DE60318065T2

DE60318065T2 - Fcyriia-transgenes tiermodell für autoimmunkrankheit

Info

Publication number: DE60318065T2
Application number: DE60318065T
Authority: DE
Inventors: Phillip Mark Williamstown HOGARTH; Patricia Lesley St Kilda MOTTRAM; Caroline Tan Heidelberg SARDJONO
Original assignee: Trillium Therapeutics ULC
Current assignee: Trillium Therapeutics ULC
Priority date: 2002-06-07
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2008-11-20
Anticipated expiration: 2023-06-07
Also published as: NZ536963A; JP2005528918A; AU2003233246A1; US20050177876A1; EP1532250A4; CA2488775C; EP1532250B1; AU2003233246B2; CA2488775A1; ATE380869T1; WO2003104459A1; EP1532250A1; DE60318065D1; US7351875B2

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die aberrante Immunaktivität und Immunkomplex-assoziierte Entzündung verringern können. Es werden Verfahren zur Identifizierung des Modus der Entwicklung einer Autoimmunerkrankung und zur Identifizierung von Verbindungen, welche diesen und damit verbundene Prozesse, welche zu der Erkrankung führen, verbessern, und nichtmenschliche transgene Lebewesenmodelle für Autoimmunerkrankungen, insbesondere Arthritis, diskutiert.
Hintergrund der Erfindung
Bekanntermaßen spielen Rezeptoren für die Fc-Domäne von IgG (FcγRs) neben anderen Faktoren eine Rolle bei der Regulation des Immunsystems. Derzeit werden drei Klassen von FcγRs auf den Zellen des Immunsystems unterschieden: der Rezeptor mit hoher Affinität FcγRI (CD64), welcher monomeres IgG binden kann; die Rezeptoren FcγRII (CD32) und FeγRIII (CD16) mit niedriger Affinität, welche bevorzugt mit komplexiertem IgG interagieren. Obwohl diese Rezeptoren überlappende Bindungsmuster für IgG-Unterklassen zeigen, variieren sie in ihren zellulären Effektorfunktionen. FcγRI, FeγRIIa und FcγRIIIa sind aktivierende Rezeptoren, die durch die Anwesenheit eines Immunorezeptor Tyrosin-basierten Aktivierungsmotivs (HAM), entweder in der cytoplasmatischen Domäne des Rezeptors (FcγRIIa) oder assoziiert mit dem Rezeptor als Hilfs-Signalübertragungsuntereinheit (γ- und/oder β-Ketten, assoziiert mit FcγRI und FcγRIIIa) gekennzeichnet sind. Im Gegensatz dazu ist FcγRIIb ein inhibitorischer Rezeptor, welcher ein Immunorezeptor Tyrosin-basiertes inhibitorisches Motiv (ITIM) in seiner cytoplasmatischen Domäne enthält. Eine bemerkenswerte Ausnahme zu dieser Dichotomie stellt FcγRIIIb dar; dieser Rezeptor ist mit dem äußeren Blatt („leaflet") der Plasmamembran durch einen Glycosyl-Phosphatidylinositiol(GPI)-Anker verknüpft und enthält keine ITAMs oder ITIMs und ist auch nicht mit diesen verbunden. Derzeit ist kein Homologes für FcγRIIa oder FcγRIIIb in Mäusen beschrieben.
Während FcR:Ig-Interaktionen wichtige Effektorsysteme bei der Immunität darstellen, ist ihre Rolle bei Autoimmunerkrankungen unklar. Bekanntermaßen exprimieren im Menschen die bedeutendsten inflammatorischen Zellen – Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile und Mastzellen – FcR-Rezeptoren, einschließlich FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb und FcγRIIIa oder FcγRIIIb. In WO95/28959 wurden Fc-Rezeptoren untersucht, indem nichtmenschliche Wirbeltiere erzeugt wurden, die nicht imstande waren, einen funktionellen Fc-Rezeptor zu exprimieren, welcher optional ein Protein exprimieren kann, welches eine Domäne eines humanen Fc-Rezeptors umfasst. In Kwack et al. (Immunology Letters, 44, 1995, 139–143) wurden Interaktionen zwischen T-Zellen und FcγRa auf T-Zellen untersucht. In WO96/08512 sind Polypeptide mit Fc-Bindungsfähigkeit offenbart.
FcγRIIa kommt nur bei Menschen und höheren Primaten vor, so dass kein Äquivalent in Mäusen oder anderen Nagetieren auftritt. Der Rezeptor ist von besonderem Interesse aufgrund der Abhängigkeit anderer Fc-Rezeptoren von diesem Rezeptor bei ihrer Signaltransduktion und ihren zellaktivierenden Eigenschaften (Chuang et al. 2000). FcγRIIa kann in transgenen Mäusen mit dem gleichen Expressionsmuster wie bei Menschen exprimiert werden (Mckenzie et al. 1999, The Journal of Immunology, 162, 4311–4318). Somit kann humanes FcγRIIa angemessen mit intrazellulären Signalübertragungswegen in der Maus interagieren und in jeder Hinsicht normal erscheinen, obwohl Änderungen in der zwischenartlichen Regulation in Transgegen stets bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden sollten. Die Expression von humanem FcγRIIa in transgegen Mäusen zeigte, dass dieser Rezeptor einen Hauptfaktor bei der Zerstörung der Blutplättchen bei Immunthrombocytopenie darstellt (Mckenzie et al. 1999). Die Rolle von FcR-Rezeptoren bei der Induzierung von Zellaktivierung ist für In-vitro-Systeme bekannt, ihre Rolle bei Entzündung in vivo ist jedoch weniger verstanden und wurde kürzlich untersucht, wie hierin beschrieben.
Als Ergebnis der Verwendung von Gen-„Knock-Out"-Lebewesen gehen Wissenschaftler- und Medizinerkreise davon aus, dass der hauptsächliche Rezeptor, der in die Induktion von Entzündung in vivo verwickelt ist, FcγRIII (ebenso als CD16 bekannt) ist. Viele Studien in der Literatur weisen darauf hin, und dies bildete einen Teil der kürzlich erfolgten Beschreibungen von immunkomplexinduzierter Entzündung in Sachbüchern. Somit war es sehr überraschend, dass transgene Mäuse, welche den humanen FcγRIIa exprimieren, hoch empfindlich gegenüber immunkomplexinduzier ter Entzündung sind und ebenso spontan eine Entzündung in verschiedenen Organen und Geweben, die charakteristisch für eine Anzahl von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus (SLE), und induzierte Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise glomeruläre Basalmembran-Nephritis, sind, entwickeln. Des Weiteren sind Mäuse, die diese überraschenden Entzündungsempfindlichkeiten entwickeln, ebenso zum Testen von Arzneimitteln geeignet.
Jedoch liegen keine Studien vor, in denen die Rolle dieses FcR bei Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise SLE, Arthritis oder andere beliebige Immunkomplex-Störungen, untersucht wurde, beispielsweise die Rolle dieses Fc-Rezeptors bei immunkomplex- oder antikörperinduzierter Entzündung in Verbindung mit Autoimmunerkrankungen. Entzündung bei diesen Erkrankungen kann Vasculitis, Lupus nephritis und Arthritis umfassen. Entzündung kann ebenso bei Erkrankungen auftreten, die nicht notwendigerweise als Autoimmunerkrankung klassifiziert sind, wie beispielsweise bei infektiöser Arthritis, Nierenerkrankungen, wie beispielsweise gemischter Kryoglobulinämie, bakteriellen Infektionen, bei malignen Erkrankungen, bei gastrointestinalen Erkrankungen, Komplement-Defizienzen und bei einer Anzahl diverser Zustände.
Demgemäß besteht immer noch ein Bedarf an Bereitstellung von wirksamen Verfahren und Modellen für Autoimmunerkrankungen und Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche aberrante Immunaktivität, Entzündung und Krankheitsprozesse verringern können. Überraschend war die Beobachtung der erhöhten Sensitivität gegenüber kollageninduzierter Arthritis in transgenen Mäusen, deren genetische Ausstattung aus Genen von im übrigen genetisch resistenten Mäusen besteht, zusammen mit der Beobachtung einer spontanen Autoimmunerkrankung, einschließlich Arthritis. Noch überraschender war, dass bei weiterer Analyse der transgenen Lebewesen ein Auftreten von spontaner Autoimmunität und Entzündung in Geweben evident war. Eine Entzündung in den Nieren und Lungen trat in vielen, wenn auch nicht allen, Mäusen auf, und eine histologische Untersuchung der Gelenke zeigte Merkmale, die charakteristisch für rheumatoide Arthritis sind, d. h., Knochenzerstörung und Pannusbildung, oder Merkmale, die charakteristischer für Arthritis in Verbindung mit Erkrankungen, wie beispielsweise SLE, sind, wenn keine Pannusbildung vorliegt. Somit scheint es, dass die Anwesenheit des humanen FcγRIIa- Rezeptors in diesen Mäusen die Entwicklung sehr verschiedener entzündlicher Prozesse in verschiedenen Geweben ermöglicht, was zu verschiedenen klinischen Diagnosen führt.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screening einer Verbindung, die imstande ist, aberrante Immunaktivität zu unterdrücken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen einer zu screenenden Verbindung einem nichtmenschlichen transgenen Lebewesen, das modifiziert worden ist, um einen humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, und wobei das nichtmenschliche transgene Lebewesen, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, gegen kollageninduzierte Arthritis resistent ist; und
(b) Untersuchen des transgenen Lebewesens, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine aberrante Immunaktivität bei dem Lebewesen verringert, wobei die aberrante Immunaktivität eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung ist. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt den zusätzlichen Schritt:
(c) Untersuchen des transgenen Lebewesens, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine immunkomplexinduzierte Entzündung verringert.

Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screening einer Verbindung, die imstande ist, eine Autoimmunerkrankung zu unterdrücken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen einer zu screenenden Verbindung einem nichtmenschlichen transgenen Lebewesen, das modifiziert worden ist, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, und wobei das nichtmenschliche transgene Lebewesen, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, gegen kollageninduzierte Arthritis resistent ist, und
(b) Untersuchen des transgenen Lebewesens, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine aberrante Immunaktivität bei dem Lebewesen verringert, wobei die aberrante Immunaktivität eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung ist.

Das nichtmenschliche transgene Lebewesen ist resistent gegen kollageninduzierte Arthritis, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird. Hoek et al. (Science, 2000, 290, 1768–1771), Horn et al. (Clinical Immunology and Immunopathology, 62, 1992, 56–65) und Wooley et al. (J. Exp. Med., 154, 1981, 688–700) beschreiben gegen kollageninduzierte Arthritis resistente Mäuse. Bevorzugt ist das transgene Lebewesen eine transgene Maus, die von den Stämmen C57BL/6 und SJL abstammt, welche modifiziert wurde, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren. Die aberrante Immunaktivität ist eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung. Bevorzugt ist die Verbindung imstande, aberrante Immunaktivität in dem Lebewesen zu verringern, indem sie die Aktivität von FcγRIIa, welches in dem Lebewesen exprimiert wird, inhibiert. In Schritt (b) des Verfahrens kann die aberrante Immunaktivität bevorzugt anhand klinischer Symptome und/oder pathologischer Merkmale der Autoimmunerkrankung, wie beispielsweise Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE), untersucht werden. Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung eine Autoimmunerkrankung, bei der es sich nicht um Thrombocytopenie handelt. Bevorzugt kann die Autoimmunerkrankung systemischen Lupus erythematosus (SLE), Morbus Crohn, gemischte Kryoglobulinämie und andere Zustände, welche eine von Immunkomplexen hervorgerufene Pathologie beinhalten, umfassen. Bevorzugter ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, noch bevorzugter, kollageninduzierte Arthritis (CIA). Der Untersuchungsschritt (b) kann geeignete Assays zur Feststellung aberranter Immunaktivität, wie beispielsweise einen geeigneten Antikörper-Assay, umfassen. Weitere Assays beinhalten die Analyse der Cytokin-Expression durch Immunohistochemie, PCR oder ELISA in situ oder im Kreislauf, Immunfunktionstests, wie beispielsweise Antigen-Präsentation, biochemische Tests, wie beispielsweise Zellsignalübertragung.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screening einer Verbindung, die imstande ist, eine Immunerkrankung zu unterdrücken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen einer zu screenenden Verbindung einer nichtmenschlichen, den humanen FcγRIIa-Rezeptor exprimierenden Zelle, wobei die Zelle aus ei nem nichtmenschlichen transgenen Lebewesen stammt, das modifiziert worden ist, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, und wobei das nichtmenschliche transgene Lebewesen, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, gegen kollageninduzierte Arthritis resistent ist; und
(b) Untersuchen der Zelle, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung in der Zelle verringert.

