SU1523055A3

SU1523055A3 - Способ получени штаммов бактерий ЕSснеRIснIа coLI и РSеUDомоNаS рUтIDа-продуцентов креатинамидиногидролазы

Info

Publication number: SU1523055A3
Application number: SU864002500A
Authority: SU
Inventors: Шумахер Гюнтер; Букель Петер; Бокамп Клаус
Original assignee: Берингер Маннхайм Гмбх (Фирма)
Priority date: 1985-01-04
Filing date: 1986-01-03
Publication date: 1989-11-15
Also published as: UA6152A1; JPS61162170A; CA1309960C; GR853154B; DK3086A; ES8704543A1; EP0187138A3; EP0187138A2; DE3500184A1; CZ7586A3; DK3086D0; US4861717A; YU204985A; EP0187138B1; ZA8630B; AU561319B2; ES550669A0; ATE74964T1; JPH07102140B2; AU5163185A

Abstract

Изобретение касаетс генетической инженерии, а именно получени креатинамидоногидролаза в штаммах бактерий ESCHERICHIA COLI I PSEUDOMONAS PUTIDA. Целью изобретени вл етс получение штаммов, конститутивно продуцирующих креатинамидиногидролазу. Выдел ют ДНК из PSEUDOMONAS PUTIDA, расщепл ют эндонуклеазой ECORI, фрагмент размером 5,8 кв обрабатывают эндонуклеазами ECORI и PYUII и получают фрагмент размером 2,2 кВ, который клонируют в расщепленный эндонуклеазой вектор, трансформируют в штамм E.COLI DSM 2102 и P.PUTIDA DSM 2106. 2 табл.

Description

Изобретение относитс к генетической инженерии и касаетс получени креатйнамидиногидролазы в штаммах бактерий Escherichia coli и Pseudomonas putida.

Цель изобретени - получение штам мов, конститутивно продуцирующих креатинамидиногидролазу.

Выдел ют ДНК из Pseudomonas putida , расщепл ют эндонуклеазой EcoRI с выделением фрагмента размером 5,8 кВ, обрабатывают его эндонуклеа- зами EcoRI и PvuII и получают фрагмент размером 2,2 кВ, который клонируют в расщепленный вектор, трансформируют в соответствующий E.coli и Р.putida.

Пример. Выдел ют хромосомную ДНК Pseudomonas putida DSM 2106 после

разрушени клеток, наматывани ДНК на стекл нную палочку после двух обработок фенолом и осс1ждени этанолом, раствор ют ее в концентрации 600 /Уг/мл.

10 Ц г хромосомной ДНК обрабатывают 5 единицами EcoRI и анализируют степень переваривани в агарозном геле,

ю бактерий штамма E.coli ED DSM 2102 инкубируют в присутствии 5-10 Д фагов Шарон 10 в течение 20 мин при 37°С и затем оставл ют дл роста до начала лизировани бактерий в 500 мл полной среды с последующим выделением фага,

10 гиг Шарон 10 ДНК полностью расщепл ют 1 мг EcoRI эндонуклеазы, разрезанную хромосомную ДНК Pseudoсд ю со о ел ел

О4

tnonas putida инкубируют с 3 г рас щепленного эндонуклеазой EcoRI ДНК фага Шарон 10 с 40 единицами фермента Т4 ДНК лигазы. Упаковку св занных ДНК-фрагментов головные и хвостовые протеины фага / производ т в пробирке . Около 0,5 Ц г св занных и Pseu- domonas ДНК инкубируют посредством исходной смеси ,в упаковке в пробирке через 60 мин добавл ют 0,5 мл SM буферного раствора, 1/200 объема (2,5 (цл) исходной смеси в упаковке инкубируют при помощи 200 л выдержанного в течение ночи штамм E.coli (в lO мол рном сульфате магни ) 10 мин при 37°С, Суспензию бактерий смешивают затем с 3 мл LB-агарозы :(0j8%) и вьшивают на-ЪВ пластины. На 1 ГЦ г введенной ДНК получают около 15 фаговых отверстий (тромбоцитов),

Дл идентифицировани фагов, которые содержат кодирующий креатиназу ген, примен ют иммунотест с фермен- том. Индикаторна система состоит из 6 мг/мл тетраметилбензидина, 20 мг/мл диоктилнатрийсульфосукцината и 0,01% в желатине. На 1000 тромбоцитов устанавливают два положительных сигнала.

