JPH07102140B2 - 組換えｄｎａ - Google Patents
組換えｄｎａInfo
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- JPH07102140B2 JPH07102140B2 JP5189871A JP18987193A JPH07102140B2 JP H07102140 B2 JPH07102140 B2 JP H07102140B2 JP 5189871 A JP5189871 A JP 5189871A JP 18987193 A JP18987193 A JP 18987193A JP H07102140 B2 JPH07102140 B2 JP H07102140B2
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- plasmid
- dna
- coli
- fragment
- creatine
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- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/877—Pseudomonas putida
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は構成性クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼを形成する微生物のプラスミドに関す
る。
ノヒドロラーゼを形成する微生物のプラスミドに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼ
（ＥＣ３．５．３．３）は、クレアチニン測定のために
工業的に使用されている。従って、これは、特に血清中
又は尿中のクレアチニン含量が、健康な組織に現われる
値とは異なる値で現われる腎臓疾患の診断のための臨床
分析で使用される。例えばクレアチニンによる誘導下
に、後処理に耐える量でクレアチンアミジノヒドロラー
ゼを製造することができる微生物例えばシュードモナス
属菌が公知であるが、この酵素の取得可能な収率及び単
離の経費は、なおこの酵素の工業的使用のためには制限
要因となっている。
（ＥＣ３．５．３．３）は、クレアチニン測定のために
工業的に使用されている。従って、これは、特に血清中
又は尿中のクレアチニン含量が、健康な組織に現われる
値とは異なる値で現われる腎臓疾患の診断のための臨床
分析で使用される。例えばクレアチニンによる誘導下
に、後処理に耐える量でクレアチンアミジノヒドロラー
ゼを製造することができる微生物例えばシュードモナス
属菌が公知であるが、この酵素の取得可能な収率及び単
離の経費は、なおこの酵素の工業的使用のためには制限
要因となっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、この欠点を有
せず、殊に、クレアチンアミジノヒドロラーゼを構成的
に形成する即ちこのために誘導を必要とすることなし
に、かつこの際に従来公知のクレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ成形体よりも著しく良好な収率を示す微生物が必
要である。更に、本発明の目的物は、遺伝子工学的方法
で、良好に培養でき、それから酵素を経費的に好適に単
離することのできる宿主微生物中に、所定酵素の合成能
力に関する遺伝子情報を有する微生物の組換えＤＮＡで
ある。
せず、殊に、クレアチンアミジノヒドロラーゼを構成的
に形成する即ちこのために誘導を必要とすることなし
に、かつこの際に従来公知のクレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ成形体よりも著しく良好な収率を示す微生物が必
要である。更に、本発明の目的物は、遺伝子工学的方法
で、良好に培養でき、それから酵素を経費的に好適に単
離することのできる宿主微生物中に、所定酵素の合成能
力に関する遺伝子情報を有する微生物の組換えＤＮＡで
ある。
【０００４】
【課題を解決する手段】本発明により、この課題は解決
される。従って、本発明の目的は、構成性クレアチンア
ミジノヒドロラーゼを形成する特徴を有するＥ・コリー
又はシュードモナス・プチダに属する微生物のＤＮＡで
ある。Ｅ・コリーに属する微生物に関して、この酵素の
誘導性形成も従来は認められていなかった。シュードモ
ナス・プチダにおいては、クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの形成に関する情報が存在するが、この酵素は誘導
下にのみ、かつ、かなり低い活性で形成される。
される。従って、本発明の目的は、構成性クレアチンア
ミジノヒドロラーゼを形成する特徴を有するＥ・コリー
又はシュードモナス・プチダに属する微生物のＤＮＡで
ある。Ｅ・コリーに属する微生物に関して、この酵素の
誘導性形成も従来は認められていなかった。シュードモ
ナス・プチダにおいては、クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼの形成に関する情報が存在するが、この酵素は誘導
下にのみ、かつ、かなり低い活性で形成される。
【０００５】本発明によるＥ・コリーに属する有利な微
生物は、プラスミドｐＢＴ２ａ−１を有する。この種の
微生物は、蛋白質のその全合成能力の５０％までをクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの形成のために調達するこ
とができる。
生物は、プラスミドｐＢＴ２ａ−１を有する。この種の
微生物は、蛋白質のその全合成能力の５０％までをクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの形成のために調達するこ
とができる。
【０００６】本発明によるもう１つの有利な微生物は、
プラスミドｐＢＴ３０６．１６を有するＥ・コリー又は
シュードモナス・プチダに属する微生物である。この種
の微生物は、同様に非常に高い構成能力を有する構成性
クレアチンアミジノヒドロラーゼ形成体である。
プラスミドｐＢＴ３０６．１６を有するＥ・コリー又は
シュードモナス・プチダに属する微生物である。この種
の微生物は、同様に非常に高い構成能力を有する構成性
クレアチンアミジノヒドロラーゼ形成体である。
【０００７】本発明のもう１つの目的は、プラスミドｐ
ＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ３１４８Ｐ）及びｐＢＴ３０６．
１６（ＤＳＭ３１４９Ｐ）である。最初に記載のプラス
ミドは特に高い合成能力をＥ・コリー属の微生物に与
え、第２番目に記載のプラスミドは、Ｅ・コリー内でも
シュードモナス・プチダ内でも所望酵素の高い表現を与
える利点を有する。
ＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ３１４８Ｐ）及びｐＢＴ３０６．
１６（ＤＳＭ３１４９Ｐ）である。最初に記載のプラス
ミドは特に高い合成能力をＥ・コリー属の微生物に与
え、第２番目に記載のプラスミドは、Ｅ・コリー内でも
シュードモナス・プチダ内でも所望酵素の高い表現を与
える利点を有する。
【０００８】前記のように、本発明によるプラスミド
は、遺伝子工学的方法で得ることができる。従って、本
発明による構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する前記種属の微生物の製法は、シュードモナス・プ
チダからのＤＮＡを ａ） EcoＲＩで制限的に消化させて５．８Ｋｂ−フラ
グメントを得るか又は ｂ） EcoＲＩ及びＲＩＩで切断して２．２Ｋｂ−フラ
グメントを得、 ａ）又はｂ）で得たフラグメントをその又は同じ制限エ
ンドヌクレアーゼで切断されたベクターにクローン化
し、これを選択したベクターにとって好適なＥ・コリー
又はＰ．プチダ株中に移し、構成性クレアチンアミジノ
ヒドロラーゼを形成するクローンを単離することよりな
る。ここでＫｂは、「キロ塩基対」即ち１０００ヌクレ
オチド塩基対である。
は、遺伝子工学的方法で得ることができる。従って、本
発明による構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する前記種属の微生物の製法は、シュードモナス・プ
チダからのＤＮＡを ａ） EcoＲＩで制限的に消化させて５．８Ｋｂ−フラ
グメントを得るか又は ｂ） EcoＲＩ及びＲＩＩで切断して２．２Ｋｂ−フラ
グメントを得、 ａ）又はｂ）で得たフラグメントをその又は同じ制限エ
ンドヌクレアーゼで切断されたベクターにクローン化
し、これを選択したベクターにとって好適なＥ・コリー
又はＰ．プチダ株中に移し、構成性クレアチンアミジノ
ヒドロラーゼを形成するクローンを単離することよりな
る。ここでＫｂは、「キロ塩基対」即ち１０００ヌクレ
オチド塩基対である。
【０００９】クレアチンアミジノヒドロラーゼの表現の
ための情報は、５．８Ｋｂ−フラグメントもしくはその
２．２Ｋｂのサブフラグメント（これは前記方法で、制
限エンドヌクレアーゼEcoＲＩ単独で又はPvuＩＩと一緒
になったEcoＲＩで切り出される）上に存在する。それ
ぞれのフラグメントは、遺伝子工学に公知の方法によ
り、適合末端を得るために同じ制限エンドヌクレアーゼ
で切断されたベクターにクローン化される。有利でない
場合にも、Ｅ・コリー又はシュードモナス・プチダに好
適なベクターを、その切断位置でシュードモナス・プチ
ダからの１個又は前記のＤＮＡ−フラグメントで補修さ
れたベクターの修復能力及びその形質転換性が宿主菌株
内で保持されるように配置されている他の制限エンドヌ
クレアーゼで切断することもできる。ベクターとして、
有利にプラスミドｐＢＲ３２２を使用し、これは双方の
