SK278079B6 - Microorganism of race escherichia coli or pseudomonas putida, method of its growing and recombinant dna - Google Patents

Description

Mikroorganizmy čeľade Escherichia coli alebo Pseudomonas putida obsahujú plazmid pBT2a-l, DSM 3418P alebo pBT 306.16, ĽÍSM 3419P. Tieto mikroorganizmy konštitutívne produkujú kreatínamidínhydrolázu, ktorá má priemyselné použitie pri stanovení kreatinínu a ďalej ju možno využiť pri diagnóze obličkových chorôb. Rekombinantná DNA je výhodne vo forme vyššie uvedených plazmidov, ktoré sú uložené vo vyššie uvedených mikroorganizmoch.

Oblasť techniky

Vynález sa týka transformácie mikroorganizmu čeľade Escherichia coli alebo Pseudomonas putida a rekombinovanej DNA.

Doterajší stav techniky

Enzým kreatínamidínhydroláza EC 3,5,3.3 má priemyselné využitie pri stanovení kreatinínu. Tento enzým je okrem iného možné využiť pri diagnóze ochorenia obliéiek, pri ktorom sa v moči nachádza množstvo kreatinínu, ktoré sa podstane líši od množstiev, ktoré je možné dokázať v moči zdravých jedincov. Sú tiež známe mikroorganizmy, napríklad z čeľade Pseudomonas, u ktorých možno indukciou použitím kreatínu vyvolať tvorbu kreatínamidinhydrolázy v množstve, ktoré možno ďalej spracovávať, dosiahnuteľné výťažky a náklad na izoláciu takto získaného enzýmu však stále ešte predstavuje limitujúci faktor na priemyselné využitie uvedeného enzýmu.

Bolo by teda potrebné nájsť mikroorganizmy, pri pestovaní ktorých by nedochádzalo k vyššie uvedeným nevýhodám a ktoré by produkovali požadovaný enzým kreatínamidínhydrolázu konštitutívne, to jest bez až doteraz nutnej indukcie, čím by tiež bolo možné dosiahnuť podstatne vyššie výsledky ako v prípade použitia až doteraz známych mikroorganizmov, ktoré sú 5 schopné uvedený enzým vytvárať. Vynález si kladie za cieľ vypestovať pri použití genetického inžinierstva taký mikroorganizmus, u ktorého by genetická informácia viedla ku zvýšenej tvorbe vyššie uvedeného enzýmu v mikroorganizme, ktorý je možné ľahko pestovať, 10 a z ktorého je tiež možné produkovaný enzým izolovať za prijateľných nákladov.

Podliata vynálezu

Podstatu vynálezu tvorí mikroorganizmus čeľade Escherichia coli alebo Pseudomonas putida, ktoré obsahujú plazmid pBT 2a-l, DSM 3148P alebo pBT 306.16, DSM 3419P a konštitutívne produkuje kreatí20 namidínhydrolázu.

Podstatu vynálezu tvorí tiež rekombinovaná DNA, ktorá obsahuje nasledujúci kódový reťazec báz pre bielkovinu, štiepiaci kreatín s reťazcom aminokyselín 1 až 403

r 1	XatGlar.íWiotyiľt.iUuArjlWkj.UnClUiplyiVt'JUTSM'fbrPhtSir « t r t i *	2« (G
21 íl	HiClnCltTyrlliAtJlr^liúliArgUiArcMaliiLecUilliGlthnllt GCKMcunraxwocci^^ <»«<«·	(G no
<1 121	AipA!L<U!leFl«Ib:S«rTrrSi«An:Ile»ri?yrfyrS».’lJ[ŕj«U«Tyrt)'» cAcacGCWcTK*cmcTtóCÄtmKMraiCT*nax*rriCTCT»cTc< t t t « 1	»t> 1B0
(1 111	S.rnrtl))itrfr«rrt*l«l«V»lV»inr««*«|*>pV.lllrf.ineS»rAli rccmsxxeare»ccOTCc5WKa«c^^ , . i · · ·	10 2(0
11 2(1	k: nl leJUnCl»GljCliir:rtrjkrjkr0rVklClyhn»pkraIlrt»lTyrthr MCXTCMCÄGGÍCMCCtTGliCGCNCJCCCltGGÓCCOlCMCHCCKtlUK	109 )»
101 »1	lipTtpClhíU^sptiiíTyrMieMiMilWMliálklw^Äy’*!1^^ acTccaccaaTkAaiiCTKGCcttatcckKM^ ,·»·«·	no 3Í0
12’ »1	iKirÍirflelirAitó’iiUuAJslOTClRUa.triúpLyiLtrkliAlk.VoTjr 4 » t · * ·	KO 420
Hl <21	lro>.i<*liCluU»»íl*soVilMíUiU»CyOletAiíHJlLh!K«tIieyíSsr ccccMC«XA(mii;CAČ5Tacccraa'K<AW«ur«KATG.\rc.iuK:c ,.····	líO m
iei tri	)liGljChliisVílk«tll»k:j1li:CMlLV9ll«*li*s?!leGlyClyÄlíAli «♦·***	U) HO
!»’. Hl	VúVilCk*liI«ClyMpGUValficGl»frrGlyV«Ul»lMJhkliTl>rGln GKfntoMocKittGCGiiCQGCTMCoBHicoMtrwtícittBoottCCCic	2G0 (00

I ·

201 U<l!«tP4Uz}>1411eM»Jli|flkrN>«íl»J»pVilCl»l«i>!l»U>pJirTrpftr220 >o> «cMarcraxcc»nG«anari^^«0 >>!<<

22i TcfŕhécinSerGlylUKinThrAtpClyAliKisÄiníroViirJiiThr.IrgLyiVsl2Í0 iil ttfJItQnCttKtKUCMCGÄCGCCWGCJCMCCCWTOiCÍMCOlCAMCW120 t « . · · t *

2i) Mal^GlyftipHtlitíHUiliiiCytta’rt&ttliUiGlytyr'Tyrnrili HO »i .vôKGtccAUiaiuecnaKKcncKuremno *»♦·*♦