Из п ти положительных в иммуно- , тесте с ферментом тромбоцитов полу чают препарат фагов -ДНК„Расщепление п ти различных ДНК посредством EcoRI позволило вы вить ДНК-полосу во всех п ти фагах ДНК 5,8 кВ.

Приблизительно 5 ill г этого EcoRI- фрагмента расщепл ют при использовании PvuII эндонуклеазы и вьщел ют фрагмент размером 2,2 кВ.Образующиес фрагменты ДНК раздел ют в низкоплавком геле агарозы по их размеру, и выдел ют фрагмент EcoRI - PvuIIа Выделение ДНК фрагментов из низко- плавких гелей агарозы производ т вырезанием соответствующих полос, переводом в пробирку (трубочку Эппендорфа) и смешиванием приблизи тельно с двухкратным объемом воды, затем инкубируют при до тех пор (от 5 до 10 мин)р пока не расплавитс агароза, пробу встр хивают в течение короткого времени и потом интенсивно встр хивают с половиной объема фенола (нейтрализованного 10 ммол ТРА-НС1 .с рН 7,5 и 1 мм ЕДТА . ТЕ), Фазы раздел ют центрифугированием за 10 мин при 15000 g и верхнюю водную фазу снова экстрагируют встр

5

0

5

0

5

0

5

0

5

хиванием с фенолом. После центрифугировани в течение 10 мин при 15000 g верхнюю фазу дважды экстрагируют путем встр хивани с простым эфиром (по I мл), простой эфир выпаривают при 65 С и дак осаждают при помощи 1/10 объема 3 М ацетата натри с рН 7,2 и 2,5-кратного объема этанола при 20°С. ДНК осаждают центрифугированием за 10 мин при 15000 g, сушат в вакууме и ввод т в 10 |ил ТЕ,, Все описанные дальше выделени фрагментов производ т аналогично.

Около 4 Ц| г pBR 322 ДНК расщепл ют посредством EcoRI и PvuII и выдел ют фрагмент размером 2,3 кВ. 0,2 /иг этого pBR 322-фрагмента инкубируют в течение ночи в присутствии п ти единиц Т4 ДНК лигазы и 0,5 |Ur EcoRI - PvuII-фрагмента размером 2,2 кВ из описанных- Л фагов. Полученную плаз МИДУ называют рВТ-3-2, она кодирует в E,coli биологически активную креатиназу .

Пример 2. Фрагмент ДНК, кодирующий креатиназу из плазмиды рВТ-3- 2, обрабатывают нитрозогуанидином, Выдел ют плазмидную ДНК после лизиро вани клеток при помощи метода CSCI- этилбромида. Клетки штамма E,coli ED 8654 трансформируют при помощи плазмидной ДНК и помещают на пластинах полной средЁ (LB)., содержащих 20 Й4Г/мл ампициллина. После инкубации в течение ночи при на ЬВ-пластины помещают нитроце-шцолозную фильтровальнзпо бумагу . После инкубации в течение ч при 37° С нитроцеллюлозный фильтр с ко- лони ми снимают и перевод т в стекл нт ную чашку Петри (ш20 см), в .которую был добавлен 1 мл смеси хлороформа с толуолом (1:1), Инкубацию провод т за 20 мин при 37°С, Затем нитроцеллюлоз ньй фильтр накладывают на индикаторную агарозную пластину таким образом , чтобы возникал пр мой контакт между клетками и индикаторной пластиной .

Цветна реакци происходит в зависимости от времени и количества сиитези рованной в отдельных клонах креатина зы. Из описанной системы фильтровани вьщел ют клон ЕД с .плазмидой рВТ , DSM 3143« Эта плазмида кодирует креатиназу , котора составл ет около 50% растворенного протеина клеток.

Как альтернативу к описанному пр мому ЫС-мутагенезу увеличение уровн

51523

экспрессивности креатиназы можно достигнуть с помощью lac-npoMOTopa (последний можно вьщел ть из имеющихс в продаже плазмид, например pUC- плазмид). Дл этого плазмиду рВт-3-2 обрабатьшают EcoRI-эндонук-, леазой, обрабатывают эндонуклеазой Bal 31 таким образом, что удал ют около 10-100 вр с. каждой стороны. Затем 1ас-промотор при помощи фермента Т4-лигазы, св зьшающего концы, ввод т в укороченную плазмиду ВТ 3-2. Эту ДНК мутагенизируют с нитрозогуани- дином, после этого примен ют дл трансформации штамма ED и клоны испытывают на высокую экспрессивность гена.