シュードモナス・プチダＤＮＡフラグメントの１個のＥ
・コリー株内への挿入により形質転換する。当業者にと
って、プラスミドｐＢＲ３２２及びその誘導体で非常に
良好に形質転換できる多くのＥ・コリー株は公知であ
る。他の有利なベクター（ファージ・シャロン（Phage
charon）１０．ｐＢＲ３２２並びにその誘導体は同様で
ある）はベクター市場で入手される。
ための情報は、５．８Ｋｂ−フラグメントもしくはその
２．２Ｋｂのサブフラグメント（これは前記方法で、制
限エンドヌクレアーゼEcoＲＩ単独で又はPvuＩＩと一緒
になったEcoＲＩで切り出される）上に存在する。それ
ぞれのフラグメントは、遺伝子工学に公知の方法によ
り、適合末端を得るために同じ制限エンドヌクレアーゼ
で切断されたベクターにクローン化される。有利でない
場合にも、Ｅ・コリー又はシュードモナス・プチダに好
適なベクターを、その切断位置でシュードモナス・プチ
ダからの１個又は前記のＤＮＡ−フラグメントで補修さ
れたベクターの修復能力及びその形質転換性が宿主菌株
内で保持されるように配置されている他の制限エンドヌ
クレアーゼで切断することもできる。ベクターとして、
有利にプラスミドｐＢＲ３２２を使用し、これは双方の
シュードモナス・プチダＤＮＡフラグメントの１個のＥ
・コリー株内への挿入により形質転換する。当業者にと
って、プラスミドｐＢＲ３２２及びその誘導体で非常に
良好に形質転換できる多くのＥ・コリー株は公知であ
る。他の有利なベクター（ファージ・シャロン（Phage
charon）１０．ｐＢＲ３２２並びにその誘導体は同様で
ある）はベクター市場で入手される。
【００１０】ｐＢＲ３２２をEcoＲＩ及びPvuＩＩで切断
し、この際に生じる２．３Ｋｂ−フラグメントを単離
し、Ｐ・プチダからの２．２Ｋｂ EcoＲＩ−PvuＩＩフ
ラグメントと連結させ、ｐＢＴ３−２と称される新規プ
ラスミドを形成させ、これをＥ・コリー中に移す方法が
より有利である。こうしてＥ・コリーＫ１２ＥＤ８６５
４（ＤＳＭ３１４４）が得られる。
し、この際に生じる２．３Ｋｂ−フラグメントを単離
し、Ｐ・プチダからの２．２Ｋｂ EcoＲＩ−PvuＩＩフ
ラグメントと連結させ、ｐＢＴ３−２と称される新規プ
ラスミドを形成させ、これをＥ・コリー中に移す方法が
より有利である。こうしてＥ・コリーＫ１２ＥＤ８６５
４（ＤＳＭ３１４４）が得られる。
【００１１】前記方法でｐＢＲ３２２からの誘導体で形
質転換されたＥ・コリー株は、そのアンピシリン耐性に
基づき、非常に良好に選択できる。これらはアンピシリ
ン耐性であり、かつクレアチンアミジノヒドロラーゼ形
成体であるので、形質転換されなかった細胞は生長させ
ることはできず、生長した細胞の下で、所望の酵素を形
成するものは後に詳述する方法で容易に取り出すことが
できる。
質転換されたＥ・コリー株は、そのアンピシリン耐性に
基づき、非常に良好に選択できる。これらはアンピシリ
ン耐性であり、かつクレアチンアミジノヒドロラーゼ形
成体であるので、形質転換されなかった細胞は生長させ
ることはできず、生長した細胞の下で、所望の酵素を形
成するものは後に詳述する方法で容易に取り出すことが
できる。
【００１２】本発明により、ｐＢＴ３−２を有する形質
転換されたＥ・コリー細胞をプラスミドの増幅の時点に
ニトロソグアニジンで処理し、その後、このプラスミド
をこれから単離し、改めてＥ・コリー細胞中に移し、こ
のサイクルを場合により繰り返し、この際に得られる特
に優れたクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有する
微生物クローンから、同様に本発明の目的物であるプラ
スミドｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ３１４８Ｐ）を得る際
に、特に良好な結果が得られる。前記のように、プラス
ミドを有するＥ・コリー細胞は、全蛋白質形成に対して
５０％までのクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産す
る。
転換されたＥ・コリー細胞をプラスミドの増幅の時点に
ニトロソグアニジンで処理し、その後、このプラスミド
をこれから単離し、改めてＥ・コリー細胞中に移し、こ
のサイクルを場合により繰り返し、この際に得られる特
に優れたクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有する
微生物クローンから、同様に本発明の目的物であるプラ
スミドｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ３１４８Ｐ）を得る際
に、特に良好な結果が得られる。前記のように、プラス
ミドを有するＥ・コリー細胞は、全蛋白質形成に対して
５０％までのクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産す
る。
【００１３】クレアチンアミジノヒドロラーゼの特に高
い活性を有する生じた微生物クローンを同定することの
できるスクリーニング系が得られ、この際、この種のク
ローンを、クレアチン、サルコシンオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ及びＨ2Ｏ2−呈色指示薬を溶解含有するア
ガロースプレートと接触させる。次いで、強い酵素形成
に相応する最も強い呈色を示すクローンを増殖のために
選択する。Ｈ2Ｏ2−呈色指示薬系としては、４−アミノ
アンチピリンをＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３
−メチルアニリン塩有利にカリウム塩と組合わせて使用
するのが有利である。
い活性を有する生じた微生物クローンを同定することの
できるスクリーニング系が得られ、この際、この種のク
ローンを、クレアチン、サルコシンオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ及びＨ2Ｏ2−呈色指示薬を溶解含有するア
ガロースプレートと接触させる。次いで、強い酵素形成
に相応する最も強い呈色を示すクローンを増殖のために
選択する。Ｈ2Ｏ2−呈色指示薬系としては、４−アミノ
アンチピリンをＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３
−メチルアニリン塩有利にカリウム塩と組合わせて使用
するのが有利である。
【００１４】本発明の方法では、Ｅ・コリー中での酵素
の表現だけでなく、Ｐ・プチダ中でも好適であるプラス
ミドも製造できる。このために、ｐＢＴ２ａ−１から制
限エンドヌクレアーゼPvuＩ及びPvuＩＩを用いる切断に
より２．８Ｋｂ−フラグメントを得、これを、他の、ｐ
ＢＴ３０６．１からPvuＩ及びSmaＩを用いる切断により
得られる１０Ｋｂ−フラグメントと結紮するのが有利で
ある。こうして、プラスミドｐＢＴ３０６．１６（ＤＮ
Ａ３１４９Ｐ）が得られ、これは、Ｅ・コリー中でもＰ
・プチダ中でも構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼ
形成作用をする。
の表現だけでなく、Ｐ・プチダ中でも好適であるプラス
ミドも製造できる。このために、ｐＢＴ２ａ−１から制
限エンドヌクレアーゼPvuＩ及びPvuＩＩを用いる切断に
より２．８Ｋｂ−フラグメントを得、これを、他の、ｐ
ＢＴ３０６．１からPvuＩ及びSmaＩを用いる切断により
得られる１０Ｋｂ−フラグメントと結紮するのが有利で
ある。こうして、プラスミドｐＢＴ３０６．１６（ＤＮ
Ａ３１４９Ｐ）が得られ、これは、Ｅ・コリー中でもＰ
・プチダ中でも構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼ
形成作用をする。
【００１５】本発明により、酵素形成の著しい増加が達
成されることは意想外である。即ち、特定遺伝子のコピ
ー数を高めることによるＤＮＡ組換え法を使用すること
により高められた遺伝子表現が得られることは既に多く
報告された。しかしながら、これから、シュードモナス
からの遺伝子Ｅ・コリー中に移すことにより確実に遺伝
子表現を高めることに由来することはできない。実際
に、ＤＮＡ−組換えによりシュードモナスからＥ・コリ
ー中に移された遺伝子の多くに関して、遺伝子表現の減
少すら報告されている［例えばスタニッシュ（Stanisis
ch）及びオルテイツ(Ortiz)による。J.Gen.Microbiol.
１９７６、９４、２８１〜２８９、ナカザワ（Nakazaw
a）等によるJ．バクテリオロジイ（J.Bacteriol.）１９
７８、１３４、２７０〜２７７、リボン（Ribbons）等
によるSoc.Gen.Microbiol.,Quart.１９７８、６、２４
〜２５、フランクリン（Franklin）等によるMicrobiol
Dagradation of Xenebiotics and Recalicitrant Compo
unds.Leisinger Cook,Huetterund Neuesch Hrsgb.１９
８１、１０９〜１３０頁参照］。最終的に酵素活性蛋白
質を形成するまで進行すべき種々の生物学的合成工程を
考察すると、この種の改良は予期できなかったことが判
る。
成されることは意想外である。即ち、特定遺伝子のコピ
ー数を高めることによるＤＮＡ組換え法を使用すること
により高められた遺伝子表現が得られることは既に多く
報告された。しかしながら、これから、シュードモナス
からの遺伝子Ｅ・コリー中に移すことにより確実に遺伝
子表現を高めることに由来することはできない。実際
に、ＤＮＡ−組換えによりシュードモナスからＥ・コリ
ー中に移された遺伝子の多くに関して、遺伝子表現の減
少すら報告されている［例えばスタニッシュ（Stanisis
ch）及びオルテイツ(Ortiz)による。J.Gen.Microbiol.