Das nichtmenschliche transgene Lebewesen ist resistent gegen kollageninduzierte Arthritis, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird. Bevorzugt ist das transgene Lebewesen eine transgene Maus, die von den Stämmen C57BL/6 und SJL stammt, welche modifiziert wurde, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren. Die aberrante Immunaktivität ist eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung. Die Verbindung ist bevorzugt imstande, aberrante Immunaktivität in der Zelle durch Inhibierung der Aktivität des in der Zelle exprimierten FcγRIIa zu verringern. Der Untersuchungsschritt (b) kann geeignete Assays zum Feststellen aberranter Immunaktivität, wie beispielsweise geeignete Antikörper-Assays, beinhalten. Andere geeignete Assays umfassen die Analyse der Cytokin-Expression durch Immunohistochemie, PCR oder ELISA in situ oder im Kreislauf, Immunfunktionstests, wie beispielsweise Antigen-Präsentation, biochemische Tests, wie beispielsweise Zellsignalübertragung. Durch die Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung kann eine Verbindung identifiziert werden, welche aberrante Immunaktivität in einer Zelle oder einem Lebewesen verringert. Ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Autoimmunerkrankung in einem Individuum kann das Verabreichen einer effektiven Menge einer Verbindung, welche aberrante Immunaktivität in dem Individuum verringern kann, umfassen.
Bevorzugt kann die Verbindung aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung in einem Individuum verringern. Bevorzugt ist die Verbindung imstande, aberrante Immunaktivität in der Zelle durch Inhibierung der Aktivität des in dem Individuum exprimierten FcyRIIa zu verringern. Die in dem Verfahren eingesetzte Verbindung wird bevorzugt durch die erfindungsgemäßen Screeningverfahren identifiziert. Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung durch aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung verursacht. Die Autoimmunerkrankung ist bevorzugt Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE). Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, bevorzugter, kollageninduzierte Arthritis (CIA). Eine Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Autoimmunerkrankung kann eine effektive Menge einer Verbindung, welche eine aberrante Immunaktivität in einem Lebewesen verringern kann, und ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel, einen Hilfsstoff (Exzipienten) oder Träger umfassen.
Bevorzugt wird die Verbindung in der Zusammensetzung durch die erfindungsgemäßen Screeningverfahren identifiziert. Die Autoimmunerkrankung ist bevorzugt Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE). Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, bevorzugter, kollageninduzierte Arthritis (CIA). In den erfindungsgemäßen Verfahren wird ein nichtmenschliches transgenes Lebewesen, welches modifiziert wurde, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, eingesetzt, wobei das transgene Lebewesen, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptor modifiziert wird, gegen kollageninduzierte Arthritis resistent ist.
Das transgene Lebewesen ist bevorzugt ein Säugetier, wie beispielsweise, aber nicht ausschließlich, ein Nagetier, ein Hund, eine Katze, ein Schwein, ein Kaninchen oder ein nichtmenschlicher Primat. Bevorzugter ist das transgene Lebewesen eine Maus. Bevorzugter ist das transgene Lebewesen eine Maus, die von den Stämmen C57BL/6 und SJL stammt, welche zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wurde. Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung durch aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung verursacht. Die Autoimmunerkrankung ist bevorzugt Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE). Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, bevorzugter, kollageninduzierte Arthritis (CIA). Das hierin beschriebene nichtmenschliche transgene Lebewesen kann in einem Verfahren zur Identifizierung eines Moleküls, welches mit FcγRIIa-Ligandenbindung assoziiert ist, oder eines Moleküls, welches von FcγRIIa-Ligandenbindung abhängig ist, eingesetzt werden. Das nichtmenschliche transgene Lebewesen kann in einem Verfahren zur Identifizierung eines Moleküls, wie beispielsweise, aber nicht ausschließlich, eines Antagonisten oder Agonisten eines Liganden von FcγRIIa, eingesetzt werden.
Das nichtmenschliche transgene Lebewesenmodell für eine Autoimmunerkrankung kann durch ein Verfahren erzeugt werden, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, welches den humanen FcγRIIa-Rezeptor kodiert, in eine Zelle eines nichtmenschlichen Embryos;
(b) Überführen des Embryos in eine Leihmutter; und
(c) Untersuchen des resultierenden neugeborenen Lebewesens im Hinblick auf eine Anfälligkeit für (eine) Autoimmunerkrankung,

Das transgene Lebewesen ist bevorzugt eine Maus. Bevorzugter ist das transgene Lebewesen eine transgene Maus, die von den Stämmen C57BL/6 und SJL stammt, welche zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wurde. Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung durch aberrante Immunkomplexbildung, Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung verursacht. Die Autoimmunerkrankung ist bevorzugt Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE). Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, bevorzugter, kollageninduzierte Arthritis (CIA). Eine Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Autoimmunerkrankung kann durch ein Verfahren hergestellt werden, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Auswählen der Verbindung durch das zuvor beschriebene Verfahren; und
(b) Formulieren der Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, Hilfsstoff (Exzipienten) oder Träger zur Herstellung der Zusammensetzung.

Kurze Beschreibung der Figuren:
1A zeigt die Füße einer Maus mit typischer spontaner Arthritis nach über 30 Wochen. Zu den Merkmalen zählen Anschwellen, Rötung und Steifheit der Gelenke, im Vergleich zu Füßen einer normalen Maus, wie in 1B dargestellt.
2 zeigt das Hinterbein einer Maus mit spontaner Arthritis (2A) und das Hinterbein einer normalen Maus (2D). Histologische Anfärbung (H&E Schnitte, 400-fache Vergrößerung) der Kniegelenke der arthritischen Maus sind in 2B und 2C dargestellt, im Vergleich zu einem normalen Kniegelenk einer nicht-transgenen Maus entsprechenden Alters (2E), wobei Entzündung mit Synovium Hyperplasie und Infiltration durch Zellen in dem arthritischen Gelenk gezeigt werden (2B). In Mäusen mit spontaner Arthritis werden Pannusbildung und Knorpelzerstörung (in 29% der Mäuse nach 20–40 Wochen und 33% der Mäuse nach > 40 Wochen) mit inflammatorischer Infiltration des Knorpels sichtbar (2B). Interessanterweise zeigte bei den anderen Mäusen mit spontaner Arthritis die Histologie Synovitis mit weniger inflammatorischen Zellen und keine Pannusbildung, was eher für Arthritis in Verbindung mit einer Erkrankung, wie beispielsweise systemischem Lupus erythematosus, charakteristisch ist (2C). 2F zeigt das prozentuale kumulative Auftreten von spontaner Arthritis nach 20 und 40 Wochen.
3 zeigt, dass die Untersuchung der Organe von > 20 Wochen alten transgenen Mäusen Symptome von Autoimmunerkrankung ergab, wobei einige der Merkmale üblicherweise bei rheumatoider Arthritis oder dem humanen systemischen Lupus erythematosus (SLE) beobachtet werden (Edworthy 2001). Zu den Abnormalitäten zählten: Pneumonitis mit perivaskulärer Entzündung (3A im Vergleich zu normalen Lungen 3B) bei 60–100% der Mäuse (3C) und Glomerulopathie (3D im Vergleich zu einer normalen Niere, 3E) bei 40–67% der älteren Mäuse (3F).
4 zeigt Elektronenmikroskopie der Nieren von einer alten transgenen Maus an der Verbindung von uriniferösem Raum (us) und einer Kapillare (cap), bei der die unregelmäßige flockenartige Elektronendichte der inneren Basalmembran, die repräsentativ für Immunkomplexablagerung ist und identisch zu der ist, die in humanen Nieren von SLE-Patienten im Endstadium beobachtet wird, deutlich wird (4B). Intra-glomeruläre Immunkomplexablagerung in der Niere einer Maus mit Glomerulopathie wurde ebenso durch Fluorescein-konjugiertes Anti-Maus-IgG nachgewiesen (4C). Dieses Merkmal wurde nicht bei nicht-transgenen Mäusen gleichen Alters beobachtet (4D). Hohe Titer an antinuklearem Antikörper wurden in den Seren von 83% der transgenen Mäuse mit einem Alter > 20 Wochen nachgewiesen, wobei sich der Zellkern mit "homogenen Zellkernmustern" anfärbte (4E). Das gleiche Muster wurde mit einem Anti-Histon-Antikörper (huPIA3) beobachtet (4F), was darauf hinweist, dass wenigstens eine Komponente des antinuklearen Antikörpers, welcher in der transgenen Maus detektiert wurde, ein Anti-Histon war. Antinukleare Antikörper (ANA) mit diesem Färbungsmuster werden in 70–95% der SLE-Patienten gefunden und sind einer der Indikatoren für SLE (Edworthy 2001). Im Gegensatz zu den anderen Merkmalen von Autoimmunerkrankungen, wurde ANA ebenso in geringen Niveaus in transgenen Mäusen, die mit 12 Wochen untersucht wurden, und in gleichaltrigen nicht-transgenen Kontrollen nachgewiesen. Dies entspricht der Situation beim Menschen, wo bis zu 30% der Population Serum-ANA aufweisen können ohne Symptome einer Autoimmunerkrankung zu zeigen. Es wurden keine Antikörper für doppelsträngige DNA beobachtet (Daten nicht gezeigt). Es wurde keine Lungen- oder Nierenerkrankung in gleichaltrigen nicht-transgenen C57BL/6- oder (C57BL/6 × SJL)F₁-Mäusen beobachtet.
5 zeigt, dass DBA/1-Mäuse (H-2^q), die mit Kollagen Typ 11 (CII) immunisiert wurden, eine Arthritis entwickeln. Die Entwicklung der kollageninduzierten Arthritis (CIA) und Schwere der Erkrankung in FcγRIIa-transgenen Mäusen (CSBL/6 und SJL genetischer Hintergrund) wurde mit CIA-resistenten Hintergrundstämmen (C57BL/6 (H-2^b) und C57BL/6 × SJL F1 (H-2^b/s)) und mit anfälligen DBA/1 (H-2^q)-Mäusen verglichen. Die FcγRIIa-transgenen Mäuse entwickelten Arthritis, welche schneller einsetzte (bereits nach 20 Tagen) und schwerer verlief als in den anfälligen DBA/1-Mäusen. Die nicht-anfälligen Stämme entwickelten keine Arthritis. 5C: Die Kreise zeigen den CIA-Score in transgenen Mäusen; die Quadrate zeigen den Score in DBA/1-Mäusen; die Dreiecke zeigen C57BL/6-Mäuse. Die Histologie der Gelenke von FcγRIIa, DBA/1, C57BL/6 und (C57BL/6 × SJL)F₁-Mäusen, die an Tag 36 nach Induktion der Arthritis aussortiert wurden, bestätigten diese Diagnose.
FcγRIIa-transgene Mäuse zeigten massive synoviale Endzündung (5A) und einige Gelenkerosion, verursacht durch einwandernde inflammatorische Zellen, die normalen Gelenkknorpel ersetzen, und die Entwicklung eines Pannus im Gelenk (5B). Diese Läsionen wurden ebenso in DBA/1-Mäusen gefunden, nicht jedoch in den Gelenken der nicht-anfälligen Stämme, wie beispielsweise C57BL/6. Pannusbil dung, die bis zum Abbau der extrazellulären Matrix fortschreitet, ist ein typisches Merkmal von Gelenken bei Menschen mit rheumatoider Arthritis.
6 zeigt eine Grafik, welche die Häufigkeit von spontaner Arthritis in FcγRIIa-Mäusen zeigt. Das prozentuale Auftreten zu jedem Zeitpunkt ist grau dargestellt, und die prozentuale kumulative Prävalenz in Mäusen (n = 50) mit der Erkrankung ist schwarz dargestellt. Es sei darauf hingewiesen, dass dies eine sehr viel größere Gruppe an Mäusen darstellt als die, die in 2 analysiert wurde.
7 zeigt eine Grafik des Niveaus des Arthritis-Index über die Zeit für CIA in Mäusen (n = 4), die mit nur zwei Dosen VIB 153 (7,5 mg/Dosis an den Tagen 21 und 27) behandelt wurden, nicht behandelt wurden (n = 28) oder Mäusen (n = 15), die mit 4 Dosen VIB 153 (7,5 mg/Dosis an den Tagen 21, 24, 27, 30) behandelt wurden. CIA wurde durch intradermale Injektion einer Emulsion, gebildet durch Vereinigen von 2 mg/ml Hühner-Kollagen Typ II (Sigma, St. Luois, MO), gelöst in 10 mM Essigsäure in einem gleichen Volumen CFA, induziert. 100 μl der Emulsion wurden i. d. in die Schwanzbasis injiziert. 21 Tage später wurde die gleiche Dosis hergestellt und proximal an die erste Stelle verabreicht (Campbell et al. 1997).
8 zeigt das typische Anschwellen, die Rötung und die Steifheit der Knöchelgelenke in den Füßen einer transgenen Maus mit CIA (A) im Vergleich zu dem normalen Erscheinungsbild der Füße von (B) einer behandelten transgenen Maus (4 Dosen VIB 153, 7,5 mg/Dosis an den Tagen 21, 24, 27, 30) am Tag 32.
9 zeigt eine Grafik des Niveaus des Arthritis-Index für CIA in nichttransgenen DBA/1-Mäusen (n = 12), die mit VIB 153 (4 Dosen, 7,5 mg/Dosis an den Tagen 21, 24, 27, 30) behandelt wurden, oder in nicht behandelten Mäusen (n = 27); dies zeigt deutlich, dass VIB 153 bei der Behandlung von CIA in nicht-transgenen Mäusen nicht wirksam ist.
10 und 11 zeigen Grafiken der Niveaus von Arthritis (Index oder Score) für individuelle Mäuse, die nach Etablierung der Arthritis mit den folgenden Arzneimittelverbindungen: 6727, 6728, VIB197 und VIB 153 behandelt wurden (4 Dosen, 7,5 mg/Dosis an den Tagen 21, 24, 27, 30). Dies zeigte, dass die Arzneimittel wirksam bei der Behandlung etablierter Arthritis sind, wenn der Krankheitsindex gering ist.
12 und 13 zeigen Grafiken der Niveaus von Arthritis (Index oder Score) in Mäusen mit CIA, die mit den folgenden Arzneimittelverbindungen vor Ein setzen der Krankheit behandelt wurden: 6727, 6728, VIB197, VIB 153 (4 Dosen, 7,5 mg/Dosis an den Tagen 21, 24, 27, 30) oder nicht behandelt wurden (n = 6 Mäuse/Gruppe).
14 zeigt eine Grafik des Niveaus des Arthritis-Index in FcγRIIa-transgenen Mäusen mit CIA, die vor dem Einsetzen der Krankheit mit bekannten immunosuppressiven und anti-inflammatorischen Agenzien Anti-CD3 monoklonalem Antikörper oder Methotrexat behandelt wurden, im Vergleich zu Kontrollen (mit PBS behandelt).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung:
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screening einer Verbindung, die imstande ist, aberrante Immunaktivität zu unterdrücken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen einer zu screenenden Verbindung einem nichtmenschlichen transgenen Lebewesen, das modifiziert worden ist, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, und wobei das nichtmenschliche transgene Lebewesen, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, gegen kollageninduzierte Arthritis resistent ist; und
(b) Untersuchen des transgenen Lebewesens, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine aberrante Immunaktivität bei dem Lebewesen verringert, wobei die aberrante Immunaktivität eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung ist. Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den zusätzlichen Schritt:
(c) Untersuchen des transgenen Lebewesens, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine immunkomplexinduzierte Entzündung verringert.