Упом нута индикаторна агарозна пластина представл ет тест-систему дл отбора активности, принцип которой состоит в том, что креатин расщепл ют ферментами креатинамидиногидрола- зы и Сарказиноксилазы на образовани Н,0 через пероксидазу в 1/2 0 и и осуществл ет реакцию кислорода с. системой цветного индикатора, например , из 4-аминоантипирина (4ААН) и N-этил-N-(сульфоэтил)-3-метиланилина,. соли EST. Образуетс голубовато-фиолетовое окрашивание, которое при избытке ферментов сарказиноксилазы и перокси- дазы представл ет степень синтезиро-. ванной в колони х креатинамидиногидро- лазы.

Тест-принпдп:

креатинамидино-

Креатин + гидролаза саркозин + мочевина

Загс - CD,

Саркозин + 0(2 + HgO глицин + формальдегид +

POD

4-ААР + EST

35

Состав системы фильтрующей активности креатинамидиногидролазы показан в табл.1.30

Указанные в пунктах 1.-7 реактивы раствор ют и смешивают с одинаковьм объемом низкоплавкой агарозы (2%), 6 мл выливают в чашку Петри, пластины можно хранить около 2 недель при в темноте.

Пример 3 Дл клонировани и обеспечени экспрессивности клонированной креатинамидиногидролазы в дО

Pseudomonas putida примен ют плазмиду RSF 1010. RSF 1010 линеаризируют посредством Pstll и из плазмиды рАСУС 177 после НАЕ11 - расщеплени вьщел ют

1,4 кВ-фрагмент, 0,2 |Цг RSF 1010 ДНК дд св зьшают с 1 /и г Нае 11-фрагмента при использовании Т4-лигазы, получаю

ща с плазмида представл ет собой рВТ 306,1 RSF 1010 и производные этой плазмиды отличаютс широким диапазономjg хоз ина и пригодны, например, дл Pseudomonaden и E.coli, Плазмиду рВТ 2а-1 расщепл ют посредством Pvul и

PvuII, вьщел ют 2,8 кВ-фрагмент. - рВТ 306,1 плазмиду расщепл ют посред- ее ством Pvul и Smal и выдел ют фрагмент размером 10 кВ. 0,5 (U г векторной дак св зывают с 0,5 (Ц г Pvu I-Pv,uII- фрагмент.а. E.coli ED трансформируют

краситель + 2Н20

5

0

О

д

и идентифицируют кодирующие креатиназу клоны при помощи отбора активности на пластинах. Из одного из положительных клонов получают по методу с С8С1-этш1- бромидом плазмидную ДНК. Плазмида имеет название рБТ 306,16, DSM 3149 Р.

Трансформируют-плазмидную ДНК в Pseudomonas putida 2440,

При помощи фильтровани с отбором активности на пластинах идентифицируют положительные клоны. Это возможно у Pseudomonas putida 2440, хот этот штамм содержит хромосомнокодированную креатинамидиногидролазу, так как экспрессивность кодированной плазмидной креатинамидиногидролазы про вл етс структурно. Этот отличительный признак позвол ет проводить различие между кодированной хромосомой и кодирован- ной плазмидной креатинамидиногидрола-

ЗОЙ.

Пример 4. Определение актив- ности креатинамидиногидролазы произ вод т обнаружением образованных в результате реакций с уреазой ионов аммони с тест-комбинацией мочевина

Дикий тип Pseudomonas putida 2440 дл определени активности креа- тинамидиногидролазы инкубируют при в течение ночи в В-среде (5 мл), котора содержит 1% креатина.

Клетки собирают центрифугированием и промывают один раз в 50 мМ фосфатного буферного раствора с рН 7,5. Клетки в первоначальном объеме ввод т в фосфатньй буферный раствор (50 мМ с рН 7,5) и раствор ют обработкой ультразвуком (4)сЗО с).

Выращивание и растворение клеток, которые содержат плазмиду, кодирующую креатинамидиногидролазу, провод т опИ санным способом, с тем исключением, что среда не содержит креатина дл индукции и что отбирают с добавкой ампициллина (20 jUr/мл дл плазмиды рВТ ) или стрептомицина (20 шг/мл дл плазмиды рВТ 306.16). Рост культур происходит дл Pseudomonas puti- da при 30° С5 дл Ebdol.i - при 37 С.