１９７６、９４、２８１〜２８９、ナカザワ（Nakazaw
a）等によるJ．バクテリオロジイ（J.Bacteriol.）１９
７８、１３４、２７０〜２７７、リボン（Ribbons）等
によるSoc.Gen.Microbiol.,Quart.１９７８、６、２４
〜２５、フランクリン（Franklin）等によるMicrobiol
Dagradation of Xenebiotics and Recalicitrant Compo
unds.Leisinger Cook,Huetterund Neuesch Hrsgb.１９
８１、１０９〜１３０頁参照］。最終的に酵素活性蛋白
質を形成するまで進行すべき種々の生物学的合成工程を
考察すると、この種の改良は予期できなかったことが判
る。
【００１６】蛋白質に関する情報は、デソキシリボ核酸
（ＤＮＡ）内に含有されている。このＤＮＡは、ＤＮＡ
−依存ＲＮＡ−ポリメラーゼによりｍＲＮＡ（メッセン
ジャーＲＮＡ）に翻訳される。このように合成されたｍ
ＲＮＡは蛋白質内のリボソームの所で翻訳され、この
際、それぞれ３個の核酸（トリプレット又はコドン）
は、遺伝子コドンの法則に従ってって特定のアミノ酸の
形成を決定する。
（ＤＮＡ）内に含有されている。このＤＮＡは、ＤＮＡ
−依存ＲＮＡ−ポリメラーゼによりｍＲＮＡ（メッセン
ジャーＲＮＡ）に翻訳される。このように合成されたｍ
ＲＮＡは蛋白質内のリボソームの所で翻訳され、この
際、それぞれ３個の核酸（トリプレット又はコドン）
は、遺伝子コドンの法則に従ってって特定のアミノ酸の
形成を決定する。
【００１７】ＤＮＡ−平面上の制御範囲は、どの位置で
ＤＮＡの１本の鎖がｍＲＮＡに翻訳されるか（プロモー
ター配列）もしくはどの位置でｍＲＮＡの合成が停止さ
れるか（末端配列）を決める。
ＤＮＡの１本の鎖がｍＲＮＡに翻訳されるか（プロモー
ター配列）もしくはどの位置でｍＲＮＡの合成が停止さ
れるか（末端配列）を決める。
【００１８】同様に蛋白質合成（翻訳）の平面上の停止
及び開始配列は、公知である。この際、一般に、ＡＴＧ
（これはｆ−メチオニンに翻訳される）は、蛋白質の開
始を、かつ例えばＴＡＡ又はＴＡＧは翻訳の終わりを決
定する。
及び開始配列は、公知である。この際、一般に、ＡＴＧ
（これはｆ−メチオニンに翻訳される）は、蛋白質の開
始を、かつ例えばＴＡＡ又はＴＡＧは翻訳の終わりを決
定する。
【００１９】ポリペプチド配列の表現の程度は、多くの
ファクターに依存し、例えば特にプロモーター配列の品
質、ｍＲＮＡ−安定性、ｍＲＮＡの２次及び３次構造、
リボソーム結合位置の品質、開始コドン（ＡＴＧ）から
のリボソーム結合位置の距離、リボソーム結合位置と開
始コドン（ＡＴＧ）との間のヌクレオチド配列及び転写
及び翻訳面に対する有効停止信号の存在に依存する。遺
伝子及びこれによりコードされた蛋白質の１次構造の正
確な知識なしに、前記の遺伝子表現の調節工程を把握す
ることはできない。本発明以前この正確な知識は存在し
なかったので、本発明による微生物及びプラスミドの改
良された合成能力は予期できなかった。
ファクターに依存し、例えば特にプロモーター配列の品
質、ｍＲＮＡ−安定性、ｍＲＮＡの２次及び３次構造、
リボソーム結合位置の品質、開始コドン（ＡＴＧ）から
のリボソーム結合位置の距離、リボソーム結合位置と開
始コドン（ＡＴＧ）との間のヌクレオチド配列及び転写
及び翻訳面に対する有効停止信号の存在に依存する。遺
伝子及びこれによりコードされた蛋白質の１次構造の正
確な知識なしに、前記の遺伝子表現の調節工程を把握す
ることはできない。本発明以前この正確な知識は存在し
なかったので、本発明による微生物及びプラスミドの改
良された合成能力は予期できなかった。
【００２０】本発明の範囲では、Ｅ・コリーとして、Ｅ
・コリーＫ１２−株の有利な誘導体を使用する。そのう
ち、特に、例えば次のものが有効に使用された： Ｅ・コリーＫ１２、Ｗ３３５０［Ｐ・チオライス（Thio
llais）の thi、galk.galT、rpsl、］（ＤＳＭ３１４
１） Ｅ・コリーＫ１２、ＤＥ８６４５［Ｋ・ムレイ（Murra
y）の trp R、hsd M+、hsd R〜、sup E sup F］（ＤＳ
Ｍ２１０２） Ｅ・コリーＫ１２、ＣＳＨ［コールド・スプリング・ハ
ーバー・スタムザンムルング（Cold Spring Harbor Sta
mmsammlung）からのthi、trp、lac Z、rpsl］（ ＤＳ
Ｍ３１４２） シュードモナス・プチダ株の宿主細胞として、野生型単
離物も実験室株も使用できる。シュードモナス・プチダ
２４４０（ＤＳＭ２１０６）［Gene、１９８１、２３７
〜２４７参照］を用いて特に良好な結果が得られた。
・コリーＫ１２−株の有利な誘導体を使用する。そのう
ち、特に、例えば次のものが有効に使用された： Ｅ・コリーＫ１２、Ｗ３３５０［Ｐ・チオライス（Thio
llais）の thi、galk.galT、rpsl、］（ＤＳＭ３１４
１） Ｅ・コリーＫ１２、ＤＥ８６４５［Ｋ・ムレイ（Murra
y）の trp R、hsd M+、hsd R〜、sup E sup F］（ＤＳ
Ｍ２１０２） Ｅ・コリーＫ１２、ＣＳＨ［コールド・スプリング・ハ
ーバー・スタムザンムルング（Cold Spring Harbor Sta
mmsammlung）からのthi、trp、lac Z、rpsl］（ ＤＳ
Ｍ３１４２） シュードモナス・プチダ株の宿主細胞として、野生型単
離物も実験室株も使用できる。シュードモナス・プチダ
２４４０（ＤＳＭ２１０６）［Gene、１９８１、２３７
〜２４７参照］を用いて特に良好な結果が得られた。
【００２１】Ｅ・コリー中での表現のためのベクター系
として、本発明によれば、前記のように、有利に市販の
プラスミドｐＢＲ３２２の遺伝学的に操作された誘導体
［ゲンGen、１９７７、９５〜１１３参照］を使用する
のが有利である、シュードモナス株中の表現のために、
プラスミドｐＲＳ Ｆ１０１０の遺伝学的に変換された
誘導体［Gene、１９８１、２３７〜２４７参照］を使用
するのが有利である。本発明の遺伝学的に変換されたプ
ラスミドの形成のための前記の制限エンドヌクレアーゼ
の使用の際に、クレアチンアミジノヒドロラーゼをコー
ドする遺伝子フラグメントが得られ、これは、表現−ベ
クター系及び宿主細胞中のベクター系の増加されたコピ
ー数に作用する調節源並びにその生成物を容易に選択す
ることのできる（例えば抗生物質耐性）遺伝子を有す
る。
として、本発明によれば、前記のように、有利に市販の
プラスミドｐＢＲ３２２の遺伝学的に操作された誘導体
［ゲンGen、１９７７、９５〜１１３参照］を使用する
のが有利である、シュードモナス株中の表現のために、
プラスミドｐＲＳ Ｆ１０１０の遺伝学的に変換された
誘導体［Gene、１９８１、２３７〜２４７参照］を使用
するのが有利である。本発明の遺伝学的に変換されたプ
ラスミドの形成のための前記の制限エンドヌクレアーゼ
の使用の際に、クレアチンアミジノヒドロラーゼをコー
ドする遺伝子フラグメントが得られ、これは、表現−ベ
クター系及び宿主細胞中のベクター系の増加されたコピ
ー数に作用する調節源並びにその生成物を容易に選択す
ることのできる（例えば抗生物質耐性）遺伝子を有す
る。
【００２２】次に本発明を添付図面及び実施例につき詳
述する。
述する。
【００２３】図１は、シュードモナス・プチダＤＮＡか
らの２．２Ｋｂ−フラグメント及びプラスミドｐＢＲ３
２２を出発物質として用いたプラスミドｐＢＴ３−２の
製造経過を略示した図であり、図２は、プラスミドＲＳ
Ｆ１０１０及びｐＡＣＹＣ１７７からの本発明によるプ
ラスミドｐＢＴ３０６．１の製造工程を示す図であり、
図３は、ｐＢＴ３０６．１及びｐＢＴ２ａ−１からの本
発明によるプラスミドｐＢＴ３０１．１６の形成工程を
示す図であり、図４は第１片：出発株シュードモナス・
プチダ、第２片：プラスミドｐＢＴ２ａ−１を有するＥ
・コリー野生株ＥＤ、第４片：宿主株ＥＤ及び第３片：
比較用精製クレアチナーゼ１５μｇの細胞エキスを付与
したＳＤＳゲルを示す図である。
らの２．２Ｋｂ−フラグメント及びプラスミドｐＢＲ３
２２を出発物質として用いたプラスミドｐＢＴ３−２の
製造経過を略示した図であり、図２は、プラスミドＲＳ
Ｆ１０１０及びｐＡＣＹＣ１７７からの本発明によるプ
ラスミドｐＢＴ３０６．１の製造工程を示す図であり、
図３は、ｐＢＴ３０６．１及びｐＢＴ２ａ−１からの本
発明によるプラスミドｐＢＴ３０１．１６の形成工程を
示す図であり、図４は第１片：出発株シュードモナス・
プチダ、第２片：プラスミドｐＢＴ２ａ−１を有するＥ
・コリー野生株ＥＤ、第４片：宿主株ＥＤ及び第３片：
比較用精製クレアチナーゼ１５μｇの細胞エキスを付与
したＳＤＳゲルを示す図である。
【００２４】次表は酵素クレアチンアミジノヒドロラー
ゼをコードするＤＮＡ配列及びこのＤＮＡ配列から生じ
る蛋白質列を示している。
ゼをコードするＤＮＡ配列及びこのＤＮＡ配列から生じ
る蛋白質列を示している。
【００２５】
【化４】
【００２６】
【化５】
【００２７】
【化６】
【００２８】
【化７】
【００２９】本発明によるこのＤＮＡ配列の１つ又は複
数の塩基は置換されていても良い。
数の塩基は置換されていても良い。
【００３０】陽性クローン即ち、構成性クレアチンアミ
ジノヒドロラーゼを形成する微生物クローンを見つける
ために、本発明によれば、酵素免疫テストの原理により
操作するスクリーニング系を使用することができる。こ
の際、クレアチンアミジノヒドロラーゼに対する特異抗
体を適当な担体例えばポリビニルシートに固定させ、こ
のシートを溶解されたコロニイ及びプラーク上にのせ
る。Ｈ2Ｏで洗浄の後に、このシートを酵素接合物（例