2fl tw<h.<:9HuI««?SeL»uX<p9ítCy>StrlUpA>p3íiU»lr5L»aT:pG!nV<l200 >51 iKw«oacwncno«ciinr^ho * * t « ·I

201 iinVilOliVilliitlUlitlyltulyiLwIlílpíŕnOlyOUtrpCpSirtip !C0

341>00 «»««··

301 IhXItAr^GloLitAitóUIliPhiLwLyslišMpVtlUoC-lrTyrArgThrPh320

301 ATttCCCíCGtóCKMCGAGArCTKCTCMCCACCACCTCCJGCAGTMCGCACCTKW t i t i t«

321 ClyTyiClySitítrFtrflvThrLeeStrtijTyrŤyrClyAr^ClttÄliCiyUuClu310

961 Gccuacccj^mftáAcattAGao^^hm « > » » ·í

Nl

1011 , I » I · ’

150

10»

3Í1

1901 tlfXttLeaPToCluGÍyLroyrcClyAltOlyClyTyrAJÍClaÍi»*^»!»¹^¹¹]¹* W »icM«iwa)cuGÔcciKwoccaaGMcräK«c«cacwo.TCC5aK mo

3E1 VilUnJluHjíGlrthOliiliilli'nrLyifttfroTyrtlylroCluLyiAi»!!· JOJ

1141 mu<sMiMcawcaxaM3iw»cc*Mnicc«TMCGaxiiauwwMO 120· , I > · · i0i 1’ιΑ:ςΜ> '

1101 ATCCOCÄAATCA . t » <20

12Í9 alebo jeho ekvivalent, ktorý je podľa genetického kódu kódovým reťazcom pre rovnaký reťazec aminokyselín.

Táto rekombinovaná DNA je výhodne vo forme plazmidu pBT 2a-l, DSM 3418P alebo pBT 306.16, DSM3419P.

Mikroorganizmus s obsahom vyššie uvedeného plazmidu je schopný produkovať kreatínamidínhydrolázu v množstve, ktoré sa rovná 50 % celkového množstva bielkovín, ktoré je vyššie uvedeným mikroorganizmom vytvárané.

Vyššie uvedené mikroorganizmy a tiež zodpovedajúce plazmidy možno získať podľa zásad genetického inžinierstva. Pri získavaní mikroorganizmov, ktoré konštitutívne vytvárajú kreatínamidínhydrolázu, je teda možné postupovať napríklad tak, že sa DNA z Pseudomonas putida

a) čiastočne štiepi enzýmom EcoRI za vzniku fragmentu s 5,8 kilobázami, alebo sa

b) štiepi enzýmami EcoRI s PvuII za vzniku fragmentu s 22 kilobázami, fragment, získaný spôsobom a) alebo b) sa potom klonuje za použitia vektora, rozštiepeného rovnakou reštrikčnou endonukleázou, získaným materiálom sa transformuje vhodný kmeň Escherichia coli alebo Pseudomonas putida a izolujú sa kmene, ktoré konštitutívne vytvárajú kreatínamidínhydrolázu. Pod pojmom kilobáza” sa rozumie v tejto prihláške tisíc párov nukleotidových báz.

Informácia pre expresiu kreatínamidínhydrolázy sa nachádza na fragmente s dĺžkou 5,8 kilobáz a na podfragmente s dĺžkou 2,2 kilobáz, ktoré možno získať štiepením pôsobením enzýmu EcoRI alebo spoločným pôsobením enzýmov EcoRI a PvuII. Vyššie uvedené fragmen ty sa podrobia klonovaniu známym spôsobom za použitia vektora, ktorý je rozštiepený tou istou reštrikčnou endonukleázou tak, aby boli získané zakončenia, ktoré možno vzájomne opäť naviazať. Možno tiež postupovať 5 tak, že sa rozštiepia vektory, vhodné na použitie pre čeľade Escherichia coli alebo Pseudomonas putida inými reštrikčnými endonukleázami tak, že pri vhodnom usporiadaní miest na štiepenie je zachovaná schopnosť replikácie pre vektor, doplnený niektorým z 10 vyššie uvedených fragmentov a uložený do uvedeného miesta po štiepení inými endonukleázami i schopnosť transformácie vyššie uvedených čeľadí mikroorganizmov týmito vektormi. Ako vektor sa výhodne použije plazmid pBR 322, transformovaný včlenením niektoré15 ho z dvoch vyššie uvedených fragmentov a zavedený do vhodného kmeňa Escherichia coli. Každý odborník môže uviesť celý rad kmeňov E. coli, ktoré sú vhodné na transformáciu plazmidom pBR 322 a jeho derivátmi. Ďalším výhodným vektorom na toto použitie je fág 20 Charon 10. Plazmid pBR 322 a jeho deriváty sa rovnako ako ďalšie vhodné vektory dnes už bežne dodávajú.

Menej výhodný je spôsob, pri ktorom sa plazmid pBR 322 rozštiepi pôsobením enzýmu EcoRI a PvuII, takto vzniknutý fragment s 2,3 kilobázami sa izoluje a 25 spojí sa s fragmentom s 22 kilobázami z P. putida po štiepení enzýmami EcoRI a PvuII za vzniku nového plazmidu, označovaného pBT 3-2, ktorý sa potom použije na transformáciu vhodného kmeňa E. coli. Týmto spôsobom sa získa kmeň E. coli K12 ED 8654 30 DSM 3144.

Kmene E. coli, získané vyššie uvedeným spôsobom transformáciou derivátom plazmidu, odvodeného od plazmidu pBR 322 možno veľmi ľahko podrobiť selekcii na základe ich rezistencie proti ampicilínu. Vzhľadom na to, že získané kmene sú odolné proti ampicilínu a súčasne vytvárajú enzým kreatínamidinhydrolázu, nemôžu netransformované bunky rásť a medzi rastúcimi bunkami sa spôsobom, ktorý bude ďalej podrobne opísaný, ľahko nájdu tie bunky, ktoré produkujú požadovaný enzým.