In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Screening einer Verbindung, die imstande ist, eine Autoimmunerkrankung zu unterdrücken, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen einer zu screenenden Verbindung einem nichtmenschlichen transgenen Lebewesen, das modifiziert worden ist, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, und wobei das nichtmenschliche transgene Lebe wesen, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, resistent gegen kollageninduzierte Arthritis ist, und
(b) Untersuchen des transgenen Lebewesens, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine aberrante Immunaktivität bei dem Lebewesen verringert, wobei die aberrante Immunaktivität eine aberrante Immunkomplexbildung, eine aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung ist.

In der vorliegenden Beschreibung ist der Ausdruck "Autoimmunerkrankung" als eine heterogene Gruppe von Störungen zu verstehen, bei denen die Erkennung von Selbst-Antigenen durch Lymphozyten bei einer pathogenen Organschädigung eine Rolle spielt (beispielsweise siehe die Tabellen 22-1, 22-2 und 12-2 vom Edworthy (2001)). Antikörper und Immunkomplexe können ebenso bei Gewebeschädigung bei Krankheiten eine Rolle spielen, die nicht ausschließlich autoimmuner Natur sind. Der Ausdruck umfasst somit Krankheiten oder Zustände, die durch aberrante Immunaktivität verursacht werden. Der Ausdruck "aberrante Immunaktivität" bezieht sich auf abnormale Immunfunktion in einer Zelle, wie beispielsweise, aber nicht ausschließlich, aberrante Antikörper- oder Immunkomplexbildung, aberrante Antikörper- oder Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung. Bevorzugt beinhaltet die aberrante Immunaktivität erhöhte Immunkomplexbildung in einer Zelle im Vergleich zu normalen Zellen. Die aberrante Immunaktivität kann bevorzugt erhöhte Niveaus an Antikörpern oder Immunkomplexklärung in einer Zelle im Vergleich zu normalen Zellen beinhalten. Die Autoimmunerkrankung wird bevorzugt durch aberrante Immunkomplexbildung verursacht (siehe Edworthy, 2001).
Aberrante Immunkomplexbildung ist typischerweise gekennzeichnet durch die Anwesenheit löslicher Immunkomplexe, Bildung von Komplexen in situ und die Ablagerung von Immunkomplexen in Zielorganen. Die Autoimmunerkrankung kann bevorzugt durch aberrante Immunkomplexklärung verursacht sein. Aberrante Immunkomplexklärung ist typischerweise gekennzeichnet durch die Unfähigkeit von Phagocyten des reticuloendothelialen Systems, Immunkomplexe über FcR zu binden. Dieses kann auf Abnormalitäten in phagocytischen Zellen oder einen Mangel an phagocytischen Zellen, Aberrationen von FcR oder eine Überproduktion von Immunkomplexen aufgrund unkontrollierter Anti-Selbst-Antikörper-Produktion zurückzuführen sein.
Die Autoimmunerkrankung ist bevorzugt Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE). Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, bevorzugter, kollageninduzierte Arthritis (CIA). Andere Autoimmunerkrankungen oder inflammatorische Zustände, die mit Antikörper- oder Immunkomplexbildung assoziiert sind, sind in der Tabelle 12-2 von Edworthy (2001) aufgelistet.
Das nichtmenschliche transgene Lebewesen ist, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, resistent gegen kollageninduzierte Arthritis. Bevorzugt ist das transgene Lebewesen eine transgene Maus, die von den Stämmen C57BL/6 und SJL stammt, welche modifiziert wurde, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren. Die aberrante Immunaktivität ist eine aberrante Immunkomplexbildung und/oder aberrante Immunkomplexklärung. Bevorzugt ist die Verbindung imstande, aberrante Immunaktivität in dem Lebewesen durch Inhibierung der Aktivität des in dem Lebewesen exprimierten FcγRIIa zu verringern.
In Schritt (b) des Verfahrens kann die aberrante Immunaktivität bevorzugt anhand klinischer Symptome und/oder pathologischer Merkmale einer Autoimmunerkrankung, wie beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE), untersucht werden. Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung eine Immunerkrankung, bei der es sich nicht um Thrombocytopenie handelt. Bevorzugt kann die Autoimmunerkrankung systemischen Lupus erythematosus (SLE), Morbus Crohn, gemischte Kryoglobulinämie und andere Zustände mit einer Pathologie, die auf Immunkomplexe zurückzuführen ist, umfassen. Bevorzugter ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) und, am bevorzugtesten, kollageninduzierte Arthritis (CIA). Die klinischen Symptome einer Autoimmunerkrankung oder einer aberranten Immunaktivität können pathologische Zell- oder Gewebeindikatoren beinhalten, die bekanntermaßen mit der Autoimmunerkrankung assoziiert sind. Beispielsweise kann die Schwere einer Autoimmunerkrankung, wie beispielsweise Arthritis, durch das Niveau der Entzündung oder des Anschwellen des Gelenks eines Lebewesens festgestellt werden. Gewebeproben eines Lebewesens können hinsichtlich ihrer Schädigung, die charakteristisch für Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise Arthritis, sind, untersucht werden. Beispielsweise kann eine histologische Untersuchung von Gewebeschnitten durchgeführt werden, um eine Schädigung, wie beispielsweise Pannusbildung, Infiltration, Knorpel- und/oder Knochenschädigung oder -Erosion, zu identifizieren. Zu weiteren Indikatoren für Entzün dung oder Autoimmunerkrankungen zählen Leukozyten-Infiltration von Zielorganen, wie beispielsweise Lungen-, Pankreas-, Speicheldrüsen-, Darm-, Haut-, Muskel-, Hoden- und Augen-Läsionen. Intraglomeruläre Immunkomplexablagerung in Verbindung mit hohen Titern an antinuklearen Antikörpern wird durch Immunohistologie und Elektronenmikroskopie nachgewiesen. Antinukleare Antikörper, der rheumatoide Faktor und enzymspezifische Antikörper (z. B. Anti-Insulin) können in ELISA-Assays nachgewiesen werden.
Der Untersuchungsschritt (b) des Screeningverfahrens kann geeignete Assays zur Untersuchung aberranter Immunaktivität, wie beispielsweise einen geeigneten Antikörper-Assay, umfassen. Beispielsweise ist systemischer Lupus erythematosus (SLE) eine Autoimmunerkrankung, die durch die Entwicklung von antinuklearen Antikörpern (ANA), insbesondere gegen DNA, gekennzeichnet ist. Aus diesem Grund können antinukleare Antikörper eingesetzt werden, um das Niveau von ANAs in einem Lebewesen zu untersuchen, um auf SLE zu testen. Weitere Assays sind in der Tabelle 11-2 von Edworthy (2001) aufgelistet. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screening einer Verbindung, die imstande ist, eine Autoimmunerkrankung zu unterdrücken, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen einer zu screenenden Verbindung einer nichtmenschlichen, den humanen FcγRIIa-Rezeptor expimierenden Zelle, wobei die Zelle aus einem nichtmenschlichen transgenen Lebewesen stammt, das modifiziert worden ist, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, und wobei das nichtmenschliche transgene Lebewesen, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, resistent gegen kollageninduzierte Arthritis ist, und
(b) Untersuchen der Zelle, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung in der Zelle verringert.