えばペルオキシダーゼとの）の形の同じ特異抗体と共に
インキュベートする。この酵素を生産しうるクローンを
存在させると、抗体−抗原及び酵素標識された抗体から
のサンドイッチが生じる。
ジノヒドロラーゼを形成する微生物クローンを見つける
ために、本発明によれば、酵素免疫テストの原理により
操作するスクリーニング系を使用することができる。こ
の際、クレアチンアミジノヒドロラーゼに対する特異抗
体を適当な担体例えばポリビニルシートに固定させ、こ
のシートを溶解されたコロニイ及びプラーク上にのせ
る。Ｈ2Ｏで洗浄の後に、このシートを酵素接合物（例
えばペルオキシダーゼとの）の形の同じ特異抗体と共に
インキュベートする。この酵素を生産しうるクローンを
存在させると、抗体−抗原及び酵素標識された抗体から
のサンドイッチが生じる。
【００３１】抗体−ペルオキシダーゼ−接合物は適当な
呈色指示薬系で呈色し、例えばゼラチン中のテトラメチ
ルベンジジン、ジオクチルナトリウムスルホスクシネー
ト及びＨ2Ｏ2からの指示薬系において、緑色斑点を示
す。この系は、蛋白質抗原１０ｐｇ〜１００ｐｇの検出
限界を示す。この種の酵素免疫テストの製造及び適当な
抗体の調製は、ベーリンガー・マンハイム社（Boehring
er Mannheim GmbH）のテストコンビナチオン・ゲンエク
スプレッション（Testkombination Genexpression）に
関する指示により実施することができる。
呈色指示薬系で呈色し、例えばゼラチン中のテトラメチ
ルベンジジン、ジオクチルナトリウムスルホスクシネー
ト及びＨ2Ｏ2からの指示薬系において、緑色斑点を示
す。この系は、蛋白質抗原１０ｐｇ〜１００ｐｇの検出
限界を示す。この種の酵素免疫テストの製造及び適当な
抗体の調製は、ベーリンガー・マンハイム社（Boehring
er Mannheim GmbH）のテストコンビナチオン・ゲンエク
スプレッション（Testkombination Genexpression）に
関する指示により実施することができる。
【００３２】
【実施例】次に実施例につき本発明を詳述する。
【００３３】例 １ Ａ）染色体 シュードモナス・プチダ（ＤＳＭ２１０６）の染色体Ｄ
ＮＡを、細胞の溶解及びガラス棒上へのＤＮＡの巻き付
け（Aufwickeln）により単離し、２回のフェノール処理
（phenolisierung）及びエタノール沈殿の後に、６００
μｇ／ｍｌの濃度で溶解させる［コスロイ（Cosloy）及
びオーイシ（Oishi）によるMolec.Gen.Genet.１９７
３、１２４、１〜１０頁参照］。
ＮＡを、細胞の溶解及びガラス棒上へのＤＮＡの巻き付
け（Aufwickeln）により単離し、２回のフェノール処理
（phenolisierung）及びエタノール沈殿の後に、６００
μｇ／ｍｌの濃度で溶解させる［コスロイ（Cosloy）及
びオーイシ（Oishi）によるMolec.Gen.Genet.１９７
３、１２４、１〜１０頁参照］。
【００３４】染色体ＤＮＡ １０μｇをEcoＲＩ（Ｅ．
Ｃ．３．１．２３．１１）５単位で制限的に３０分間分
解させ、アガロースゲル中で消化の程度を分析する。
Ｃ．３．１．２３．１１）５単位で制限的に３０分間分
解させ、アガロースゲル中で消化の程度を分析する。
【００３５】Ｂ）λシャロン（Charon）１０ ＤＮＡの
単離及び精製 株Ｅ・コリーＥＤ（ＤＳＭ ２１０２）の細菌１０10を
λファージシャロン１０ ５×１０8と共に３７℃で２
０分間インキュベートし、引続き、このバクテリアの溶
解が開始するまで完全培地５００ｍｌ中で生長させる。
ファージ及びＤＮＡ−単離の工程は、正確には、マニア
チス（Maniatis）等による文献モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laborat
ory）１９８２、７６〜８５頁の処方に従い行った。
単離及び精製 株Ｅ・コリーＥＤ（ＤＳＭ ２１０２）の細菌１０10を
λファージシャロン１０ ５×１０8と共に３７℃で２
０分間インキュベートし、引続き、このバクテリアの溶
解が開始するまで完全培地５００ｍｌ中で生長させる。
ファージ及びＤＮＡ−単離の工程は、正確には、マニア
チス（Maniatis）等による文献モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laborat
ory）１９８２、７６〜８５頁の処方に従い行った。
【００３６】シャロン１０ ＤＮＡ １０μｇを完全にEc
oＲＩで切断する。Ａ）によるEcoＲＩで制限的に消化さ
れた染色体シュードモナス・プチダＤＮＡ １μｇをEco
ＲＩで切断されたシャロン１０ ＤＮＡ ３μｇと酵素Ｔ
4ＤＮＡリガーゼの４０単位と共にインキュベートす
る。このファージλの頭部−及び尾部蛋白質で連結され
たＤＮＡ−フラグメントの包装（Verpacken）を試験管
内で行う。包装に必要な蛋白質の製造並びにＤＮＡの包
装は、マニアチス（Maniatis）等によるモレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning;Cold Spring Harbor
Laboratory）１９８２、２５６〜２９１に記載の方法
で行う（λ ＤＮＡ粒子に関する試験管内包装系は、市
場で例えばベーリンガー・マンハイムのＤＮＡ−パッケ
ージング・キット（DNA−packaging Kit）である。連結
されたλ及びシュードモナス・プチダＤＮＡ約０．５ｇ
を、試験管内包装バッチ２０μｌと共にインキュベート
し、６０分後に、ＳＭ緩衝液０．５ｍｌ（マニアチスに
よるモレキュラークローニング１９８２、４４３）を添
加し、この包装バッチの1／200量（２．５μｌ）を、株
ＥＤの昼夜培養物（１０〜2Ｍ硫酸マグネシウム中）２
００μｌと共に３７℃で１０分間インキュベートする。
この細菌懸濁液を引続きＬＢ［ミラー（Miller）のエク
スペリメンツ・イン・モレキュラー・ゲネティクス（Ex
periments inMolecular Genetics, Cold Spring Harbor
Loboratory）１９７２、４３３頁参照］アガロース
（０．８％）３ｍｌと混合し、ＬＢプレート上に注ぐ。
使用ＤＮＡ １μｇ当り、ファージプラーク（プラー
ク）約１０5が得られる。
oＲＩで切断する。Ａ）によるEcoＲＩで制限的に消化さ
れた染色体シュードモナス・プチダＤＮＡ １μｇをEco
ＲＩで切断されたシャロン１０ ＤＮＡ ３μｇと酵素Ｔ
4ＤＮＡリガーゼの４０単位と共にインキュベートす
る。このファージλの頭部−及び尾部蛋白質で連結され
たＤＮＡ−フラグメントの包装（Verpacken）を試験管
内で行う。包装に必要な蛋白質の製造並びにＤＮＡの包
装は、マニアチス（Maniatis）等によるモレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning;Cold Spring Harbor
Laboratory）１９８２、２５６〜２９１に記載の方法
で行う（λ ＤＮＡ粒子に関する試験管内包装系は、市
場で例えばベーリンガー・マンハイムのＤＮＡ−パッケ
ージング・キット（DNA−packaging Kit）である。連結
されたλ及びシュードモナス・プチダＤＮＡ約０．５ｇ
を、試験管内包装バッチ２０μｌと共にインキュベート
し、６０分後に、ＳＭ緩衝液０．５ｍｌ（マニアチスに
よるモレキュラークローニング１９８２、４４３）を添
加し、この包装バッチの1／200量（２．５μｌ）を、株
ＥＤの昼夜培養物（１０〜2Ｍ硫酸マグネシウム中）２
００μｌと共に３７℃で１０分間インキュベートする。
この細菌懸濁液を引続きＬＢ［ミラー（Miller）のエク
スペリメンツ・イン・モレキュラー・ゲネティクス（Ex
periments inMolecular Genetics, Cold Spring Harbor
Loboratory）１９７２、４３３頁参照］アガロース
（０．８％）３ｍｌと混合し、ＬＢプレート上に注ぐ。
使用ＤＮＡ １μｇ当り、ファージプラーク（プラー
ク）約１０5が得られる。
【００３７】クレアチナーゼをコードする遺伝子を有す
るファージの同定のために、先に記載の酵素免疫テスト
を使用する。この指示薬系は、６％ゼラチン中のテトラ
メチルベンジジン６ｍｇ／ｍｌ、ジオクチルナトリウム
スルホサクシネート２０ｍｇ／ｍｌ及びＨ2Ｏ2 ０．０
１％より成る。１０００プラーク当り２個の陽性信号が
測定される。
るファージの同定のために、先に記載の酵素免疫テスト
を使用する。この指示薬系は、６％ゼラチン中のテトラ
メチルベンジジン６ｍｇ／ｍｌ、ジオクチルナトリウム
スルホサクシネート２０ｍｇ／ｍｌ及びＨ2Ｏ2 ０．０
１％より成る。１０００プラーク当り２個の陽性信号が
測定される。
【００３８】Ｃ）Ｅ・コリー中のクレアチナーゼ−遺伝
子の再クローニング 酵素免疫テストで陽性のプラーク５個から前記のように
して、ファージＤＮＡを調製した。
子の再クローニング 酵素免疫テストで陽性のプラーク５個から前記のように
して、ファージＤＮＡを調製した。
【００３９】EcoＲＩを用いる５個の種々のＤＮＡの切
断は、種々異なるバンド（Band）と並んで５．８Ｋｂの
すべての５個のファージＤＮＡにおける共通のＤＮＡ−
バンドを示した。この５．８Ｋｂの大きさのフラグメン
トは種々の制限ヌクレアーゼで特性付けられた（図１参
照）。
断は、種々異なるバンド（Band）と並んで５．８Ｋｂの
すべての５個のファージＤＮＡにおける共通のＤＮＡ−
バンドを示した。この５．８Ｋｂの大きさのフラグメン
トは種々の制限ヌクレアーゼで特性付けられた（図１参
照）。
【００４０】このEcoＲＩフラグメント約５μｇからPvu