Zvlášť dobré výsledky možno spôsobom podľa vynálezu získať tak, že sa na bunky, vybraté z vhodného kmeňa E. coli s obsahom plazmidu pBT 3-2 pôsobív období amplifikácie plazmidu nitrozoguanidinom, potom sa plazmid izoluje, znovu sa transformujú bunky E. coli, cyklus sa prípadne opakuje a z takto získaných klonov s vyjadrenou tvorbou kreatínamidinhydrolázy sa izoluje plazmid BT 2a-1, DSM 3148P, ktorého spôsob výroby je tiež predmetom vynálezu. Ako už bolo uvedené vyššie, produkujú bunky Escherichia coli, transformované vyššie uvedeným plazmidom kreatínamidinhydrolázu v množstve, ktoré zodpovedá 50 % celkového množstva bielkovín, produkovaného týmito bunkami.

Vzniknuté klony mikroorganizmov je možné identifikovať ako kmene, produkujúce vysoké množstvo kreatínamidínhydrolázy tak, že sa tieto klony privedú do styku s agarózovými platňami, ktoré obsahujú kreatín, sarkozinoxinázu, peroxidázu a farebný indikátor na dôkaz peroxidu vodíka. Jednotlivé klony je v tomto systéme možné identifikovať podľa silného sfarbenia, ktoré zodpovedá vysokej tvorbe enzýmu. Ako indikátorový systém pre peroxid vodíka sa výhodne použije 4-aminoantipyrin v kombinácii s N-etyl-N-(sulfoetyl)-3-metylalanínovou soľou, výhodne vo forme draselnej soli.

Pri použití spôsobu podľa vynálezu je tiež možné skonštruovať plazmidy, ktoré sú vhodné nielen na expresiu v mikroorganizmoch E. coli, ale tiež v mikroorganizmoch P. putida. Výhodne sa postupuje tak, že sa z plazmidu pBT 2a-1 získa štiepením reštrikčnou endonukleázou Pvu I a Pvu Π fragment s 2,8 kilobázami a tento fragment sa naviaže na ďalší fragment s 10 kilobázami, získaný z plazmidu pBT 306.1 štiepením enzýmami Pvu I a Sma I. Týmto spôsobom sa získa plazmid pBT 306.16, DSM 3149P, ktorý vyvoláva konštitutívnu tvorbu kreatínamidinhydrolázy ako u mikroorganizmov E. coli, tak u mikroorganizmov P. putida.

Je prekvapujúce, že spôsobom podľa vynálezu je možné dosiahnuť podstatné zvýšenie tvorby enzýmu. Už niekoľkokrát bolo síce oznámené, že zvýšením počtu kópii určitého génu možno dosiahnuť zvýšenú expresiu tohto génu. Z toho však nebolo možné predpokladať, že i pri prenesení génu z čeľade Pseudomonas do čeľade E. coli bude pravdepodobne možné dosiahnuť vyššiu expresiu génu. V skutočnosti boli podávané správy o tom, že pri prenesení nových génových kombinácii z čeľade Pseudomonas do čeľade E. coli došlo k zníženiu expresie génu, ako bolo uvedené napríklad v publikáciách B. Stanisisch a J. Oritz, J. Gen. Microbiol. 1976, 94, str. 281-289, Nakazawa a ďalší, J. Bacteriol. 1978, 134, str. 270-277, Ribbons a ďalši, Soc. Gen. Microbiol. Quart. 1978, 6, str. 24-25 a Franklin a ďalší, Microbiological Degradation of Xenobiotics and Recalicitrant Compounds, Leisinger Cook, Htltter und Nuesch Hrsgb., 1981, 109-130. Skutočnosť, že nebolo možné očakávať zlepšenie uvedeného typu je možné doložiť prehľadom najrôznejších niekoľkostupňových syntéz, na konci ktorých sa získa enzymaticky účinná bielkovina.

Informácia na vznik bielkoviny je uložená v dezoxyribonukleovej kyseline (DNA). Táto DNA sa prevádza pôsobením RNA-polymerázy na mRNA. Takto syntetizovaná mRNA sa v ribozómoch prevádza na bielkovinu, pričom vždy tri nukleotidy (triplet alebo kodón) sú podľa usporiadania genetického kódu kľúčom na tvorbu jednej určitej aminokyseliny.

Riadiace oblasti na úrovni DNA určujú, na ktorom mieste sa začne reťazec DNA prevádzať na mRNA(sled promótora) a tiež na ktorom mieste sa syntéza mRNA zastaví (terminačný sled).

Sledy pre začiatok a pre ukončenie sa nachádzajú tiež na úrovni syntézy bielkovín (translácia). Všeobecne možno uviesť, že kodón ATC (ktorý sa prevádza na f-metionin) znamená začiatok bielkoviny a napríklad kodóny TAA alebo TAC znamenajú terminačný kodón pre ukončenie translácie.

Miera expresie polypeptidového sledu závisí od celého radu faktorov, okrem iného aj od kvality sledu promótora, stálosti mRNA, sekundárnej a terciámej štruktúry mRNA, kvality miesta vizby na ribozóm, odstup miesta väzby na ribozóm od kodónu pre začiatok translácie (ATG), od sledu nukleotidov medzi miestom väzby na ribozóm a medzi kodónom pre začiatok translácie (ATG) a medzi signálom pre ukončenie translácie na úrovni transkripcie aj translácie. Bez presnej znalosti primárnej štruktúry génu a štruktúry bielkoviny, pre ktorú je gén kódom, nie je možné cielene zasiahnuť do vyššie opísaných riadiacich procesov expresie génu. Pretože tieto presné vedomosti neboli v danom prípade k dispozícii, nebolo možné predpokladať ani vyšší výťažok syntézy pri použití vyššie uvedených mikroorganizmov a plazmidov, získaných spôsobom podľa vynálezu.

Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa ako kmeň Escherichia coli použije výhodne E. coli K12, a to najmä:

E. coli K12, W 3 350 (thi, galK, galT, rpsl, [P. Tiollais], DSM 3141),

E. coli K12, ED 8 654 (trp R, hsd M\ hsd R', sup E, sup F, [K. Murray], DSM 2 102),

E. coli K12, CSH 1 (thi, trp, lac z, rpsl [zbierka mikroorganizmov Cold Spring Harbor], DSM 3 142).

Z kmeňov Pseudomonas putida je možné použiť izoláty divých kmeňov aj kmene laboratórne. Zvlášť dobré výsledky je možné dosiahnuť pri použití Pseudomonas putida 2440, DSM 2106 (Gene 1981, 237-247).

Ako vektorové systémy pre expresiu v E. coli sa pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu výhodne používajú genetickou manipuláciou získané deriváty bežne dodávaného plazmidu pBR 322 (Gene 1977, 95-113). Pre expresiu v kmeňoch Pseudomonas sa výhodne používajú geneticky pozmenené deriváty plazmidu pRSF 1010 (Gene 1981, 237-247). Pri použití vyššie uvedených reštrikčných endonukleáz na konštrukciu geneticky pozmenených plazmidov podľa vynálezu sa získajú úseky génu, ktoré sú kódom pre kreatínamidinhydrolázu a obsahujú ešte systémy pre expresiu vektora, riadiaci systém pre začiatok translácie v cieľovej bunke a gén, podľa ktorého je možné výsledné mikroorganizmy ľahko podrobiť selekcii, napríklad gén pre odolnosť proti antibiotikám.

Vynález bude ďalej opísaný v súvislosti s priloženými výkresmi.

SK 278079 Β6

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je schematicky znázornená konštrukcia plazmidu pBT 3-2 pri použití fragmentu s veľkosťou 22 kilobáz z DNA Pseudomonas putida a plazmidu pBR 322 ako východiskových materiálov pre túto konštrukciu.

Na obr. 2 je znázornená konštrukcia plazmidu pBT 306.1 z plazmidu RSF 1 010 a pACYC 177 spôsobom podľa vynálezu.

Na obr. 3 je znázornená konštrukcia plazmidu pBT 306.16 z plazmidu pBT306.1 a pBT 2a-1 spôsobom podľa vynálezu.

Na obr. 4 je znázornený výsledok nanesenia bunkového extraktu na SDS gél, a to:

Stĺpec 1 : východiskový kmeň Pseudomonas putida.

Stĺpec 2: cieľový využiteľný kmeň E. coli ED, ktorý nesie plazmid pBT 2a-1.

Stĺpec 3 . pre porovnanie 15 mikrogramov čistenej kreatinázy.

Stĺpec 4: využiteľný kmeň E. coli ED.

Na obr. 5 je znázornený sled DNA, ktorý je kódom pre enzým kreatinamidinhydrolázu a bielkovinový sled, ktorý je výsledkom použitia vyššie uvedeného sledu DNA.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Aby bolo možné nájsť pozitívne klony, to znamená klony, ktoré konštitutívne produkujú kreatinamidinhydrolázu, je možné pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu použiť zvláštny triediaci systém, ktorého princípom je imunologický test na enzým. Pri uskutočňovaní tohto postupu sa fixujú na vhodný nosič, napríklad na polyvinylovú fóliu, špecifické protilátky proti kreatínamidínhydroláze, fólia sa priloží na rozrušené kolónie alebo tiež na plaky. Po premytí vodou sa fólia inkubuje s tou istou špecifickou protilátkou vo forme enzymatického konjugátu napríklad s peroxidázou. V prípade, že je prítomný kloň produkujúci enzým, vzniká navrstvenie antigénu-protilátky a enzymaticky značenej protilátky.

Konjugát protilátky a peroxidázy poskytuje vo vhodnom systéme s obsahom farebného indikátora sfarbenie, napríklad pri použití indikátorového systému s obsahom tetrametylbenzidmu, dioktylsulfojantaranu sodného a peroxidu vodíka v želatíne zeleno sfarbené škvrny. Rozsah stanoviteľného množstva pri použití tohto systému je 10 až 100 pg antigénu bielkovinovej povahy. Systém tohto typu možno vytvoriť na základe poznatkov, ktoré sú uvedené v publikácii Testkombination Genexpression Boehringer Mannheim GmbH.

Vynález bude osvetlený nasledujúcimi príkladmi.

Príklad 1

A) Izolácia DNA z chromozómov Pseudomonas putida.

DNA z chromozómov kmeňa Pseudomonas putida DSM 2106 sa po rozrušení buniek izoluje a po dvojnásobnej fenolizácii a po vyzrážaní etanolom sa rozpustí na koncentráciu 600 pgánl (Cosloy a Oisni, Molec. Gen. Genet., 1973,124,1-10).

pg chromozomálnej DNA sa čiastočne štiepi pôsobením piatich jednotiek reštrikčnej endonukleázy EcoRI, E.C. 3.1.23.11 počas 30 minút a miera štiepenia sa sleduje na agarózovom géli.

B) Izolácia a čistenie DNA z fágu lambda Charon 10.

10'° baktérií kmeňa E. coli ED DSM 2 102 sa inkubuje s 5x10⁸ fágu lambda Charon 10 počas 20 minút pri teplote 37’C a potom sa zmes nechá rásť až do začiatku lýzy buniek pri použití 500 ml živného prostredia s dostatočným množstvom živín. Izolácia fágu a DNA sa potom uskutočňuje piesne podľa návodu, ktorý je uvedený v publikácii Maniatisa a ďalších Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982,76-85.

pg DNA fágu Charon 10 sa úplne rozštiepi pôsobením reštrikčnej endonukleázy EcoRI. Potom sa spoločne inkubuje 1 pg čiastočne rozštiepenej DNA z chromozómov Pseudomonas putida (odstavec A), 3 pg DNA fágu Charon 10, rozštiepené enzýmom EcoRI a 40 jednotiek enzýmu T4 DNA ligázy. Uloženie naviazaných fragmentov DNA do prednej a zadnej časti bieikoviny fágu lambda možno uskutočniť in vitro. Výroba bielkovín, potrebných na tento účel a uloženie DNA je podrobne opísané v publikácii Maniatisa a ďalších, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 256-291 (in vitro systémy pre DNA fágu lambda sa obchodne dodávajú - napríklad Boehringer Manheim, DNA-Packing Kit). Približne 0,5 pg získaného produktu a DNA z Pseudomonas putida sa inkubuje s 20 pl systému, získaného in vitro, po 60 minútach sa pridá 0,5 ml pufru SE (Maniatis a ďalší, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 443) a 1/200 objemu (2,5 pl) systému, získaného in vitro s 200 pl cez noc pestovanej kultúry kmeňa ED (v 10 ²M síranu horečnatého) počas 10 minút pri teplote 37’C. Suspenzia baktérii sa potom zmieša s 3 ml LB (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972, 433), 0,6 % agarózy a zmes sa vleje na platne LB. Na 1 pg použitej DNA sa ziska približne 10’plakov.

