ES2236714T3 - Proceso para producir antibioticos beta-lactamicos a partir de microorganismos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA BIOSINTESIS DE ANTIBIOTICOS DE {BE}-LACTAMA. MAS CONCRETAMENTE, SE RELACIONA CON PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCION DE ANTIBIOTICOS DE {BE}-LACTAMA IN VIVO E IN VITRO. ASIMISMO, SE DESCRIBE UNA NUEVA ENZIMA CAPAZ DE CATALIZAR CIERTAS FASES IMPLICADAS EN LA BIOSINTESIS DE LA {BE}LACTAMA. ASIMISMO, LA INVENCION SE REFIERE A UNA ESTRUCTURA DE ADN QUE CODIFICA PARA DICHA NUEVA ENZIMA, A UN VECTOR RECOMBINANTE O A VEHICULO DE TRANSFORMACION QUE INCLUYE DICHA ESTRUCTURA DE ADN, Y, FINALMENTE, A UNA CELULA QUE COMPRENDE DICHA ESTRUCTURA DE ADN O DICHO VECTOR RECOMBINANTE.

Description

Proceso para producir antibióticos \beta-lactámicos a partir de microorganismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la biosíntesis de los antibióticos \beta-lactámicos. De forma más particular, la invención se refiere a procesos de producción de antibióticos \beta-lactámicos in vivo e in vitro.

También está contemplada una nueva enzima que puede utilizarse ventajosamente en la biosíntesis de antibióticos \beta-lactama. Además, la invención se refiere a un constructo de ADN que codifica tal nueva enzima, un vector recombinante o vehículo de transformación que comprende dicho constructo de ADN y, finalmente, una célula que comprende el citado constructo de ADN o vector recombinante.

Antecedentes de la invención Vía biosintética de penicilina

El primer paso en la biosíntesis de penicilina implica la formación del tripéptido \delta-(L-\alpha-aminoadipilo)-L-cisteinilo-D-valina (ACV) procedente del ácido L-\alpha-aminoadípico, L-cisteína y L-valina (Fawcett y col., Biochem. J., 157, pp. 651-660, 1976). La reacción es catalizada por una enzima multifuncional, la \delta-(L-\alpha-aminoadipilo)-L-cisteinilo-D-valina sintetasa (ACV-sintetasa) con ATP y Mg^{2+} como cofactores (Banko y col., J. Am. Chem. Soc., 109, pp. 2858-2860, 1987).

La ACV-sintetasa (ACV-S) se purifica a partir de Aspergillus nidulans (Van Liempt y col., J. Biol. Chem., 264, pp. 3680-3684, 1989), Cephalosporium acremonium (Baldwin y col., J. Antibiot., 43, pp. 1055-1057, 1990) y Streptomyces clavuligerus (Jensen y col., J. Bacteriol., 172, pp. 7269-7271, 1990 y Zhang y col., Biotechnol. Lett., 12, pp. 649-654, 1990). No se ha publicado la purificación de la ACV-sintetasa de Penicillium chrysogenum. Sin embargo, la ACV-sintetasa de P. chrysogenum ha sido clonada por Diez y col., (J. Biol. Chem., 265, pp. 16358-16365, 1990).

El tripéptido lineal, el ACV, se convierte en isopenicilina N (IPN) en presencia de isopenicilina N-sintasa (también denominada ciclasa o isopenicilina N-sintetasa (IPNS)), iones ferrosos, oxígeno y un donante de electrones (por ejemplo ascorbato). La isopenicilina N-sintasa fue aislada en primer lugar de P. chrysogenum por Ramos y col. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 27, pp. 380-387, 1985) y el gen estructural de isopenicilina N-sintasa procedente de P. chrysogenum fue clonado por Carr y col. (Gene, 48, pp. 257-266, 1986).

Estos dos primeros pasos de la biosíntesis de penicilinas son comunes en los hongos y bacterias productores de penicilina y cefalosporina.

En algunos hongos, por ejemplo, en P. chrysogenum y en A. nidulans, la cadena lateral \alpha-aminoadipilo de la isopenicilina N puede reemplazarse por otras cadenas laterales de origen intracelular o suministradas de forma exógena. El intercambio es catalizado por una aciltransferasa (denominada acil-coenzima A: isopenicilina N acetiltransferasa; o acil-coenzima A: aciltransferasa del ácido 6-aminopenicilánico). No está todavía muy claro si esta conversión se realiza in vivo mediante una reacción en dos etapas en la primera de las cuales se elimina la cadena lateral L-\alpha-aminoadipilo para producir ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) seguida de la etapa de acilación, o si la conversión es un intercambio directo de las cadenas laterales. La aciltransferasa purificada procedente de P. chrysogenum posee tanto una actividad de isopenicilina N-amidohidrolasa como una actividad de acil-coenzima A: aciltransferasa de ácido 6-aminopenicilánico (Alvarez y col. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, pp. 1675-1682, 1987).

Los genes que codifican la ACV-sintetasa (pcbAB), isopenicilina N-sintasa (pcbC) y acil-coenzima A: aciltransferasa de ácido aminopenicilánico (penDE) se encuentran en el mismo grupo de hongos en P. chrysogenum y A. nidulans (Diez y col., J. Biol. Chem., 265, pp. 16358-16365, 1990, y Smith y col., Bio/Technology, 8, pp. 39-41, 1990).

La amplificación del grupo de genes pcbC-penDE de P. chrysogenum Wis 54-1255, que codifica la isopenicilina N-sintasa (IPN-S) y la aciltransferasa (AT), respectivamente, conducía a un aumento tan importante como del 40% en los rendimientos de producción (Veenstra y col., J. Biotechnol., 17, pp. 81-90, 1991). También fueron encontrados mayores rendimientos de antibióticos en los transformantes de A. nidulans que contenían múltiples copias de genes pcbAB (que codifica la ACV-sintetasa (ACV-S)) y pcbC (que codifica la isopenicilina N-sintetasa (INP-S)) (McCabe y col., J. Biotechnol., 17, pp. 91-97, 1991).

En EP 200425 (Eli Lilly) se describen los vectores que codifican la isopenicilina N-sintetasa (IPN-S). Los vectores permiten un alto nivel de expresión de IPN-S en C. acremonium y E. coli. Según dicho documento, los vectores de Cephalosporium sirven para mejorar la cepa, incrementar la eficacia y producir fermentaciones para la síntesis de antibióticos de penicilina y cefalosporina. Los vectores también pueden ser modificados para dar vectores que permitan incrementar los rendimientos y la eficacia de la producción de P. chrysogenum, Streptomyces clavuligerus, etc., en fermentaciones.

En EP 357119 (Gist Brocades) se describen los genes antibióticos biosintéticos agrupados que codifican IPN-S, AT y ACV-S y se emplean ventajosamente para mejorar la producción de antibiótico en los microorganismos y para aislar otros genes involucrados en la biosíntesis del antibiótico. La invención se ilustra con la producción mejorada de penicilina en P. chrysogenum, con el aislamiento de otro(s) gen(es) biosintético(s) agrupado(s) y con la expresión de genes agrupados biosintéticos de penicilina en Acremonium chrysogenum.

Activación de la cadena lateral

Con el fin de sustituir la cadena lateral ácido \alpha-aminoadípico en la reacción catalizada de la aciltransferasa debe activarse el grupo ácido carboxílico de la nueva cadena lateral. Esta activación es una de las etapas menos entendidas de la biosíntesis de las penicilinas. Se propusieron dos teorías.

La teoría más ampliamente aceptada es que la enzima cataliza la esterificación de ácidos carboxílicos en tioésteres de coenzima A por medio de un mecanismo en dos etapas que se desarrolla a través de la pirofosforolisis de ATP (adenosintrifosfato), en presencia de Mg^{2+}. En primer lugar, el ácido carboxílico (la nueva cadena lateral), el ATP y la enzima forman un complejo que conduce a un complejo acil-AMP-enzima. En segundo lugar, este complejo reacciona con la coenzima A para liberar acilcoenzima A y AMP (adenosinmonofosfato).

La otra teoría se basa en la formación de un intermedio acil-S-glutatión, que puede transformarse en el éster de acilcoenzima A correspondiente (Ferrero y col., J. Antibiot., 43, pp. 684-691, 1990).

Brunner, Röhr y Zinner (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 349, pp. 95-103, 1968), Brunner y Röhr (Methods Enzymol., 43, pp. 476-481, 1975), Kogekar y Deshpande (Ind. J. Biochem. Biophys., 19, pp. 257-261, 1982), y Kurzatkowski (Med. Dosw. Mikrobiol., 33, pp. 15-29, 1981) han descrito una fenacil: coenzima A ligasa procedente de P. chrysogenum capaz de catalizar la síntesis de fenoxiacetil-coenzima A y fenilacetil-coenzima A en presencia de ATP, Mg^{2+}, coenzima A y ácido fenoxiacético o ácido fenilacético. Según Brunner y col., la ligasa muestra grados similares de actividad con el ácido fenilacético, el ácido fenoxiacético y el ácido acético. Sin embargo, la enzima no se purificó nunca hasta homogeneidad.

Martínez-Blanco y col. (J. Biol. Chem., 267, pp. 5474-5481, 1992) han descrito una acetil-coenzima A-sintetasa de P. chrysogenum Wis 54-1255 que no solamente acepta como sustrato el ácido acético sino también el ácido fenilacético en la síntesis de los ésteres de acil-coenzima A correspondientes, exactamente como la ligasa descrita por Brunner y col. Sin embargo, la actividad con el ácido fenoxiacético no está descrita por Martínez-Blanco y col. Según Martínez-Blanco y col, la acetilcoenzima A-sintetasa es un homodímero (\alpha_{2}) que tiene un peso molecular de 139.000 Dalton determinado por filtración en gel y de 70.000 Dalton tal como se determina mediante SDS-PAGE (electrofóresis en gel poliacrilamida dodecil sulfato de sodio) y un punto isoeléctrico entre pH 5,6 y de 6,0.

El gen que codifica la acetil-coenzima A-sintetasa de Martínez-Blanco y col. ha sido caracterizado por Martínez-Blanco y col. (Gene, 130, pp. 265-270, 1993). El gen, que se designó acuA, contiene cinco intrones y codifica un polipéptido de 669 aminoácidos. Este polipéptido posee un peso molecular de 74.287.

Gouka y col. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 38, pp. 514-519, 1993) y Van Hartingsveldt y col. (WO 92/07079) han descrito el aislamiento y la secuencia de un gen de acetilcoenzima A-sintetasa (facA) de P. chrysogenum que codifica una proteína de 669 aminoácidos, correspondientes a un peso molecular de aproximadamente 74.000 Dalton (utilizando un peso molecular medio de 110 g/mol por cada aminoácido). Las secuencias genéticas del gen facA de Gouka u col., y del acuA de Martínez-Blanco u col. no mostraban ninguna diferencia.

No se ha publicado ninguna caracterización detallada de las fenilacil-coenzima A-ligasas descritas por Brunner y col. y por Kogekar y Deshpande.

En su forma activada, la nueva cadena lateral que debe sustituir la cadena lateral de ácido \alpha-aminoadípico en la reacción catalizada por la aciltransferasa puede estar en forma de un tioéster de coenzima A u otro tioéster, ya que se ha señalado que otros tioésteres (por ejemplo acil-S-cisteinilglicina y acil-S-glutatión) son sustratos para la aciltransferasa. Como otra posibilidad, el dipéptido (cisteinil-glicina) puede ser sustituido por CoASH en una reacción no-enzimática antes de introducirse en la reacción de aciltransferasa (Ferrero y col., J. Biol. Chem., 265, pp. 7084-7090, 1990).

Una vez formado, el grupo tionilo de los tioésteres puede intercambiarse rápidamente con otros tioles (por ejemplo mercaptoetanol, 1,4-ditiotreitol, ACV y coenzima A) en una reacción no-enzimática.

Ligasas en general

Las ligasas, que pertenecen a la subclase de enzimas 6.2.1., ligasas Ácido-Tiol (Enzyme Nomenclature, Academic Press, inc., 1992) también denominadas acilcoenzima A-sintetasas o acilcoenzima A-tioquinasas, catalizan la formación de los tioésteres de acilcoenzima A a partir de un ácido carboxílico y la coenzima A en presencia de ATP y Mg^{+2}.