ＩＩの使用下に２．２Ｋｂフラグメントを切断した。生
じるＤＮＡフラグメントは、低融点アガロースゲル中で
その大きさに応じて分離され、２．２Ｋｂ EcoＲＩ−Pv
uＩＩフラグメントが単離される。低融点アガロースゲ
ルからのＤＮＡフラグメントの単離は、相応するバンド
を切出し、試験管（エッペンドルフ管）内に移し、約２
倍量の水を加えることにより行う。引続き、６５℃で、
アガロースが融解するまで（５〜１０分）インキュベー
トし、試料を短時間振動し、半量のフェノール（１０ｍ
Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び１ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ＴＥで中和）と共に激しく振動する。この相を１５
０００ｇで１０分間遠心することにより分離させ、上の
水相を改めてフェノールで振出する。１５０００ｇで１
０分間の遠心の後に、上相をエーテル各１ｍｌで２回振
出し、エーテルを６５℃で蒸発させ、ＤＮＡを、３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ７．２）1／10量及びエタノール
２．５倍量で−２０℃で沈殿させる。ＤＮＡを１５００
０ｇで１０分間の遠心により沈殿させ、真空中で乾燥さ
せ、ＴＥ １０μｌ中に入れる。他のすべてのフラグメ
ント単離はこの工程で行う。
ＩＩの使用下に２．２Ｋｂフラグメントを切断した。生
じるＤＮＡフラグメントは、低融点アガロースゲル中で
その大きさに応じて分離され、２．２Ｋｂ EcoＲＩ−Pv
uＩＩフラグメントが単離される。低融点アガロースゲ
ルからのＤＮＡフラグメントの単離は、相応するバンド
を切出し、試験管（エッペンドルフ管）内に移し、約２
倍量の水を加えることにより行う。引続き、６５℃で、
アガロースが融解するまで（５〜１０分）インキュベー
トし、試料を短時間振動し、半量のフェノール（１０ｍ
Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び１ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ＴＥで中和）と共に激しく振動する。この相を１５
０００ｇで１０分間遠心することにより分離させ、上の
水相を改めてフェノールで振出する。１５０００ｇで１
０分間の遠心の後に、上相をエーテル各１ｍｌで２回振
出し、エーテルを６５℃で蒸発させ、ＤＮＡを、３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ７．２）1／10量及びエタノール
２．５倍量で−２０℃で沈殿させる。ＤＮＡを１５００
０ｇで１０分間の遠心により沈殿させ、真空中で乾燥さ
せ、ＴＥ １０μｌ中に入れる。他のすべてのフラグメ
ント単離はこの工程で行う。
【００４１】ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ約４μｇをEcoＲＩ
及びPvuＩＩで切断し、２．３Ｋｂフラグメントを単離
させる。このｐＢＲ３２２フラグメント０．２μｇをＴ
4ＤＮＡリガーゼ５単位の使用下に、前記λファージか
らの２．２Ｋｂ EcoＲＩ−PvuＩＩフラグメント０．５
μｇと共にインキュベートする。生じるプラスミドはｐ
ＢＴ３−２なる名称を有し、Ｅ・コリー中で生物学的活
性のクレアチナーゼをコードする。
及びPvuＩＩで切断し、２．３Ｋｂフラグメントを単離
させる。このｐＢＲ３２２フラグメント０．２μｇをＴ
4ＤＮＡリガーゼ５単位の使用下に、前記λファージか
らの２．２Ｋｂ EcoＲＩ−PvuＩＩフラグメント０．５
μｇと共にインキュベートする。生じるプラスミドはｐ
ＢＴ３−２なる名称を有し、Ｅ・コリー中で生物学的活
性のクレアチナーゼをコードする。
【００４２】例 ２ プラスミドｐＢＴ３−２からのクレアチナーゼをコード
するＤＮＡを、タルマジェ（Talmadge）及びギルバート
（Gilbert）の方法［ゲン（Gene）１９８０、１２、２
３５〜２４１参照］で、増幅相の間にニトロソグアニジ
ンで処理する。引続き、プラスミド−ＤＮＡを細胞の溶
解の後にCsCl−エチジウムブロミド法で単離する［マニ
アチス等によるモレキュラー・クローニング（Molecula
r Cloning;Cold Spring Harbor ）１９８２、８８−９
４参照］。株Ｅ・コリーＥＤ８６５４の好適な細胞をプ
ラスミドＤＮＡで形質転換し（マニアチス等によるモレ
キュラー・クローニング、１９８２、２５０〜２５１参
照）、アンピシリン２０μｇ／ｍｌを含有する完全培地
プレート（ＬＢ）上に塗抹する。３７℃で１夜インキュ
ベートの後、コロニーを、予めニトロセルロース濾紙
［シュライヒア（Schleicher）、シュル（Schuell）Ｂ
Ａ８５］が載せられているＬＢプレート上で熱処理す
る。このプレートを３７℃で１２〜１８時間培養の後、
ニトロセルロース濾紙をコロニーと共に取り出し、クロ
ロホルム／トルオール（１：１）１ｍｌが加えられたガ
ラスペトリシャーレ（φ２０ｃｍ）中に移す。３７℃で
２０分間インキュベートする。引続き、ニトロセルロー
ス濾紙を指示薬−アガロースプレート上に、細胞と指示
薬プレートとの間に直接接触が生じるように置く。呈色
反応は時間と個々のクローン中で合成されたクレアチナ
ーゼの量との関係で得られる。前記活性スクリーニング
から、プラスミドｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ３１４３）を
有するクローンＥＤが単離される。このプラスミドは、
細胞の可溶性蛋白質の約５０％を構成するクレアチナー
ゼをコードする。この方法は図１に図示されている。
するＤＮＡを、タルマジェ（Talmadge）及びギルバート
（Gilbert）の方法［ゲン（Gene）１９８０、１２、２
３５〜２４１参照］で、増幅相の間にニトロソグアニジ
ンで処理する。引続き、プラスミド−ＤＮＡを細胞の溶
解の後にCsCl−エチジウムブロミド法で単離する［マニ
アチス等によるモレキュラー・クローニング（Molecula
r Cloning;Cold Spring Harbor ）１９８２、８８−９
４参照］。株Ｅ・コリーＥＤ８６５４の好適な細胞をプ
ラスミドＤＮＡで形質転換し（マニアチス等によるモレ
キュラー・クローニング、１９８２、２５０〜２５１参
照）、アンピシリン２０μｇ／ｍｌを含有する完全培地
プレート（ＬＢ）上に塗抹する。３７℃で１夜インキュ
ベートの後、コロニーを、予めニトロセルロース濾紙
［シュライヒア（Schleicher）、シュル（Schuell）Ｂ
Ａ８５］が載せられているＬＢプレート上で熱処理す
る。このプレートを３７℃で１２〜１８時間培養の後、
ニトロセルロース濾紙をコロニーと共に取り出し、クロ
ロホルム／トルオール（１：１）１ｍｌが加えられたガ
ラスペトリシャーレ（φ２０ｃｍ）中に移す。３７℃で
２０分間インキュベートする。引続き、ニトロセルロー
ス濾紙を指示薬−アガロースプレート上に、細胞と指示
薬プレートとの間に直接接触が生じるように置く。呈色
反応は時間と個々のクローン中で合成されたクレアチナ
ーゼの量との関係で得られる。前記活性スクリーニング
から、プラスミドｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ３１４３）を
有するクローンＥＤが単離される。このプラスミドは、
細胞の可溶性蛋白質の約５０％を構成するクレアチナー
ゼをコードする。この方法は図１に図示されている。
【００４３】ここに記載の直接ＮＧ−突然変異生成に対
して択一的に、異種プロモーター例えばラクトースプロ
モーター（これは例えば市場で入手しうるプラスミド例
えばｐＵＣ−プラスミドから、ＤＮＡ−フラグメントと
して単離されうる）の導入によっても、このクレアチナ
ーゼの表現増加が得られる。このために、プラスミドｐ
ＢＴ３−２をEcoＲＩ−位置で開裂させ、エキソヌクレ
アーゼBal ３１で各々の側から約１０〜１００ＢＰが除
かれるように処理する。次いで、ラクトースプロモータ
ーを、酵素Ｔ4−リガーゼを用いて、末端の連結下に、
短縮されたプラスミドｐＢＴ３−２中に導入連結させ
る。このＤＮＡを、次いで前記のようにニトロソ−グア
ニジンで突然変異させ、引続き株ＥＤの形質転換のため
に使用し、クローンを前記のプレートスクリーニングで
遺伝子表現に関して試験する。
して択一的に、異種プロモーター例えばラクトースプロ
モーター（これは例えば市場で入手しうるプラスミド例
えばｐＵＣ−プラスミドから、ＤＮＡ−フラグメントと
して単離されうる）の導入によっても、このクレアチナ
ーゼの表現増加が得られる。このために、プラスミドｐ
ＢＴ３−２をEcoＲＩ−位置で開裂させ、エキソヌクレ
アーゼBal ３１で各々の側から約１０〜１００ＢＰが除
かれるように処理する。次いで、ラクトースプロモータ
ーを、酵素Ｔ4−リガーゼを用いて、末端の連結下に、
短縮されたプラスミドｐＢＴ３−２中に導入連結させ
る。このＤＮＡを、次いで前記のようにニトロソ−グア
ニジンで突然変異させ、引続き株ＥＤの形質転換のため
に使用し、クローンを前記のプレートスクリーニングで
遺伝子表現に関して試験する。
【００４４】前記の指示薬−アガロースプレートは、ク
レアチンからの酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼ及
びサルコキシオキシダーゼにより生じたＨ2Ｏ2を、ペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）を介して1／2Ｏ2とＨ2Ｏに分解
し、この酵素を、例えば４−アミノアンチピリン（４−