Das nichtmenschliche transgene Lebewesen ist resistent gegen kollageninduzierte Arthritis, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa modifiziert wird. Bevorzugt ist das transgene Lebewesen eine transgene Maus und, bevorzugter, mit G57BL/6 und SJL genetischem Hintergrund, welche modifiziert wurde, um den hu manen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren. Die Maus ist in der Veröffentlichung von McKenzie et al. 1999, die in den Literaturhinweisen aufgeführt ist, charakterisiert.
Die aberrante Immunaktivität ist eine aberrante Immunkomplexbildung und/oder aberante Immunkomplexklärung. Die aberrante Immunaktivität kann in einer Zelle bevorzugt durch Untersuchen klinischer Symptome und/oder pathologischer Merkmale einer Autoimmunerkrankung, wie beispielsweise Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE), gemessen werden. Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung eine Autoimmunerkrankung, bei der es sich nicht um Thrombocytopenie handelt. Bevorzugt kann die Autoimmunerkrankung systemischen Lupus erythematosus (SLE), Morbus Crohn, gemischte Kryoglobulinämie und andere Zustände, die eine Pathologie aufgrund von Immunkomplexen zeigen, umfassen. Bevorzugter ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) und, am bevorzugtesten, kollageninduzierte Arthritis (CIA). Die klinischen Symptome einer Autoimmunerkrankung oder einer aberranten Immunaktivität können pathologische Zell- oder Gewebeindikatoren beinhalten, die bekanntermaßen mit der Autoimmunerkrankung assoziiert sind. Beispielsweise kann die Schwere einer Autoimmunerkrankung, wie beispielsweise Arthritis, durch das Niveau der Entzündung oder des Anschwellens eines Gelenks des Lebewesens festgestellt werden. Gewebeproben eines Lebewesens können auf Schädigungen, die charakteristisch für Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise Arthritis, sind, untersucht werden. Beispielsweise kann eine histologische Untersuchung von Gewebeschnitten durchgeführt werden, um eine Schädigung, beispielsweise Pannusbildung, Infiltration, Knorpel- und/oder Knochenschädigung oder – Erosion zu identifizieren. Andere Indikatoren entzündlicher Autoimmun- oder Bindegewebserkrankungen umfassen Leukozyten-Infiltration von Zielorganen, wie beispielsweise Lungen-, Pankreas-, Speicheldrüsen-, Darm-, Haut-, Muskel-, Hoden- und Augen-Läsionen. Intraglomeruläre Immunkomplexablagerung, die mit hohen Titern an antinuklearen Antikörpern assoziiert ist, wird durch Immunohistologie und Elektronenmikroskopie nachgewiesen. Antinukleare Antikörper, Anti-Kollagen-Antikörper und der Rheumatoid-Faktor können durch FACS- und ELISA-Assays nachgewiesen werden. Aberrante Cytokin-Sekretion (TNF-Alpha, IL1, in RA) kann durch ELISA, ELISPOT oder RNAse-Protection-Assays nachgewiesen werden. Der Untersuchungsschritt (b) kann geeignete Assays zum Feststellen aberranter Immunaktivität, wie beispielsweise einen geeigneten Antikörper-Assay, umfassen. Antinuk leare Antikörper, Anti-Kollagen-Antikörper und der Rheumatoid-Faktor können durch FACS- und ELISA-Assays nachgewiesen werden.
Die durch das erfindungsgemäße Screeningverfahren identifizierte Verbindung ist bevorzugt imstande, aberrante Immunaktivität in der Zelle durch Inhibierung der Aktivität des in der Zelle exprimierten FcγRIIa zu verändern. Die Verbindung kann ein Antagonist von FcyRIIa, wie beispielsweise ein Antikörper gegen FcγRIIa oder ein lösliches FcγRIIa-Proteinfragment, sein. Weitere geeignete Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren gescreent werden können, können natürlich vorkommende Verbindungen, wie beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Proteine und Nukleinsäuremoleküle, rekombinante Moleküle oder synthetische Agenzien, umfassen. Die Verbindung kann eine den Fc-Rezeptor modulierende Verbindung, wie beispielsweise in dem US-Patent 6,355,683 und WO 00/15214 beschrieben, sein. Die Verbindungen können ferner Antikörper, Peptide, nicht-natürliche Peptide, welche aus nicht-natürlichen Aminosäuren bestehen oder nicht-natürliche Bindungen aufweisen oder unter Anwendung nicht-natürlicher Syntheseverfahren synthetisiert wurden, oder kleine chemische Einheiten, welche anorganische oder organische Verbindungen beinhalten, oder Kombinationen davon umfassen.
Durch die erfindungsgemäßen Screeningverfahren kann eine Verbindung identifiziert werden, welche aberrante Immunaktivität in einer Zelle oder einem Lebewesen verringern kann. Derartige Verbindungen können als pharmazeutische Agenzien bei der Behandlung oder Vorbeugung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden. Des Weiteren können die durch die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen in Studien zur weiteren Erforschung der Autoimmunerkrankung eingesetzt werden. Ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Autoimmunerkrankung in einem Individuum kann das Verabreichen einer effektiven Menge einer Verbindung, die aberrante Immunaktivität in dem Individuum verringern kann, umfassen.
Bevorzugt kann die Verbindung aberrante Immunkomplexbildung und/der aberrante Immunkomplexklärung in einem Individuum verringern. Bevorzugt ist die Verbindung imstande, aberrante Immunaktivität in der Zelle durch Inhibierung der Aktivität des in dem Individuum exprimierten FcγRIIa zu reduzieren. Die in dem Verfahren eingesetzte Verbindung wird bevorzugt durch die erfindungsgemäßen Screeningverfahren identifiziert. Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung durch aberrante Immun komplexbildung und/oder aberrante Immunkomplexklärung verursacht. Die Autoimmunerkrankung ist bevorzugt Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE). Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, bevorzugter, kollageninduzierte Arthritis (CIA).
Der Ausdruck "effektive Menge" bezeichnet eine Konzentration wenigstens einer Verbindung, die ausreichend ist, um die Behandlung oder Vorbeugung einer Autoimmunerkrankung in einem Individuum bereitzustellen. Die effektive Menge einer Verbindung, die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, kann in Abhängigkeit von dem Individuum und dem Typ und des Niveaus der Autoimmunerkrankung variieren.
Das behandelte Individuum kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus Menschen, Schafen, Rindern, Pferden, Schweinen, Geflügel, Hunden und Katzen, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die einem Individuum verabreichte Verbindung ist bevorzugt als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert. Die Verbindung kann einem Menschen oder Lebewesen oral, rektal, parenteral (d. h., intravenös, intramuskulär, subkutan), intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, topisch (beispielsweise durch Pulver, Salben oder Tropfen), transdermal, bukkal oder als Mund- oder Nasenspray verabreicht werden. Bevorzugt wird die Verbindung durch Injektion in eine Gewebestelle einer Autoimmunerkrankung, wie beispielsweise ein Gelenk, verabreicht. Die injizierbaren Formulierungen können beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterien zurückhaltenden Filter oder durch Einarbeiten sterilisierender Agenzien in Form von sterilen Feststoffzusammensetzungen, welche in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor der Verwendung gelöst oder dispergiert werden, sterilisiert werden. Feste Dosierungsformen der Verbindungen zur oralen Verabreichung können Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate umfassen. In derartigen festen Dosierungsformen liegt die aktive Verbindung gemischt mit wenigstens einem inerten, pharmazeutisch akzeptablem Hilfsstoff (Exzipienten) oder Träger, wie beispielsweise Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder a) Füllstoffen oder Streckmitteln, wie beispielsweise Stärken, Lactose, Sucrose, Glucose, Mannitol und Kieselsäure, b) Bindemitteln, wie beispielsweise Carboxymethylzellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Sucrose und Acacia, c) Feuchtmitteln, wie beispielsweise Glycerol, d) Trennmitteln, wie beispielsweise Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Algininsäure, bestimmte Silikate und Natriumcarbonat, e) lösungsverzögernden Agen zien, wie beispielsweise Paraffin, f) Absorptionsbeschleunigern, wie beispielsweise quaternäre Ammoniumverbindungen, g) Benetzungsmitteln, wie beispielsweise Cetylalkohol und Glycerolmonostearat, h) Absorptionsmitteln, wie beispielsweise Kaolin und Bentonit-Ton und i) Gleitmitteln, wie beispielsweise Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglycole, Natriumlaurylsulfat, und Mischungen davon, vor. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen kann die Dosierungsform ebenso puffernde Agenzien umfassen. Es kann eine Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung einer Autoimmunerkrankung entwickelt werden, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge einer Verbindung, welche aberrante Immunaktivität in einem Lebewesen verringern kann, und ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel, einen Hilfsstoff oder Träger umfasst.
Bevorzugt wird die Verbindung in der Zusammensetzung durch die erfindungsgemäßen Screeningverfahren identifiziert. Die Autoimmunerkrankung ist bevorzugt Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE). Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, bevorzugter, kollageniduzierte Arthritis (CIA).
Die Zusammensetzungen können als Lösungen und Emulsionen formuliert sein. Geeignete Hilfsstoffe, wie beispielsweise Emulgatoren, grenzflächenaktive Stoffe, Stabilisatoren, Farbstoffe, Penetrationsverstärker und Antioxidationsmittel, können ebenso in den Zusammensetzungen vorliegen. Geeignete Träger, die der Zusammensetzung zugegeben werden können, können Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Polyethylenglycole, Gelatine, Lactose, Magnesiumstearat und Kieselsäure umfassen. Die Zusammensetzungen können sterile und nicht-sterile wässrige Lösungen umfassen. Die Zusammensetzungen liegen bevorzugt in löslicher Form vor, und die Verbindungen sind bevorzugt in einer sterilen gepufferten Salzlösung oder Wasser gelöst. Die Zusammensetzungen können ebenso als Suspensionen in wässrigen, nicht-wässrigen oder gemischten Medien formuliert sein. Wässrige Suspensionen können ferner Substanzen, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, und ebenso Stabilisatoren enthalten. Die Lösungen können ebenso Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive enthalten. Die Zusammensetzungen können weitere zusätzliche Komponenten, die mit der Aktivität der Verbindungen kompatibel sind, enthalten. Die Zusammensetzungen können als Schäume, einschließlich Emulsionen, Mikroemulsionen, Cremes und Gele, formuliert sein. Die Formulierungen der oben beschriebenen Zusammensetzungen sind einem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie geläufig.
Die Zusammensetzungen können in Form von festen Dosierungsformen, wie beispielsweise Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate, vorliegen, die mit Beschichtungen und Umhüllungen hergestellt sein können, wie beispielsweise enterischen Beschichtungen und anderen Beschichtungen, die auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierung bestens bekannt sind. Sie können optional opazifierende Agenzien enthalten und außerdem derart zusammengesetzt sein, dass sie den/die aktiven Inhaltsstoff(e) nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Magen-Darm-Trakts, optional in verzögerter Weise, freisetzen. Zu Beispielen für einbettende Zusammensetzungen, die verwendet werden können, zählen polymere Substanzen und Wachse.
Wenn erwünscht, können die Verbindungen für eine effektivere Verteilung in langsam freisetzende oder zielgerichtete Abgabesysteme, wie beispielsweise Polymermatrices, Liposomen und Mikrosphären, eingearbeitet sein. Die Verbindungen können ebenso in mikroeingekapselter Form, wenn zweckdienlich, mit einem oder mehreren der oben erwähnten Hilfsstoffe, vorliegen. Flüssige Dosierungsformen der Verbindungen zur oralen Verabreichung können pharmazeutisch akzeptable Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere umfassen. Zusätzlich zu den Verbindungen können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, die üblicherweise auf dem Gebiet verwendet werden, beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, solubilisierende Agenzien und Emulgatoren, beispielsweise Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Rizinus- und Sesamöle), Glycerol, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglycole und Fettsäureester von Sorbitan, und Mischungen davon enthalten.
Neben den inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen ferner Adjuvanzien, wie beispielsweise Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Agenzien, Süßungsmittel, Aromastoffe und Duftstoffe enthalten. Die Zusammensetzung kann in Dosierungsformen zur topischen Verabreichung der Verbindung, wie beispielsweise als Pulver, Spray, Salbe und Inhaliermittel, vorliegen. Die Verbindung kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und beliebigen erforderlichen Konservierungsstoffen, Puffern oder Treibmitteln, welche zur Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung erforderlich sein können, gemischt sein.
Ein nichtmenschliches transgenes Lebewesen, welches zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wurde, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, wird in der Erfindung eingesetzt, wobei das transgene Lebewesen, bevor es zur Expression des humanen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, gegen kollageninduzierte Arthritis resistent ist.
Das transgene Lebewesen ist bevorzugt eine Maus. Bevorzugter ist das transgene Lebewesen eine transgene Maus, die aus den Stämmen C57BL/6 und SJL stammt, welche modifiziert wurde, um den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren. Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung verursacht durch aberrante Immunkomplexbildung und/oder aberrante Immunkomplexklärung. Die Autoimmunerkrankung ist bevorzugt Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE). Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, bevorzugter, kollageninduzierte Arthritis (CIA). Das nichtmenschliche transgene Lebewesenmodell für eine Autoimmunerkrankung kann durch Verfahren erzeugt werden, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einführen eines Nukleinsäuremoleküls, welches den humanen FcγRIIa-Rezeptor kodiert, in eine Zelle eines nichtmenschlichen Embryos;
(b) Überführen des Embryos in eine Leihmutter; und
(c) Untersuchen der resultierenden neugeborenen Lebewesen im Hinblick auf eine Anfälligkeit für (eine) Autoimmunerkrankung,

