CZ279427B6 - Způsob pěstování mikroorganismu - Google Patents
Způsob pěstování mikroorganismu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ279427B6 CZ279427B6 CS8675A CS7586A CZ279427B6 CZ 279427 B6 CZ279427 B6 CZ 279427B6 CS 8675 A CS8675 A CS 8675A CS 7586 A CS7586 A CS 7586A CZ 279427 B6 CZ279427 B6 CZ 279427B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- coli
- pseudomonas putida
- creatinamidine
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 41
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 title claims abstract description 33
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 22
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 claims description 15
- 239000006046 creatine Substances 0.000 claims description 15
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- YOTNPRLPIPHQSB-XUXIUFHCSA-N Ile-Arg-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N YOTNPRLPIPHQSB-XUXIUFHCSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 37
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 35
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 12
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 108010077078 Creatinase Proteins 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010060059 Sarcosine Oxidase Proteins 0.000 description 4
- 102000008118 Sarcosine oxidase Human genes 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDOUZKKFHVEKRI-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-n-[(prop-2-enoylamino)methyl]propanamide Chemical compound BrCCC(=O)NCNC(=O)C=C CDOUZKKFHVEKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019329 dioctyl sodium sulphosuccinate Nutrition 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101150007503 rps1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150008822 rpsA gene Proteins 0.000 description 2
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 2
- SVDAGORERCSAIV-UHFFFAOYSA-N 2-(n-ethyl-3-methylanilino)ethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 SVDAGORERCSAIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMQREXBKXHCPKR-ZETCQYMHSA-N CC[C@@H](C(=O)O)N(CC)CCS(=O)(=O)O Chemical class CC[C@@H](C(=O)O)N(CC)CCS(=O)(=O)O GMQREXBKXHCPKR-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 230000003682 DNA packaging effect Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000901842 Escherichia coli W Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101150102398 Galt gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical group [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 235000005811 Viola adunca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009038 Viola odorata Species 0.000 description 1
- 235000013487 Viola odorata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002254 Viola papilionacea Nutrition 0.000 description 1
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 108700010833 lambda phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000007040 multi-step synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
- Y10S435/877—Pseudomonas putida
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Mikroorganismy čeledi Escherichia coli nebo Pseudomonas putida, které obsahují plasmid pBT 22a-1, DSM 3148P nebo pBT 306.16, DSM-3149P. Tyto mikroorganismy konstruktivně produkují kreatinamidinhydrolázu, ktkerá má průmyslové využití při stanovení kreatininu a dále je možno ji využít při diagnose ledvinových chorob. Řešení se rovněž týká rekombinované DNA, s výhodou ve formě svrchu uvedených plasmidů, které jsou uloženy do svrchu uvedených mikroorganismů.
ŕ
Description
Mikroorganismus čeledi Escherichia coli nebo Pseudomonas putida a rekombinovaná DNA
Oblast techniky
Vynález se týká mikroorganismu čeledi Escherichia coli nebo Pseudomonas putida a rekombinované DNA.
Dosavadní stav techniky
Enzym kreatinamidinhydroláza EC 3,5,3.3 má průmyslové využití při stanovení .kreatininu. Tento enzym je mimo jiné možno využít při diagnóze onemocnění ledvin, při němž se v moči nachází množství kreatininu, které se podstatně liší od množství, které je možno prokázat v moči zdravých jedinců. Jsou také známy mikroorganismy, například z čeledi Pseudomonas, u nichž je možno indukcí při použití kreatinu vyvolat tvorbu kreatinamidinhydrolázy v množství, které je možno dále zpracovávat, dosažitelné výtěžky a náklad na izolaci takto získaného enzymu však stále ještě představuje limitující faktor pro průmyslové využití uvedeného enzymu.
Bylo by tedy zapotřebí nalézt mikroorganismy, při jejichž pěstování -by nedocházelo ke shora uvedeným nevýhodám a které by produkovaly požadovaný enzym kreatinamidinhydrolázu konstitutivně, to jest bez až dosud nutné indukce, čímž by také bylo možno dosáhnout podstatně vyšších výsledků než v případě použití až dosud známých mikroorganismů, které jsou schopné uvedený enzym vytvářet. Vynález si klade zacil vypěstovat při použití genetického inženýrství takový mikroorganismus, u něhož by genetická informace vedla ke zvýšené tvorbé shora uvedeného enzymu v mikroorganismu, který je možno snadno pěstovat a z něhož je také možno produkovaný enzym izolovat za přijatelných nákladů.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří mikroorganismus čeledi Escherichia coli nebo Pseudomonas putida, které obsahují plasmid pBT 2a-l, DSM 3148P nebo pBT 306.16, ĎSM 3149P a konstruktivně produkuje kreatinamidinhydrolázu.
Podstatu vynálezu tvoří také rekombinovaná DNA, která obsahuje následující kódový řetězec baží pro bílkovinu, štěpící kreatin s řetězcem aminokyselin 1 až 403