Se han identificado varias ligasas o acilcoenzima A-sintetasas procedentes de varias fuentes, por ejemplo acetilcoenzima A-sintetasa, propionilcoenzima A-sintetasa (Groot, Biochim. Biophys. Acta, 441, pp. 260-267, 1976), butirilcoenzima A-sintetasa (Wanders y col., J. Biol. Chem., 240, pp. 29-33, 1965), acilcoenzima A-sintetasas grasas de cadena media, cadena larga y cadena muy larga (Waku, Biochim. Biophys. Acta, 1124, pp. 101-111, 1992, revisado), benzoilcoenzima A-ligasa de Pseudomonas sp (Auburger, Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, pp. 789-795, 1992) y fenilacetilcoenzima A-ligasas (Martínez-Blanco y col., J. Biol. Chem., 265, pp. 7084-7090, 1990, y Vitovski, FEMS Microbiol. Letters, 108, pp. 1-6, 1993). La mayor parte de ellas tienen amplias especificidades de sustrato.

Las acilcoenzima A-sintetasas (ligasas) en general son unas enzimas clave en el metabolismo primario de los ácidos grasos y del ácido acético y en los pasos iniciales en la degradación de los ácidos aromáticos en la cual, a través de la formación del enlace tioéster rico en energía, activan el grupo acilo del ácido carboxílico.

Producción in vivo de \beta-lactamas

Muchas de las denominadas \beta-lactamas naturales (por ejemplo, la penicilina DF, la isopenicilina N, 6-APA, la cefalosporina C, etc.) son inestables, difíciles de purificar a partir del caldo de fermentación, tienen solamente un efecto antibiótico limitado y/o tienen un rendimiento de producción bajo.

La sustitución de las cadenas laterales de las \beta-lactamas naturales con ácido fenoxiacético o ácido fenilacético por ejemplo conduce a la formación de penicilinas (penicilina V y penicilina G, respectivamente), que son más estables, más fáciles de aislar y tienen una mayor actividad antibiótica.

Las únicas penicilinas directamente fermentadas de interés industrial son la penicilina V y la penicilina G, producidas mediante adición de ácido fenoxiacético o ácido fenilacético, respectivamente, al recipiente de fermentación. La adición de precursores alternativos, por ejemplo ácido de 2-tiofenacético o ácido 3-tiofenacético, durante la fermentación de P. chrysogenum conduce a otras penicilinas. Algunos precursores añadidos, por ejemplo 1-fenil-n-alcanos o 1-fenoxi-n-alcanos, pueden metabolizarse parcialmente dentro de las células de P. chrysogenum antes de utilizar un sustrato para la aciltransferasa en la producción de penicilinas (Szarka, Advances in Biotechnology, 3, pp. 167-173, 1980; Szarka y col., US 4.250.258; y Szarka y col., US 4.208.481). En la biosíntesis de las llamadas penicilinas naturales, por ejemplo penicilina DF, penicilina K, penicilina F y penicilina H, las cadenas laterales, ácido hexanoico, ácido octanoico, ácido 3-hexenoico, y ácido heptanoico respectivamente, derivan probablemente del metabolismo
primario.

En algunos casos, la cadena lateral fenoxiacetilo o fenilacetilo actúa también como grupo protector durante la fermentación y la recuperación de la \beta-lactama, ya que la penicilina aislada V o G se hidroliza en un proceso enzimático o químico orgánico formando 6-APA, que, a su vez, es el bloque constructivo básico para las nuevas penicilinas semisintéticas que tienen unas propiedades farmacológicas mejoradas en comparación con la penicilinas naturales así como con las penicilinas V o G.

Del mismo modo, en la producción de las cefalosporinas, las cefalosporinas naturales tienen un valor farmacéutico limitado ya que también son difíciles de aislar y tienen solamente un bajo efecto antibiótico. Además, son difíciles de transformar en nuevas cefalosporinas de mayor valor farmacéutico.

Para transformar la cefalosporina fermentada en el antibiótico deseado han de realizarse diversos pasos; por ejemplo, en la producción de las cefalosporinas orales cefalexina y cefadroxila, se parte de penicilina V o G, que se transforma entonces en una cefalosporina mediante una serie de reacciones químicas, manteniendo la cadena lateral fenoxiacetilo o fenilacetilo como grupo protector. Después de que se haya formado la expansión del anillo V-DCA o G-DCA (ácido V/G-deacetoxicefalosporánico) respectivamente, se elimina la cadena lateral por hidrólisis en un proceso similar a la hidrólisis de la penicilina V o G. Finalmente, se añade una nueva cadena lateral (por ejemplo D-fenilglicina o D-p-hidroxifenilglicina) mediante un proceso organoquímico.

En la producción de cefalosporinas a partir de cefalosporina C, el ácido D-\alpha-aminoadípico puede eliminarse por hidrólisis química o por un proceso enzimático organoquímico en dos etapas. El 7-ACA resultante (ácido 7-aminocefalosporánico) es entonces acilado para formar el producto deseado.

Ambas reacciones que conducen a la formación de V-DCA, G-DCA y a la hidrólisis de la cefalosporina C en 7-ACA se llevan a cabo a escala industrial pero son difíciles de controlar, caras y los rendimientos son generalmente bajos.

Para evitar este problema se han sugerido varias alternativas, alguna de las cuales implica la transformación del P. chrysogenum con epimerasa y expandasa de Streptomyces por ejemplo, tal como se describe en C. Cantwell y col., 248, pp. 283-289, 1992. Demostraron que el P. chrysogenum transformado era capaz de producir ácido deacetoxicefalosporánico. Sin embargo, no se encontró ningún V-DCA. Cantwell sugirió que la expandasa puede ser modificada por ingeniería genética para cambiar la especificidad de su sustrato y así aceptar V o G como sustrato. Entonces el V/G-DCA puede ser producido directamente por fermentación.

S. Gutierrez y col., Mol. Gen. Genet., 225, pp. 56-64, 1991, transformaron C. acremonium con aciltransferasa de P. chrysogenum, y fueron capaces de detectar la formación de penicilina G por el C. acremonium transformado, pero no se demostró la presencia de G-DCA.

En EP 532341 (Merck & Co., Inc.) se describe la fermentación de adipoil-ADCA (ácido adipoil-7-aminodesacetoxicefalosporánico) en un P. chrysogenum transformado con expandasa de Streptomyces clavuligerus. El adipoilo-7-ADCA puede ser extraído entonces del caldo de fermentación y ser hidrolizado por una acilasa de adipoilo procedente de Pseudomonas por ejemplo.

La ES 2.016.476 revela la preparación bioquímica in vitro de fenilacetil-coenzima A y bencil penicilina (penicilina G). La fenilacetil-coenzima A se obtiene incubando la fenilacetilcoenzima A-ligasa procedente de Pseudomonas putida con ATP, ácido fenilacético y MgCl_{2} a 10-45ºC y un pH 5-10 durante 10-180 minutos. La bencil penicilina se obtiene incubando fenilacetilcoenzima A-ligasa y acilcoenzima A: ácido 6-aminopenicilánico acil transferasa procedente de Penicillium chrysogenum con ácido 6-aminopenicilánico y ácido fenilacético, ATP, coenzima A y MgCl_{2} a 10-40ºC y un pH 5,5-9 durante 30-180 minutos.

La ES 2.033.590 describe la producción in vitro de distintas penicilinas derivadas de bencil penicilina (penicilina G). La producción comprende la incubación de un sistema enzimático que contiene fenilacetilcoenzima A-ligasa de Pseudomonas putida y acilcoenzima A-ácido aminopenicilánico acil-transferasa de Penicillium chrysogenum y sustratos como ácido 6-aminopenicilánico, ATP, coenzima A, MgCl_{2}, ditiotreitol (DTT) y precursores de penicilinas.

En la técnica anterior se describieron diversos procesos para la producción de algunas penicilinas y cefalosporinas que incluyen etapas in vitro. En la mayoría de los casos estos procesos son difíciles de controlar, trabajosos y/o caros.

Sumario de la invención

Un objeto de la invención consiste en superar algunos de los problemas descritos anteriormente. Esto se consigue proporcionando mejores procesos para la producción de antibióticos \beta-lactámicos, procesos que tienen lugar en presencia de una actividad ligasa incrementada en comparación con la actividad de ligasa presente cuando se produce la fermentación del citado microorganismo original solo, en las condiciones de fermentación originales.

La invención se refiere también a una nueva enzima que presenta una actividad ligasa con alta especificidad de sustrato frente a los importantes precursores \beta-lactama, tales como ácido fenoxiacético, ácido fenilacético y ácido adípico, así como una baja especificidad con el ácido acético.

De acuerdo con la invención, le enzima puede derivar de los hongos filamentosos Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans o Cephalosporium acremonium.

La nueva enzima puede utilizarse en referencia a la biosíntesis de diversos antibióticos \beta-lactámicos.

Es también objeto de la invención proporcionar un método para producir antibióticos \beta-lactámicos in vitro.

Se plantea también un constructo de un ADN que codifica tal nueva enzima con actividad ligasa.

Además, es objeto de la invención proporcionar un vector recombinante o un vehículo de transformación que comprenda dicho constructo de ADN.

También se contempla de acuerdo con la invención una célula que comprenda dicho constructo de ADN o dicho vector recombinante.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra las concentraciones de ACV y de isopenicilina N en función del tiempo de fermentación.

La Figura 2 muestra el pH óptimo para la actividad ligasa.

La Figura 3 muestra la temperatura óptima para la actividad ligasa.

Descripción detallada de la invención

Como la economía en la producción es un factor importante en la producción de las \beta-lactamas, se necesitan procesos mejorados que conduzcan a un mayor rendimiento de la fermentación, procesos que sean más fáciles de controlar y que sean menos trabajosos y, por consiguiente, menos costosos.

Un objeto de la invención consiste en proporcionar dichos procesos mejorados para producir antibióticos \beta-lactámicos.

Se ha descubierto ahora de forma sorprendente que estos procesos mejorados pueden proporcionarse si la producción de antibióticos \beta-lactámicos de interés tiene lugar en presencia de una actividad incrementada de ligasa.

De acuerdo con la invención, este proceso mejorado para producir el antibiótico \beta-lactámico, comprende:

i)

la fermentación de un microorganismo capaz de producir dicho antibiótico \beta-lactámico, y

ii)

la recuperación de dicho antibiótico \beta-lactámico en una forma sustancialmente pura,

donde la citada fermentación tiene lugar en presencia de una actividad incrementada de ligasa en comparación con la actividad ligasa presente cuando se fermenta con el microorganismo original solo y en las condiciones de fermentación originales.

La actividad incrementada de ligasa se define como una conversión intensificada del ácido carboxílico en cuestión para dar el éster de acilcoenzima A correspondiente en comparación con el microorganismo original no modificado y/o las condiciones originales de fermentación.

En una realización de la invención, dicho microorganismo original, capaz de producir \beta-lactamas, o bien no está presente o posee solamente una baja actividad ligasa.

La expresión incrementada de la actividad ligasa puede conseguirse de cualquier forma adecuada.

Como ejemplo, y de acuerdo con una realización de la invención, la actividad ligasa puede incrementarse modulando las condiciones físicas del proceso de fermentación, por ejemplo la temperatura y el pH. Otra posibilidad consiste en someter al microorganismo a unos compuestos o agentes que conduzcan a una expresión aumentada de ligasa. La naturaleza de dicho compuesto o agente depende, por ejemplo, del activador utilizado para iniciar la expresión de ligasa. Además, al interferir en los mecanismos de control celular que controlan la expresión de ligasa se puede lograr una expresión incrementa de la actividad ligasa.

En una realización de la invención la citada actividad ligasa o la actividad ligasa incrementada se consigue mediante la modificación de dicho microorganismo.

Esto puede llevarse a cabo mediante procedimientos bien conocidos, por ejemplo introduciendo al menos una copia de un constructo de ADN o de un vector recombinante que comprende un gen codificador de una enzima que presenta actividad ligasa en el citado microorganismo original a ser fermentado.