ＡＡＰ）及びＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３−
メチルアニリン、Ｋ−塩（ＥＳＴ）からの呈色指示薬系
と反応させる。酵素サルコシンオキシダーゼ及びペルオ
キシダーゼの過剰の際に、コロニー中に合成されたクレ
アチンアミジノヒドロラーゼに関する尺度を表わす青−
紫色が生じる。
レアチンからの酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼ及
びサルコキシオキシダーゼにより生じたＨ2Ｏ2を、ペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）を介して1／2Ｏ2とＨ2Ｏに分解
し、この酵素を、例えば４−アミノアンチピリン（４−
ＡＡＰ）及びＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３−
メチルアニリン、Ｋ−塩（ＥＳＴ）からの呈色指示薬系
と反応させる。酵素サルコシンオキシダーゼ及びペルオ
キシダーゼの過剰の際に、コロニー中に合成されたクレ
アチンアミジノヒドロラーゼに関する尺度を表わす青−
紫色が生じる。
【００４５】テスト原理：
【００４６】
【化８】
【００４７】 クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性スクリーニング系の組成 １ クレアチン 最終濃度 １０ｍＭ ２ ＮａＮ3 最終濃度 ０．５ｍＭ ３ トリス（Tris）HCl（pH７．８） 最終濃度 ２０ｍＭ ４ サルコシンオキシダーゼ 最終濃度 ５Ｕ／ｍｌ ５ ペルオキシダーゼ 最終濃度 ２．５Ｕ／ｍｌ ６ ４−ＡＡＰ 最終濃度 ０．２５ｍｇ／ｍｌ ７ ＥＳＴ 最終濃度 １．５ｍｇ／ｍｌ １〜７に記載の試薬を溶かし、同量の低融点アガロース
（２％）と混合する。６ｍｌをペトリシャーレ中に注
ぎ、プレートは４℃で約２週間暗所に貯蔵することがで
きる。
（２％）と混合する。６ｍｌをペトリシャーレ中に注
ぎ、プレートは４℃で約２週間暗所に貯蔵することがで
きる。
【００４８】例 ３ クローン化及びシュードモナス・プチダ中のクローン化
されたクレアチンアミジノヒドロラーゼの表現のため
に、プラスミドＲＳＦ １０１０［バグダサリアン（Bag
dasarian）等によるゲン（Gene）１９８１、１６、２３
７〜２４７参照］を使用する。ＲＳＦ １０１０をPvnＩ
Ｉで直線化し、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７［チャン
（Chang）及びコーエン（Cohen）によるＪ．バクテリオ
ロジイ（Bacteriol.）１９７８、１３４、１１４１〜１
１５６参照］からHaeＩＩ切断により１．４Ｋｂフラグ
メントを単離した。ＲＳＦ １０１０ ＤＮＡ ０．２μ
ｇＴ4リガーゼの使用下にHaeＩＩフラグメント１μｇと
連結させると生じるプラスミドはｐＢＴ３０６．１であ
る（図２）。ＲＳＴ １０１０及びこのプラスミドの誘
導体は、広い宿主範囲により優れており［ゲン（Gene）
１６（１９８１）、２３７〜２４７参照］、例えば、シ
ュードモナス属菌内でもＥ・コリー内でも増幅するのに
好適である。プラスミドｐＢＴ２ａ−１をPvnＩ及びPvn
ＩＩで切断し、２．８Ｋｂフラグメントを単離させ、ｐ
ＢＴ３６０．１をPvuＩ及びSmaＩで切断し、１０Ｋｂフ
ラグメントを単離させた。ベクターＤＮＡ ０．５μｇ
をPvnＩ−PvnＩＩフラグメント０．５μｇと連結させ
る。Ｅ・コリーＥＤを形質転換させ、クレアチナーゼを
コードするクローンを前記プレート活性スクリーニング
系を用いて同定する。陽性クローンから前記CsCl−エチ
ジウムブロミド法によりプラスミドＤＮＡを調製する。
このプラスミドは、ｐＢＴ３０６．１６（ＤＳＭ３１４
９Ｐ）なる名称を有する（図３）。
されたクレアチンアミジノヒドロラーゼの表現のため
に、プラスミドＲＳＦ １０１０［バグダサリアン（Bag
dasarian）等によるゲン（Gene）１９８１、１６、２３
７〜２４７参照］を使用する。ＲＳＦ １０１０をPvnＩ
Ｉで直線化し、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７［チャン
（Chang）及びコーエン（Cohen）によるＪ．バクテリオ
ロジイ（Bacteriol.）１９７８、１３４、１１４１〜１
１５６参照］からHaeＩＩ切断により１．４Ｋｂフラグ
メントを単離した。ＲＳＦ １０１０ ＤＮＡ ０．２μ
ｇＴ4リガーゼの使用下にHaeＩＩフラグメント１μｇと
連結させると生じるプラスミドはｐＢＴ３０６．１であ
る（図２）。ＲＳＴ １０１０及びこのプラスミドの誘
導体は、広い宿主範囲により優れており［ゲン（Gene）
１６（１９８１）、２３７〜２４７参照］、例えば、シ
ュードモナス属菌内でもＥ・コリー内でも増幅するのに
好適である。プラスミドｐＢＴ２ａ−１をPvnＩ及びPvn
ＩＩで切断し、２．８Ｋｂフラグメントを単離させ、ｐ
ＢＴ３６０．１をPvuＩ及びSmaＩで切断し、１０Ｋｂフ
ラグメントを単離させた。ベクターＤＮＡ ０．５μｇ
をPvnＩ−PvnＩＩフラグメント０．５μｇと連結させ
る。Ｅ・コリーＥＤを形質転換させ、クレアチナーゼを
コードするクローンを前記プレート活性スクリーニング
系を用いて同定する。陽性クローンから前記CsCl−エチ
ジウムブロミド法によりプラスミドＤＮＡを調製する。
このプラスミドは、ｐＢＴ３０６．１６（ＤＳＭ３１４
９Ｐ）なる名称を有する（図３）。
【００４９】シュードモナス・プチダ２４４０中のプラ
スミドＤＮＡの形質転換は、正確には、フランクリン
（Franklin）の方法［マイクロビオール・デグラデーシ
ョン・オブ・キセノビオティクス・アンド・レカリシト
ラント・コンパウンズ（Microbiol Degradation of Xen
obiotics and Recalicitrant Compounds.Leisinger,Coo
k,heetter und Neusch.）１９８１、１０９〜１３０参
照］により行う。このプレート活性スクリーニングを用
いて、陽性クローンを同定した。このことは、シュード
モナス・プチダ２４４０（この株は染色体コードされた
クレアチンアミジノヒドロラーゼを含有する）で、プラ
スミドコードされたクレアチンアミジノヒドロラーゼの
表現を構成的に行うので、可能である。この識別特性に
より、染色体コードされたクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼとプラスミドコードされたクレアチンアミジノヒド
ロラーゼとの間での区別ができる。
スミドＤＮＡの形質転換は、正確には、フランクリン
（Franklin）の方法［マイクロビオール・デグラデーシ
ョン・オブ・キセノビオティクス・アンド・レカリシト
ラント・コンパウンズ（Microbiol Degradation of Xen
obiotics and Recalicitrant Compounds.Leisinger,Coo
k,heetter und Neusch.）１９８１、１０９〜１３０参
照］により行う。このプレート活性スクリーニングを用
いて、陽性クローンを同定した。このことは、シュード
モナス・プチダ２４４０（この株は染色体コードされた
クレアチンアミジノヒドロラーゼを含有する）で、プラ
スミドコードされたクレアチンアミジノヒドロラーゼの
表現を構成的に行うので、可能である。この識別特性に
より、染色体コードされたクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼとプラスミドコードされたクレアチンアミジノヒド
ロラーゼとの間での区別ができる。
【００５０】例 ４ クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の測定は、ウレア
ーゼを用いる反応で生じるアンモニウムイオンを、テス
ト組成物「ハルンストツフ（Harnstoff）（ベーリンガ
ー・マンハイムＢｅｓｔ．Ｎｒ．１２４７７０）」を用
いて検出することにより行う。
ーゼを用いる反応で生じるアンモニウムイオンを、テス
ト組成物「ハルンストツフ（Harnstoff）（ベーリンガ
ー・マンハイムＢｅｓｔ．Ｎｒ．１２４７７０）」を用
いて検出することにより行う。
【００５１】野生型シュードモナス・プチダ２４４０を
クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の測定のためにク
レアチン１％を含有するＬＢ培地（５ｍｌ）中で３０℃
で１夜インキュベートする。細胞を遠心により収得し、
５０ｍＭ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中で１回洗浄す
る。細胞を当初量で、燐酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
７．５）中に入れ、超音波処理（４×３０秒）により溶
解させる。クレアチンアミジノヒドロラーゼコードプラ
スミドを有する細胞の培養及び溶解は、前記と同様の方
法であるが、培地に誘導用のクレアチンを含有せず、ア
ンピシリン（プラスミドｐＢＴ３−２、ｐＢＴ２ａ−１
に対して２０μｇ／ｍｌ）もしくはストレプトマイシン
（プラスミドｐＢＴ３０６．１６に対して２００μｇ／
ｍｌ）の添加によりプラスミドを選択するようにして、
行う。培養物の生長は、シュードモナス・プチダに関し
ては３０℃で、Ｅ・コリーに関しては３７℃で行う。
クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の測定のためにク