1' MetGlnMetProLysThrLeuArglleArgAsnGlyAspLysValArgSerThrPheSer20
ATGCAAATGCCCAAGACGCTCCGCATCCGTAACGGCGACAAGGTTCGCTCCACCTTCTfC60 ******
AlaGlnGluTyrAlaAsnArgGlnAlaArgLeuArgAlaBisLeuAlaAlaGluAsnne40
GCCCAGGAATACGCCAATCGCCAAGCCAGGCTGCGCGCCCACCTGGCGGCGGAGAACATC120 t * * t ii
AspAlaAlallePheThrSerTyrHisAsnlleAsnTyrTyrSerAspPheLeuTyrCys60
121 GACGCCGCGATCTTCACCTCGTACCACAACATCAACTACTACTCCGACTTCCTCTACTGC180 * * * **
-1CZ 279427 B6
SerPheGlyArgProTyrAlaLeuValValThrHisAspAspVallleSerlleSerAla80
181 TCCTTCGGCCGCCCCTACGCGTTGGTGGTGACCCACGACGACGTCATCAGCATCAGCGCC2 4 0 * i i i ii
AsnlleAspGlyGlyGlnProTrpArgArgThrValGlyThrAspAsnlleValTyrThr100
41 AACATCGACGGCGGCCAGCCGTGGCGCCGCACCGTCGGCACCGACAACATCGTCTACACC3 0 0 * t i i ii ’ 101' AspTrpGlnArgAspAsnTyrPheAlaAlalleGlnGlnAlaLeuProLysAlaArgArg120
301 GACTGGCAGCGCGATAACTACTTCGCCGCCATCCAGCAGGCGTTGCCGAAGGCCCGCCGC360 i t i i ii
121 IleGlylleGluBisAspBisLeuAsnLeuGlnAsnArgAspLysLevAlaAlaArgTyr140
61 ATCGGCATCGAACATGACCACCTGAACCTGCAGAACCGCGACAAGCTGGCCGCGCGCTAT420 i i * * **
141 ProAspAlaGluLeuValAspValAlaAlaAlaCyšHeLArcEs-tArgMetlleLysSer160
421 CCGGACGCCGAGCTGGTGGACGTGGCCGCCGCCTGC.ATGCGŤATGCGCATGATCAAATCC480 * t i * ii
161 AlaGluGluHisValMetlleArgBisGlyAlaArglleAlaAspIleGlyGlyAlaAla180
81 GCCGAAGAGCACGTGATGATCCGCCACGGCGCGCGCATCGCCGACATCGGTGGTGCGGCG5 4 0 * i i i ii
181 ValValGluAlaLeuGlyAspGlnValProGluTvrGlyValAlaLeuBisAlaThrGln200
541 GTGGTCGAAGCCCTGGGCGACCAGGTACCGGAATACGAAGTGGCGCTGCATGCCACCCAG600 * i i i **
201. AlaMetValArgAlalleAlaAspThrPheGluAspValGluLeuMetAspThrTrpThr220
601 GCCATGGTCCGCGCCATTGCCGATACCTTCGAGGACGTGGAGCTGATGGATACCTGGACC660 i * i t t*
221 TrpPheGlnSerGlylleAsnThrAspGlyAlaHisAsnProValThrThrArgLysVal240
661 TGGTTCCAGTCCGGCATCAACACCGACGGCGCGCACAACCCGGTGACCACCCGCAAGGTG720 * t i i ti
241 AsnLysGlyAspneLeuSerLeuAsnCysPheProMetlleAláGlyTyrTyrThrAla260
721 AACAAGGGCGACATCCTCAGCCTCAACTGCTTCCCGATGATCGCCGGCTACTACACCGCG780 t i i i τi
261 LeuGluArgThrLeuPheLsuAspHisCysSsrAspAspHisLeuArgLeuTrpGlnVal2:0
81 TTGGAGCGCACCCTGTTCCTCGACCACTGCTCGGACGACCACCTGCGTCTGTGGCAGGTC8 4 0 ***** *
281 AsnValGluValHisGluAlaGlyLeuLysLeuIleLysProGlyAlaArgCysSerAsp300
41 AACGTCGAGGTGCATGAAGC C GGCCTGAAGCTGATCAAGCCCGGTGCGCGTTGCAGCGAT9 0 0 * * * * **
301 IleÁlaArgGluLeuAsnGluIlePheLeuLysHisAspValLeuGlnTyrArgThrPhe320
901 ATCGCCCGCGAGCTGAACGAGATCTTCCTCAAGCACGACGTGCTGCAGTACCGCACCTTC960 * . i i i ti
321 GlyTyrGlyHisSerPheGlyThrLeuSeiBisTyrTyrGlyArgGluAlaGlyLeuGlu340
61 GGCTACGGCCACTCCTTCGGCACGCTCAGCCACTACTÁCGGCCGCGAGGCCGGGTTGGAA1020 ***** *
-2CZ 279427 B6
341 LeuArgGluAspIleAspThrValLeuGluProGlyMetValValSerMetGluProMet360
1021 CTGCGCGAGGACATCGACACCGTGCTGGAGCCGGGCATGGTGGTGTCGATGGAGCCGATG1080 * * * * *i
61 11eMetLeuP roGluGlyLeuP roGlyAlaGlyGlyTyrArgGluH i sAs pIleLeuIle380
1081 ATCATGCTGCCGGAAGGCCTGCCGGGCGCCGGTGGCTATCGCG AGC AC GACATCCTGATC1140 * * i * **
381 ValAsnGluAsnGlyAlaGluAsnlleThrLysPheProTyrGlyProGluLysAsnlle. 400
1141 GTCAACGAGAACGGTGCCGAGAACATCACCAAGTTCCCCTACGGCCCGGAGAAAAACATC 1200
| i | * | * | i | i | * | |
| 401 | IleArgLys | 420 | ||||
| 1201 | ATCCGCAAATGA | 1260 | ||||
| * | i | * | * | i | * |
nebo jeho ekvivalent, který je řetězcem pro stejný řetězec aminokyselin.
podle genetického kódu kódovým
2a-l
Tato řekombinovaná
DSM 3148P nebo pBT
DNA je s výhodou ve formě 306,16, DSM 3149P.
plasmidu pBT
Mikroorganismus s obsahem shora uvedeného plasmidu je schopen produkovat kreatinamidinhydrolázu v množství, které je rovno 50 % celkového množství bílkovin, které je shora uvedeným mikroorganismem vytvářeno.
Shora uvedené mikroorganismy a také odpovídající plasmidy lze získat podle zásad genetického inženýrství. Při získávání mikroorganismů, které konstitutivně vytvářejí kreatinamidinhydrolázu je tedy možno postupovat například tak, že se DNA z Pseudomonas putida
a) částečně štěpí enzymem EcoRi za vzniku fragmentu o 5,8 kilobazí, nebo se
b) štěpí enzymy Eco RI a Pvu II za vzniku fragmentu o 2,2 kilobazí, fragment, získaný způsobem a) nebo b) se potom klonuje při použití vektoru, rozštěpeného stejnou restrikční endonukleázou, získaným materiálem se transformuje vhodný kmen Escherichia coli nebo Pseudomonas putida.a izolují se kmeny, které konstitutivně vytvářejí kreatinamidinhydrolázu. Pod pojmem kilobaze se rozumí v průběhu přihlášky tisíc párů nukleotidových baží.
Informace pro expresi kreatinamidinyhdrolázy se nachází na fragmentu o délce 5,8 kilobazí a na podfragmentu o délce 2,2 kilobazí, které je možno získat štěpením působením enzymu Eco RI nebo společným působením enzymů Eco RI a Pvu II. Shora uvedené fragmenty se podrobí klonování známým způsobem při požití vektoru, který je rozštěpen toutéž restrikční endonukleázou tak, aby byly získány typy zakončení, které je možno vzájemně opět navázat. Je také možno postupovat tak, že se rozštěpí vektory, vhodné pro použití u čeledí Escherichia coli nebo Pseudomonas putida jinými restrikčními endonukleázami tak, že při vhodném uspořádání míst pro štěpení je zachována schopnost replikace pro vektor, doplněný některým ze shora uvedených fragmentů a uložený do
-3CZ 279427 B6 uvedeného místa po štěpení jinými endonukleázami i schopnost transformace shora uvedených čeledí mikroorganismů těmito vektory. Jako vektor se s výhodou užije plasmid pBR 322, transformovaný včleněním některého ze dvou shora uvedených fragmentů a zavedený do vhodného kmene Escherichia coli. Každý odborník může uvést celou řadu kmenů E. coli, které jsou vhodné pro transformaci plasmidem pBR 322 a jeho deriváty. Dalším výhodným vektorem pro toto použití je fág Charon 10. Plasmid pBR 322 a jeho deriváty se stejně jako další vhodné vektory dnes již běžně dodávají.