Na identifikáciu fágov, ktoré obsahujú gén pre kreatinázu sa použije vyššie uvedený imunologický test na prítomnosť enzýmu. Indikátorový systém sa skladá z 6 mg/ml tetrametylbenzidinu, 20 mgánl dioktylsulfojantaranu sodného a 0,01 % peroxidu vodíka v 6 % želatíne. Na 1000 plakov bolo možné preukázať dva pozitívne signály.

C) Reklonovanie génu pre kreatinázu pri použití E. coli.

Z piatich plakov, ktoré boli dokázané ako pozitívne pri vyššie uvedenom imunologickom teste bola izolovaná DNA tohto fágu. P&ť vzoriek takto získanej DNA bolo rozštiepených pôsobením reštrikčného enzýmu E-coRI a okrem rôznych pásov bolo možné vo všetkých piatich vzorkách DNA dokázať spoločný pás pre DNA s veľkosťou 5,8 kilobáz. Tento fragment bol charakterizovaný pomocou štiepenia niekoľkými rôznymi reštrikčnými endonukleázami, ako je znázornené na obr.

1.

Z približne 5 pg tohto fragmentu, získaného štiepením enzýmom EcoRI sa odštiepi pôsobením enzýmu Pvu Π fragment s veľkosťou 22 kilobáz. Vzniknuté fragmenty DNA sa delia na agarózovom géli s nízkou teplotou topenia a izoluje sa fragment s 2 2 kilobázami - Eco RI-Pvu Π. Pri izolácii uvedeného fragmentu DNA z agarózového gélu sa postupuje tak, že sa zodpovedajúce pásy vyrežú, prenesú do reakčnej sklenenej nádoby (Eppen-dorfovej skúmavky) a zmiešajú s približne dvojnásobným množstvom vody. Potom sa zmes inkubuje tak dlho pri teplote 65^aC, tá. dôjde k rozpusteniu agarózy (5 až 10 minút), vzorka sa krátko pretre pe a potom sa energicky pretrepe s polovičným objemom fenolu (neutrali-zovaného 10 mM Tris-HCl s pH 7,5 a lmM EDTA, TE). Jednotlivé fázy sa od seba oddelia odstredením počas 10 minút pri 15 000 g a horná vodná fáza sa znovu pretrepe s fenolom. Po opakovanom odstredení 10 minút pri 15 000 g sa horná fáza dvakrát pretrepe vždy s 1 ml éteru, éter sa odparí pri teplote 65°C a DNA sa vyzráža 1/10 objemu 3 M octanu soidného s pH 7 J a 2,5 násobným objemom etanolu pri teplote -20°C. Potom sa DNA odstredí počas 10 minút pri 15 000 g, suší sa vo vákuu a potom sa zmieša 10 pl TE. Všetky ďalšie izolácie jednotlivých fragmentov boli vždy uskutočňované podľa tohto postupu.

Približne 4pg DNA z plazmidu pBR 322 sa rozštiepi pôsobením enzýmov EcoRI a Pvu Π a izoluje sa fragment s veľkosťou 2,3 kilobáz. 0,2 pg tohto fragmentu DNA z pBR 322 sa inkubuje cez noc s piatimi jednotkami T4 DNA ligázy a s 0,5 pg fragmentu z vyššie uvedeného fágu lambda s 12 kilobázami, získaného štiepením pomocou reštrikčných enzýmov EcoRI a Pvu Π. Výsledný plazmid je označovaný ako plazmid pBT 3-2 a je v mikroorganizmoch E. coli kódom pre biologicky účinnú kreatinázu.

Príklad 2

DNA z plazmidu pBT 3-2, ktorá je kódom pre kreatinázu sa v priebehu amplifikačnej fázy ďalej spracováva pôsobením nitrózoguanidínu presne podľa návodu uvedeného v publikácii Talmagde a Gilbert, Gate, 1980, 12, 235 až 241. Potom sa DNA plazmidu po rozrušení buniek izoluje metódou s použitím CsCl-etídiumbromidu (Maniatis a ďalší, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982,250-251) a nanesie sa na prostredie s plným množstvom živín (LB) s obsahom 20 pg/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri teplote 37°C sa kolónie prenášajú na platne s obsahom prostredia LB, na ktoré boli vopred uložené kotúče nitrocelulózového filtračného papiera (Schleicher, Schtlll BA 85). Platne sa inkubujú pri teplote 37°C počas 12 až 18 hodín, potom sa nitrocelulózový filter s kolóniami prenesie do sklenenej Petriho misky s priemerom 20 cm s obsahom 1 ml zmesi toluénu a chloroformu s obsahom 1:1. Inkubácia trvá 20 minút pri teplote 37’C. Nitrocelulózový filter sa potom uloží na agarózovú platňu s obsahom indikátora tak, aby došlo k priamemu styku medzi bunkami a indikátorovou platňou. Farebná reakcia sa objaví v závislosti od času a od množstva kreatinázy, syntetizovanej v jednotlivých klonoch. Podľa vyššie uvedenej schémy bol izolovaný kloň ED, ktorý obsahoval plazmid pBT 2a-1, DSM 3143. Tento plazmid je kódom pre kreatinázu, ktorá tvorí približne 50 % celkového množstva bielkoviny, produkovaného bunkou. Tento spôsob je schematicky znázornený na priloženom obr. 1.