En una realización, la actividad ligasa o la actividad ligasa incrementada se consigue por mutagénesis específica sitio-dirigida o aleatoria de dicho microorganismo.

Además, dicha modificación, que conlleva una actividad ligasa incrementada, puede conseguirse sustituyendo aminoácidos, mediante deleciones o adiciones de la enzima ligasa, tal como se describe a continuación.

Como alternativa, dicha actividad ligasa o actividad ligasa incrementada se consigue mediante la adición de una enzima que presenta actividad ligasa durante la producción del antibiótico \beta-lactámico.

En una realización alternativa, dicho constructo de ADN deriva de una especie que es distinta a la del microorganismo en el cual va a ser introducida.

La introducción del constructo de ADN o del vehículo de transformación puede ser llevarse a cabo mediante métodos bien conocidos, tal como se describe a continuación.

En algunos casos es deseable desplazar la totalidad de la biosíntesis de una \beta-lactama, incluida la expresión de la enzima que muestra la actividad ligasa, a otro microorganismo que no sea capaz por sí mismo de producir dicha \beta-lactama. Por ejemplo, este puede ser el caso si el microorganismo receptor (huésped) 1) se transforma más fácilmente, 2) es capaz de expresar las enzimas biosintéticas a alto nivel, 3) posee mejores características de crecimiento, o 4) produce menos impurezas, lo que puede dificultar la recuperación. Así puede obtenerse un rendimiento global superior de la \beta-lactama.

Como alternativa, pueden resultar deseables nuevas vías biosintéticas en un organismo.

De acuerdo con la invención, el microorganismo receptor o huésped anteriormente mencionado se selecciona del grupo que comprende Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus, Nocardia, Streptomyces, Bacillus, Cerospora, Microspora, otras Eubacterias, otros Actinomycetes u hongos filamentosos.

En una realización preferente, dicho microorganismo pertenece a una especie seleccionada del grupo que comprende Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus nidulans, Nocardia lactamdurans y Streptomyces clavuligerus.

En una realización de la invención, la expresión de dicha actividad ligasa está sincronizada con la expresión de otros genes que pertenecen a la vía de acceso biosintética de la \beta-lactama. Dichos genes pueden ser, por ejemplo, los genes pcbAB, pcbC y/o penDE.

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El antibiótico \beta-lactámico anteriormente mencionado procede del grupo que comprende penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, monobactamas, y nocardicinas.

Preferentemente, dicho antibiótico es una cefalosporina o una penicilina, como penicilina V, penicilina G, V-DCA, G-DCA, ácido 7-(L-\alpha-5-amino-5-carboxivaleramido)cefalosporánico (isocefalosporina C), adipoil-7-ADCA, o adipoil-7-ACA.

En una realización de la invención, el cultivo del citado microorganismo tiene lugar en condiciones que inducen la expresión de dicha secuencia de ADN obtenida en la producción del tioéster de coenzima A de cadena lateral activada, lo cual, a su vez, en presencia de una aciltransferasa (AT), conduce a la formación de una \beta-lactama que contiene dicha cadena lateral.

El cultivo de dicho microorganismo modificado tiene lugar, preferentemente, en condiciones que inducen la expresión del citado constructo o vector recombinante de ADN, lo que resulta así en una producción incrementada del tioéster de coenzima A del ácido correspondiente a la cadena lateral en el antibiótico \beta-lactámico deseado, lo que, a su vez, permite un mayor flujo por toda la etapa de biosíntesis de la \beta-lactama durante la cual se introduce la cadena lateral \beta-lactama en el núcleo de la \beta-lactama.

Además, el cultivo del microorganismo puede llevarse a cabo también en condiciones que inducen la expresión de dicha ligasa dependiendo del promotor.

En el caso particular de producción de penicilina V o de penicilina G, el incremento de la actividad ligasa, por ejemplo mediante ingeniería genética, conducirá a un flujo metabólico incrementado a lo largo de toda la última etapa de biosíntesis.

Las ventajas de los procesos mejorados de acuerdo con la invención son en primer lugar un proceso, de acuerdo con la invención, que resulta en un rendimiento acumulado claramente mayor del antibiótico \beta-lactámico de interés.

En segundo lugar, debido a la formación de menos producto(s) de desecho, se facilita la recuperación y purificación de los antibióticos \beta-lactámicos en su forma sustancialmente pura.

En tercer lugar, la invención permite la producción de los antibióticos \beta-lactámicos de interés sin generar cantidades significativas de productos de desecho. En consecuencia, esto hace que los procesos sean más eficaces, debido a la mayor energía disponible para sintetizar los productos de interés. Además, los productos de desecho pueden interferir de forma adversa en la vía biosintética.

En cuarto lugar, el rendimiento del antibiótico \beta-lactámico de interés es, en cualquier momento del proceso de fermentación, significativamente mayor si se compara con los procesos de fermentación con microorganismos que carecen de o tienen poca actividad ligasa. En este contexto, el rendimiento puede ser un rendimiento global o un rendimiento durante un cierto período de tiempo.

Todas las ventajas anteriormente mencionadas hacen que los procesos de producción industrial de antibióticos \beta-lactámicos sean menos caros.

Cuando se trata de la producción de penicilina V y de penicilina G, donde se observa una acumulación de ACV e isopenicilina N durante la fermentación, un incremento de la actividad ligasa conducirá, de acuerdo con la invención, a una menor acumulación de los citados metabolitos intermedios, cuando la conversión de isopenicilina N en penicilina V es un "cuello de botella".

La expresión de la actividad ligasa o sólo un incremento de tal actividad, en caso de aquellos microorganismos que carecen de o que tienen poca actividad ligasa, de acuerdo con la invención, puede realizar una eliminación no-enzimática de las cadenas laterales de los intermedios del antibiótico \beta-lactámico superfluos generados en la producción, por ejemplo de penicilinas y cefalosporinas.

Además, la recuperación e hidrólisis enzimática posterior de las \beta-lactamas fermentadas pueden resultar más fáciles si las cadenas laterales de las denominadas \beta-lactamas naturales están sustituidas por cadenas laterales hidrofóbicas, por ejemplo por ácido fenoxiacético o ácido fenilacético, que son fácilmente eliminables por hidrólisis enzimática utilizando penicilina V-acilasas o penicilina G-acilasas, bien conocidas en la industria \beta-lactámica en la producción de 6-APA.

En consecuencia, esto abre la posibilidad de producir ciertos intermedios de antibióticos \beta-lactámicos industriales importantes in vivo, por ejemplo V-DCA y G-DCA.

De acuerdo con la invención, se ha descubierto que es posible producir ciertos antibióticos \beta-lactámicos mediante procesos enzimáticamente catalizados en su totalidad, y en consecuencia sin necesidad alguna de procesos químicos.

En una realización de la invención, el V-DCA o G-DCA se produce enteramente, por medios enzimáticos in vivo, induciendo al microorganismo huésped a expresar una actividad ligasa incrementada según la invención. También están presentes una aciltransferasa (AT) (por ejemplo, acilcoenzima A: isopenicilina N acil-transferasa procedente de P. chrysogenum) y enzimas capaces de transformar las penicilinas en cefalosporinas (por ejemplo, una expandasa procedente de S. clavuligerus).

La invención se refiere asimismo a una nueva enzima que puede utilizarse de acuerdo con la invención.

Recientemente se ha obtenido y caracterizado una nueva enzima adecuada que muestra actividad ligasa.

Esta nueva enzima según la invención es una acilcoenzima A-sintetasa (ligasa) y conduce a un flujo incrementado hacia el producto de interés cuando produce antibióticos \beta-lactámicos.

Una característica de la enzima según la invención es que posee una alta especificidad con ciertos importantes precursores industriales de antibióticos \beta-lactámicos.

Como la ligasa de esta invención no presenta actividad aparente alguna con el ácido acético, una expresión incrementada de la actividad ligasa probablemente no dificulte la disponibilidad intracelular de acetilcoenzima A, uno de los metabolitos clave en el metabolismo primario. Así, el riesgo de interferencia adversa en el metabolismo primario se reduce en comparación con las manipulaciones (por ejemplo, genéticas o químicas), que conducen a la expresión incrementada de la ligasa que tiene actividad tanto con el ácido acético como con el ácido fenilacético y/o fenoxiacético y/o adípico.

De forma más específica, la nueva enzima según la invención es al menos entre 10 y 100 veces, preferentemente 10^{3} veces y con más preferencia hasta 10^{4} y 10^{5} veces más activa frente al ácido fenoxiacético que frente al ácido acético.

Además, la enzima según la invención posee una especificidad de sustrato al menos entre 10 y 100 veces, preferentemente 10^{3} veces y con más preferencia hasta 10^{4} y 10^{5} veces más activa con el ácido fenilacético que con el ácido acético.

La enzima de la invención, tal como se ha mencionado anteriormente, es una acilcoenzima A-sintetasa, de forma más específica una fenoxiacetilcoenzima A-sintetasa y en lo que sigue se denominará "ligasa".

El peso molecular aparente de una forma activa catalítica de la ligasa se encuentra en el rango de entre 40.000 y 60.000 Dalton, de forma más específica aproximadamente es de 50.000 Dalton, determinado por filtración en gel.

La ligasa tiene una actividad aparente óptima en el rango de pH de 7,0 a 9,0, en particular en el rango de pH de 8,0 a 8,5. In vitro, la enzima muestra solamente una baja actividad a un pH 7 o inferior, probablemente debido a la baja estabilidad de la ligasa cuando se mantiene a un pH por debajo de 7,5.

La temperatura óptima para la actividad ligasa se encuentra entre 35ºC y 45ºC, con su actividad más alta aproximadamente a 40ºC.

El punto isoeléctrico (pI) de la ligasa aparece a un pH superior a 7,25, de forma más probable por encima de un pH 9, y por debajo hasta aproximadamente un pH 12.

La enzima puede ser purificada a partir de extractos celulares de P. chrysogenum por precipitación con sulfato de amonio y por elución a partir de columnas rellenas de varios geles (por ejemplo Fenilsefarosa, Azul de Cibacrón y Sephacryl® S-200). A continuación se describe un ejemplo de purificación de la ligasa. Sin embargo, pueden emplearse otros procedimientos bien conocidos en la purificación de proteínas, por ejemplo pueden utilizarse otros materiales para la columna como Rojo Reactivo, Sepharose® Q FF y Sepharose S FF.

De acuerdo con la presente invención, se ha mostrado que dicha ligasa puede catalizar la formación de fenoxiacetilcoenzima A, fenilacetilcoenzima A, adipoilcoenzima A y hexanoilcoenzima A a partir de Mg^{2+}, ATP, CoASH y ácido fenoxiacético, ácido fenilacético, ácido adípico o ácido hexanoico, respectivamente. Cuando se somete a ensayo en los mismos sistemas (por ejemplo tal como se describe en los ejemplos siguientes), la ligasa no muestra ninguna actividad significativa con el ácido acético.

La enzima es inestable in vitro, pero la adición de ATP, Mg^{2+} y mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), ácido ascórbico u otros agentes reductores estabiliza de manera significativa la actividad durante la purificación y almacenamiento. La presencia de una alta concentración de sulfato de amonio o glicerol estabiliza también la enzima.

Basándose en el consumo de CoASH en el ensayo, la actividad con el ácido fenilacético es aproximadamente un 80% de la actividad con el ácido fenoxiacético, en las condiciones de prueba descritas a continuación en el Ejemplo 6.

Solamente cuando se ensayó en ausencia de otros tioles (por ejemplo, mercaptoetanol. ditiotreitol (DTT)), se observó una actividad sintética directa de fenoxiacetilcoenzima A. Sin embargo, la incubación de la ligasa con ATP, Mg^{2+}, CoASH, ácido fenoxiacético y, por ejemplo, mercaptoetanol conduce a la formación de un compuesto que posee el mismo espectro UV que el tioéster de ácido fenoxiacético y mercaptoetanol, fenoxiacetilo-S-CH_{2}-CH_{3}, que puede actuar también como sustrato para la aciltransferasa (AT).