Méně výhodný je způsob, při němž se plasmid pBR 322 rozštěpí působením enzymů Eco RI a Pvu II, takto vzniklý fragment o 2,3 kilobazích se izoluje a spojí se s fragmentem o 2,2 kilobazích z P. putida po štěpení enzymy Eco RI a Pvu II za vzniku nového plasmidu, označovaného pBT 3-2, který se potom použije k transformaci vhodného kmene E. coli. Tímto způsobem se získá kmen E. coli K12 ED 8654 DSM 3144.
Kmeny E. coli, získané shora uvedeným způsobem transformací derivátem plasmidu, odvozeného od plasmidu pBR 322 je možno velmi snadno podrobit selekci na základě jejich resistence proti ampicilinu. Vzhledem k tomu, že získané kmeny jsou odolné proti ampicilinu a současně vytvářejí enzym kreatinamidinhydrolázu, nemohou netransformované buňky růst a mezi rostoucími buňkami se způsobem, který bude dále podrobněji popsán snadno najdou ty buňky, které produkují požadovaný enzym.
Zvláště dobré výsledky je možno způsobem podle vynálezu získat tak, že se na buňky, zvolené z vhodného kmene E. coli s obsahem plasmidu pBT 3-2 působí v období amplifikace plasmidu nitrosoguanidinem, potom se plasmid izoluje, znovu se transformují buňky E. coli, cyklus se popřípadě opakuje a z takto získaných klonů s vyjádřenou tvorbou kreatinamidinhydrolázy se izoluje plasmid pBT 2a-l, DSM 3148P, jehož způsob výroby je také popsán. Jak již bylo uvedeno shora, produkuji buňky Escherichia coli, transformované shora uvedeným plasmidem kreatinamidinhydrolázu v množství, které odpovídá 50 % celkového množství bílkovin, produkovaného těmito buňkami.
Vzniklé klony mikroorganismů je možno identifikovat jako kmeny, produkující vysoké množství kreatinamidinhydrolázy tak, že se tyto klony uvedou do styku s agarózovými plotnami, které obsahují kreatin, sarkosinoxidázu, peroxidázu a barevný indikátor pro průkaz peroxidu vodíku. Jednotlivé klony je v tomto systému možno identifikovat podle silného zbarvení, které odpovídá vysoké tvorbě enzymu. Jako indikátorový systém pro peroxid vodíku se s výhodou použije 4-aminoantipyrin v kombinaci s N-ethyl-N-(sulfoethyl) -3-methylalaninové soli, s výhodou ve formě draselné soli.
Podle vynálezu je také možno zkonstruovat plasmidy, které jsou vhodné nejen pro expresi v mikroorganismech E. coli, ale také v mikroorganismech P. putida. S výhodou se postupuje tak, že se z plasmidu pBT 2a-l získá štěpením restrikční endonukleázou Pvu I a Pvu II fragment o 2,8 kilobazí a tento fragment se naváže na další fragment o 10 kilobazích, získaný.z plasmidu pBT 306.1 štěpením enzymy Pvu I a Srna I. Tímto způsobem se získá plasmid pBT 306-16, DSM 3149 P, který vyvolává konstitutivní tvorbu
-4CZ 279427 B6 kreatinamidinhydrolázy jak u mikroorganismů E. coli, tak u mikroorganismů P. putida.
Je překvapující, že způsobem podle vynálezu je možno dosáhnout podstatného zvýšení tvorby enzymu. Již několikrát bylo sice oznámeno, že zvýšením počtu kopií určitého genu je možno dosáhnout zvýšené exprese tohoto genu. Z toho však nebylo možno předpokládat, že i při přenesení genů z čeledi Pseudomonas do čeledi E. coli bude pravděpodobně možno dosáhnout vyšší exprese genu. Ve skutečnosti byly podávány zprávy o tom, že při přenesení nových genových kombinací z čeledi Pseudomonas do E. coli došlo ke snížení exprese genu, jak bylo uvedeno například v publikacích B. Stanisisch a J. Ortiz, J. Gen. Microbiol. 1976. 94, str. 281 až 289, Nakazáwa a další, J. Bacteriol. 1978, 134, str. 270 až 277, Ribbons a další, Soč. Gen. Microbiol. Quart. 1978, 6, str. 24 až 25 a Franklin a další, Microbiological Degradation of Xenobiotics and Recalicitrant Compounds, Leisinger Cook, Hútter und Nuesch Hrsgb., 1981, 109 až 130. Skutečnost, že nebylo možno očekávat zlepšení uvedeného typu je možno doložit přehledem nejrůznějších několikastupňových syntéz, na jejichž konci se získá enzymaticky účinná bílkovina.
Informace pro vznik bílkoviny je uložena v desoxyribonukleové kyselině (DNA). Tato DNA se převádí působením RNA-polymerázy na mRNA. Takto synthetizovaná mRNA se v ribosomech převádí na bílkovinu, přičemž vždy tři nukleotidy (triplet nebo kodon) jsou podle uspořádání genetického kódu klíčem pro tvorbu jedné určité aminokyseliny
Řídicí oblasti na úrovni DNA určují, na kterém místě se začne řetězec DNA převádět na mRNA (sled promotoru) a také na kterém místě se syntéze mRNA zastaví (terminační sled).
Sledy pro začátek a pro ukončení se nacházejí také na úrovni syntézy bílkovin (translace). Obecně je možno uvést, že kodon ATG (který se převádí na f-methionin) znamená počátek bílkoviny a například kodony TAA nebo TAG znamenají terminační kodon pro ukončení translace.
Míra exprese poAypeptidového sledu závisí na celé řadě faktorů, mimo jiné i na kvalitě sledu promotoru, stálosti mRNA, sekundární a terciární struktury mRNA, kvalitě místa vazby na ribosom, odstup místa vazby na ribosom· od kodonu pro počátek translace (ATG), na sledu nukleotidů mezi místem vazby na ribosom a mezi kodonem pro počátek translace (ATG) a mezi signálem pro ukončení translace na úrovni transkripce i translace. Bez přesné znalosti primární struktury genu a struktury bílkoviny, pro niž je gen kódem není možno cíleně zasáhnout do Shora popsaných řídicích procesů exprese genu. Protože tyto přesné znalosti nebyly v daném případě k dispozici, nebylo možno předpokládat ani vyšší výtěžek syntézy při použití svrchu uvedených mikroorganismů a plasmidů, získaných způsobem podle vynálezu.
Při provádění způsobu podle vynálezu se jako kmenů Escherichia coli užije s výhodou E. coli K12, a to zejména:
E. coli K12, W 3350 (thi, galK, galT, rpsl, [P. Tiollais], DSM 3141) ,
-5CZ 279427 B6
E. coli K12, ED 8654 (trp R, hsd M+, hsd R , sup E, sup F, [K. Murray], DSM 2102),
E. coli K12, CSH 1 (thi, trp, lac z, rpsl [sbírka mikroorganismů Cold Spring Harborj, DSM 3142).
Z kmenů Pseudomonas putida je možno použít izoláty divokých kmenů i kmeny laboratorní. Zvláště dobrých výsledků je možno dosáhnout při použití Pseudomonas putida 2440, DSM 2106 (Gene 1981, 237 až 247).