Das transgene Lebewesen ist bevorzugt eine Maus. Bevorzugter ist das transgene Lebewesen eine transgene Maus, die von den Stämmen C57BL/6 und SJL stammt und modifiziert wurde, den humanen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren. Bevorzugt wird die Autoimmunerkrankung durch aberrante Immunkomplexbildung und/oder Immunkomplexklärung verursacht. Die Autoimmunerkrankung ist bevorzugt Arthritis oder systemischer Lupus erythematosus (SLE). Bevorzugt ist die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder, bevorzugter, kollageninduzierte Arthritis (CIA). Die Maus ist in der Veröffentlichung von McKenzie et al. 1999 charakterisiert.
In der vorliegenden Beschreibung ist der Ausdruck "umfassen" oder Variationen, wie beispielsweise "umfasst" oder "umfassend" derart zu verstehen, dass ein bestimmtes Element, eine Zahl oder ein Schritt oder eine Gruppe von Elementen, Zahlen oder Schritten einbezogen werden, jedoch ein anderes Element, eine andere Zahl oder ein anderer Schritt, oder Gruppen aus anderen Elementen, Zahlen oder Schritten nicht ausgeschlossen sind.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der nicht einschränkenden Figuren und Bespiele beschrieben.
Beispiel 1 – Verfahren zur Anwendung eines transgenen Hausmodells für eine Autoimmunerkrankung
a) Transgene Mäuse, welche den humanen IgG-Rezeptor FcγRIIa exprimieren
In den transgenen Hausmodellen der vorliegenden Erfindung wurden die folgenden Hausstämme verwendet: männliche, 8–12 Wochen alte DBA/1 (H-2^q), männliche oder weibliche, 8–15 Wochen alte C57BL76 (H-2^b) und (C57BL/6 × SJL) F₁ (H-2^b/s), und transgene Mäuse, welche das humane FcγRIIa-Transgen auf Blutplättchen, Neutrophilen und Markophagen mit physiologischen Niveaus exprimieren (wie von McKenzie et al. 1999 beschrieben). Transgene männliche oder weibliche 12–15 Wochen alte Mäuse wurden in kollageninduzierte Arthritis (CIA)-Experimenten verwendet, und > 25 Wochen alte Mäuse wurden für die Studien der spontanen Autoimmunerkrankung eingesetzt. Alle Mäuse wurden unter sauberen Bedingungen angezogen und gehalten und erhielten eine Standardemährung und Wasser ad libitum. Die Maus ist in der Veröffentlichung von McKenzie et al. 1999, die in den Literaturhinweisen aufgeführt ist, charakterisiert.
(b) Präparation von Kollagen Typ II
Freudsches Komplett-Adjuvanz (CFA) wurde durch Mischen von 100 mg hitzegetöteter M tuberculosls H37 Ra (Difco Laborstories, Detroit, MI), die in 20 ml Freudschem Inkomplett-Adjuvanz (Difco Laborstories, Detroit, MI) zermahlen worden waren, hergestellt. Es wurde durch Vereinigen von 2 mg/ml Hühner-Kollagen Typ II (Sigma, St Louis, MO), gelöst in 10 mM Essigsäure in einem gleichen Volumen CFA, eine Emulsion gebildet. 100 μl der Emulsion wurden i. d. in die Schwanzbasis injiziert.
Die gleiche Dosis wurde 21 Tage später nochmals hergestellt und proximal zu der ersten Stelle verabreicht (Campbell et al. 1997).
(c) Klinische Untersuchung von Arthritis
Die Mäuse wurden 2- bis 3-mal wöchentlich von Tag 14 an untersucht. Die Schwere der Arthritis wurde auf einer Skala von 0 bis 3 für jede Extremität bewertet, basierend auf der Schwellung, Rötung und Gelenkfunktion. Score 0 = normal, 1 = leichte Schwellung und Rötung, 2 = schwere Schwellung und Rötung, 3 = schwere Schwellung und Rötung begleitet von Gelenk-Dysfunktion. Der Score jeder Maus wurde für alle vier Gliedmaßen berechnet (maximaler Gesamtscore von 12 für jede Maus) (Campbell et al. 1997).
(d) Assay auf antinukleare Antikörper (ANAs)
ANA-Tests wurden an Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), die an einer Lab-Tek-8-Kammer-Platte (Nunc, Naperville, IL) anhafteten, über 5 Stunden bei 37°C durchgeführt. Die Zellen wurden mit 100%igem Aceton für 5 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und zweimal mit PBS/0,5% BSA gewaschen. Die Zellen wurden dann mit Mausserum oder aus Mäusen gewonnenem Anti-Histon-Antikörper (Antikörper HuPIA3; Zelllinienbezeichnung 410.9D6A3 (Cosgrove 1987)) in verschiedenen Verdünnungen für 30 Minuten auf Eis inkubiert; danach wurde mit Schaf-Anti-Maus-IgG (Fab'2-Fragment)-FITC (Silenus, Melbourne, Australien) für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubiert. Für die in 4E dargestellte Anfärbung wurde das Serum 1:1000 verdünnt; für 4F wurde der Anti-Histon-Antikörper in Ascites 1:500 verdünnt.
(e) Histopathologische Untersuchung
Am Ende der Experimente wurden die Mäuse aussortiert und die Organe ge wonnen. Nieren, Lungen und verschiedene andere Gewebe wurden mit 10% Formalin/PBS fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte (4–6 μm) wurden mit Hematoxylin und Eosin angefärbt. Um Immunkomplexablagerung nachzuweisen, wurden Nierenschnitte mit Schaf-Anti-Maus-IgG (Fab'2-Fragment)-FITC (Silenus, Melbourne, Australien) angefärbt.
Die Gelenkgewebe wurden vor der Paraffineinbettung mit einer Lösung, enthaltend 5% HCl, 3,5% Eisessig, 95% Ethanol und 12,5% Chloroform, entkalzifiziert. Die Entkalzifizierung wurde als vollständig betrachtet, wenn die Gelenke ausgebleicht und flexibel waren. Die Schnitte (4–6 μm) wurden mit Hematoxylin und Eosin angefärbt und hinsichtlich histologischer Veränderungen in Verbindung mit Arthritis (Pannusbildung, Infiltration, Knorpel- und Knochenschädigung) untersucht.
(f) Elektronenmikroskopische Untersuchung
Die Nierenproben wurden unter Verwendung von Rasierklingen in 1–2-mm-große Würfel geschnitten und dann durch Eintauchen in Fixiermittel, enthaltend 2–8% Paraformaldehyd, 2–5% Glutaraldehyd in 0,15 M Cacodylatpuffer bei pH 7,4, fixiert. Nach der Fixierung für mindestens 6 Stunden bei 4°C wurden die Gewebe in Cacodylatpuffer gespült und in 1% Osmiumtetroxid in 0,15 M Cacodylatpuffer, pH 7,4, für 2 Stunden bei Raumtemperatur nachfixiert. Die Proben wurden dann in destilliertem Wasser gewaschen und in 10% inkrementellen Konzentrationen von Aceton vor der Einbettung in Procure-Araldit-Harz dehydriert. Während des Dehydrierungsverfahrens wurden die Gewebe unter Verwendung einer Lösung von 2% Uranylacetat in 70% Aceton blockweise angefärbt. Auf einem Kryostaten wurden unter Verwendung von Glasmessern ultradünne Schnitte angefertigt und mit 5% Uranylacetat in wässriger Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend durch Reynolds-Bleicitrat für 10 Minuten angefärbt. Die ultradünnen Schnitte wurden auf einem Philips-300-Elektronenmikroskop bei 60 KV untersucht. Sämtliche Reagenzien wurden von ProSciTech, Australien, bezogen.
(g) Antikörpernachweis.
Die Serumniveaus an Gesamt-IgG und Anti-Kollagen-Typ-II-Antikörpern wurden durch einen ELISA unter Anwendung von Standardtechniken untersucht. Dabei wurden 96-Kammer-Serocluster-„U"-Vinylplatten (Costar, Cambridge, MA) über Nacht bei 4°C mit 50 μl/Kammer 50 μg/ml Kollagen Typ II in 10 mM Essigsäure beschichtet. Die Platten wurden mit 2% BSA in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Die Maus-Testseren wurden seriell verdünnt und jeder Kammer zugegeben. Der an die Platten gebundene Antikörper wurde dann durch sekundäres Schaf-Anti-Maus-IgG (Fab'2-Fragment)-HRP (Amersham LIFESCIENCE, Buckinghamshire, England) nachgewiesen und unter Verwendung von ABTS (Boehringer Mannheim, Rockville, MD) entwickelt. Die Absorption bei 405 nm wurde durch ein ELISA-Mikrolesegerät gemessen.
(h) Statistische Analyse
Die Daten, die als Mittelwert +/– SEM ausgedrückt sind, wurden unter Anwendung des Student-Tests verglichen.
Beispiel 2 – Ergebnisse aus einem Hausmodell für spontane Arthritis (SA)
Spontane Arthritis wurde bei 47% der FcγRIIa-transgenen Mäuse mit einem Alter von > 20 Wochen und 58% der Mäuse mit einem Alter von > 40 Wochen beobachtet; sie manifestierte sich durch Anschwellen und Rötung der Pfoten und Steifheit der Zehen, Knie und Knöchel (1A, im Vergleich zu der Kontrolle gleichen Alters, 1B). Eine histologische Untersuchung der Extremitäten bestätigte die Diagnose der Arthritis, dargestellt in 2B und 2C (im Vergleich zu normalen Extremitäten von gleichaltrigen nicht-transgenen Mäusen (2E)) und zeigte die Entzündung mit Synovium-Hyperplasie und Infiltration durch polymorphonukleare Zellen. In den meisten Fällen von spontaner Arthritis wurden Pannusbildung und Knorpelzerstörung beobachtet, begleitet von entzündlicher Infiltration des Knorpels (2B). Jedoch zeigte in ungefähr einem Drittel der Mäuse mit spontaner Arthritis die Histologie eine sub-aktute Synovitis, weniger inflammatorische Zellen und keine Pannusbildung (2C). 2F zeigt das prozentuale kumulative Auftreten von spontaner Arthritis nach 20 und 40 Wochen, wobei Pannusbildung bei 29% mit 20 Wochen und 33% mit > 40 Wochen auftritt.
Die Untersuchung der Organe aus diesen und anderen > 20 Wochen alten transgenen Mäusen zeigte Symptome einer Autoimmun-Bindegewebserkrankung mit einigen Merkmalen, die üblicherweise bei menschlichem systemischen Lupus erythematosus (SLE) beobachtet werden (Edworthy 2001). Zu den Abnormalitäten zählten Pneumonitis mit perivaskulärer Entzündung bei 60–100% der Mäuse (3A, 3C) und Glomerulopathie bei 40–67% (3D, F). Intraglomeruläre Immunkomplexablagerung in der letzteren Gruppe wurde durch Fluorescein-konjugiertes Anti-Maus-IgG nachgewiesen (4C); ein Merkmal, das in gleichaltrigen nichttransgenen Mäusen nicht beobachtet wurde (4D). Elektronenmikroskopie der Nieren von alten transgenen Mäusen (4A) bestätigte die Immunhistochemie, welche eine unregelmäßige flockenartige Elektronendichte der inneren Basalmembran zeigte, die repräsentativ für Immunkomplexablagerung ist und identisch zu der ist, die in menschlichen Nieren von SLE-Patienten im Endstadium beobachtet wird (4B). Trotz der beträchtlichen Nierenschädigung in älteren Mäusen, wurde in diesen Mäusen keine erhöhte Proteinurie im Vergleich zu nicht-transgenen älteren Mäusen nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Jedoch korrelierte das Einsetzen der Proteinurie in einigen Lebewesenmodellen von Autoimmun-Glomerulonephritis anscheinend nicht mit dem Verlauf von Glomerulonephritis und Nierenversagen (Cly nes, Dumitru et al. 1998). In den gleichaltrigen nicht-transgenen C57BL/6- oder (C57BL/6 × SJL)F₁-Mäusen (3B und E) wurden keine Lungen- oder Nierenerkrankungen beobachtet, und keines der anderen untersuchten Organe (Speicheldrüse, Pankreas, Darm, Gehirn, Herz, Lymphknoten, Milz, Haut, Augen) zeigte Abnormalitäten, weder bei den transgenen noch den nicht-transgenen Mäusen.
Die transgene Expression von aktivierungsverknüpftem FcγRIIa veränderte deutlich die Immunfunktion in Mäusen, wodurch sie anfällig für spontane Immunkomplexerkrankung wurden. Die Beobachtung multipler Symptome einer spontanen Immunkomplexerkrankung in diesen Mäusen liefert den ersten direkten Beweis einer Schlüsselrolle dieses Rezeptors bei der Entwicklung einer derartigen gewebespezifischen Autoimmunerkrankung.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass eine spontane immunkomplexassoziierte Krankheit, welche sich anfänglich als Arthritis manifestiert, in Mäusen beobachtet wurde, die das humane FcγRIIA-Gen tragen. Nicht-transgene Mäuse mit gleichem genetischem Hintergrund entwickelten niemals die Erkrankung in diesem Alter. Diese Mäuse zeigten Anzeichen einer anderen Immunkomplex-vermittelten Autoimmunreaktivität mit hohen Serumniveaus an antinuklearen Antikörpern und Immunkomplexablagerung in den Nieren. Arthritis war gekennzeichnet durch Entzündung des Synoviums, mit Synovium-Hyperplasie, Ödem, zellulärer Infiltration und Neovascularisierung, was zur Bildung von fingerähnlichen Fortsätzen über dem Knorpel führte. Dieses Merkmal (Pannus) tritt einzig bei rheumatoider Arthritis auf und führt zu einem Chondrocyten-Zusammenbruch, Knorpelerosion und, schließlich, Knochenreabsorption. Die Entzündung wird durch Sekretion von IL-1 und TNF-Alpha durch Makrophagen stimuliert, was zur Sekretion von Stickstoffoxid und Kollagenase und Absterben von Chondrocyten führt. T-Zell-vermittelte Induktion von Autoantikörpern beinhaltet den rheumatoiden Faktor (RF) gegen den Fc-Teil von IgG. Dabei handelt es sich meistens um IgM, und dies wird bei 70–90% der RA-Patienten beobachtet. Andere Autoantikörper gegen Kollagen Typ 11 (die Hauptknorpelkomponente) und gegen Kerstin sind insbesondere diagnostisch, werden jedoch nicht bei allen Patienten beobachtet. FcγRIIa-transgene Mäuse mit spontaner Arthritis zeigten die meisten der obigen Merkmale in einem Alter von > 25 Wochen, wodurch erstmals bewiesen wird, dass die Expression des FcR bei der Entwicklung der Krankheit eine Rolle spielt.
Beispiel 3 – Untersuchung von systemischem Lupus erythematosus (SLE)
Sytemischer Lupus erythematosus (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Entwicklung von antinuklearen Antikörpern (ANA), insbesonders gegen DNA, gekennzeichnet ist. Ebenso entwickeln sich Antikörper gegen Oberflächenantigene der roten und weißen Blutzellen, was zu Anämie, Thrombocytopenie, Leukopenie, Schädigung der Endothelialzellen und Vasculitis führt. Ebenso wird Nervenschädigung beobachtet. Nierenversagen und schließlich mehrfaches Organsversagen sind das Endergebnis. Viele dieser Symptome werden in den alternden FcγRIIa-Mäusen beobachtet, da sie ebenso Glomerulonephritis, Pneumonitis und antinukleare Antikörper entwickeln. Es waren keine Mäuse positiv hinsichtlich des rheumatoiden Faktors. Der Nachweis von antinuklearen Antikörpern, welche symptomatisch für SLE sind, wurde folgendermaßen durchgeführt. Hohe Titer an antinuklearem Antikörper wurden in 83% der Seren von transgenen Mäusen mit einem Alter von > 20 Wochen beobachtet, wobei der Zellkern mit dem "homogenen Kemmuster" anfärbte. Das gleiche Muster wurde mit einem Anti-Histon-Antikörper (huPIA3) beobachtet (4E und 4F), was darauf hinweist, dass der detektierte antinukleare Antikörper ein Anti-Histon war. Antinukleare Antikörper mit diesem Färbungsmuster werden bei 70–95% der SLE-Patienten gefunden und sind einer der Indikatoren für SLE, obwohl sie nicht diagnostisch für diese Krankheit sind (Edworthy 2001). Im Gegensatz zu den anderen Merkmalen der Autoimmunerkrankung wurde ANA ebenso in transgenen Mäusen, die mit 12 Wochen untersucht wurden, und in gleichaltrigen nicht-transgenen Kontrollen nachgewiesen. Dies spiegelt die humane Situation wider, wo bis zu 30% der Population Serum-ANA aufweisen können, ohne Symptome der Autoimmunerkrankung zu zeigen. Es wurden keine Antikörper gegen doppelsträngige DNA beobachtet (Daten nicht gezeigt).