Alternatívnym spôsobom k vyššie opísanej NG-mutagenézii je použitie cudzorodého promótora, napríklad promótora pre laktózu, a tým dosiahnuť vyššiu úroveň expresie kreatinázy. Promótor možno získať z komerčne dodávaných plazmidov, napríklad ako fragment DNA z plazmidu pUC. Pri uskutočňovaní tohto spôsobu sa rozštiepi plazmid pBT 3-2 v mieste štiepenia enzýmom EcoRI a potom sa podrobí pôsobeniu exonukleázy Bal 31, aby bolo z každej strany odštiepené približne 10 až 100 párov báz. Potom sa do skráteného plazmidu pBT 3-2 včlení promótor pre laktózu pôsobením enzýmu Trligázy. Táto DNA sa potom vyššie uvedeným spôsobom podrobí mutagenéze pôsobením nitrózoguanidínu a potom sa použije na transformáciu kmeňa ED a jednot livé takto získané klony sa vyššie uvedeným spôsobom skúšajú na vysokú expresiu génu.

Vyššie uvedená agarózová platňa s indikátorovým systémom predstavuje skúšobný systém, ktorého princíp spočíva v tom, že sa peroxid vodíka, vzniknutý z kreatínu pôsobením kreatínamidínhydrolázy a sarkozínoxidázy štiepi peroxidázou na 112 Oi a vodu a kyslík reaguje s farebným indikátorovým systémom, napríklad obsahujúcim 4-amínoantipyrín (4-AAP)a N-etyl-N-(sulfoetyl)-3-metylanilín vo forme draselnej soli (EST). Vznikne modrofialové sfarbenie, ktoré je za prítomnosti prebytku enzýmu sarkozinoxidázy a peroxidázy mierou množstva kreatínamidínhydrolázy, syntetizovanej v kolóniách.

Princíp uvedeného stanovenia možno schematicky znázorniť nasledujúcim spôsobom:

kreat í n«ai d í nhydra 14m

Kreatin ♦ HjO ---------------------—aarkoxtn · aočovli are - OD carkozin ♦ Oj ♦ HjO ---------- flycin 4 formaldehyd * * peronid vodíka

POD

HjOj ♦ 4-AAP + EST —---------► farbivo 4 2HjO

Zloženie systému na zaistenie účinnosti kreatínamidinhydrolázy

Zložka Konoontxici*

1. krttMtía	10 mM
2. NaNj	0.5 kN
S. Trt»- HC1 (pH 7,í)	20 tM
4. aarkoaínoiidáza	5 Jednotiok/«1
3. peruxidáaa	2,5 jednôtíek/ml
6 4-AAP	0.23 ag/al
7. EST	1.3 ag/al

Všetky reakčné zložky sa rozpustia a zmiešajú sa s rovnakým objemom agarózy s nízkou teplotou topenia (2 %). 6 ml takto získaného materiálu sa vleje do Petriho misky, platne je možné skladovať v tme približne dva týždne pri teplote 4*C.

Príklad 3

Pri klonovaní a expresii klenového sledu pre kreatinamidinhydrolázu v mikroorganizme Pseudomonas putida sa používa plazmid RSF 1 010 (Bagdasarian a ďalší, Gene 1981,16,237-247). Plazmid RSF 1 010 sa linearizuje pomocou reštrikčného enzýmu Pvu Π a potom sa izoluje z plazmidu pACYC 177 (Chang a Cohen, J. Bacteriol 1978, 134, 1141-1156) po štiepení enzýmom Hae H fragment s 1,4 kilobázami. 02 PS DNA plazmidu RSF 1 010 sa spojí s 1 pg fragmentu po štiepení enzýmom Hae H za použitia T4 ligázy, ako výsledný plazmid sa získa plazmid pBT 306.1, znázornený na obr. 2. Plazmid RSF 1 010 a deriváty tohto plazmidu majú široké použitie (Gene 16, 1981, 237247) a sú napríklad použiteľné na amplifikáciu tak aj v mikroorganizmoch E. coli, ako v čeľadi Pseudomonas. Plazmid pBT 2a-1 sa rozštiepi enzýmami Pvu I a Pvu Π a izoluje sa fragment s veľkosťou 2,8 kilobáz, plazmid pBT 306.1 sa tiež rozštiepi a izoluje sa fragment s veľkosťou 10 kilobáz. 0,5 pg DNA vektora sa naviaže na 0,5 pg fragmentu po štiepení enzýmami

Pvu I a Pvu H. Získaným materiálom Sa transformuje E. coli ED a klony, produkujúce kreatinázu sa vyhľadajú použitím vyššie uvedených platní s obsahom indikátora. Z jedného z pozitívnych klonov sa pripraví vyššie uvedeným spôsobom s použitím CsCl-etidiumbromidu DNA plazmid. Tento plazmid sa označuje pBT 306.16, DSM 3 149P, ako je znázornené na obr. 3.

Transformácia DNA z plazmidu v Pseudomonas putida 2 440 sa uskutočňuje presne podľa metódy, uvedenej v publikácii Franklin a ďalší, Microbiol. Degradation of Xenobiotics and Recalicitrant Compounds, Leisinger, Cook, Htltter and Neutsch, Hrgsb., 1981, 109-130. Pri použití platní s obsahom indikátora sa identifikujú pozitívne klony. Tento postup je v prípade Pseudomonas putida 2 440 možný napriek tomu, že tento kmeň obsahuje v chromozómoch kód pre kreatínamidínhydrolázu, pretože k expresii génu pre kreatínamidínhydrolázu dochádza konštitutívne. V tomto prípade je teda možné rozlišovať medzi chromozomálnym a plazmidovým kódom pre kreatínamidínhydrolázu.

Príklad 4

Stanovenie kreatínamidínhydrolázy sa uskutočňuje sledovaním reakcie amóniových iónov vzniknutých reakciou s ureázou s použitím bežne dodávaného reakčného činidla Hamstoff (Boehringer Mannheim, Best. Nr. 124 770).

