 제9도 및 제10도). 제9도는 본 발명의 다제내성 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열과 kamB 유전자로부터 번역되는 아미노산 서열을 비교한 결과이며, 제10도는 본 발명의 다제내성 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열과 fmrT 유전자로부터 번역되는 아미노산 서열을 비교한 결과이다. 제9도 및 제10도에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였으며, (-)는 결실된 염기를 나타낸다.

또한, 본 발명의 다제내성 유전자(amr)로부터 번역되는 아미노산 서열을 바탕으로 한 단백질의 소수성 분석(hydrophobicity analysis) 결과 및 등전점(isoelectric point) 분석결과를 각각 제11도 및 제12도에 나타내었다. 제11도에서 평균지표(mean index)는 0.07이었으며, 제12도에서 pI값은 9.18이었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 스트렙토알로타이쿠스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus, ATCC 31219)의 게놈으로부터 분리된 아미노글라이코사이드계 항생제에 대한 다제내성을 지정하는 DNA 단편, 그로부터 번역되는 아미노산 서열, 전기 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드 및 그것으로 형질전환된 미생물을 제공한다. 본 발명의 아미노글라이코사이드계 항생제에 다제내성을 지정하는 DNA 단편은 항생제 생산균주로부터 항생제의 수율 증가 및 항생제 생합성 유전자의 분리에 사용될 수 있을 것이다.

Claims

스트렙토알로타이쿠스 힌두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus, ATCC 31219)로부터 분리한 다음과 같은 염기서열을 가지는 아미노글라이코사이드계 항생제에 다제내성을 지정하는 유전자(amr) :
제1항의 유전자로부터 번역되는 다음과 같은 아미노산 서열을 가지는 단백질 :

(상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다.)
제1항의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pTMR32.
제3항의 재조합 플라스미드 pTMR32로 형질전환된 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 1326(KFCC-10822).
제1항의 유전자(amr)를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 항생물질 생산균주를 배양하는 공정을 포함하는 항생제 생산균주로부터 항생물질의 생합성을 증가시키는 방법.