En una realización de la invención, dicha enzima es inmunorreactiva con un anticuerpo erigido contra una ligasa purificada de la invención y que deriva de la cepa B10 de Penicillium chrysogenum.

Las propiedades inmunoquímicas de la enzima pueden determinarse inmunológicamente mediante pruebas de identidad de reacción cruzada. Las pruebas de identidad pueden ser realizadas por el procedimiento bien conocido de doble inmunodifusión Ouchterlony o por inmunoelectroforesis cruzada tándem según N.H. Axelsen; Handbook of Inmunoprecipitation-in-Gel Techniques; Blackwell Scientific Publications, Capítulos 5 y 14, 1983. Los términos "identidad antigénica" e "identidad antigénica parcial" están descritos en el mismo libro, capítulos 5, 19 y 20.

La enzima según la invención es un polipéptido.

En este contexto, las enzimas según la invención incluyen las proteínas maduras o formas precursoras de las mismas, así como los fragmentos funcionales de las mismas que poseen en esencia la actividad de los polipéptidos de longitud total.

Se contemplan además, de acuerdo con la invención, los homólogos de dichas enzimas. Estos homólogos comprenden una secuencia de aminoácidos que muestra un grado de identidad de al menos entre el 50% y el 70%, especialmente entre el 70% y el 80%, en particular hasta el 100%, con la secuencia de aminoácidos de la enzima según la presente invención.

El grado de identidad puede determinarse por métodos convencionales, ver por ejemplo: Altshul y col., Bull. Math. Bio., 48, pp. 603-616, 1986, y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, pp. 10915-10919, 1992. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar los scores de alineación utilizando una penalización por abertura de GAP de 10, una penalización por extensión de GAP de 1, y una matriz de puntuación "blosum 62" de Henikoff y Henikoff, supra.

Como alternativa, el homólogo de la enzima según la invención puede ser uno que esté codificado por una secuencia de nucleótido que se hibridiza con una sonda de oligonucleótido preparada sobre en base a una secuencia de nucleótido de dicha enzima que muestra actividad ligasa.

Las moléculas a las cuales la sonda de oligonucleótido hibridiza en estas condiciones se detectan mediante procedimientos de detección estándar (por ejemplo Southern Blot).

Los homólogos del presente polipéptido pueden tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Esos cambios son, preferentemente, de naturaleza menor; es decir sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan de forma adversa al plegamiento o a la actividad de la proteína, pequeñas deleciones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tal como un residuo amino-terminal metionina, un pequeño péptido de enlace de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación, como una región de polihistidina, un epítope antigénico o un dominio ligante. Ver en general Ford y col., Protein Expression and Purification, 2, pp. 95-107, 1991. Ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran dentro del grupo de aminoácidos básicos (como arginina, lisina, histidina), aminoácidos acídicos (como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (como glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (como leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (como fenilalanina, triptófano, tirosina) y pequeños aminoácidos (como glicina, alanina, serina, treonina, metionina).

Para las personas especializadas en la técnica es evidente que estas sustituciones se realizan fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y que siguen resultando en una enzima activa. Los aminoácidos esenciales para la actividad de la enzima de la invención, y por lo tanto preferentemente no sujetos a sustitución, pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, como mutagénesis sitio-dirigida, mutagénesis de selección de alanina (Cunningham y Wells, Science, 244, pp. 1081-1085, 1989). En esta última, las mutaciones se introducen en cada residuo en la molécula y se comprueba la actividad biológica de las moléculas mutantes resultantes (por ejemplo, la actividad ligasa para identificar los residuos de aminoácidos críticos para la actividad molecular). Los sitios de interacción ligando-receptor pueden también determinarse mediante análisis de la estructura cristalina por ejemplo tal como se determina con técnicas como resonancia magnética nuclear, marcado cristalográfico o de fotoafinidad. Ver, por ejemplo, de Vos y col., Science, 255, pp. 306-312, 1992; Smith y col., J. Mol. Biol., 224, pp. 899-904, 1992; Wlodaver y col., FEBS Lett. 309, pp. 59-64, 1992.

El homólogo puede ser una variante alélica, es decir una forma alternativa de un gen que surge a través de la mutación, o una enzima alterada codificada por el gen mutado, pero que tiene sustancialmente la misma actividad que la enzima de la invención. Por tanto, las mutaciones pueden ser silenciosas (ningún cambio en la enzima codificada) o pueden codificar enzimas que tienen una secuencia de aminoácidos alterada.

El homólogo de la presente enzima también puede ser un homólogo de especie, es decir una enzima con una actividad similar derivada de otras especies.

Se puede aislar un homólogo de la enzima preparando una librería genómica o de ADNc de una célula de la especie en cuestión, y seleccionando las secuencias de ADN que codifican todo o parte del homólogo mediante sondas sintéticas de oligonucleótido de acuerdo con técnicas estándar, por ejemplo tal como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, o por medio de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos tal como se describe en Sambrook y col., supra.

Además, los homólogos de la presente enzima son aquellos que poseen reactividad inmunológica cruzada con los anticuerpos que surgen contra la enzima de la invención.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar un constructo de ADN que codifique la citada enzima que muestra actividad ligasa.

Tal como se utiliza aquí, el término "constructo de ADN" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico de ADNc, ADN genómico, ADN sintético o de origen de ARN. El término "constructo" se refiere a un segmento de ácido nucleico que puede ser de filamento único o doble, y que puede basarse en una secuencia de nucleótido de origen completamente o parcialmente natural que codifica un polipéptido de interés. El constructo puede contener opcionalmente otros segmentos de ácido nucleico.

El constructo de ADN de la invención, que codifica el polipéptido de la invención, puede ser bien de origen genómico o procedente de ADNc, por ejemplo obtenido mediante la preparación de una librería genómica o de ADNc y selección de las secuencias de ADN que codifican todo o parte del polipéptido por hibridación utilizando de sondas sintéticas de oligonucleótido de acuerdo con técnicas estándar (ver Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Para el propósito actual, la secuencia de ADN que codifica el polipéptido procede, preferentemente, de hongos filamentosos o es de origen bacteriano.

El constructo de ADN de la invención que codifica el polipéptido puede también prepararse sintéticamente mediante métodos establecidos estándar, por ejemplo el método fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, pp. 1859-1869, 1981, o por el método descrito en Matthes y col., EMBO Journal, 3, pp. 801-805, 1984. De acuerdo con el método fosfoamidita, los oligonucleótidos se sintetizan por ejemplo en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se aparean, se ligan y se clonan en vectores adecuados.

Además, el constructo de ADN puede ser mezcla de origen sintético y genómico, mezcla de sintético y ADNc o mezcla de genómico y de ADNc, preparado mediante ligadura de fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado), correspondiendo los fragmentos a varias partes del constructo completo de ácido nucleico, de acuerdo con técnicas estándar.

El constructo de ADN también puede prepararse mediante la reacción de cadena de polimerasa utilizando cebadores específicos, por ejemplo tal como se describe en US 4.683.202 o en Saiki y col., Science, 239, pp. 487-491, 1988. En una realización preferente de la invención, la secuencia de ADN deriva de un hongo filamentoso que pertenece al género Aspergillus, Penicillium o Cephalosporium, preferentemente procede de una cepa de P. chrysogenum, C. acremonium o A. nidulans, especialmente la cepa B10 de P. chrysogenum.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector recombinante o vehículo de transformación que comprende el citado constructo de ADN de la invención y que codifica la citada enzima con actividad ligasa. El vector recombinante dentro del cual se inserta el constructo de ADN de la invención puede ser cualquiera que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector a menudo dependerá de la célula huésped dentro de la cual se debe introducir. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónomo, es decir un vector que existe como entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser tal que, cuando se introduce dentro de una célula huésped, se integra dentro del genoma de la célula huésped y se replica junto con el(los) cromosoma(s) dentro de los cuales ha sido integrado.

El vector es preferentemente un vector de expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de la invención está enlazada operativamente a los segmentos adicionales necesarios para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión deriva de ADN de plásmido o viral, o puede contener elementos de ambos. El término "enlazado operativamente" indica que los segmentos están dispuestos de modo que puedan funcionar de común acuerdo para los propósitos que pretenden, por ejemplo la transcripción empieza en un promotor y continúa por toda la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre una actividad transcripcional en la célula huésped elegida y puede derivar de los genes que codifican las proteínas homólogas o heterólogas de la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para su utilización en células huésped de hongo filamentoso son, por ejemplo, el promotor ADH3 (McKnight y col., The EMBO J., 4, pp. 2093-2099, 1985) o el promotor tpiA. Ejemplos de otros promotores útiles son aquellos que derivan del gen que codifica la amilasa en A. oryzae TAKA, la proteinasa aspártica en Rhizomucor miehei, la \alpha-amilasa neutra en A. niger, la \alpha-amilasa ácido estable en A. niger, la glucoamilasa (gluA) en A. niger o A. awamori, la lipasa en Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina en A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa en A. oryzae o la acetamidasa en A. nidulans. Los promotores preferentes son TAKA-amilasa y gluA.

A menudo resulta ventajoso utilizar promotores idénticos o similares para regular dos o más genes biosintéticos con el fin de obtener una producción sincronizada de los intermedios involucrados en la síntesis de los antibióticos \beta-lactámicos. Si la producción de los intermedios no está sincronizada, puede producirse una acumulación de intermedios (cuello de botella). En consecuencia, la producción del antibiótico \beta-lactámico puede ser retenida.

En una realización de la invención, el promotor del citado gen de ligasa se sustituye por el promotor procedente de otro gen implicado en la biosíntesis de \beta-lactamas.

Un ejemplo específico de promotor adecuado es el promotor AT descrito en la solicitud de patente danesa no publicada Nº 1118/94.

Ejemplos de promotores adecuados para su utilización en células huésped bacterianas incluyen el promotor del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, el gen de BAN amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de proteasa alcalina de Bacillus subtilis, o el gen de xilosidasa de Bacillus pumilus, o los promotores P_{R} o P_{L} de fago Lambda o los promotores lac, trp o tac de E. coli.

Si es necesario, la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención puede conectarse operativamente a un terminador adecuado.

El vector recombinante de la invención puede comprender ventajosamente una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en cuestión.

El vector recombinante puede comprender asimismo un marcador de selección, por ejemplo un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, por ejemplo el gen que codifica la hidrofolato reductasa (DHFR) o el gen TPI de Schizosaccharomyces pombe (descrito por P. R. Russell, Gene, 40, pp. 125-130, 1985), o uno que confiera resistencia a un medicamento, por ejemplo a ampicilina, canamicina, tetraciclina, fleomicina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato. Para los hongos filamentosos, los marcadores de selección incluyen amdS, pyrG, argB, niaD y sC.

Para dirigir una enzima ligasa de la presente invención al emplazamiento deseado dentro de la célula huésped o dentro de los medios de fermentación, se puede proporcionar en el vector recombinante una secuencia de señales diana o de señales secretoras (también conocida como secuencia líder, pre-prosecuencia o pre-secuencia), respectivamente. La secuencia de señales diana o de señales secretoras se unen a la secuencia de ADN que codifica la enzima en el marco de lectura correcto. Las secuencias secretoras normalmente se posicionan en 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica la enzima, mientras que las secuencias de señales diana se suelen posicionar en 3' con respecto a la secuencia de ADN. Las secuencias de señales diana o de señales secretoras pueden ser las que se asocian normalmente a la enzima o pueden proceder de un gen que codifica otra proteína que tiene la secuencia de señales deseada.

Para su utilización en hongos filamentosos, el péptido señal puede derivarse convenientemente de un gen que codifica una amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp, un gen que codifica la lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei, una lipasa de Humicola lanuginosa, etc. El péptido señal deriva preferentemente de un gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, la \alpha-amilasa neutra de A. niger, la amilasa ácido estable de A. niger, o la glucoamilasa de A. niger.