Eine Zusammenfassung der Symptome und des Auftretens der Krankheit ist in Tabelle 1 dargestellt. Wie oben erwähnt, erschien ANA vor anderen Indikatoren der Autoimmunerkrankung, stand jedoch nicht in eindeutigem Zusammenhang mit der Krankheitsentwicklung, da er ebenso in älteren nicht-transgenen Lebewesen beobachtet wurde. Von den 23 transgenen Mäusen, die mit > 20 Wochen untersucht wurden, wiesen 19 (83%) weitere Symptome einer Bindegewebserkrankung auf. Von den krankheitsfreien Mäusen waren drei 21–40 Wochen alt, und eine war > 40 Wochen alt. Glomerulonephritis (Gn) mit oder ohne Pneumonitis (Gn/Pn) war die am häufigsten beobachtete Erkrankung: von 16 Mäusen mit diesen Symptomen wiesen acht Gn/Pn ohne Arthritis auf, acht wiesen Arthritis auf, und fünf von ihnen wiesen Pannus auf. Die Schwere der Gn nahm mit dem Alter zu, jedoch nicht die Arthritis-Scores, wobei die Schwellung und Rötung mit der Zeit abnahm, obwohl die Gelenke steif blieben. Lediglich eine Maus (untersucht mit 30 Wochen) wies alle Symptome auf (ANA, Gn, Arthritis, Pannus). Drei Mäuse wiesen lediglich Arthritis auf, und zwei von ihnen zeigten Pannusbildung. Somit scheinen sich diese Symptome von Gn/Pn und Arthritis unabhängig voneinander zu entwickeln. Wie erwartet, war die Pannusentwicklung von Arthritis abhängig (elf Mäuse wiesen Arthritis auf, bei sieben von ihnen wurde ein Pannus beobachtet). Tabelle 1. Krankheit und Symptome Zusammenfassung

Normale Mäuse C57BI/6 (M) C57BI/6×SJ L (F1)	Geschlecht	Aussortiertes Alter (Wochen)	ANA	dsDNA	Arthritis- Score	Pannus	Nieren-GN	Pneumonitis
M#1		25	–	–	0	–	–	–
M#2		25	+	–	0	–	–	–
M#alt		>35	+	–	0	–	–	–
M#1a		32	–	–	0	–	–	–
M#2b		32	+	–	0	–	–	–
F1#1		>44	–	–	0	–
F1#2		>44	–	–	0	–
F1#3		>52	+	–	0	–

Transgene Mäuse Gruppe 1: < 20 Wochen	Geschlecht	Aussortiertes Alter (Wochen)	ANA	dsDNA	Arthritis-Score	Pannus	Nieren-GN	Pneumonitis
S4.0.2	M	12	-	–	0	–	–
S4.0.3	M	12	+	–	0	–	–
S4.0.1	M	12	+	–	0	–	–
S4.0.4	M	12	+	–	0	–	–

Transgene Mäuse Gruppe 2: 21–40 Wochen	Geschlecht	Aussortiertes Alter (Wochen)	ANA		Arthritis-Score	Pannus	Nieren-GN	Pneumonitis
S3.9N.13	F	25			0	–	+++	+
S3.5.17	F	32	+		0	–	–
S3.1.1	M	35	–		0	–	–
S3.1.2	M	36	+		0	–	–
S3.4.14	M	37	+		0	–	–/+
S3.4.11	M	38	+		0	–	+
S3.4.16	M	38	–		0	–	–/+
S3.7.4	M	36			3	–	++
S3.1.5	M	36	–		6	–	–
52.1		30	+		10	+	+++
S8.0.3	F	31			10	+	+	–
ITP6.3		25	+		11	–	–	–
S8.0.2	F	32	+		12	+	+	+
S8.0.1	F	40	+		12	+	–	+

Transgene Mäuse Gruppe 3: > 40 Wochen	Geschlecht	Aussortiertes Alter (Wochen)	ANA		Arthritis-Score	Pannus	Nieren-GN	Pneumonitis
S3.2.8	F	52	+		0	+	++
S3.6.76	F	52	+		0	+	+++	+
S7#2	F	54	+		0	+	+++
S3.2.6	F	52	+		0	+	–
S3.2.5	F	52	+		0	+	+++
S7#1	F	47	+		4	+	–
S7#3	F	54	+		5	+	–/+
S7#4	F	54	+		10	+	++
53.2.7	F	52	+		10	+	–	+
ANA-, Pannus- und Pneumonitis-Ergebnisse sind als positiv (+) oder negativ (–) angegeben. Die Arthritis-Scores wurden wie oben beschrieben berechnet (Score von 0–12). Eine Nierenerkrankung wurde als nicht vorliegend (–), leicht (–/+), moderat (++) oder schwer (+++) bewertet.