Divý kmeň Pseudomonas putida 2 440 sa inkubuje pri stanovení účinnosti kreatínamidínhydrolázy v 5 ml prostredia LB s obsahom 1 % kreatínu cez noc pri teplote 30“C. Bunky sa oddelia odstredením a raz sa premyjú 50 ml fosfátového pufra s pH 7,5. Potom sa bunky znova zmiešajú s pôvodným objemom fosfátového pufra s koncentráciou 50 mM pri pH 7,5 a rozrušia sa pôsobením ultrazvuku počas 4 x 30 sekúnd. Pestovanie a rozrušenie buniek vyššie uvedeným spôsobom sa v prípade buniek, ktoré obsahujú plazmid, ktorý je kódom pre kreatínamidínhydrolázu, uskutočňuje rovnako s tým rozdielom, že prostredie neobsahuje žiadny kreatín na indukciu a že sa selekcia na prítomnosť plazmidu uskutočňuje pridaním ampicilínu (20 pg/ml pre plazmid pBT 3-2, pBT 2a-1) alebo streptomycínu (200 pg pre plazmid pBT 306.16). Kultúry sa pestujú v prípade Pseudomonas putida pri teplote 30°C, v prípade E. coli pri teplote 37’C.

Kreatínamidínhydroláza v Pseudomonas putida a v E. coli

Kneú/plazaid Účinnosť Pcntuvmnic jodnotky/1

O	F.aniidrwmnas	púti dn	2440	1	* kreatín
2>	F&eudotkonas	putida	2440	250	* kreatín
3)	PNeudOMonas	putida	2440/	25 U
	pBT 306.16			1600	- kreatín
*)	E. coli ED			•	* kreatín
S)	E. coli BD/pBT 3-2		30	• kreatín
«)	E. coli ED/pBT 2*-	1	2600	- kreatín

Údaje ukazujú, že pri klonovani sledu, ktorý je kódom pre kreatínamidínhydrolázu

1) baktérie E. coli získavajú novú schopnosť syntetizovať kreatínamidínhydrolázu, pričom

2) táto expresia prebieha na rozdiel od východiskového kmeňa Pseudomonas putida tak aj pre E. coli, ako pre Pseudomonas putida konštitutívne.

Naviac je možné pri mutagenézii pôsobením DNA, ktorá je kódom pre kreatínamidínhydrolázu. dosiahnuť zvlášť vysokú expresiu. Ide napríklad až o 1 000 násobné zvýšenie účinnosti/liter v porovnaní s východiskovým kmeňom Pseudomonas a až o 2800 násobné zvýšenie v prípade E. coli.

V E. coli ED/pBT 2a-l DSM 3 143 je účinnosť 500 jednotiek/g biomasy (vlhkej), špecifická účinnosť je 4,5 jednotiek/mg bielkoviny. Pretože špecifickáúčinnosť v prípade vysoko čistenej bielkoviny je 9 jednotiek/mg, je zrejmé, že u E. coli tvorí kreatínamidínhydroláza 50 % rozpustných bielkovín. Pri analýze surového extraktu na SDS-géli spôsobom podľa publikácie Laemmli, Náture, 1970,227,680 až 685 je možné dokázať, že kreatínamidínhydroláza tvorí hlavné pásy rozpustnej bielkovinovej frakcie, ako je zrejmé z obr.4, stĺpec 2.

Príklad 5

Na kultiváciu vo fermentore boli použité tri kmene Escherichia coli, a to E. coli W 3350, E. coli ED 8 654 a E. coli CSH 1. Na transformáciu sa použije plazmid pBT 2a-1. Po čistení jednotlivých kolónii sa pestuje predbežná kultúra v živnom prostredí DYT (Miller, Experimente in Molecular Genetics, Cold Springs Harbor, 1972, 433) s obsahom 20 pg/ml ampicilínu cez noc pri teplote 37°C. Fermentačné prostredie (DYT) sa potom naočkuje predbežnou kultúrou (1 % očkovacieho materiálu) a bez selekcie na prítomnosť plazmidu sa kultúra nechá rásť 20 až 30 hodín pri teplote 37’C. Po 25 hodinách pestovania je účinnosť kreatínamidínhydrolázy približne 600 jednotiek/gram vlhkej biomasy, t. j. približne 4,5 jednotiek/mg bielkoviny.

V prípade fermentácie Pseudomonas putida sa použije plazmid pBT 306.16 na transformáciu kompetentných buniek kmeňa Pseudomonas putida 2440 vyššie uvedeným spôsobom, čím sa získa kmeň Pseudomonas putida DSM 3147.

Po čistení jednotlivých kolónií sa pestuje v prostredí DYT cez noc pri teplote 30°C predbežná kultúra, prostredie obsahuje 200 pg/ml streptomycínu. Potom sa touto kultúrou naočkuje fermentačné prostredie (DYT) pri použití l % očkovacieho materiálu a kultúra sa nechá rásť pri teplote 30°C 20 až 30 hodín. Účinnosť po 25 hodinách je približne 220 jednotiek/g vlhkej biomasy, t. j. približne 1,8 jednotiek/mg bielkoviny

Claims (5)

1. Mikroorganizmus čeľade E. coli alebo Pseudomonas putida, obsahujúci plazmid pBT 2a-l, DSM 3148P alebo pBT 306.16, DSM 3149P a konštitutívne produkujúci kreatínamidínhydrolázu.