De acuerdo con la presente invención, la secuencia diana es, preferentemente, una señal diana capaz de dirigir la actividad ligasa hacia el emplazamiento deseado dentro de la célula (por ejemplo, hacia los microcuerpos). A menudo es deseable que se mantengan señales diana potenciales. Sin embargo, la señal diana puede ser sustituida por otras señales que tengan la misma función. Además, si se inserta la secuencia de codificación de ligasa dentro de un organismo, al carecer de una señal diana adecuada de ligasa, ésta puede añadirse con el fin de obtener la expresión de la ligasa en el emplazamiento adecuado dentro de la célula huésped.

Para la utilización en hongos filamentosos, un ejemplo de señal peroxisomal diana (PTS) con capacidad para translocar las proteínas citosólicas viajeras a los peroxisomas (clasificados como microcuerpos) en Neurospora crassa por ejemplo se describe en Keller y col., J. Cell Biol., 114, pp. 893-904, 1991.

Los procedimientos utilizados para unir las secuencias de ADN que codifican la presente enzima, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia de señales secretoras o secuencia de señales diana respectivamente y para insertarlas dentro de los vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación son bien conocidos de las personas especializadas en la técnica (ver Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Además es objeto de la invención proporcionar una célula que comprenda el constructo de ADN o un vector recombinante según la invención.

La secuencia de ADN que codifica el presente polipéptido introducido dentro de la célula huésped puede ser homóloga o heteróloga con respecto al huésped en cuestión. Si es homóloga con respecto a la célula huésped, es decir producida por la célula huésped en estado natural, puede conectarse operativamente a otra secuencia de promotores o, si es aplicable, a otra secuencia de señales secretoras y/o secuencia de terminadores distintas a las de su medio natural. El término "homólogo" pretende incluir un ADNc, un ADN producido semisintética o sintéticamente, una secuencia que codifica un polipéptido originario del organismo huésped en cuestión. El término "heterólogo" pretende incluir una secuencia de ADN no expresada por la célula huésped en su estado natural. Así, la secuencia de ADN puede proceder de otro organismo o puede ser una secuencia sintética.

La célula huésped en la cual se introduce el constructo de ADN o el vector recombinante de la invención puede ser cualquier célula que pueda ser capaz de producir el citado polipéptido (enzima) e incluye, preferentemente, hongos filamentosos y células bacterianas.

Ejemplos de células huésped bacterianas que en cultivo serán capaces de producir la enzima de la invención son bacterias gram-positivas tales como las cepas de Bacillus, por ejemplo cepas de B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium o B. thuringiensis, o cepas de Streptomyces, tales como S. lividans, S. murinus o S. clavuligarus, o bacterias gram-negativas como Escherichia coli. La transformación de la bacteria puede verse afectada por la transformación de protoplastos o por la utilización de células competentes de forma conocida per se (ver, Sambrook y col, supra).

Cuando se expresa la enzima en bacterias como E. coli, la enzima puede ser retenida en el citoplasma, normalmente como gránulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión), o puede ser dirigida hacia el espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células son lisadas y los gránulos son recuperados y desnaturalizados después de lo cual el polipéptido se repliega mediante dilución del agente desnaturalizador. En el último caso, la enzima puede recuperarse a partir del espacio periplásmico mediante disrupción de las células, por ejemplo por sonicación o choque osmótico, para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la enzima.

Ejemplos de células de hongos filamentosos son, por ejemplo, Penicillium spp., Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp., Trichoderma spp. o Cephalosporinas spp., en particular cepas de P. chrysogenum, P. notatum, A. oryzae, A. nidulans, A. niger o C. acremonium. Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de regeneración de la pared celular de forma conocida per se. La utilización de Aspergillus spp. para la expresión de las proteínas está descrita, por ejemplo, en EP 272 277, EP 238 023 y EP 184 438. La transformación de F. oxysporum puede llevarse a cabo, por ejemplo, tal como se describe en Malardier y col., 1989, Gene 78, pp. 147-156.

Cuando se utiliza un hongo filamentoso como célula huésped, éste puede transformarse convenientemente con el constructo de ADN de la invención mediante integración del constructo de ADN en el cromosoma huésped para obtener una célula huésped recombinante. Esta integración se considera generalmente como una ventaja ya que es probable que la secuencia de ADN se mantenga estable en la célula. La integración de los constructos de ADN dentro del cromosoma huésped puede realizarse siguiendo métodos convencionales, por ejemplo por recombinación homóloga o heteróloga.

La célula huésped transformada y transfectada descrita anteriormente se cultiva entonces en un medio nutritivo adecuado y en condiciones que permiten la expresión de la enzima en cuestión, después de lo cual la enzima resultante puede recuperarse del cultivo.

El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de células huésped, por ejemplo medios mínimos o complejos que contengan suplementos apropiados. Los medios adecuados están disponibles de suministradores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con recetas publicadas (por ejemplo en los catálogos de American Type Culture Collection).

La enzima producida por las células puede entonces recuperarse del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales que incluyen la separación de las células huésped del medio por centrifugación o filtración, por precipitación de los componentes proteínicos del sobrenadante o por filtrado mediante una sal, por ejemplo sulfato de amonio; purificación mediante diversos procedimientos cromatográficos y/o electroforéticos, por ejemplo por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, enfoque isoeléctrico, cromatografía de afinidad o similares, según el tipo de polipéptido en cuestión.

En el caso de que la enzima esté presente intracelularmente en la célula huésped, las células se recuperan inicialmente de los medios de fermentación por centrifugación o filtración. Luego, las células se someten a homogeneización para abrirlas, a continuación los componentes proteínicos del sobrenadante o del filtrado precipitan mediante una sal tal como se ha mencionado anteriormente. Finalmente, la enzima se purifica tal como se ha descrito anteriormente.

En una realización de la invención, la célula huésped en la cual la célula bacteriana es una célula de una bacteria gram-positiva, por ejemplo del género Bacillus o Streptomyces, o es una célula de una bacteria gram-negativa, por ejemplo del género Escherichia, y el un hongo filamentoso es, por ejemplo, del género Aspergillus, Cephalosporium o Penicillium.

En una realización preferente, la célula huésped es P. chrysogenum y C. acremonium.

Métodos y materiales Cepas

B10: cepa de P. chrysogenum (disponible de Panlabs, 11804 North Creek Parkway South, Bothell WA 98011-8805, USA)

P8: cepa de P. chrysogenum (disponible de Panlabs).

Materiales

Tubos de agar inclinados (en slant) LCS: (J. Lein, "The Panlabs penicillin strain improvement program", pp. 105-139 en Vanek, Z. y Hostálek, Z. (eds.) Sobreproducción de metabolitos microbianos, mejora de las cepas y estrategias de control de procesos. Butterworth, Boston (1986)).

Medio LCS: monohidrato de lactosa 1,5%, de líquido de maceración de maíz 0,5%, peptona 0,5%, NaCl 0,4%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,05%, KH_{2}PO_{4}0,06%, FeCl_{3}\cdot6H_{2}O 0,0005%

Tween®-80: Merck Art. 822187

Medio de Siembra P-1: (J. Lein, supra, (1986))

Medio de Fermentación P-2: (J. Lein, supra, (1986)).

Vector

pUC19: Fragmento 2,6kb Asp719-SalI.

Marcador selectivo de transformación

Gen resistente a la fleomicina Tn5 de E. coli expresado por el promotor de Aspergillus oryzae TPI (triosa fosfato isomerasa) y el terminador de Aspergillus niger AMG (amiloglucosidasa).

Equipo

Columna Sepharose® S FF (Pharmacia Biotech)

Columna Fenil-Sepharose CL 4B (150 ml) (Pharmacia Biotech)

Columna PD10 (Pharmacia Biotech)

Columna Supelcosil RP C-18 DB (250 x 4,6 mm), supelguard (Supelco)

Detector de radioactividad Flow-one/Beta serie 100 (Radiomatic)

Célula de flujo de silicato de ytrio (Radiomatic)

Columna Sephacryl S-200 (181 ml) (Pharmacia Biotech)

Columna de cromatoenfoque PBE^{TM} 94 (20 ml) (Pharmacia Biotech)

Pharmacia LKB PhastSystem (Pharmacia Biotech)

Columna Cibacron Blue 3GA (Sigma)

Detector HPLC por matriz de fotodiodo ABI 1000S (Applied Biosystems)

HPLC (Waters)

Sintetizador de ADN/ARN de Applied Biosystems 394

Secuenciador de Aminoácidos de Applied Biosystems 473

Detector por Matriz de Fotodiodo Waters^{TM} 991.

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Enzimas y Compuestos de Referencia

Acetilcoenzima A (Sigma)

Acetilcoenzima A-sintetasa (Sigma)

Albúmina de suero bovino ("BSA") (Sigma A7638)

Kit de Calibración de filtración en gel (Pharmacia Biotech)

Éster de ácido fenoxiacético coenzima A (M. J. Alonso y col., J. Antibiot., 41, pp. 1074-1084, 1988)

Éster de ácido fenilacético coenzima A (Sigma).

El éster de ácido adípico coenzima A se preparó como sigue: se añadió cloruro de adipoilo (0,14 ml; Aldrich) a una suspensión enfriada con agua helada y bien agitada de coenzima A-sal sódica (400 mg; 5,152 x 10^{-4} mmol; Sigma) en acetona (60 ml; Merck PA) + agua (0,6 ml) + KHCO_{3} 0,2M (para elevar el pH a > 7) bajo atmósfera de nitrógeno. Se llevó el pH del contenido de la reacción hasta aproximadamente 7,7 y luego se agitó además durante aproximadamente 60 min a la misma temperatura. A continuación, se eliminó parcialmente la acetona a presión reducida, el producto resultante se disolvió en agua fría y se secó por congelación. Rendimiento 0,0890 g. Finalmente, se sometió el producto a ultrafiltración.

Tampones

Tampón A:

50 mM de Tris/HCl, pH 8,5, sulfato de amonio 1,36 M, EDTA 4 mM, ATP 5 mM, ácido ascórbico 5 mM, PMSF 1 mM (fenil-metil-sulfonil-fluoruro)

Tampón B:

Tris/HCl 50 mM, pH 8,5, sulfato de amonio 0,68 M, EDTA 4 mM, ATP 5 mM, ácido ascórbico 5 mM, PMSF 1 mM

Tampón C:

Tris/HCl 50 mM, pH 8,5, glicerol 20%, EDTA 4 mM, ATP 5 mM, MgCl_{2}5 mM, ácido ascórbico 5 mM, PMSF 1 mM.

Tampón D:

Como el tampón C, KCl 150 mM

Tampón E:

Tris/HCl 10 mM, glicerol 20%, EDTA 4 mM, MgCl_{2} 5 mM, ATP 5 mM, ácido ascórbico 5 mM, PMSF 1 mM

Tampón F:

Tris/HCl 50 mM, glicerol 20%, EDTA 4 mM, MgCl_{2}5 mM, ATP 5 mM y ácido ascórbico 5 mM, pH 7,5

Soluciones

Solución A:

Tris/HCl 50 mM, pH 8,5; sulfato de amonio 35%, de EDTA 4 mM, ATP 5 mM, PMSF 1 mM, mercaptoetanol 5 mM

Solución B:

10 \mul de MgCl_{2}0,25 M, 50 \mul de ATP 0,1 M en Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, 50 \mul de CoASH 20 mM en Tris/HCl 50 mM, pH 8,0 y 30 \mul de de ácido fenoxiacético 0,2 M o ácido fenilacético o ácido adípico o ácido hexanoico en Tris/HCl 50 mM, pH 8,0 mezclados y equilibrados a 25ºC durante 5 minutos

Solución C:

Tris/HCl 50 mM, pH 8,5, sulfato de amonio (20% saturación), EDTA 4mM, ATP 5 mM, ácido ascórbico 5 mM, PMSF 1 mM, MgCl_{2}4 mM

Solución D:

5 ml contienen MgSO_{4}1,2 M, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 5,8, 150 mg de Novozym234 (lote #1199), 100 \mul de quitinasa (Sigma, 4U/ml)

Solución E:

sorbitol 0,6 M, Tris/HCl 100 mM, pH 7,0

Solución F:

sorbitol 1,2 M, Tris/HCl 10 mM, pH 7,5, CaCl_{2}10 mM

Solución G:

PEG4000 (BDH#29576) 60%, Tris/HCl 10 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 10 mM

Disolvente H:

acetonitrilo 20% (v/v) en tampón de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5

Disolvente I:

metanol 13% en fosfato de sodio 20 mM, pH 2,5

\newpage

Solución de sustrato A: 100 \mul de MgCl_{2}0,25 M, 500 \mul de ATP 0,1 M en Tris/HCl 50 mM, 500 \mul de CoASH 20 mM en Tris/HCl 50 mM y 300 \mul de acetato de potasio 0,067 M en Tris/HCl 50 mM

Disolvente A:

acetonitrilo15% (v/v) en amortiguador de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5

Disolvente B:

acetonitrilo 5% (v/v) en amortiguador de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5.