Jako vektorové systémy pro expresi v E. coli se při provádění způsobu podle vynálezu s výhodou užívají genetickou manipulací získané deriváty běžně dodávaného plasmidu pBR 322 (Gene 1977, 95 až 113). Pro expresi v kmenech Pseudomonas se s výhodou užívají geneticky pozměněné deriváty plasmidu pRSF 1010 (Gene 1981, 237 až 247). Při použití shora uvedených restrikčních endonukleáze pro konstrukci geneticky pozměněných plasmidů podle vynálezu se získají úseky genu, které jsou kódem pro kreatinamidinhydrolázu s obsahují ještě systémy pro expresi vektoru, řídicí systém pro počátek translace v cílové buňce a gen, podle něhož je možno výsledné mikroorganismy snadno podrobit selekci, například gen pro odolnost proti antibiotikům.
Vynález bude dále popsán v souvislosti s připojenými výkresy, kde na obr. 1 je schematicky znázorněna konstrukce plasmidu pBT 3-2 při použití fragmentu o velikosti 2,2 kilobazí z DNA Pseudomonas putida a plasmidu pBR 322 jako výchozích materiálů pro tuto konstrukci, na obr. 2 je znázorněna konstrukce plasmidu pBT 306.1 z plasmidů RSF 1010 a pACYC 177 způsobem podle vynálezu, na obr. 3 je znázorněna konstrukce plasmidu pBT 306.16 z plasmidů pBT 306.1 a pBT 2a-l způsobem podle vynálezu, na obr. 4 je znázorněn výsledek nanesení buněčného extraktu na SDS gel, a to:
Sloupec 1: výchozí kmen Pseudomonas putida,
Sloupec 2: cílový využitelný kmen E. coli ED, který nese plasmid pBT 2a—1,
Sloupec 3: pro srovnání 15 mikrogramů čištěné kreatinázy,
Sloupec 4: využitelný kmen E. coli ' ED a na obr. 5 je znázorněn sled DNA, který je kódem pro enzym kreatinamidinhydrolázu a bílkovinný sled, který je výsledkem použití shora uvedeného sledu DNA.
Aby bylo možno nalézt pozitivní klony, to znamená klony, které konstitutivně produkují kreatinamidinhydrolázu je možno při provádění způsobu podle vynálezu užít zvláštní třídicí systém, jehož principem je imunologický test na enzym. Při provádění tohoto postupu se fixují na vhodný nosič, například na polyvinylovou fólii specifické protilátky proti kreatinamidinhydroláze, fólie se přiloží na rozrušené kolonie nebo také na plaky. Po promytí vodou se fólie inkubuje se stejnou specifickou protilátkou ve formě enzymatického konjugátu, například s peroxidázou. V případě, že je přítomen klon, produkující enzym, vzniká navrstvení antigenu-protilátky a enzymaticky značené protilátky.
Konjugát protilátky a peroxidázy poskytuje ve vhodném systému s obsahem barevného indikátoru zbarvení, například při použití
-6CZ 279427 B6 indikátorového systému s obsahem tetramethylbenzidinu, dioktylnatriumsulfosukcinátu a peroxidu vodíku v želatině zeleně zbarvené skvrny. Rozmezí stanovitelného množství při použiti tohoto systému je 10 až 100 pg antigenu bílkovinné povahy. Systém tohoto typu je možno vytvořit na základě poznatků, které jsou uvedeny v publikaci Testkombination Genexpression Boehringer Mannheim GmbH.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
A. Izolace DNA z chromosomů Pseudomonas putida
DNA z chromosomů kmene Pseudomonas putida DSM 2106 se po rozrušení buněk izoluje a po dvojí fenoliziaci a po vysrážení ethanolem se rozpustí na koncentraci 600 μg/ml (Cosloy a Oishi, Molec. Gen. Genet., 1973, 124, 1 až 10).
μg chromosomální DNA se částečně štěpí působením pěti jednotek restrikční endonukleázy Eco RI, E.C. 3.1.23.11 po dobu 30 minut a míra štěpení se sleduje na agarózovém gelu.
B. Izolace a čištění DNA z fágu lambda Charon 10
Ί Π bakterii kmene E. coli ED DSM 2102 se inkubuje O s 5 x 10 fágu lambda Charon 10 po dobu 20 minut při teplotě 37 °C a potom se směs nechá růst až do počátku lyse buněk při použití 500 ml živného prostředí s dostatečným množstvím živin. Izolace fágu a DNA se potom provádí přesně podle návodu, který je uveden v publikaci Maniatise a dalších, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 76 až 85.
^g DNA fágu Charon 10 se úplně rozštěpí působením restrikční endonukleázy Eco RI. Potom se společně inkubuje 1 μg částečně rozštěpené DNA z chromosomů Pseudomonas putida (odstavec A), 3 μg DNA fágu Charon 10, rozštěpené enzymem Eco RI a 40 jednotek enzymu T4 DNA ligázy. Uložení navázaných fragmentů DNA do přední a zadní části bílkoviny fágu lambda je možno provést in vitro. Výroba bílkovin, potřebných k tomuto účelu a uložení DNA je podrobně popsáno v publikaci Maniatis a.další, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 256 až 291 (in vitro systémy pro DNA fágu lambda se obchodně dodávají — například Boehringer Mannheim, DNA-Packaging Kit). Přibližně 0,5 μg získaného produktu a DNA z Pseudomonas putida se inkubuje s 20 μΐ systému, získaného in vitro, po 60 minutách se přidá 0,5 ml pufru SM (Maniatis a další, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 443) a 1/200 objemu (2,5 μΐ) systému, získaného in vitro __ n s 200 μΐ přes noc pěstované kultury kmene ED (v 10 síranu hořečnatého) podobu 10 minut při teplotě 37 °C. Suspenze bakterií se potom smísí s 3 ml LB (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972, 433), 0,8 % agarózy a směs se vlije na plotny LB. Na 1 μg použité DNA sé 'získá přibližně 105 plaků.
-7CZ 279427 B6
K identifikaci fágů, které obsahují gen pro kreatinázu se užije shora uvedeného imunologického testu na přítomnost enzymu. Indikátorový systém sestává z 6 mg/ml tetramethylbenzidinu, 20 mg/ml dioktylnatriumsulfosukcinátu a 0,01 % peroxidu vodíku v 6% želatině. Na 1 000 plaků bylo možno prokázat dva pozitivní signály.
C. Reklonování genu pro kreatinázu při použití E. coli.
Z pěti plaků, které byly prokázány jako pozitivní při shora uvedeném imunologickém testu byla izolována DNA tohoto fágu. Pět vzorků takto získané DNA bylo rozštěpeno působením restrikčního enzymu Eco RI a kromě různých pásů bylo možno ve všech pěti vzorcích DNA prokázat společný pás pro DNA o velikosti 5,8 kilobazí. Tento fragment byl charakterizován pomocí štěpení několika různými restrikčními endonukleázami, jak je znázorněno na obr. 1.