ANA erschien vor anderen Indikatoren der Autoimmunerkrankung, stand jedoch nicht in eindeutigem Zusammenhang mit der Krankheitsentwicklung, da er auch in älteren nicht-transgenen Lebewesen beobachtet wurde. Von den 23 transgenen Mäusen, die mit > 20 Wochen untersucht wurden, wiesen 19 (83%) weitere Symptome der Erkrankung auf. Von den krankheitsfreien Mäusen waren drei 21–40 Wochen alt, und eine war > 40 Wochen alt. Glomerulonephritis (Gn) mit oder ohne Pneumonitis (Gn/Pn) war die am häufigsten beobachtete Erkrankung: von 16 Mäusen mit diesen Symptomen wiesen acht Gn/Pn ohne Arthritis auf, acht wiesen Arthritis auf, und von diesen wiesen fünf Mäuse Pannusbildung auf. Die Schwere von Gn erhöhte sich mit zunehmendem Alter, jedoch nicht die Arthritis-Scores, wobei die Schwellung und Rötung mit der Zeit abnahm, obwohl die Gelenke steif blieben. Lediglich eine Maus (untersucht mit 30 Wochen) wies alle Symptome auf (ANA, Gn, Arthritis, Pannus). Drei Mäuse wiesen lediglich Arthritis auf, und zwei von ihnen zeigten Pannusbildung. Somit scheinen sich diese Symptome von Gn/Pn und Arthritis unabhängig voneinander zu entwickeln. Wie erwartet, war die Pannusentwicklung von Arthritis abhängig (11 Mäuse wiesen Arthritis auf, bei sieben von ihnen wurde Pannus beobachtet).
Beispiel 4 – Ergebnisse aus einem Hausmodell für kollageninduzierte Arthritis (CIA)
Die Krankheitsentwicklung von CIA und deren Schwere bei FcγRIIa-transgenen Mäusen wurden mit den CIA-resistenten Hintergrundstämmen (C57BL/6 H-2^b und (C57BL/6 × SJL)F1, H-2^b/s) und mit CIA-anfälligen DBA/1 (H-2^q)-Mäusen verglichen. Im Unterschied zu den Hintergrundstämmen, welche keine CIA entwickelten, entwickelten die FcγRIIa-transgenen Mäuse Arthritis mit schnellerem Einsetzen (bereits an Tag 20) und in schwererer Form als die DBA/1-Mäuse (5C). Eine Histologie der Gelenke von FcγRIIa-, DBA/1-, C57BL/6- und (C57BL/6 × SJL)F1-Mäusen, die an Tag 36 nach Arthritis-Induktion aussortiert wurden, bestätigte diese Diagnose. FcγRIIa-transgene Mäuse zeigten massive synoviale Entzündung (5A) und einige Gelenkerosion, verursacht durch einwandernde inflammatorische Zellen, welche normales Gelenkknorpelgewebe ersetzten, und die Entwicklung von Pannus im Gelenk (5B). Diese Läsionen wurden ebenso in den DBA/1-Mäusen gefunden, jedoch nicht in den Gelenken der nicht-anfälligen Stämme, wie beispielsweise C57BL/6. Pannusbildung, die anfänglich auf die Proliferation von fibroblastenartigen Zellen zwischen Gelenkoberflächen zurückzuführen ist und bis zu einem Abbau der extrazellulären Matrix fortschreitet, ist ein gewöhnliches Merkmal der Gelenke beim Menschen mit rheumatoider Arthritis (Harris 2001). Die Ergebnisse zeigen, dass kollegeninduzierte Arthritis in FcγRIIa-Mäusen früher einsetzt und einen schwereren Krankheitsverlauf zeigt als in DBA/1-Mäusen.
Beispiel 5 – Ergebnisse der Anti-Kollagen-II-Antikörper- und Rheumatoid-Faktor-Detektion
Der Titer von Anti-Kollagen-II-Antikörper im Serum von transgenen Mäusen, DBA/1- und C57BL/6-Mäusen wurde durch ELISA gemessen. Obwohl Arthritisentwicklung bei den FcγRIIa-transgenen Mäusen früher beobachtet wurde, besaßen sie niedrigere Antikörper-Titer (nachgewiesen an Tag 21 und Tag 36) als die DBA/1- oder C57BL/6-Mäuse. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass inflammatorische Anworten in den FcγRIIa-transgenen Mäusen durch geringe Titer an Anti-Kollagen-Antikörper aktiviert werden, was zur schnellen und frühen Induktion von Arthritis führt. ELISA-Assays auf Antikörper gegen IgG, d. h., den Rheumatoid-Faktor (RF), ergaben keine positiven Ergebnisse. RF wird normalerweise nicht bei Mäusen mit CIA nachgewiesen.
Beispiel 6 – Ergebnisse aus dem Modell für Spontane Arthritis (SA)
Die in dieser Studie verwendeten transgenen Mäuse exprimierten einen einzigen humanen Rezeptor für IgG, FcγRIIa, auf den gleichen Zellen und mit physiologischen Niveaus ähnlich zu denen, die beim Menschen beobachtet werden. Im Alter (> 25 Wochen) entwickelten die Mäuse spontane Arthritis (SA) und zeigten Abnormalitäten, wie beispielsweise hohe Titer an antinuklearen Antikörpern, inflammatorische Lungen-Läsionen und Glomerulonephritis mit intraglomerulärer Immunkomplexablagerung. Diese Studie zeigt eine klare Rolle für den humanen FcγRIIa bei der Entwicklung einer Immunkomplexerkrankung in diesem Mausmodell-System. 6 zeigt das prozentuale Auftreten einer neuen Erkrankung zu jedem Zeitpunkt (grau) und die prozentuale kumulative Prävalenz von Mäusen (n = 50) mit der Krankheit (schwarz).
Die Ergebnisse zeigen, dass spontane Arthritis auf die Expression des humanen FcγRIIa zurückzuführen ist. Wie in 6 gezeigt, wurden Mäuse in einem Alter von 9–55 Wochen regelmäßig hinsichtlich der Entwicklung von Arthritis untersucht.
Die histologische Untersuchung wurde an Gewebeproben (Nieren, Lungen und verschiedenen anderen Geweben), die von 9–55 Wochen alten Mäusen entnommen und mit 10% Formalin/PBS fixiert und in Paraffin eingebettet wurden, durchgeführt. Schnitte (4–6 μm) wurden mit Hematoxylin und Eosin angefärbt. Zum Nachweis von Immunkomplexablagerung wurden Nierenschnitte mit Schaf-Anti-Maus-IgG (Fab'-Fragment)-FITC (Silenus, Melbourne, Australien) angefärbt. Die Gelenkgewebe wurden vor der Paraffineinbettung mit einer Lösung, enthaltend 5% HCl, 3,5% Eisessig, 95% Ethanol und 12,5% Chloroform, entkalzifiziert. Die Entkalzifizierung wurde als vollständig betrachtet, wenn die Gelenke ausgebleicht und flexibel waren. Die Schnitte (4–6 μm) wurden mit Hematoxylin und Eosin (H&E) angefärbt; die krankhaften Gelenke zeigten die histologischen Veränderungen, die charakteristisch für Arthritis sind (Pannusbildung, Infiltration, Knorpel- und Knochenschädigung). 2 zeigt mit H&E gefärbte Schnitte von (E): einem normalen Kniegelenk und (B): einem arthritischen Kniegelenk einer SA-Maus, welche Knorpelerosion und Pannusbildung zeigt.
Beispiel 7 – Kollageninduzierte Arthritis in einem transgenen Mausstamm, welcher den humanen FcγRIIa exprimiert
Bei jüngeren Mäusen (8–12 Wochen) verlieh die Anwesenheit des FcγRIIa-Gens in einem Mausstamm mit gemischtem genetischem Hintergrund (C57BL/6/SJL, H-2^b/s), welcher normalerweise resistent gegen kollageninduzierte Arthritis (CIA) ist, eine Anfälligkeit für diese Erkrankung. Zudem zeigten diese Mäuse ein früheres Ein setzen von CIA als DBA/1 (H-2^q)-Mäuse, ein bekannter anfälliger Stamm (siehe unten). CIA wurde in den Mäusen durch i. d. Injektion einer Emulsion von Hühner-Kollagen Typ II in Freudschem Komplett-Adjuvanz (CFA) in die Schwanzbasis induziert. Es wurden zwei Injektionen an Tag 0 und 21 des Experiments verabreicht. Die Schwere der Arthritis wurde auf einer Skala von 0 bis 3 für jede Extremität, auf der Grundlage von Anschwellung, Rötung und Gelenkfunktion, bewertet.

• Score 0 = normal,
• 1 = leichte Schwellung und Rötung von Pfoten oder Zehen,
• 2 = schwere Schwellung und Rötung von Pfoten und Zehen,
• 3 = schwere Schwellung und Rötung, begleitet von Gelenk-Dysfunktion.

Der Score für jede Maus wurde durch Addieren der Scores aller vier Extremitäten berechnet (maximaler Score von 12 für jede Maus) (Campbell et al. 1997).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression des FcγRIIa-Transgens in Mäusen zu einer Anfälligkeit für die Krankheit in einem zuvor resistenten Stamm führt, wobei die Krankheit schwerer verläuft und früher einsetzt als bei Mäusen mit einem anfälligen Hintergrund. Somit überführte die Zugabe von FcγRIIa nicht nur den nicht für CIA anfälligen Maus-Hintergrundstamm in einem anfälligen Stamm, sondern induziert außerdem eine Immunerkrankung, die stark der humanen rheumatoiden Arthritis und/oder SLE in älteren Mäusen ähnelt, einer Erkrankung, die zuvor nicht in den Ursprungsmausstämmen (C57BL/6 oder SJL) beschrieben war. Die Ergebnisse zeigen, dass FcγRIIa eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer Autoimmunerkrankung spielt, insbesondere bei rheumatoider Arthritis und SLE. Strategien, die zur Blockierung oder Herunterregulierung dieses Rezeptors führen, stellen ebenso einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz zur Inhibierung von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise rheumatoider Arthritis und SLE, beim Menschen bereit.
Beispiel 8 – Testen von Verbindungen in Mäusen mit kollageninduzierter Arthritis
In Kontrollmäusen (n = 28) schritt die Erkrankung über einen Zeitraum von 37 Tagen fort und führte zu einem mittleren Score von 7,5 (7). Von diesem Zeitpunkt bis zu > 60 Tagen wurde kein weiterer Anstieg der Schwere der Krankheit beobachtet. Mäuse (n = 15), die beginnend an Tag 21 mit vier Dosen 7,5 mg VIB 153 behandelt worden waren, welches intraperitoneal verabreicht wurde (behandelt an Tag 21, 24, 27, 30), (7) und bis > 60 Tage untersucht wurden, zeigten keine Erkrankung bis zum Tag 37, und lediglich eine Maus entwickelte eine leichte Erkrankung während dieses Zeitraums. Mäuse, die mit lediglich zwei Dosen VIB 153 behandelt worden waren (7,5 mg/Dosis an den Tagen 21 und 27) zeigten ebenso sehr geringe Niveaus der Erkrankung bis Tag 37. Behandelte Gruppen aus der Vier-Dosen-Gruppe zeigten keine Anzeichen des Fortschreitens der Erkrankung an > 60 Tagen. In den unbehandelten Mäusen nahm die Schwellung im Verlauf der Zeit ab, die Pfoten blieben jedoch steif und unbeweglich an > 60 Tagen. Wiederum zeigten die krankhaften Gelenke die histologischen Veränderungen, die mit Arthritis verbunden sind (Pannusbildung, Infiltration, Knorpel- und Knochenschädigung), und sehr ähnlich zu denen sind, die bei SA beobachtet wurden (siehe 5). 8 zeigt das typische Anschwellen und die Deformierung in einem unbehandelten Fuß (A) im Vergleich zu der normalen Erscheinung des Fußes einer behandelten Maus (B) an Tag 32.
An einem nicht-transgenen Hausstamm, der anfällig für CIA ist, entwickelten (DBA/1) Kontrollmäuse (unbehandelt) (n = 27) im Laufe der Zeit CIA, mit einem mittleren Arthritis-Index von 7 an Tag 37. Mäuse (n = 12), die mit drei 7,5 mg-Dosen VIB 153 an den Tagen 21, 24 und 27 behandelt wurden, entwickelten ebenso CIA, und an Tag 37 wies die Erkrankung eine ähnliche Schwere auf wie bei den Kontrollen (siehe 9), was zeigt, dass dieses Arzneimittel keine Wirkung besitzt, wenn das Transgen nicht vorliegt.
Beispiel 9 – Weiteres Testen von Verbindungen in einem Hausmodell für kollageninduzierte Arthritis
Mäuse mit spontaner Arthritis (> 30 Wochen), die mit drei 7,5 mg-Dosen VIB 153 an den Tagen 0, 7, 14 nach Beobachtung der Arthritis behandelt wurden, zeigten eine verringerte Schwellung und Rötung am Ende der Behandlung (die durchschnittlichen Scores waren auf 4 reduziert, gegenüber dem Score 6 bei den unbehandelten Kontrollen), ein Fortschreiten der Gelenksteifheit wurde jedoch nicht verhindert. Die individuelle Variation in dieser Hausgruppe (n = 3) war beträchtlich, bedingt durch die Schwere der Erkrankung zum Zeitpunkt der Behandlung. Mäuse mit höheren Scores waren einer Behandlung weniger zugänglich.
Bei den Mäusen mit CIA entwickelten einige die Krankheit vor der Arzneimittelbehandlung (nach der ersten Kollagen-Injektion). Diese wurden mit den gleichen Arzneimitteldosen behandelt wie die krankheitsfreien Mäuse. Wiederum war die individuelle Variation in dieser Hausgruppe (n = 2 Mäuse/Arzneimittel) beträchtlich und abhängig von der Schwere der Erkrankung zum Zeitpunkt der Behandlung. Mäuse mit höheren Scores waren weniger zugänglich für eine Behandlung (10 und 11).
CIA wurde in den Mäusen durch i. d. Injektion einer Emulsion aus Hühner-Kollagen Typ II in Freudschem Komplett-Adjuvanz (CFA) in die Schwanzbasis induziert. Es wurden zwei Injektionen an Tag 0 und 21 des Experiments verabreicht. Die Schwere der Arthritis wurde auf einer Skala von 0 bis 3 für jede Extremität auf der Grundlage von Schwellung, Rötung und Gelenkfunktion bewertet.