Métodos A) Clonación de fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa a partir de P. chrysogenum

Se aisló ADN genómico procedente de P. chrysogenum de acuerdo con el procedimiento de Schwarz-Sommer y col., (EMBO J., 3, pp. 1021-1028, 1984) y se digirió parcialmente con Sau3A. Los fragmentos de 15-23 kb de tamaño se aislaron entonces y se ligaron a los brazos BamHI de lambda EMBL3 (Promega).

Cuando se purificó hasta homogeneidad, pudo determinarse una secuencia parcial de aminoácido de fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa mediante la aplicación de una degradación Edman a la ligasa o a un fragmento de la misma con un Secuenciador de Aminoácidos de Applied Biosystems 473. A partir de la secuencia de aminoácido se pudieron preparar unos cebadores degenerados mediante el método de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, pp. 1859-1869, 1981, por ejemplo con un sintetizador de ADN/ARN de Applied Biosystems 394.

Mediante selección de la librería genómica del ADN de P. chrysogenum construida en lambda EMBL3 con el método de hibridación en placa (Maniatis y col., 1982, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) se pudo aislar un clon, el cual se hibridizó con el cebador degenerado específico del gen de fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa.

La región del clon de lambda que contiene el gen funcional de fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa se subclonó en el vector pUC19 junto con el gen resistente a la fleomicina Tn5, y el plásmido resultante se utilizó para la transformación de P. chrysogenum por ejemplo.

B) Transformación de P. chrysogenum

La cepa B10 de Penicillium chrysogenum (cepa de alto rendimiento) se cultiva en 2 matraces de 100 ml de medio LCS durante 36 horas a 26ºC. Los micelios se recogen en un paño Myra y se lavan suavemente con 500 ml de MgSO_{4}0,6 M. Se colocan entonces los micelios en un tubo de plástico y se suspenden en 5 ml de la Solución D y se colocan sobre hielo durante 5 minutos. Se añaden 750 \mul de BSA (12 mg/ml) a la suspensión micelial y se incuba luego a 30ºC durante 1 a 2 horas con agitación suave. La formación de protoplastos se controla con microscopio óptico.

Se recogen los protoplastos en un paño Myra y se colocan cuidadosamente por capas en 5 ml de la Solución E. Después de centrifugación lenta de hasta 2.000 r.p.m. durante 15 min., los protoplastos localizados en la interfase entre la Solución E y la Solución D se recogen con pipeta y se diluyen mediante adición de 2 vol. de la Solución F y se centrifugan de nuevo a 2.500 r.p.m. durante 5 min. El gránulo de protoplastos se lava dos veces con la Solución F y los protoplastos aislados se diluyen mediante adición de la Solución F para obtener 1-2 x 10^{7} células/ml. Para la transformación se utilizan 100 \mul de protoplastos.

10 \mug de ADN preparados por gradiente de densidad CsCl (Maniatis y col., 1982, supra) se añaden a los protoplastos y se dejan a temperatura ambiente durante 20 min. Luego se añaden 200 \mul de la Solución G y se dejan a temperatura ambiente durante 20 min. Se añaden entonces 3 vol. de sorbitol 1,2 M y el agregado de protoplastos-ADN se centrifuga a 2.500 r.p.m. durante 10 min. El gránulo se vuelve a suspender mediante adición de 300 \mul de sorbitol 1,2 M y se coloca sobre 3 placas selectivas (100 \mul cada una) que contienen 50 \mug/ml de fleomicina en el tubo inclinado de agar LCS. Las placas se incuban a 26ºC hasta que aparecen los transformantes.

Los transformantes pueden entonces ser aislados y sometidos a prueba en cuanto a su capacidad de producción de penicilina mediante fermentación en matraces de agitación.

C) Fermentación de P. chrysogenum

Las esporas liofilizadas de la cepa B10 ó P8 (Panlabs) de Penicillium chrysogenum fueron inoculadas en tubos inclinados de agar LCS de 10 ml después de su suspensión en agua destilada que contenía Tween®-80 0,1% (v/v). Después de incubación a 25ºC durante 10 días, las esporas de la superficie de cada tubo inclinado se suspendieron en 10 ml de Tween®-80 0,1% y una parte de 5 ml de esta suspensión se utilizó para inocular 50 ml de Medio de Semillas P-1 en matraces Erlenmeyer de 300 ml. Los cultivos de semillas se incubaron a 25ºC en un agitador rotatorio a 290 r.p.m. A las 48 horas, se utilizaron partes alícuotas de 2 ml del cultivo de semillas para la inoculación del medio de fermentación P-2, 35 ml en matraces Erlenmeyer de 300 ml (aceite de tocino sustituido por aceite de oliva). Los cultivos se incubaron a 25ºC a 290 r.p.m. hasta su cosecha.

D) Cosecha, extracción y precipitación

Las células procedentes de un cultivo de 3 días de P. chrysogenum se aislaron mediante filtración y se lavaron rápidamente con 5 volúmenes de cloruro de sodio al 0,9%. Las células se congelaron en nitrógeno líquido y se homogeneizaron en un mortero. La enzima se extrajo mediante suspensión en la Solución A. Los residuos celulares se eliminaron por centrifugación. El extracto se llevó a una saturación del 50% de sulfato de amonio y el precipitado se eliminó por centrifugación. Entonces, se pudo precipitar la enzima mediante adición de sulfato de amonio a una saturación del 70%. Después de la centrifugación, el gránulo se disolvió en la Solución C.

E) Cromatografía en columna Phenyl-Sepharose® CL 4B

Se aplicaron 2.280 mg de proteína (95 ml) (procedente de la sección anterior) a una columna Phenyl-Sepharose CL 4B (150 ml), equilibrada en el Tampón A, velocidad de flujo: 60 ml por hora. Se lavó la columna con 500 ml del tampón A, seguido de un gradiente desde el 100% de Tampón B hasta el 100% de Tampón C, volumen total de 1.800 ml. Se recogieron fracciones de 8 ml.

Todas las fracciones fueron analizadas en cuanto a la actividad de la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa y a la actividad de acetilcoenzima A-sintetasa. La actividad de fenoxiacetil-coenzima A sintetasa se eluyó entre las fracciones Nº 115-277, mostrando un pico de actividad en la fracción Nº 175. La actividad de acetilcoenzima A-sintetasa se eluyó entre las fracciones Nº 108-157, mostrando un pico de actividad en la fracción Nº 118.

F) Cromatografía en columna Cibacron Blue

Se reunieron las fracciones Nº 143-225 procedentes de la cromatografía en Phenyl-Sepharosa y la proteína se precipitó mediante adición de sulfato de amonio a una saturación del 65%. El precipitado se volvió a suspender en 10 ml de Tampón C y se desaló en una columna PD10. Volumen final de la muestra: 16 ml.

La muestra se aplicó a una columna llena de 20 ml de Cibacron Blue equilibrada con el Tampón C. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna del Tampón C y se eluyó con un gradiente de KCl (0-0,25 M KCl) a una velocidad de flujo de 25 ml por hora. Se recogió el eluato como fracciones de 8,3 ml. La actividad fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa se eluyó entre las fracciones Nº 36 y Nº 65 con un máximo en la fracción Nº 45.

G) Filtración en gel S-200 (súper fino)

Las fracciones Nº 36-56 procedentes de la cromatografía en Cibacron Blue se reunieron y concentraron por ultrafiltración (separación 10.000), se desalaron en una columna PD10 de Tampón D y se aplicaron 7 mg de proteína (3,3 ml) a una columna Sephacryl S-200 (181 ml) equilibrada con el mismo tampón. La columna se eluyó con el Tampón D (velocidad de flujo de 10 ml por hora) y se recogieron y sometieron a prueba partes alícuotas de 1 ml. La fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa se eluyó en las fracciones 72 a 118, mostrando un pico de actividad en la fracción 87.

H) Cromatoenfoque PBE^{TM} 94

Las fracciones Nº 79-107 se reunieron, se concentraron por ultrafiltración (separación de 10.000) y desalaron en una columna PD10 mediante la utilización del Tampón E. Volumen final de la muestra: 3,0 ml.

La muestra se aplicó a una columna PBE^{TM} 94 de 20 ml equilibrada en el Tampón E y la columna se eluyó con el Tampón E a un flujo de 30 ml por hora. Se recogieron fracciones de 1,5 ml. La actividad fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa se eluyó en las fracciones Nº 11-40, obteniéndose la máxima actividad en la fracción Nº 17.

I) Cromatografía en columna Sepharose® S FF

La proteína (149 mg) en una parte alícuota procedente de las fracciones reunidas Nº 143-225 procedentes de la cromatografía Phenyl-Sepharose (ver más arriba) se precipitó mediante adición de sulfato de amonio a una saturación del 65%. El precipitado se volvió a suspender en el Tampón F y se desaló a través de la columna PD10. Volumen final de la muestra: 28 ml.

La muestra se aplicó a una columna de 50 ml Sepharose S FF equilibrada en el Tampón F. Después de la aplicación de la muestra, se lavó la columna con 150 ml del Tampón F y se eluyó con un gradiente de KCl (0-0,3 M KCl). Se utilizó en todas las etapas una velocidad de flujo de 50 ml por hora y una fracción de 5 ml de tamaño. La actividad fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa se eluyó entre las fracciones 45 y 120 con un máximo en la fracción Nº 48, mientras que el mayor pico de proteína apareció en la fracción Nº 16.

J) Ensayo directo para la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa y la fenilacetil-coenzima A-sintetasa

La reacción empezó mediante adición de 100 \mul de una solución enzimática a la Solución B que contenía ácido fenoxiacético (o ácido fenilacético) y CoASH. Después de incubación durante 30 minutos a 25ºC, se interrumpió la reacción por adición de 240 \mul de ácido trifluoroacético al 0,5%. El precipitado formado fue eliminado por centrifugación y la cantidad de éster de ácido fenoxiacético coenzima A (o éster de ácido fenilacético coenzima A) formado fue analizada por HPLC.

Detección de éster de ácido fenoxiacético coenzima A o éster de ácido fenilacético coenzima A por HPLC:

Columna:

Supelcosil RP C-18 DB con Supelguard

Detección:

Detección UV a 260 nm

Disolvente A:

acetonitrilo 15% (v/v) en 25 mM de tampón fosfato de sodio, pH 6,5

Flujo:

1 ml/min

Tiempo de retención para el éster de ácido fenoxiacético coenzima A: 9,7 minutos y 9,0 minutos para el éster de ácido fenilacético coenzima A.

El éster de ácido fenoxiacético coenzima A y el éster de fenilacetil-coenzima A fueron cuantificados en relación a un estándar.

K) Ensayo directo para la adipoil-coenzima A-sintetasa

La reacción empezó por adición de 1 volumen de enzima a 1,4 volúmenes de Solución B que contenía ácido adípico, ajustada a un pH 8,5. La mezcla típica de incubación consistía en 250 \mul de enzima y 350 \mul de Solución B. La incubación se realizó a 30ºC. Las muestras se retiraron a intervalos regulares de tiempo de la mezcla de incubación y se mezclaron con una parte igual de ácido trifluoroacético al 0,5%. El precipitado formado se eliminó por centrifugación. La cantidad de éster adipoilo-coenzima A formado fue analizada por HPLC.

Detección de éster de adipoil-coenzima A por HPLC:

Columna:

Supelcosil RP C-18-DB

Detección:

Detección UV a 257 nm

Eluyente:

Acetonitrilo al 5% en tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 5,6

Flujo:

1 ml/min.