レアチン１％を含有するＬＢ培地（５ｍｌ）中で３０℃
で１夜インキュベートする。細胞を遠心により収得し、
５０ｍＭ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）中で１回洗浄す
る。細胞を当初量で、燐酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
７．５）中に入れ、超音波処理（４×３０秒）により溶
解させる。クレアチンアミジノヒドロラーゼコードプラ
スミドを有する細胞の培養及び溶解は、前記と同様の方
法であるが、培地に誘導用のクレアチンを含有せず、ア
ンピシリン（プラスミドｐＢＴ３−２、ｐＢＴ２ａ−１
に対して２０μｇ／ｍｌ）もしくはストレプトマイシン
（プラスミドｐＢＴ３０６．１６に対して２００μｇ／
ｍｌ）の添加によりプラスミドを選択するようにして、
行う。培養物の生長は、シュードモナス・プチダに関し
ては３０℃で、Ｅ・コリーに関しては３７℃で行う。
【００５２】 シュードモナス・プチダ及びＥ・コリー中のクレアチンアミジノヒドロラーゼ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 株／プラスミド 活 性 培 養 Ｕ／ｌ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １）シュードモナス・プチダ ２４４０ １ −クレアチン ２） 〃 ２５０ ＋クレアチン ３）シュードモナス・プチダ ２４４０／ｐＢＴ306.16 １８００ −クレアチン ４）Ｅ・コリー ＥＤ − ±クレアチン ５）Ｅ・コリー ＥＤ／ ｐＢＴ３−２ ３０ −クレアチン ６）Ｅ・コリー ＥＤ／ ｐＢＴ２ａ−１ ２８００ −クレアチン −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− このデータは、クレアチンアミジノヒドロラーゼのクロ
ーン化により、１）Ｅ・コリー細菌は新特性を有するク
レアチンアミジノヒドロラーゼを合成し、２）この表現
（出発株シュードモナス・プチダとは逆に）は、Ｅ・コ
リーに関しても、シュードモナス・プチダに関しても構
成的に行われることを示している。更に、クレアチンア
ミジノヒドロラーゼコード性ＤＮＡの突然変異生成によ
り、特に高い表現を得ることができることが判る（誘導
されなかった出発株に比べたリットル当りの活性の増
大、シュードモナスでは力価１８００、Ｅ・コリーでは
力価２８００）。
ーン化により、１）Ｅ・コリー細菌は新特性を有するク
レアチンアミジノヒドロラーゼを合成し、２）この表現
（出発株シュードモナス・プチダとは逆に）は、Ｅ・コ
リーに関しても、シュードモナス・プチダに関しても構
成的に行われることを示している。更に、クレアチンア
ミジノヒドロラーゼコード性ＤＮＡの突然変異生成によ
り、特に高い表現を得ることができることが判る（誘導
されなかった出発株に比べたリットル当りの活性の増
大、シュードモナスでは力価１８００、Ｅ・コリーでは
力価２８００）。
【００５３】Ｅ・コリーＥＤ／ｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ
３１４３）中で、活性は５００単位／ビオマス（湿）１
ｇもしくは特異活性は４．５Ｕ／蛋白質ｍｇである。高
度精製された蛋白質の特異活性は、９Ｕ／ｍｇであるの
で、Ｅ・コリー中のクレアチンアミジノヒドロラーゼ
は、可溶性蛋白質の５０％になる。ＳＤＳ−ゲルでの粗
製エキスの分析結果［レムリ（Laemmli）によるナトウ
ア(Nature)１９７０、２２７、６８０〜６８５参照］
は、クレアチンアミジノヒドロラーゼは可溶性蛋白質フ
ラクションの主要バンドであることを示している（図
４、第２片）。
３１４３）中で、活性は５００単位／ビオマス（湿）１
ｇもしくは特異活性は４．５Ｕ／蛋白質ｍｇである。高
度精製された蛋白質の特異活性は、９Ｕ／ｍｇであるの
で、Ｅ・コリー中のクレアチンアミジノヒドロラーゼ
は、可溶性蛋白質の５０％になる。ＳＤＳ−ゲルでの粗
製エキスの分析結果［レムリ（Laemmli）によるナトウ
ア(Nature)１９７０、２２７、６８０〜６８５参照］
は、クレアチンアミジノヒドロラーゼは可溶性蛋白質フ
ラクションの主要バンドであることを示している（図
４、第２片）。
【００５４】例 ５ 醗酵装置中での培養のために、３種の種々のＥ・コリー
宿主系即ちＥ・コリーＷ３３５０、Ｅ・コリーＥＤ８６
５４もしくはＥ・コリーＣＳＨ１を使用した。プラスミ
ドｐＢＴ２ａ−１を適当な細胞中に移す。個々のコロニ
ー上での浄化の後に、アンピシリン２０μｇ／ｍｌを含
有するＤＹＴ培地［ミラー（Miller）のエクスペリメン
ト・イン・モレキュラー・ゲネテイスク（Experiments
in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor）、１９７
２、４３３参照］中の前培養物を３７℃で１夜培養す
る。この醗酵培地（ＤＹＴ）に前培養物を接種し（イノ
キュラム１％）、選択せずにプラスミド保持物（Plasmi
derhalt）上で３７℃で２０〜３０秒間生長させる。ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ活性は、２５時間後に約
６００Ｕ／湿物質ｇもしくは４．５Ｕ／蛋白質ｍｇであ
る。
宿主系即ちＥ・コリーＷ３３５０、Ｅ・コリーＥＤ８６
５４もしくはＥ・コリーＣＳＨ１を使用した。プラスミ
ドｐＢＴ２ａ−１を適当な細胞中に移す。個々のコロニ
ー上での浄化の後に、アンピシリン２０μｇ／ｍｌを含
有するＤＹＴ培地［ミラー（Miller）のエクスペリメン
ト・イン・モレキュラー・ゲネテイスク（Experiments
in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor）、１９７
２、４３３参照］中の前培養物を３７℃で１夜培養す
る。この醗酵培地（ＤＹＴ）に前培養物を接種し（イノ
キュラム１％）、選択せずにプラスミド保持物（Plasmi
derhalt）上で３７℃で２０〜３０秒間生長させる。ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ活性は、２５時間後に約
６００Ｕ／湿物質ｇもしくは４．５Ｕ／蛋白質ｍｇであ
る。
【００５５】シュードモナス・プチダの培養のために、
プラスミドｐＢＴ３０６．１６を株２４４０の適当な細
胞中に移すと、ＰＳプチダ（ＤＳＭ３１４７）が得られ
る。
プラスミドｐＢＴ３０６．１６を株２４４０の適当な細
胞中に移すと、ＰＳプチダ（ＤＳＭ３１４７）が得られ
る。
【００５６】個々のコロニーの浄化の後に、ストレプト
マイシン２００μｇ／ｍｌを含有するＤＹＴ培地中の培
養物を３０℃で１夜インキュベートする。培養培地（Ｄ
ＹＴ）に接種し（イノキュラム１％）、培養物を３０℃
で２０〜３０時間放置生長させる。２５時間後の活性は
約２２０Ｕ／湿物質ｇもしくは１．８Ｕ／蛋白質ｍｇで
ある。
マイシン２００μｇ／ｍｌを含有するＤＹＴ培地中の培
養物を３０℃で１夜インキュベートする。培養培地（Ｄ
ＹＴ）に接種し（イノキュラム１％）、培養物を３０℃
で２０〜３０時間放置生長させる。２５時間後の活性は
約２２０Ｕ／湿物質ｇもしくは１．８Ｕ／蛋白質ｍｇで
ある。
【図１】シュードモナス・プチダＤＮＡからの２．２Ｋ
ｂ−フラグメント及びプラスミドｐＢＲ３２２を出発物
質として用いたプラスミドｐＢＴ３−２の製造経過を示
す図。
ｂ−フラグメント及びプラスミドｐＢＲ３２２を出発物
質として用いたプラスミドｐＢＴ３−２の製造経過を示
す図。
【図２】プラスミドＲＳＦ１０１０及びＰＡＣＹＣ１７
７からのプラスミドｐＢＴ３０６．１６の製造経過を示
す図。
７からのプラスミドｐＢＴ３０６．１６の製造経過を示
す図。
【図３】ｐＢＴ３０６．１及びｐＢＴ２ａ−１からの本
発明によるプラスミドｐＢＴ３０６．１の形成経過を示
す図。
発明によるプラスミドｐＢＴ３０６．１の形成経過を示
す図。
【図４】出発株シュードモナス・プチダ（１）、プラス
ミドｐＢＴ２ａ−１を有するＥ・コリー野生株ＥＤ
（２）、宿主株ＥＤからの細胞エキス（４）及び比較用
の精製クレアチナーゼ（３）を付与したＳＤＳゲルを示
す図。
ミドｐＢＴ２ａ−１を有するＥ・コリー野生株ＥＤ
（２）、宿主株ＥＤからの細胞エキス（４）及び比較用
の精製クレアチナーゼ（３）を付与したＳＤＳゲルを示
す図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:40） Ｃ１２Ｒ 1:40） (72)発明者 ペーター ブケル ドイツ連邦共和国 ベルンリート アイヒ エンシユトラーセ 19 (72)発明者 クラウス ボーカンプ ドイツ連邦共和国 トウツイング フオン −キユールマン−シユトラーセ 15
Claims (3)
- 【請求項１】 所定のアミノ酸配列１〜４０３のクレア
チン分解性蛋白質をコードする塩基配列１〜１２１２： 【化１】 【化２】 【化３】 を有することを特徴とする、組換えＤＮＡ。 - 【請求項２】 プラスミドｐＢＴ２ａ−１（ＤＳＭ３１
４８Ｐ）の形の、請求項１記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項３】 プラスミドｐＢＴ３０６.１６（ＤＳＭ
３１４９Ｐ）の形の、請求項１記載の組換えＤＮＡ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3500184.4 | 1985-01-04 | ||