• Score 0 = normal,
• 1 = leichte Schwellung und Rötung der Pfoten oder Zehen,
• 2 = schwere Schwellung und Rötung der Pfoten und Zehen,
• 3 = schwere Schwellung und Rötung, begleitet von Gelenk-Dysfunktion.

Der Score für jede Maus wurde durch Addieren der Scores aller vier Extremitäten (maximaler Score von 12 für jede Maus) berechnet (Campbell et al. 1997).
Die Mäuse wurden beginnend an Tag 21 mit vier 7,5 mg-Dosen des Arzneimittels, welches intraperitoneal verabreicht wurde (an Tag 21, 24, 27, 30), behandelt und bis > 60 Tage untersucht (siehe 12 und 13). Bei den unbehandelten Mäusen nahm die Schwellung im Laufe der Zeit ab, die Pfoten blieben jedoch steif und unbeweglich an > 60 Tagen. Wiederum zeigten die krankhaften Gelenke die histologischen Veränderungen, die mit Arthritis verbunden sind (Pannusbildung, Infiltration, Knorpel- und Knochenschädigung), sehr ähnlich zu denen, die bei SA beobachtet wurden. Sämtliche getesteten Arzneimittel (6727, 6728, VIB197, VIB 153) modifizierten die Entwicklung von CIA, indem sie entweder das Einsetzen der Krankheit verzögerten oder die Schwere signifikant herabsetzten, wobei geringe Scores für > 30 Tage aufrechterhalten wurden.
Aus diesen Studien wird deutlich, dass die Anwesenheit von FcγRIIa diesen Mäusen eine Sensitivität gegenüber Immunkomplexen verleiht, obwohl alle anderen aktivierenden und inhibierenden Fc-Rezeptoren – FcRI und FcRIII sowie FcRIIb – in diesen Mäusen vorliegen. Es wird somit davon ausgegangen, dass bei Krankheiten, bei denen es sich nicht um Autoimmunerkrankungen handelt, eine derartige Sensitivität gegenüber Antikörpern und durch Antikörper und Immunkomplexe hervorgerufene Entzündung in FcγRIIa-transgenen Mäusen offensichtlich und zum Testen von Verbindungen zur potentiellen Behandlung dieser Erkrankungen geeignet ist.
Beispiel 10 – Behandlung von CIA mit Anti-T-Zell- oder anti-inflammatorischen Agenzien
T-Zellen spielen bekanntermaßen eine signifikante Rolle bei der Induktion von CIA. Beispielsweise wurde gezeigt, dass T-Zell-Inaktivierung mit einem Anti-CD3-monoklonalen Antikörper (KT3), welcher die T-Zell-Rezeptorkette erkennt, vor dem Einsetzen von CIA in DBA/1-Mäusen die Schwere der Krankheit herabsetzt (Hughes, Wolos et al. 1994). In der vorliegenden Studie wurde der Anti-CD3-Antikörper in einer Dosis verwendet, die bekanntermaßen in Mäusen immunosuppressiv wirkt (Mottram, Murray-Segal et al. 2002), um FcγRIIa-transgene Mäuse mit induzierter CIA zu behandeln. CIA wurde in den Mäusen, wie in Beispiel 7 beschrieben, induziert; dann wurden die Mäuse an Tag 20, vor Einsetzen der Krankheit und vor der zweiten Kollagen-Injektion (Tag 21), und nochmals an den Tagen 22, 23 und 25 mit 0,5 mg i. p. Anti-CD3 behandelt. Wie bereits für DBA/1-Mäuse beschrieben (Hughes, Wolos et al. 1994), verzögerte diese Behandlung das Einsetzen von CIA, wobei der Index bei diesen Mäusen bis zum Tag 37 gering blieb (14).
In der vorliegenden Studie war die Behandlung mit Methotrexat, einem DMARD, welches üblicherweise zur Behandlung schwerer rheumatoider Arthritis bei Menschen eingesetzt wird (Hildner, Finotto et al. 1999) und welches bekanntermaßen CIA in DBA/1-Mäusen wirksam verzögert (Neurath, Hildner et al. 1999), ebenso wirksam bei der Verzögerung von CIA in den FcγRIIa-transgenen Mäusen (14). Methotrexat wurde mit einer geringen Dosis 14 Tage lang vom Zeitpunkt der zweiten Kollagen-Injektion an verwendet (1 mg/kg, d. h., 30 μg/30 g Maus von Tag 21–35) (14). Sowohl bei der Anti-CD3- als auch bei der Methotrexat-Behandlung wurde Arthritis aufgrund der Depletion inflammatorischer Effektorzellen verzögert, und die Krankheit nahm an Schwere zu, wenn sich nach Beendigung der Behandlung die Immunfunktion auf das Normale einstellte.
Im Gegensatz dazu wurde durch Behandlung mit Anti-FcR-Agenzien (siehe oben, Beispiele 8 und 9) der Krankheitsverlauf permanent angehalten, was darauf hinweist, dass wesentliche initiale Schritte in dem inflammatorischen Prozess inhibiert wurden, was eine Verhinderung der Erkrankung eher als eine Verzögerung ermöglicht. Die in 14 dargestellten Daten zeigen, dass bekannte Behandlungen, einschließlich biologische Agenzien, wie beispielsweise monoklonale Antikörper, und Arzneimittel, wie beispielsweise Methotrexat, die wirksam bei CIA in DBA/1-Mäusen sind, gleichfalls effektiv in den FcγRIIa-transgenen Mäusen sind. CIA in den DBA/1-Mäusen wird als Testmodell für Arzneimittel gegen Arthritis seit vielen Jahren verwendet (Phadke, Fouts et al. 1985; Imaizumi, Hinoue et al. 1991). Die Daten der vorliegenden Studie zeigen, dass die FcγRIIa-transgenen Mäuse ebenso auf Behandlungen ansprechen, die in DBA/1-Mäusen wirksam sind, und dass diese Mäuse somit zum Testen von Arzneimitteln gegen Arthritis eingesetzt werden können.
Die vorliegenden Ausführungsformen sind in jeglicher Hinsicht als illustrativ und nicht einschränkend zu verstehen.
Jegliche Diskussion von Dokumenten, Tätigkeiten, Materialien, Vorrichtungen, Gegenständen oder Ähnlichem, welche in der vorliegenden Beschreibung enthalten ist, dient lediglich dem Zweck, einen Kontext für die vorliegende Erfindung zu liefern. Es soll nicht als Zugeständnis verstanden werden, dass ein beliebiger oder alle dieser Dinge den Stand der Technik bilden oder zur allgemeinen Kenntnis auf dem betreffenden Gebiet der vorliegenden Erfindung in Australien oder an irgendeinem anderen Ort vor dem Prioritätsdatum eines jeden Anspruchs dieser Anmeldung gehören.
Literaturhinweise:

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Claims

Verfahren zum Screening einer Verbindung, die imstande ist, aberrante Immunaktivität zu unterdrücken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Verabreichen einer zu screenenden Verbindung einem nichtmenschlichen transgenen Lebewesen, das modifiziert worden ist, um den menschlichen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, und wobei das nichtmenschliche transgene Lebewesen, bevor es zur Expression des menschlichen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, gegen kollageninduzierte Arthritis resistent ist; und (b) Untersuchen des transgenen Lebewesens, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine aberrante Immunaktivität bei dem Lebewesen verringert, wobei die aberrante Immunaktivität eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung ist.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Screening einer Verbindung, die imstande ist, eine Autoimmunerkrankung zu unterdrücken.
Verfahren zum Screening einer Verbindung, die imstande ist, eine Autoimmunerkrankung zu unterdrücken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Verabreichen einer zu screenenden Verbindung einer nichtmenschlichen, den menschlichen FcγRIIa-Rezeptor exprimierenden Zelle, wobei die Zelle aus einem nichtmenschlichen transgenen Lebewesen stammt, das modifiziert worden ist, um den menschlichen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren, so dass das transgene Lebewesen für eine Autoimmunerkrankung anfällig ist, und wobei das nichtmenschliche transgene Lebewesen, bevor es zur Expression des menschlichen FcγRIIa-Rezeptors modifiziert wird, gegen kollageninduzierte Arthritis resistent ist; und (b) Untersuchen der Zelle, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung in der Zelle verringert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren den zusätzlichen Schritt umfasst: (c) Untersuchen des transgenen Lebewesens, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine immunkomplexinduzierte Entzündung in der Zelle verringert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das nichtmenschliche transgene Lebewesen eine aus den Stämmen C57BL/6 und SJL stammende transgene Maus ist, die modifiziert worden ist, um den menschlichen FcγRIIa-Rezeptor zu exprimieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung eine aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung bei dem Lebewesen verringert, indem sie die Aktivität des in dem Lebewesen exprimierten FcγRIIa inhibiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 6, wobei in Schritt (b) die aberrante Immunkomplexbildung, aberrante Immunkomplexklärung oder immunkomplexinduzierte Entzündung anhand der klinischen Symptome und/oder pathologischen Merkmale einer Autoimmunerkrankung untersucht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Autoimmunerkrankung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Arthritis und systemischem Lupus erythematosus (SLE).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) oder kollageninduzierte Arthritis (CIA) ist.