Tiempo de retención para el éster de adipoil-coenzima A: 11,4 minutos.

Se utilizó como referencia éster de adipoil-coenzima A.

L) Ensayo directo para la hexanoil-coenzima A-sintetasa

La reacción empezó por adición de 1 volumen de enzima a 1,4 volúmenes de Solución B que contenía ácido hexanoico, ajustada a un pH 8,5. La mezcla típica de incubación consistía en 250 \mul de enzima y 350 \mul de Solución B. La incubación se realizó a 30ºC. Las muestras se retiraron a intervalos regulares de tiempo de la mezcla de incubación y se mezclaron con una parte igual de ácido trifluoroacético al 0,5%. El precipitado formado se eliminó por centrifugación. La cantidad de éster hexanoil-coenzima A formado fue analizada por HPLC.

Detección de éster de hexanoil-coenzima A por HPLC:

Columna:

Supelcosil RP C-18-DB

Detección:

Detección UV a 257 nm

Eluyente:

Acetonitrilo al 15% en tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5

Flujo:

1 ml/min

Tiempo de retención para el éster hexanoil-coenzima A: 20,4 minutos.

M) Ensayo directo para la acetil-coenzima A-sintetasa

La Solución A de sustrato se mezcló y el pH se ajustó a 8,0 con KOH 4 M. Se añadieron 40 \mul de sal sódica de ácido acético-1-^{14}C (41,8 mCi/mmol, 1,0 mCi/ml) y la mezcla se equilibró a 35ºC.

\newpage

Ensayo: 25 \mul de enzima y 35 \mul de Solución A de sustrato se mezclaron e incubaron a 35ºC durante 30 minutos. La reacción se interrumpió por adición de 60 \mul de ácido trifluoroacético al 0,5%. Todo precipitado formado fue eliminado por centrifugación y la cantidad de éster acetil-coenzima A formado fue analizada por HPLC equipado con un detector de radioactividad. Los compuestos no-radioactivos se detectaron por detección UV a 210 nm colocada en serie con el detector Radiomatic.

Detección del éster de acetil-coenzima A por HPLC:

Columna:

Columna Supelcosil RP C-18 DB con Supelguard

Detección:

Los compuestos radioactivos fueron detectados utilizando un detector de radioactividad Flow-one/Beta serie 100 (Radiomatic) provisto de una célula de flujo de 250 \mul de silicato de ytrio.

Detección UV a 210 nm

Disolvente B:

Acetonitrilo al 5% (v/v) en tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5

Flujo:

1 ml/min.

Tiempo de retención para el éster acetil-coenzima A: 6,9 minutos.

Se utilizó como estándar acetilcoenzima A (Sigma) así como incubación de la mezcla A de sustrato con acetilcoenzima A-sintetasa (Sigma) seguida de análisis por HPLC del ^{14}C-acetil-coenzima A formado.

N) Detección de penicilina V y de penicilina G por HPLC

Después de la incubación se colocó el frasco sobre hielo durante 10 minutos. Después de centrifugación, se analizó por HPLC el sobrenadante en cuanto a penicilina V o penicilina G utilizando las siguientes condiciones:

Columna:

Columna Supelcosil LC C-18 DB (250 x 4,6 mm) con Supelguard

Detección:

Detección UV a 215 nm

Disolvente:

Disolvente H

Flujo:

1 ml/min

Volumen de inyección:

10 \mul

El tiempo de retención (RT) para la penicilina V fue de 13,3 minutos y de 8,7 minutos para la penicilina G.

O) Preparación de la muestra para la determinación por HPLC de ACV e IPNS

Se extrajo una muestra de 2 ml del matraz agitador y se enfrió rápidamente a 0-4ºC, se diluyó 25 veces con fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5 y se ultrafiltró (separación de 10.000). Se añadió al filtrado ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 5 mM y las muestras fueron analizadas por HPLC.

Columna:

Columna Supelcosil LC-18 DB (250 x 4,6 mm) con Supelguard

Detección:

Detección UV a 210 nm

Disolvente:

Disolvente I

Flujo:

2 ml/min

Temperatura:

35ºC

Volumen de inyección:

10 \mul

Tiempos de retención (RT) para la isopenicilina N y ACV: 5,7 y 17 minutos, respectivamente.

P) Extracción de acilcoenzima A de P. chrysogenum

Se extrajeron compuestos de acilcoenzima A procedentes de P. chrysogenum según el método de Barbera E. Corkey y Jude T. Deeney "Acyl CoA regulation of metabolism and signal transduction" Progress in clinical and Biological Research, 321, pp. 217-232, 1990.

Se cultivó P. chrysogenum (cepa B10 o cepa P8) en matraces agitadores tal como se describe en la sección "A) Fermentación de P. chrysogenum". Después de 4 días de cultivo en medio P-2 (pH 6,1), las células se enfriaron rápidamente en un baño de sal-hielo y se centrifugaron durante 30 segundos a 22.000 g_{av} y el gránulo se enfrió en nitrógeno líquido en un espacio de 3 minutos después de cosechar las células. Las células se descongelaron después de la adición de dos volúmenes de ácido tricloroacético 0,6 N. Después de la sonicación durante 30 segundos, los extractos celulares se aislaron por centrifugación (12.000 g_{av} durante 30 segundos). El ácido tricloroacético fue eliminado por extracción con dietil éter hasta que el pH en la fase acuosa fuera 6. La fase acuosa (que contiene los compuestos acilcoenzima A) se liofilizó y la muestra se disolvió finalmente en el tampón fosfato de sodio 25 mM de pH 6,5 y se analizó por HPLC bajo las condiciones expuestas en "Detección de ácido fenoxiacético coenzima A".

Q) Marcado de los metabolitos de ácido fenoxiacético en P. chrysogenum

Se cultivó P. chrysogenum (B10 ó P8) en matraces agitadores tal como se describe en la sección "Fermentación del P. chrysogenum". A los 4 días de cultivo en medio P-2 (pH 6,1) se trasladaron 10 ml de células a un matraz Erlenmeyer de 50 ml que contenía 250 \mul de ácido [1-^{14}C]-fenoxiacético (72 \muCi/ml, 9,7 \muCi/\mumol). Se incubó entonces el matraz a 26ºC con agitación.

Después de 1, 15, 30, 60, 120, 240 y 360 minutos se eliminó 1 ml de células, se enfriaron inmediatamente a 0ºC y se centrifugaron durante 1 minuto a 22.000 g_{av}. El gránulo se suspendió en 500 \mul de ácido fosfórico al 5% y 500 \mul de metanol y la mezcla fue sometida a sonicación durante 1 minuto. Después de centrifugación, el sobrenadante se analizó por HPLC utilizando un detector de radioactividad para identificar los metabolitos marcados.

Condiciones de HPLC:

Columna:

Columna Supelcosil LC-18 DB (250 x 4,6 mm) con Supelguard

Detección:

Radiomatic A-140 con célula de flujo de silicato de ytrio

Disolvente 1:

Fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5

Disolvente 2:

Acetonitrilo.

Gradiente

	Tiempo (min)	Disolvente 1 (%)	Disolvente 2 (%)
	0	100	0
	40	70	30
	45	70	30
	46	100	0
	60	100	0

Flujo: 1 ml/min.

Los únicos máximos que aparecieron en el cromatograma correspondían al ácido fenoxiacético (RT: 14,5 min), al ácido p-hidroxifenoxiacético (RT: 8,4 min) y a la penicilina V (RT: 34 min). Los máximos para el ácido p-hidroxifenoxiacético y la penicilina V fueron solamente detectables después de incubación durante 60 minutos.

Ejemplos Ejemplo 1 Actividad ligasa en una cepa de alto y bajo rendimiento de P. chrysogenum

Los rendimientos de penicilina cuando se fermenta una cepa P8 de P. chrysogenum se consideran, en general, entre bajos a intermedios, mientras que la cepa B10 de P. chrysogenum se considera una cepa de gran rendimiento.

Las cepas de P. chrysogenum (B10 y P8) se fermentaron tal como se describe en la sección "Fermentación de P. chrysogenum". Se recogieron las células y la fenoxiacetilcoenzima A-sintetasa se extrajo tal como se describe en la sección "B) Cosecha, extracción y precipitación", y la actividad de la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa (ligasa) en los dos extractos se determinó tal como se describe en la sección "Ensayo directo para la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa y fenilacetil-coenzima A-sintetasa".

Los resultados de las determinaciones de actividad de la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa se muestran en la tabla siguiente.

TABLA 1

1

Este ejemplo muestra claramente que la actividad de la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa tiene correlación con la producción de penicilina por la cepa.

Ejemplo 2 Acumulación de metabolitos intermedios

Se cultivó P. chrysogenum (B10) en matraces agitadores tal como se describe en la sección "A) Fermentación de P. chrysogenum". Después de su inoculación en el medio de fermentación P-2, las concentraciones de ACV e isopenicilina N en el caldo de cultivo fueron determinadas por HPLC cada día durante 7 días utilizando el procedimiento descrito anteriormente.

Las concentraciones de ACV e isopenicilina N en función del tiempo de fermentación se muestran en la Figura 1.

La figura demuestra claramente una acumulación de ACV y de isopenicilina N en el caldo de cultivo procedente de la fermentación de P. chrysogenum.

Ejemplo 3 Síntesis in vitro de penicilina V y penicilina G

Se incubó a 30ºC una mezcla de 25 \mul de ácido fenoxiacético* 60 mM, 25 \mul de ATP* 40 mM, 25 \mul de coenzima A* 6 mM y 10 \mul de ácido 6-aminopenicilánico* 6 mM en presencia de 10 \mul de fenoxiacetilcoenzima A- sintetasa (procedente de las fracciones reunidas Nº 11-40 procedentes de cromatografía por Cromatoenfoque PBE^{TM} 94 (descrita anteriormente)) y 10 \mul de acilcoenzima A: ácido 6-aminopenicilánico acil-transferasa (purificada a partir de P. chrysogenum tal como se describe en Emilio Alvarez y col., "Purification to Homogeneity and Characterization of Acyl-Coenzyme A: 6-Aminopenicillanic Acid Acyltransferase of Penicillium Chrysogenum" Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31(11), pp. 1675-1682, 1987.

(*: disuelto en Tris/HCl 50 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM y de ácido ascórbico 5 mM).

Para la síntesis in vitro de penicilina G, el ácido fenoxiacético se sustituyó por 25 \mul de ácido fenilacético 60 mM.

A los 15 minutos se interrumpió la incubación mediante adición de 100 \mul de metanol y el recipiente se colocó sobre hielo durante 10 minutos. Después de centrifugación, el sobrenadante se analizó por HPLC en cuanto a penicilina V o penicilina G tal como se describe anteriormente.

Identificación de penicilina V o penicilina G

La identificación de los máximos de penicilina V o de penicilina G en el cromatograma se comprobó mediante comparación con soluciones estándar de penicilina V y penicilina G, respectivamente, y mediante la comparación del espectro UV en los vértices y puntos de inflexión con el espectro obtenido a partir de los estándares de penicilina utilizando un detector HPLC por matriz de fotodiodo ABI 1000S tal como se describe anteriormente.

Cuando se omitió de la mezcla de reacción el ácido 6-aminopenicilánico, el ATP o el ácido fenoxiacético o el ácido fenilacético de la coenzima A no se sintetizó ninguna penicilina V o G.

Esto confirma que la enzima aislada muestra una actividad fenoxiacetil-coenzima A y una actividad de ácido fenilacético coenzima A (actividad ligasa).

Ejemplo 4 Síntesis in vitro de V-DCA

Se incuba a 30ºC una mezcla de 25 \mul de ácido fenoxiacético*, 25 \mul de ATP* 40 mM, 25 \mul de de coenzima A* 6 mM y 10 \mul de ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico* (7-ADCA) en presencia de 10 \mul de fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa (procedente de las fracciones reunidas Nº 11-40 procedentes de la cromatografía por Cromatoenfoque PBE^{TM} (descrita anteriormente)) y 10 \mul de aciltransferasa (purificada a partir de P. chrysogenum tal como describe Emilio Alvarez en "Purification to Homogeneity and Characterization of Acyl-Coenzyme A: 6-Aminopenicillanic Acid Acyltransferase of Penicillium Chrysogenum" Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31(11), pp. 1675-1682, 1987).