Z přibližně 5 μg tohoto fragmentu, získaného štěpením enzymem Eco RI se odštěpí působením enzymu Pvu II fragment o velikosti 2,2 kilobazí. Vzniklé fragmenty DNA se dělí na agarózovém gelu s nízkou teplotou tání a izoluje se fragment o 2,2 kilobazích Eco RI- Pvu II. Při izolaci uvedeného fragmentu DNA z agarózového gelu se postupuje tak, že se odpovídající pásy vyříznou, přenesou do reakční skleněné nádoby (Eppendorfovy zkumavky) a smísí s přibližně dvojnásobným množstvím vody. Potom se směs inkubuje tak dlouho při teplotě 65 °C, až dojde k rozpuštění agarózy (5 až 10 minut), vzorek se krátce protřepe a potom se energicky protřepe s polovičním objemem fenolu (neutralizovaného 10 mM Tris HC1 o pH 7,5 a 1 mM EDTA, TE). Jednotlivé fáze se od sebe oddělí odstředěním po dobu 10 minut při 15 000 g a horní vodná fáze se znovu protřepe s fenolem. Po opakovaném odstředění 10 minut při 15 000 g se horní fáze dvakrát protřepe vždy s 1 ml éteru, éter se odpaří při teplotě 65 °C a DNA se vysráží 1/10 objemu 3 M octanu sodného o pH 7,2 a 2,5násobným objemem ethanolu při teplotě -20 °C. Potom se DNA odstředí po dobu 10 minut při 15 .000 -g, suší;se ve vakuu a potom se smísí s 10 μΐ TE. Všechny další izolace jednotlivých fragmentů byly vždy prováděny podle tohoto postupu.
Přibližně 4 μg DNA z plasmidu pBR 322 se rozštěpí působením enzymů Eco RI a Pvu II a izoluje se fragment o velikosti 2,3 kilobazí. 0,2 μg tohoto.'fragmentu DNA z pBR 322 se. inkubuje přes noc s pěti jednotkami T4 DNA ligázy a s 0,5 μg fragmentu ze shora uvedeného fágu lambda o 2,2 kilobazích, získaného štěpením pomocí restrikčních enzymu Eco RI a Pvu II. Výsledný plasmid je označován jako plasmid pBT 3-2 a je v mikroorganismech E. coli kódem pro biologicky účinnou kreatinázu.
Příklad 2
DNA z plasmidu pBT 3-2, která je kódem pro kreatinázu se v průběhu amplifikační fáze dále zpracovává působením nitrosoguanidinu přesně podle návodu, uvedeného v publikaci Talmadge a Gilbert, Gene, 1980, 12, 235 až 241. Potom se DNA plasmidu po rozrušení buněk izoluje metodou s použitím CsCl-ethidiumbromidu (Maniatis a další, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982, 250 až 251) a nanese se na prostředí s plným množstvím živin (LB)
-8CZ 279427 B6 s obsahem 20 μ^/τηΐ ampicillinu. Po inkubaci přes noc při teplotě 37 °C se kolonie přenášejí na plotny s obsahem prostředí LB, na něž byly předem uloženy kotouče nitrocelulózového filtračního papíru (Schleicher, Schúll BA 85). Plotny se inkubují při teplotě 37 C po dobu 12 až 18 hodin, potom se nitrocelulózový filtr s koloniemi přenese do skleněné Petriho misky průměru 20 cm s obsahem 1 ml směsi toluenu a chloroformu s obsahem 1:1. Inkubace trvá 20 minut při teplotě 37 °C. Nitrocelulózový filtr se potom uloží na agarózovou plotnu s obsahem indikátoru tak, aby došlo k přímému styku mezi buňkami a indikátorovou plotnou. Barevná reakce se objeví v závislosti na čase a na množství kreatinázy, synthetizované v jednotlivých klonech. Podle shora uvedeného schématu byl izolován klon ED, který obsahoval plasmid pBT 2a-l, DSM 314'3. Tento plasmid je kódem pro kreatinázu, která tvoří přibližně 50 % celkového množství bílkoviny, produkovaného buňkou. Tento způsob je schematicky znázorněn na přiloženém obr. 1.
Alternativním způsobem ke shora popsané NG-mutagenesi je použití cizorodého promotoru, například promotoru pro laktózu, a tím dosáhnout vyšší úrovně expresse kreatinázy. Promotor je možno získat z komerčně dodávaných plasmidů, například jako fragment DNA z plasmidů pUC. Při provádění tohoto způsobu se rozštěpí plasmid pBT 3-2 v místě štěpení enzymem EcoRI a potom se podrobí působení exonukleázy Bal 31 tak, aby bylo z každé strany odštěpeno přibližně 10 až 100 párů baží. Potom se do zkráceného plasmidů pBT 3-2 včlení promotor pro laktózu působením enzymu T4~ligázy. Tato DNA se potom shora uvedeným způsobem podrobí mutagenese působením nitrosoguanidinu a potom se použije k transformaci kmene ED a jednotlivé takto získané klony se shora uvedeným způsobem zkoušejí na vysokou expresi genu.
Shora uvedená agarózová plotna s indikátorovým systémem představuje zkušební systém, jehož princip spočívá v tom, že se peroxid vodíku, vzniklý z kreatinu působením kreatinamidinhydrolázy a sarkosinoxidázy štěpí peroxidázou na 1/2 O2 a vodu a kyslík reaguje s barevným indikátorovým systémem, například obsahujícím 4-aminoántipyrin (4-AAP) a N-ethyl-N-(sulfoethyl)-3-methylanilin ve formě draselné soli (EST). Vznikne modrofialové zabarvení, které je za přítomnosti přebytku enzymu sarkosinoxidázy a peroxidázy mírou množství kreatinamidinhydrolázy, synthetizované v koloniích.
Princip uvedeného stanovení je možno schematicky znázornit následujícím způsobem:
Kreatin + H2O kreatinamidinhydroláza sarkosin + močovina
-----------------:------.>
sarkosin + O2 + H2O Sarc - OD glycin + formaldehyd + peroxid vodíku —>
H2O2 + 4-AAP + EST POD barvivo + 2 H2O :>
-9CZ 279427 B6
Složení systému pro zjišťování účinnosti kreatinamidinhydrolázy
Složka
Koncentrace
| 1. | kreatin | 10 | mM |
| 2. | NaN3 | 0, | 5 mM |
| 3 . | Tris HC1 (pH 7,8) | 20 | mM |
| 4. | sarkosinoxidáza | 5 | jednotek |
| 5. | peroxidáza | 2,5 | jednotek |
| 6. | 4-AAP | 0,25 | mg/ml |
| 7. | EST | 1,5 | mg/ml |
Všechny reakční složky se rozpustí a smísí se se stejným objemem agarózy s nízkou teplotou tání (2 %). 6 ml takto získaného materiálu se vlije do Petriho misky, plotny je možno skladovat ve tmě přibližně 2 týdny při teplotě 4 °C.