Данные показывают, что в результа те. клонировани креатинамидиногидро лазы в E. coli бактерии получают новое свойство синтезировать креатинамидиногидролазу и эта экспрессивность в противоположность исходному штамму Pseudomonas putida про вл етс струк турно как дл E.coli, так и дл Pseudomonas putida. Благодар мутагенезу ДНК, кодирующих креатинамидиногидро лазу, можно достигнуть особенно высокой экспрессивности

. В E coli ЕД/рВТ 2А-1 DSM 3143 активность составл ет 500 ед./г биомассы (влажной) 5. удельна активность 4,5 ед,/мг протеина Так как удельна активность высокоочищенного протеина составл ет 9 ед./мг это означает, что креатинамидиногидролаза в E.coli составл ет 50% растворимого протеина. Анализ сырого экстракта в показьшает, что креатинамидиногидрола за представл ет основную полосу фрак ции растворимого протеина.

50

Пример 5. Дд культивировани .« в ферментере примен ют три различных .системы хоз ина Eecoli, а именно E.coli W 3350, E.coli ЕД 8654 и E.ccli CHI Ппаэмиду рВТ трансформируют в соответствующие компетентные клетки. Отдельнь с колонии культуры выращивают в DYT-среде, котора содержит 20 jyr/i-in ампициллина, в течение ночи при . Ферментационную среду (DYT) засевают предварительной культурой (инокул т 1%) и без отбора на содержание плазми-- - ды оставл ют на ч при 37 С дл - роста. Активность креатинамидиногидро- лазы после 25 ч инкубировани состав

0

5

0

5

30

35

40

50

.« - -

л ет около 600 ед/г сырой массы или 4,5 ед./мг протеина.

Плазмиду рВТ 306.16 трансформируют, в клетки Pseudomonas putida штамма 2440, причем получают Р. putida DSM N3147.

Claims

После очистки отдельных колоний инкубируют культуру в DYT-среде, котора содержит 200 Кг/мл стрепто мицина при 30°С в течение ночи. Ферментационную среду (ДУТ) засевают (инокул т 1%) и оставл ют культуру дл роста на 20-30 ч при 30°С, Активность после 25 ч составл ет около 220 ед./г сырой массы, активность 1,8 едо/мг протеина Формула изобретени

Способ получени щтаммов бактерий Escherichia coli и Pseudomonas putida - продуцентов креатинамидиногидролазы , заключающийс в том, что хромосомную ДНК из Pseudomonas putida DSM 2106 и ДИК фага Шарон 10 обрабатывают эндонуклеазой Eco. RI, лигируют полученные фрагменты, упаковывают гибридные ДНК в присутствии протеинов оболочки фага, трасдуцируют полу ченными гибридными фагами клетки E.coli DSM 2102, которые предвари- тельно обрабатывают в течение ночи 0, раствором мальтозы и раствор ют в 0,1 М/л MgSO, далее идентифицируют фаги, зкспрессируюшде креатинамидиногидролазу с помощью индикаторной системы, содержащей 6 мг/мл тетра- метилбензидина, 20 мг/мл диоктилнат- рийсукцината и 0,01% , в 6%-ной желатине, выдел ют фаги, дающие положительную реакцию, ДНК этих фагой об-( рабатывают эндонуклеазой Eco.RI с последующим выделением фрагмента размером 5,8 кВ, которые обрабатывают эндонуклеазой PvuII, выдел ют Eco.RI PvuII - фрагмент размером 2,2 кВ, который лигируют с расщепленным Г EcOoRI и PvuII вектором pBR 322, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют клетки бактерий E.coli DSM 2102, отбирают клетки, конститутивно .продуцирующие креатиназу, полученные клетки обрабатывают 25 мг/мл нитрозе- гуанидином, выдел ют плазмидную ДНК,. которой т зансформируют клетки E.coli DSM 2102, отбирают бактерии, содержащие плазмиду рВТ 2а-1, полученной плазмидной ДНК трансформируют E.coli DSM 2102 и обрабатывают ее

эндонуклеазами Pvul и PvuII, вьщел - ют фрагмент, размером 2,8 кВ, которьй лигируют с фрагментом Pvul - Smal размером 10 кВ вектора рВТ 306,1, полученного в результате обработки плазмиды pSE 1010 и лигировани с

Таблица

Креатинамидиногидролаза в Pseudomonas putida и E.Coli

05510

фрагментом 1,4 кВ Haell плазмиды рАСУС177, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют клетки P.putida DSM 2440 и выдел ют клоны, конститу тивно продуилрующие креатинамидино- гидролазу.

Т б .a..