(*: disuelto en Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 10 mM y ácido ascórbico 5 mM).

A los 15 minutos se interrumpió la incubación mediante adición de 100 \mul de ácido trifluoroacético al 0,5% y el recipiente se colocó sobre hielo durante 10 minutos. Después de centrifugación, el sobrenadante se analizó por HPLC en cuanto a V-DCA bajo las condiciones cromatográficas descritas en la sección "Q: Marcado de los metabolitos del ácido fenoxiacético en P. chrysogenum". Tiempo de retención para V-DCA: 32 minutos.

Identificación de V-DCA

La identificación del máximo de V-DCA en el cromatograma se comprobó mediante comparación con soluciones estándar de V-DCA y mediante la comparación del espectro UV en los vértices máximos con el espectro a partir del estándar de V-DCA utilizando un Detector por Matriz de Fotodiodo Waters^{TM} 991.

Ejemplo 5 Determinación del peso molecular por filtración en gel

El peso molecular de la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa (ligasa) se determinó comparando el volumen de elución de filtración en gel descrita en la sección "Filtración en Gel S-200 (súper fina)" con los volúmenes de elución para los estándares aplicados obtenidos a partir del Kit de Calibración por filtración en gel (Ribonucleasa A (13.700 Dalton), Quimotripsinógeno A (25.000 Dalton), Ovalbumina (43.000 Dalton), Albúmina de suero bovino (67.000 Dalton) y Aldolasa (158.000 Dalton) en la misma columna, y utilizando las mismas condiciones que las que se dan anteriormente, la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa posee un peso molecular aparente de aproximadamente 50.000 Dalton.

Ejemplo 6 Punto isoeléctrico (pI)

El punto isoeléctrico (pI) se estimó cambiando el pH en el Tampón F (pH 7,5) utilizado en la cromatografía en columna Sepharose S FF (descrita anteriormente) por 8,5. Al mantener los demás parámetros constantes, se descubrió que la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa (ligasa) no estaba retenida en la columna durante la elución con el Tampón F (pH ajustado a 8,5).

Esto indica que el pH, cuando la carga neta de la enzima es cero (es decir, el punto isoeléctrico), se encuentra por encima de 7,25.

Ejemplo 7 Fenoxiacetil-coenzima A en los extractos

Para obtener una indicación de la presencia de actividad fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa (ligasa), se extrajo la acilcoenzima A tal como se describe en la sección "Extracción de la acilcoenzima A de P. chrysogenum" y se analizó por HPLC.

Aunque el límite de detección en el ensayo por HPLC se encontraba por debajo de 50 pmol, no se pudo identificar ningún ácido fenoxiacético coenzima A en los extractos celulares. La extracción de los metabolitos marcados de ácido fenoxiacético no mostró tampoco ningún ácido fenoxiacético coenzima A detectable en los extractos celulares tal como se describe en la sección "Marcado de los metabolitos del ácido fenoxiacético en P. chrysogenum".

Ejemplo 8 Caracterización

Se utilizó la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa (ligasa) procedente de la purificación (descrita anteriormente) para la caracterización posterior de la enzima.

Temperatura y pH óptimos

Se ensayó la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa tal como se describe en la sección "Ensayo directo para la fenoxicoenzima A-sintetasa" a temperaturas de 15 a 50ºC y variando los valores pH en el ensayo desde 6,5 hasta 9,0.

Como se muestra en la Figura 2, la actividad fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa alcanzó un máximo alrededor de un pH 8-8,5 y la Figura 3 muestra una temperatura óptima de alrededor 40ºC.

Especificidad del sustrato

Incubación la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa con ácido fenoxiacético, ácido fenilacético, ácido adípico, ácido hexanoico y ácido acético, bajo las condiciones de ensayo dadas en la sección "Ensayo directo para la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa", en la sección "Ensayo directo para la acetil-coenzima A-sintetasa", en la sección "Ensayo directo para la adipoil-coenzima A-sintetasa" y en la sección "Ensayo directo para la hexanoil-coenzima A-sintetasa", se obtuvieron los resultados siguientes:

	Sustrato	Actividad Relativa
	Ácido fenoxiacético	100
	Ácido fenilacético	80
	Ácido adípico	19
	Ácido hexanoico	320
	Ácido acético	< 1

Determinación de K_{M} aparente para el ATP, el ácido fenoxiacético, la coenzima A, y el MgCl_{2}

La actividad de fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa se sometió a ensayo tal como se describe en la sección "Ensayo directo para la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa", en presencia de concentraciones variables de los sustratos, una cada vez. Los valores aparentes de K_{M} (en las condiciones utilizadas en este ensayo) se determinaron a partir de los gráficos de Eadie-Hofstee, Hanes y Lineweaver-Burk, tal como se describe en Nicholas C. Price & Lewis Stenens "Fundamentals of Enzymology", Oxford University Press, p. 123, 1982. A partir de los gráficos, estaba claro que la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa cumplía con la cinética de Michaelis-Mentens con respecto a los sustratos individuales.

Los resultados se muestran en la Tabla 2 siguiente.

TABLA 2

2

K_{M} es la constante de Michaelis.

Inhibición de la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa a partir de ácido fenilacético y de ácido acético

La actividad de la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa se sometió a ensayo tal como se describe en la sección "Ensayo directo para la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa", en presencia de concentraciones variables de ácido fenilacético o bien de ácido acético y con varias concentraciones de ácido fenoxiacético.

Las concentraciones del ácido fenoxiacético utilizadas en el ensayo fueron de 1,7; 3,3; 6,6; 20 y 42 mM y la concentración de ácido fenilacético y de ácido acético fueron 0; 1,0; 5,0; 10 y 25 mM respectivamente.

Se demostró a partir de los gráficos de Lineweaver-Burk que el ácido fenilacético actuaba como inhibidor de oposición para la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa, mientras que el ácido acético no actuaba como inhibidor de oposición para la fenoxiacetil-coenzima A-sintetasa en las condiciones de ensayo utilizadas.

Claims (29)

1. Enzima que muestra actividad ligasa, que se obtiene a partir de Penicillium chrysogenum y que es al menos 10 veces más activa con el ácido fenoxiacético y con el ácido fenilacético que con el ácido acético, y caracterizada porque la enzima posee un peso molecular aparente de entre 40.000 y 60.000 Dalton tal como se determina por filtración en gel y una actividad óptima aparente en el rango de pH de 7,0-9,0, así como una actividad óptima aparente en el rango de temperaturas de 35-45ºC.

2. Enzima según la reivindicación 1, que es al menos 10 veces más activa con ácido adípico que con ácido acético.

3. Enzima según las reivindicaciones 1 ó 2, que es al menos 10 veces más activa con ácido hexanoico que con ácido acético.

4. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque posee un peso molecular aparente de aproximadamente 50.000 Dalton, tal como se determina por filtración en gel.

5. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque posee una actividad óptima aparente en el rango de pH de 8,0-8,5.

6. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque posee una actividad óptima aparente a una temperatura de aproximadamente 40ºC.

7. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque se obtiene a partir de un hongo filamentoso que pertenece al género Aspergillus, Penicillium o Cephalosporium, preferentemente obtenida a partir de una cepa de P. chrysogenum o C. acremonium, especialmente la cepa B10 de P. chrysogenum.

8. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque es inmunológicamente reactiva con un anticuerpo erigido contra dicha ligasa purificada procedente de la cepa B10 de P. chrysogenum.

9. Utilización de la enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un proceso fermentativo para la producción de un antibiótico \beta-lactámico.

10. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, pudiendo obtenerse dicha secuencia de ADN a partir de Penicillium chrysogenum.

11. Constructo de ADN según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha secuencia de ADN que codifica la enzima se obtiene a partir de un hongo filamentoso que pertenece al género Aspergillus, Penicillium o Cephalosporium, preferentemente obtenida a partir de una cepa de P. chrysogenum o C. acremonium, especialmente de la cepa B10 de P. chrysogenum.

12. Vector recombinante o vehículo de transformación que comprende el constructo de ADN según las reivindicaciones 10 u 11.

13. Vector o vehículo de transformación según la reivindicación 12, caracterizado porque dicha secuencia de ADN que codifica la enzima está enlazada operativamente a una secuencia de promotor y opcionalmente a una secuencia de terminador.

14. Vector o vehículo de transformación según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha secuencia de promotor procede de otro gen involucrado en la biosíntesis de \beta-lactamas en vez de del gen que codifica la ligasa.

15. Vector o vehículo de transformación según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque dicho constructo de ADN está enlazado operativamente a una secuencia que codifica una señal diana o una señal de secreción.

16. Célula huésped microbiana que comprende un constructo de ADN según las reivindicaciones 10 u 11 o un vector o vehículo de transformación según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.

17. Célula huésped microbiana según la reivindicación 16, que es una célula huésped bacteriana o fúngica.

18. Célula huésped microbiana según la reivindicación 17, caracterizada porque el huésped bacteriano es una bacteria gram-positiva, por ejemplo perteneciente al género Bacillus o Streptomyces o es una bacteria gram-negativa, por ejemplo perteneciente al género Escherichia, y el huésped fúngico es un hongo filamentoso, por ejemplo perteneciente al género Aspergillus, Cephalosporium o Penicillium.

\newpage

19. Proceso para la producción de un antibiótico \beta-lactámico que comprende:

i)

fermentación de un microorganismo capaz de producir dicho antibiótico \beta-lactámico que se transforma con un constructo de ADN según las reivindicaciones 10 u 11 o en un vector o vehículo de transformación según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, y

ii)

recuperación de dicho antibiótico \beta-lactámico.

20. Proceso según la reivindicación 19, caracterizado porque el microorganismo transformado procede del grupo que comprende Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus, Nocardia, Streptomyces, Bacillus, Cerospora, Microspora, otras Eubacterias, otros Actinomycetes y hongos filamentosos.

21. Proceso según la reivindicación 20, caracterizado porque el microorganismo transformado pertenece a una especie procedente del grupo que comprende Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus nidulans, Nocardia lactamdurans y Streptomyces clavuligerus.

22. Método para la producción de un antibiótico \beta-lactámico que comprende la incubación de un ácido carboxílico, coenzima A, una enzima que muestra actividad ligasa según las reivindicaciones 1 a 8, aciltransferasa y un intermedio \beta-lactámico.

23. Método según la reivindicación 22, caracterizado porque dicha actividad ligasa se establece mediante la utilización de enzimas que presentan actividad ligasa en la producción de \beta-lactamas.

24. Método según las reivindicaciones 22 ó 23, caracterizado porque el intermedio \beta-lactámico es isopenicilina N (IPN), ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), ácido 7-aminocefalosporánico (7-ACA), ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA) y ácido 7-aminodeacetilcefalosporánico, ácido 7-(L-\alpha-5-amino-5-carboxivaleramido)cefalosporánico (isocefalosporina C), adipoil-7-ADCA, o adipoil-7-ACA.

25. Método según la reivindicación 22, caracterizado porque el ácido carboxílico es ácido fenoxiacético, ácido fenilacético, ácido adípico, ácido hexanoico, ácido 2-tiofenacético o ácido 3-tiofenacético.

26. Método según las reivindicaciones 22 a 25, caracterizado porque la incubación tiene lugar en presencia de Mg^{2+} y ATP.

27. Método según las reivindicaciones 22 a 26, caracterizado porque la incubación tiene lugar en presencia de un agente reductor, como ditiotreitol (DTT), mercaptoetanol, ácido ascórbico o glutatión.

28. Método según las reivindicaciones 22 a 27, caracterizado porque la incubación tiene lugar a una temperatura entre 10ºC y 60ºC, preferentemente entre aproximadamente 15ºC y 50ºC, especialmente entre 20ºC y 45ºC.

29. Método según las reivindicaciones 22 a 28, caracterizado porque la incubación tiene lugar a un pH entre 5,5 y 9, preferentemente a un pH de aproximadamente 8.