2. Rekombinantá DNA, obsahujúca nasledujúci kódový reťazec báz pre bielkovinu štiepiacu kreatín s re-ťazcom aminokyselín 1 až 403

SK 278079 Β6

NatGlnNatFroLysThrljauArgllaArgAanGlyAapLyaValArgSarTbrPhaSar ATGCAAATCCCCAAGACCCTCCGCATCCGTAACGGCCACAAGGTTCGCTCCACCTTCTCC

AlaGInGluTyrAlaAanArGCliiAlaArgLauArgAlallIsLauAlBAlaGluAsnZIa GCCCAGGAATACGCCAATCGCCAAGCCAGGCTGCGCGCCCACCTGGCGGCGGAGAACATC

AepAlaAlaXlePheThrSarTyrKisAenllaAanTyrTyrSarÄapPhaLauTyrCys GACGCCGCGATCTTCACCTCGTACCACAACATCAACTACTACŤCCGACTTCCTCTACTGC

SarPhaGlyArgProTyrAlaLeaValValThrHiaA«pAepValIlaSarIItStrAla TCCrTCGGCCGCCCCTACGCGTTCGTGGTGACCCACCACGACGTCATCAGCATCAGCGCC

AanlXeAepGlyGlyGlnProTrpArgArgThrValGlyThrAepAanZlaValTyťThr AACÄTCGACGGCGGCCAGCCGTGGCGCCGCACCGTCGGCACCGACAACATCGTCTACACC

AspTrpGlnArgAapAanTyrPheAlaAlalleGinGlnAlaLauProLysALaArgArg GACTGGCAGCGCGATAACTACTTCGCCGCCATCCAGCAGGCGTTGCCGAAGGCCCGCCGC

ZlaGlylleGluHĹsAspHisLauAsnLauGlnAanArgAapĹyaLavAlaAlaXrg'Tyr ATCGGCATCGAACATGACCACCTGAACCTGCAGAACCGCGACAAGCTGGCCGCGCGCTAT

PreAapAlaGlutauValAepVaLALaAlaAlaCyaMatArgNatArgMatZleLysSar CCGGACGCCCAGCTGGTGGACGTGGCCGCCGCCTGCATGCGTATGCCCATGATCAAATCC

AlaGluGluHisValMetlleArgHLsGlyAlaArgILaAlaA»pIl«GlyGLyAlaAla GCCGAAGAGCACGTGATGATCCCCCACGCCGCGCGCATCCCCCACATCGGTGSTGCGGCG

ValValGluAULauGlyAapClnValProGluTvrciyValAlaLauXlsAlaThrGJn GTGGTCGAAGCCCTGGCCCACCAGGTACCGGAATACG AAGTGGCGCTGCATGCCACCCAG

AlaHatValArgAlallaAlaAspThrPhaGluAspValGlúLauMetAspThrTrpThr GCCATGGTCCGCGCCATrGCCGArACCrrCGACGACGTGGAGCTGAtGGATACCTGGACC

TrpPhaGlnSarGlyllaAanThrAspGlyAlaHisAtnProValThrThrArgLyeval TGGTTCCAGTCCGGCATCAACACCGACGGCGCGCACAÄCCCGGTGACCACCCGCAACGTG

AanLyiGlyAapIleLeuSarLeuAanCysPheProMetlleAlaGlyTyrTyrThrAla AACAACGGCGACATCCTCAGCCTCAACTGCTTCCCGATGATCCCCCCCTACrACACCGCG

LauGluArgThrLauPhaLeuAspHiaCyaSarAspAapHisLauArgLeuTrpGlnVal TTCGAGCGCACCCTGTTCCTCSACCACTGCTCGGACGACCACCTGCGTCTGTGGCAGGTC

AanValGluYalHisGluAlaGlyLeuLysLeuIlaLyaProGlyAlaArgCysSerAsp

AACGTCGAGGTCCATGAÄGCCGGCCTGAAGCTGATCAAGCCCGGTGCGCGTTGCAGCGAT

Ι1«Α1*λΓ9ε1υΙ<·υΑ*ηβ1λΐΙ1«ΡήβΧ'·υΕγ»Η1ΒΑ9ρνΒ1Ι>«υ61ηΤγΓλΓφΤΗΓΡΗβ

ATCGCCCGCGAGCTGAACGAGATCTTCCTCAAGCACGACGTGCTGCAGTACCGCACCTTC

GlyTyrGlyHiaSerPlMGlyThrLau$arHHTyrTyrGlyAť9GluAlaGlyLauGlu GGCTACGGCCACTCCTTCGGCACGCTCAGCCACTACTACGGCCGCGAGGCeGGGTTGGAA

LauArgGluAapZlaAapThrValLtuGluProGlyMatValValSarNatGluProMat CTGCGCGAGGÄCATCGACACCGTGCTGGAGCCGGGCATGOTGGTGTCGATGGAGCCGATG

IleMetLeuProGluGlyLeuPrQGlyAlaGlyGlyTyrArgGIuHi*AspZlal*auIle ATCATGCTCCCGCAAGGCCTGCCGGGCCCCGGTGGCTATCGCGAGCACGACATCCTGATC

ValAsnGluAsnGlyALaGluAsnlleThrLysPheProTyrGlyProGluLysAsnXle

GTCAACGAGAACGGTGCCGAGAACATCACCAAGTTCCCCTACGGCCCGGAGAAAAACATC

IlaArgLya

ATCCGCAAATGA alebo jeho ekvivalent, ktorý je podľa genetického kódu kódovým reťazcom pre rovnaký reťazec aminokyselín.

5. Rekombinantné DNA podľa nároku 2 vo forme plazmidu pBT 2a-l, DSM 3148P.

6. Rekombinantná DNA podľa nároku 2 vo forme 5 plazmidu pBT 306.16, DSM 3149P.

6 výkresov

Obr.l

8gl II Pvu ll

SpH Xhol Pst I SpHI Pstl Pvu II Eco Rl I [ Eco Rl

1 Kb

Eco Rl, Pvu II

Eco Rl, Pvu II izol. 2,2 Kb fragment izol. 2,3 Kb fragment

Ta ligáza

NG nnitagenéza

NG mutagenéza izol. plazili. DNA trans. B. coli ED i

acreening aktivity

SK 278079 Bé

Obr.2

1ΪΟ1. 1,4 Kb fragment

Obr. 3

Pvu I, Pvu II izol. 2,8 Kb fragment

SK 278079 Β6

Obr. A __165 Kd

155 Kd

--- 68 Kd

-- 45 Kd