Příklad 3
Při klonování a expresi klonovaného sledu pro kreatinamidinhydrolázu v mikroorganismu Pseudomonas putida se používá plasmid RSF 1010 (Bagdasarian a další, Gene 1981, 16, 237 až 247). Plasmid RSF 1010 se linearizuje pomocí restrikčního enzymu Pvu II a potom se izoluje z plasmidu pACYC 177 (Chang a Cohen, J. Bacteriol. 1978, 134, 1141 až 1156) po štěpení enzymem Hae II fragment o 1,4 kilobazích. 0,2 ^g DNA plasmidu RSF 1010 se spojí s 1 μg fragmentu po štěpení enzymem Hae II za použití T4 ligázy, jako výsledný plasmid se získá plasmid pBT 306.1, znázorněný na obr. 2. Plasmid RSF 1010 a deriváty tohoto plasmidu mají široké použití (Gene 16, 1981, 237 až 247) a jsou například použitelné k amplifikaci jak v mikroorganismech E. coli, tak v čeledi Pseudomonas. Plasmid pBT 2a-l se rozštěpí enzymy Pvu I a Pvu II a izoluje se fragment o velikosti 2,8 kilobazí, plasmid pBT 306.1 se také rozštěpí a izoluje se fragment o velikosti 10 kilobazí. 0,5 ^g DNA vektoru se naváže na 0,5 μg fragmentu po štěpení enzymy Pvu I a Pvu II. Získaným materiálem se transformuje E. coli ED a klony, produkující kreatinázu se vyhledají použitím shora uvedených ploten s obsahem indikátoru. Z jednoho z pozitivních klonů se připraví shora uvedeným způsobem s použitím CsCl-ethidiumbromidu DNA plasmidu. Tento plasmid se označuje pBT 306.16, DSM 3149 P, jak je znázorněno na obr. 3.
Transformace DNA z plasmidu v Pseudomonas putida 2440 se provádí přesně podle metody, uvedené v publikaci Franklin a další, Microbiol. Degradation of Xenobiotics and Recalicitant Compounds, Leisinger, Cook, Hútter and Nuetsch, Hrgsb., 1981, 109 až 130. Při použití ploten s obsahem indikátoru se identifikují pozitivní klony. Tento postup je v případě Pseudomonas putida 2440 možný, přestože tento kmen obsahuje v chromosomech kod pro kreatinamidinhydrolázu, protože k expresi genu pro kreatinamidinhydroláz^u dochází konstitutivně. Je tedy možno v tomto případě rozlišovat mezi chromosomálním a plasmidovým kódem por kreatinamidinhydrolázu.
-10CZ 279427 B6
Příklad 4
Stanovení kreatinamidinhydrolázy se provádí sledováním reakce amoniových iontů, vzniklých reakcí s ureázou při použití běžně dodávaného reakčního činidla Harnstoff (Boehringer Mannheim, Best. Nr. 124 770).
Divoký kmen Pseudomonas putida 2440 se inkubuje při stanovení účinnosti kreatinamidinhydrolázy v 5 ml prostředí LB s obsahem 1 % kreatinu přes noc při teplotě 30 °C. Buňky se oddělí odstředěním a jednou se promyjí 50 mM fosfátového pufru o pH 7,5. Potom se buňky znovu smísí s původním objemem fosfátového pufru o koncentraci 50 mM při pH 7,5 a rozruší se působením ultrazvuku na dobu 4 x 30 sekund. Pěstování a rozrušení buněk, které obsahují plasmid, který je kódem pro kreatinamidinhydrolázu provádí stejně s tím rozdílem, že prostředí neobsahuje žádný kreatin pro indukci a že selekce na přítomnost plasmidu provádí přidáním ampicilinu (20 μg/ml pro plasmid pBT 3-2, pBT 2a-l) nebo streptomycinu (200 μg pro plasmid pBT 306.16). Kultury se pěstují v případě Pseudomonas putida při teplotě 30 °C, v případě E. coli při teplotě 37 °C.
Kreatinamidinhydroláza v Pseudomonas putida a v E. coli
Kmen/plasmid
Účinnost jednotky/1
Pěstování
| 1. | Pseudomonas | putida | 2440 | 1 | - kreatin | ||
| 2. | Pseudomonas | putida | 2440 | 250 | + | kreatin | |
| 3 . | Pseudomonas | putida | 2440/ | ||||
| pBT 306.16 | 1 | 800 | - | kreatin | |||
| 4. | E. coli ED | - | + | kreatin | |||
| 5. | E. coli ED/pBT 3-2 | 30 | - | kreatin | |||
| 6. | E. coli ED/pBT 2a-l | 2 | 800 | - | kreatin |
Údaje prokazují, že při klonování sledu, který je kódem pro kreatinamidinhydrolázu
1. bakterie E. coli získávají novou schopnost synthetizovat kreatinamidinhydrolázu, přičemž
2. tato exprese probíhá na rozdíl od výchozího kmene Pseudomonas putida jak pro E. coli, tak pro Pseudomonas putida konstitutivně .
Navíc je možno při mutagenezi působením DNA, která je kódem pro kreatinamidinhydrolázu dosáhnout zvláště vysoké exprese. Jde například až o 1 OOOnásobné zvýšení účinnosti/litr ve srovnání s výchozím kmenem Pseudomonas a až ó 2 SOOnásobné zvýšení v případě E. coli.
V E. coli ED/pBT 2a-l DSM 3143 je účinnost 500 jednotek/g biomasy (vlhké), specifická účinnost je 4,5 jednotek/mh bílkoviny. Protože specifická účinnost v případě vysoce čištěné bílkoviny je 9 jednotek/mg, je zřejmé, že u E. coli tvoří kreatinamidinhydroláza 50 % rozpustných bílkovin. Při analýze surového extrak-11CZ 279427 B6 tu na SDS-gelu způsobem podle publikace Laemmli, Nátuře, 1970, 227, 680 až 685 je možno prokázat, že kreatinamidinhydroláza tvoři hlavní pásy rozpustné bílkovinné frakce, jak je zřejmé z obr. 4, sloupec 2.
Příklad 5
Pro kultivaci ve fermentoru byly užity tři kmeny Escherichia coli, a to E. coli W 3350, E. coli ED 8654 a E. coli CSH 1. K transformaci se užije plasmidu pBT 2a-l. Po čištění jednotlivých kolonií se pěstuje předběžná kultura v živném prostředí DYT (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972, 433) s obsahem 20 μ9^1 ampicilinu přes noc při teplotě 37 °C. Fermentační prostředí (DYT) se potom naočkuje předběžnou kulturou (1 % očkovacího materiálu) a bez selekce na přítomnost plasmidu se kultura nechá růst 20 až 30 hodin při teplotě 37 °C. Po 25 hodinách pěstování je účinnost kreatinamidinhydrolázy přibližně 600 jednotek/gram vlhké biomasy, tj. přibližně 4,5 jednotek/mg bílkoviny.
V případě fermentace Pseudomonas putida se užije plasmid pBT 306.16 k transformaci kompetentních buněk kmene Pseudomonas putida 2440 shora uvedeným způsobem, čímž se získá kmen pseudomonas putida DSM 3147.