| DE19853500184 DE3500184A1 (de) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60292383A Division JPH062050B2 (ja) | 1985-01-04 | 1985-12-26 | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06233687A JPH06233687A (ja) | 1994-08-23 |
| JPH07102140B2 true JPH07102140B2 (ja) | 1995-11-08 |
Family
ID=6259284
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60292383A Expired - Lifetime JPH062050B2 (ja) | 1985-01-04 | 1985-12-26 | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 |
| JP5189871A Expired - Lifetime JPH07102140B2 (ja) | 1985-01-04 | 1993-07-30 | 組換えｄｎａ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60292383A Expired - Lifetime JPH062050B2 (ja) | 1985-01-04 | 1985-12-26 | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4861717A (ja) |
| EP (1) | EP0187138B1 (ja) |
| JP (2) | JPH062050B2 (ja) |
| AT (1) | ATE74964T1 (ja) |
| AU (1) | AU561319B2 (ja) |
| CA (1) | CA1309960C (ja) |
| CZ (1) | CZ279427B6 (ja) |
| DE (2) | DE3500184A1 (ja) |
| DK (1) | DK3086A (ja) |
| ES (1) | ES8704543A1 (ja) |
| GR (1) | GR853154B (ja) |
| IE (1) | IE58794B1 (ja) |
| SK (1) | SK278079B6 (ja) |
| SU (1) | SU1523055A3 (ja) |
| UA (1) | UA6152A1 (ja) |
| YU (1) | YU204985A (ja) |
| ZA (1) | ZA8630B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3500184A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
| JPS62208281A (ja) * | 1986-03-07 | 1987-09-12 | Kikkoman Corp | クレアチナ−ゼの製造法 |
| JPS62205786A (ja) * | 1986-03-07 | 1987-09-10 | Kikkoman Corp | 新規な組み換え体ｄｎａ |
| DE3803175A1 (de) * | 1987-05-12 | 1988-11-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabile creatinamidinohydrolase-mutanten |
| JPS6437292A (en) * | 1987-08-04 | 1989-02-07 | Toyo Jozo Kk | Dna having genetic information of creatinase and use thereof |
| JP2527035B2 (ja) * | 1989-06-16 | 1996-08-21 | 東洋紡績株式会社 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61162170A (ja) * | 1985-01-04 | 1986-07-22 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51118884A (en) * | 1975-04-05 | 1976-10-19 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Process for preparing creatine amidinohydrolase |
| US4039384A (en) * | 1975-04-05 | 1977-08-02 | Noda Institute For Scientific Research | Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them |
-
1985
- 1985-01-04 DE DE19853500184 patent/DE3500184A1/de not_active Withdrawn
- 1985-12-24 AU AU51631/85A patent/AU561319B2/en not_active Ceased
- 1985-12-26 JP JP60292383A patent/JPH062050B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-27 YU YU204985A patent/YU204985A/sh unknown
- 1985-12-30 GR GR853154A patent/GR853154B/el unknown
-
1986
- 1986-01-02 CA CA000498900A patent/CA1309960C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-03 AT AT86100066T patent/ATE74964T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-01-03 DE DE8686100066T patent/DE3684787D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-03 IE IE1686A patent/IE58794B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-01-03 SK SK75-86A patent/SK278079B6/sk unknown
- 1986-01-03 CZ CS8675A patent/CZ279427B6/cs unknown
- 1986-01-03 EP EP86100066A patent/EP0187138B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-03 SU SU864002500A patent/SU1523055A3/ru active
- 1986-01-03 DK DK3086A patent/DK3086A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-01-03 ZA ZA8630A patent/ZA8630B/xx unknown
- 1986-01-03 UA UA4002500A patent/UA6152A1/uk unknown
- 1986-01-03 ES ES550669A patent/ES8704543A1/es not_active Expired
- 1986-01-06 US US06/816,565 patent/US4861717A/en not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-07-30 JP JP5189871A patent/JPH07102140B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61162170A (ja) * | 1985-01-04 | 1986-07-22 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 |
Also Published As
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| SK7586A3 (en) | 1995-12-06 |
| AU561319B2 (en) | 1987-05-07 |
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| DE3500184A1 (de) | 1986-08-14 |
| UA6152A1 (uk) | 1994-12-29 |
| SU1523055A3 (ru) | 1989-11-15 |
| EP0187138A3 (en) | 1988-03-23 |
| IE58794B1 (en) | 1993-11-17 |
| GR853154B (ja) | 1986-04-24 |
| EP0187138B1 (de) | 1992-04-15 |
| CA1309960C (en) | 1992-11-10 |
| US4861717A (en) | 1989-08-29 |
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