Po čištění jednotlivých kolonií se pěstuje v prostředí DYT přes noc při teplotě 30 °C předběžná kultura, prostředí obsahuje 200 μg/ml streptomycinu. Potom se touto kulturou naočkuje fermentační prostředí (DYT) při použití 1 % očkovacího materiálu a kultura se nechá růst při teplotě 30 C 20 až 30 hodin. Účinnost po 25 hodinách je přibližně 220 jednotek/g vlhké biomasy, tj. přibližně 1,8 jednotek/mg bílkoviny.
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Mikroorganismus čeledi E. coli nebo Pseudomonas putida, obsahující plasmid pBT 2a-l, DSM 3148P nebo pBT 306.16. DSM 3149P a konstruktivně produkující kreatinamidinhydrolázu.
- 2. Rekombinovaná DNA, obsahující následující kódový řetězec baží pro bílkovinu, štěpící kreatin s řetězcem aminokyselin 1 až 403,. .MetGlnMetProLysThrLeuArglleArgAsnGlyAspLysValArgSerThrPheSer ATGCAAATGCCCAAGACGCTCCGCATCCGTAACGGCGACAAGGTTCGCTCCACCTTCTCCAlaGlnGluTyrAlaAsnArgGlnAlaArgLeuArgAlaHisLeuAlaAlaGluAsnileGCCCAGGAATACGCCAATCGCCAAGCCAGGCTGCGCGCCCACCTGGCGGCGGAGAACATCAspAlaAlallePheThrSerTyrHisAsnlleAsnTyrTyrSerAspPheLeuTyrCys GACGCCGCGATCTTCACCTCGTACCACAACATCAACTACTACTCCGACTTCCTCTACTGCSerPheGlyArgProTyrAlaLeuValValThrHisAspAspVallleSerlleSerAla TCCTTCGGCCGCCCCTACGCGTTGGTGGTGACCCACGACGACGTCATCAGCATCAGCGCCAsnlleAspGlyGlyGlnProTrpArgArgThrValGlyThrAspAsnlleValTyrThr AACATCGACGGCGGCCAGCCGTGGCGCCGCACCGTCGGCACCGACAACATCGTCTACACCAspTrpGlnArgAspAsnTyrPheAlaAlalleGlnGlnAlaLeuProLysAlaArgArg GACTGGCAGCGCGATAACTACTTCGCCGCCATCCAGCAGGCGTTGCCGAAGGCCCGCCGCIleGlylleGluHisAspHisLeuAsnLeuGlnAsnArgAspLysLevAlaAlaArgTyr ATCGGCATCGAACATGACCACCTGAACCTGCAGAACCGCGACAAGCTGGCCGCGCGCTATProAspAlaGluLeuValAspValAlaAlaAlaCysMetArgMetArgMetlleLysSer CCGGACGCCGAGCTGGTGGACGTGGCCGCCGCCTGCATGCGTATGCGCATGATCAAATCCAlaGluGluHisValMetlleArgHisGlyAlaArglleAlaAspIleGlyGlyAlaAlaGCCGAAGAGCACGTGATGATCCGCCACGGCGCGCGCATCGCCGACATCGGTGGTGCGGCGValValGluAlaLeuGlyAspGlnVálProGluTvrGlyValAlaLeuHisAlaThrGlnGTGGTCGAAGCCCTGGGCGACCAGGTACCGGAATACGAAGTGGCGCTGCATGCCACCCAGAlaMetValArgAlalleAlaAspThrPheGluAspValGluLeuMetAspThrTrpThr GCCATGGTCCGCGCCATTGCCGATACCTTCGAGGACGTGGAGCTGATGGATACCTGGACCTrpPheGlnSerGlylleAsnThrAspGlyAlaHisAsnProValThrThrArgLysVal TGGTTCCAGTCCGGCATCAACACCGACGGCGCGCACAACCCGGTGACCACCCGCAAGGTGAsnLysGlyAspIleLeuSerLeuAsnCysPheProMetlleAlaGlyTyrTyrThrAlaAACAAGGGCGACATCCTCAGCCTCAACTGCTTCCCGATGATCGCCGGCTACTACACCGCGLeuGluArgThrLeuPheLeuAspHisCysSerAspAspHisLeuArgLeuTrpGlnVal TTGGAGCGCACCCTGTTCCTCGACCACTGCTCGGACGACCACCTGCGTCTGTGGCAGGTCAsnValGluValHisGluAlaGlyLeuLysLeuIleLysProGlyAlaArgCysSerAsp AACGTCGAGGTGCATGAAGCCGGCCTGAAGCTGATCAAGCCCGGTGCGCGTTGCAGCGAT-13CZ 279427 B6IleAlaArgGluLeuAsnGluIlePheLeuLysHisAspValLeuGlnTyrArgThrPhe . ATCGCCCGCGAGCTGAACGAGATCTTCCTCAAGCACGACGTGCTGCAGTACCGCACCTTCGlyTyrGlyHisSerPheGlyThrLeuSerHisTyrTyrGlyArgGluAlaGlyLeuGluGGCTACGGCCACTCCTTCGGCACGCTCAGCCACTACTACGGCCGCGAGGCCGGGTTGGAALeuArgGluAspIleAspThrValLeuGluProGlyMetValValSerMetGluProMetCTGCGCGAGGACATCGACACCGTGCTGGAGCCGGGCATGGTGGTGTCGATGGAGCCGATGIleMetLeuProGluGlyLeuProGlyAlaGlyGlyTyrArgGluHisAspIleLeuIleATCATGCTGCCGGAAGGCCTGCCGGGCGCCGGTGGCTATCGCGAGCACGACATCCTGATCValAsnGluAsnGlyAlaGluAsnlleThrLysPheProTyrGlyProGluLysAsnlleGTCAACGAGAACGGTGCCGAGAACATCACCAAGTTCCCCTACGGCCCGGAGAAAAACATCIleArgLysATCCGCAAATGA nebo jeho ekvivalent, který je podle genetického kódu kódovým řetězcem pro stejný řetězec aminokyselin.
- 3. Rekombinovaná DNA podle nároku 2 ve formě plasmidu pBT 2a-l, DSM 3148P.
- 4. Rekombinovaná DNA podle nároku 2 ve formě plasmidu pBT 306.16, DSM 3149P.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853500184 DE3500184A1 (de) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ7586A3 CZ7586A3 (en) | 1994-11-16 |
| CZ279427B6 true CZ279427B6 (cs) | 1995-04-12 |
Family
ID=6259284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS8675A CZ279427B6 (cs) | 1985-01-04 | 1986-01-03 | Způsob pěstování mikroorganismu |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4861717A (cs) |
| EP (1) | EP0187138B1 (cs) |
| JP (2) | JPH062050B2 (cs) |
| AT (1) | ATE74964T1 (cs) |
| AU (1) | AU561319B2 (cs) |
| CA (1) | CA1309960C (cs) |
| CZ (1) | CZ279427B6 (cs) |
| DE (2) | DE3500184A1 (cs) |
| DK (1) | DK3086A (cs) |
| ES (1) | ES8704543A1 (cs) |
| GR (1) | GR853154B (cs) |
| IE (1) | IE58794B1 (cs) |
| SK (1) | SK7586A3 (cs) |
| SU (1) | SU1523055A3 (cs) |
| UA (1) | UA6152A1 (cs) |
| YU (1) | YU204985A (cs) |
| ZA (1) | ZA8630B (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3500184A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
| JPS62208281A (ja) * | 1986-03-07 | 1987-09-12 | Kikkoman Corp | クレアチナ−ゼの製造法 |
| JPS62205786A (ja) * | 1986-03-07 | 1987-09-10 | Kikkoman Corp | 新規な組み換え体ｄｎａ |
| DE3803175A1 (de) * | 1987-05-12 | 1988-11-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabile creatinamidinohydrolase-mutanten |
| JPS6437292A (en) * | 1987-08-04 | 1989-02-07 | Toyo Jozo Kk | Dna having genetic information of creatinase and use thereof |
| JP2527035B2 (ja) * | 1989-06-16 | 1996-08-21 | 東洋紡績株式会社 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51118884A (en) * | 1975-04-05 | 1976-10-19 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Process for preparing creatine amidinohydrolase |
| US4039384A (en) * | 1975-04-05 | 1977-08-02 | Noda Institute For Scientific Research | Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them |
| DE3500184A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
-
1985
- 1985-01-04 DE DE19853500184 patent/DE3500184A1/de not_active Withdrawn
- 1985-12-24 AU AU51631/85A patent/AU561319B2/en not_active Ceased
- 1985-12-26 JP JP60292383A patent/JPH062050B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-27 YU YU204985A patent/YU204985A/sh unknown
- 1985-12-30 GR GR853154A patent/GR853154B/el unknown
-
1986
- 1986-01-02 CA CA000498900A patent/CA1309960C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-03 DK DK3086A patent/DK3086A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-01-03 EP EP86100066A patent/EP0187138B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-03 ZA ZA8630A patent/ZA8630B/xx unknown
- 1986-01-03 ES ES550669A patent/ES8704543A1/es not_active Expired
- 1986-01-03 CZ CS8675A patent/CZ279427B6/cs unknown
- 1986-01-03 IE IE1686A patent/IE58794B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-01-03 SU SU864002500A patent/SU1523055A3/ru active
- 1986-01-03 SK SK75-86A patent/SK7586A3/sk unknown
- 1986-01-03 AT AT86100066T patent/ATE74964T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-01-03 UA UA4002500A patent/UA6152A1/uk unknown
- 1986-01-03 DE DE8686100066T patent/DE3684787D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-06 US US06/816,565 patent/US4861717A/en not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-07-30 JP JP5189871A patent/JPH07102140B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3684787D1 (de) | 1992-05-21 |
| DK3086D0 (da) | 1986-01-03 |
| AU561319B2 (en) | 1987-05-07 |
| JPH06233687A (ja) | 1994-08-23 |
| SK278079B6 (en) | 1995-12-06 |
| DK3086A (da) | 1986-07-05 |
| IE860016L (en) | 1986-07-04 |
| EP0187138A2 (de) | 1986-07-09 |
| ZA8630B (en) | 1986-09-24 |
| ATE74964T1 (de) | 1992-05-15 |
| CZ7586A3 (en) | 1994-11-16 |
| US4861717A (en) | 1989-08-29 |
| GR853154B (cs) | 1986-04-24 |
| UA6152A1 (uk) | 1994-12-29 |
| SK7586A3 (en) | 1995-12-06 |
| JPS61162170A (ja) | 1986-07-22 |
| ES550669A0 (es) | 1987-04-16 |
| ES8704543A1 (es) | 1987-04-16 |
| AU5163185A (en) | 1986-07-10 |
| SU1523055A3 (ru) | 1989-11-15 |
| CA1309960C (en) | 1992-11-10 |
| JPH062050B2 (ja) | 1994-01-12 |
| YU204985A (sh) | 1992-09-07 |
| JPH07102140B2 (ja) | 1995-11-08 |
| IE58794B1 (en) | 1993-11-17 |
| DE3500184A1 (de) | 1986-08-14 |
| EP0187138B1 (de) | 1992-04-15 |
| EP0187138A3 (en) | 1988-03-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1188236A (en) | Plasmids | |
| Nakano et al. | Isolation and characterization of sfp: a gene that functions in the production of the lipopeptide biosurfactant, surfactin, in Bacillus subtilis | |
| Buckel et al. | Expression of Pseudomonas fluorescens D-galactose dehydrogenase in E. coli | |
| RU2178808C2 (ru) | Способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-adca) | |
| US4375514A (en) | Preparation and use of recombinant plasmids containing genes for alkaline phosphatases | |
| KR100312456B1 (ko) | 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자 | |
| CA2271785C (en) | Methods for preparing nucleotide integrases | |
| JP2729628B2 (ja) | 巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼの調製方法 | |
| CZ279427B6 (cs) | Způsob pěstování mikroorganismu | |
| FR2559781A1 (fr) | Nouveau vecteur plasmidique hybride de e. coli conferant le pouvoir de faire fermenter le saccharose et son procede de preparation | |
| CZ348096A3 (en) | Actinomycetic promoter | |
| Mayer et al. | Cloning of the penicillin G-acylase gene of Escherichia coli ATCC 11105 on multicopy plasmids | |
| JPH02167078A (ja) | 二次代謝産物生産増加のための生合成遺伝子又は制御遺伝子の単離法及び使用法 | |
| US4464471A (en) | Biologically engineered plasmid coding for production of β-glucosidase, organisms modified by this plasmid and methods of use | |
| JP3343567B2 (ja) | 糸状菌のエンハンサーｄｎａ塩基配列およびその用途 | |
| JPS62155081A (ja) | 新規微生物およびそれを用いる醗酵法によるビオチンの製造法 | |
| EP0071486B1 (en) | Novel microorganisms of the genus eschericia, hybrid dna for use in their production and the use of the microorganisms in the preparation of glutathione | |
| JP2777805B2 (ja) | イソアミラーゼの構造遺伝子 | |
| CZ311888A3 (en) | Creatinamidine hydrolase,, process of its preparation and use | |
| CA2002890C (en) | Expression of dna sequences derived from nocardioform microorganisms | |
| Allison et al. | A suicide vector for allelic recombination involving the gene for glutamate 1-semialdehyde aminotransferase in the cyanobacterium Synechococcus PCC 7942 | |
| JPS61181374A (ja) | 中性プロテア−ゼの産生法 | |
| EP0038156A2 (en) | A plasmid and its microbiological preparation | |
| KR0165907B1 (ko) | 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 다제내성을 지정하는 dna 단편 | |
| Bruni et al. | Salmonella typhimurium mutants lacking ribonuclease I: effect on the polarity of histidine mutants |