BRPI0915968B1 - Uso de polipeptídeo purificado para tratar infecção pelo vírus da dengue - Google Patents

Abstract

composição compreendendo polipeptídeo e uso do dito polipeptídeo na inibição da formação de imunocomplexo associada à infecção viral. polipeptídeos e outros compostos que podem se ligar especificamente a abertura c(h)2-c(h)3 de uma molécula de imunoglobulina, e métodos para usar tais polipeptídeos e compostos para inibir a formação de imunocomplexo mediado por fc na infecção viral. por exemplo, os polipeptídeos e outros compostos podem ser usados para inibir a ligação de vírion(s) anti-df de igg imunocomplexado a f(y)r, ade de infecções com df/dhf/dss por inibição da ligação antigênica viral de df a igg imunocomplexado f(y)r e mc1q (c1q de membrana) de igg imunocomplexado ou ligação de c1 solúvel.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA À APLICAÇAO RELACIONADA

[001] Este pedido reivindica o benefício da prioridade do Pedido de Patente Provisório US 61/081.943, depositado em 18 de julho de 2008.

CAMPO TÉCNICO

[002] Este documento refere-se à inibição da formação do imu- nocomplexo associado às infecções virais. Por exemplo, este documento proporciona materiais e métodos para inibir a formação do imu- nocomplexo em infecções da dengue (DF) e intensificação dependente de anticorpos (ADE) de infecções de DF, incluindo a Febre de Dengue Hemorrágica (DHF) e a Síndrome do Choque da Dengue (DSS). Em particular, este documento refere-se à inibição da formação do imu- nocomplexo por polipeptídeos e outras moléculas pequenas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Imunorrespostas humorais são ativadas quando um antíge- no se liga especificamente a um anticorpo. A combinação de uma molécula de anticorpo e um antígeno forma um pequeno imunocomplexo relativamente solúvel. Os antígenos podem ou ser substâncias estrangeiras, como polipeptídeos virais ou bacterianas, ou podem ser "auto- antígenos" como polipeptídeos normalmente encontrados no sangue humano. O sistema imunológico normalmente distingue antígenos externos de autoantígenos. Uma doença "autoimune" pode, entretanto, ocorrer quando este sistema é quebrado, de tal modo que o sistema imune se volta contra o corpo e destrói tecidos, órgãos ou sistemas como se fossem substâncias estranhas. Imunocomplexos maiores são mais patogênicos que os imunocomplexos pequenos e mais solúveis. A formação de imunocomplexos maiores relativamente insolúveis pode resultar tanto da interação das moléculas de anticorpos com o antíge- no quanto da interação entre moléculas de anticorpos. Tais imu- nocomplexos também podem resultar de interações entre anticorpos na ausência de antígenos.

[004] Os anticorpos podem prevenir infecções ao revestir os vírus ou bactérias, mas são de outra forma, relativamente inofensivos por si mesmos. Por outro lado, dano a tecido específico de órgãos pode ocorrer quando os anticorpos combinam com os antígenos e os imu- nocomplexos resultantes se ligam a certas outras moléculas efetoras no corpo. Moléculas efetoras possuem esse nome porque elas são responsáveis pelos efeitos patogênicos dos imunocomplexos. Pela inibição da formação de imunocomplexos grandes e insolúveis, ou pela inibição da ligação dos imunocomplexos às moléculas efetoras, os efeitos danosos aos tecidos dos imunocomplexos podem ser evitados. SUMÁRIO

[005] Este documento se baseia em parte na descoberta de que polipeptídeos que possuem sequências de aminoácidos baseadas naquelas reveladas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 20 (também referidas aqui por NB-406) podem se ligar especificamente e com alta afinidade ao domínio CH2-CH3 das moléculas de imunoglobulina, assim inibindo a formação de imunocomplexos insolúveis contendo anticorpos e antígenos, e impedindo a ligação de tais complexos às moléculas efetoras. Este documento fornece tais polipeptídeos, outros compostos de ligação a CH2-CH3, composições que contêm os polipeptí- deos e/ou compostos, e métodos para uso dos polipeptídeos e com-posições para inibir a formação de imunocomplexos e uso terapêutico no tratamento de infecções virais.

[006] Em um aspecto, este documento descreve um método para inibir a formação de imunocomplexos em um paciente, método que compreende administrar a um paciente uma composição que compre- ende um polipeptídeo purificado, o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos (Xaai)m-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu- Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n (SEQ ID NO: 53), em que Xaa1 é qualquer aminoácido, Xaa2 é Trp, Tyr ou Phe, 5-hidroxitriptofano (5-HTP), 5- hidroxitriptamina (5-HT) ou outro derivado de aminoácido, Xaa3 é qualquer aminoácido e m e n são, independentemente, 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 e em que a formação dos imunocomplexos está associada a uma infecção viral. A formação do imunocomplexo pode estar associada ao aperfeiçoamento dependente de anticorpos (ADE) da dengue ou infecção pelo vírus da dengue (DENV), ou contribui para a intensificação de uma infecção com DENV. O peptídeo pode causar melhora clínica ou histológica de uma infecção com DENV. O peptídeo pode causar uma melhora ou atrasar o aparecimento de uma ou mais características histológicas de uma infecção com DENV. O peptídeo pode diminuir a ADE de uma infecção com DENV.

[007] A infecção com DENV pode ser Febre de Dengue Hemorrágica (DHF) ou síndrome do choque da dengue (DSS). O peptídeo pode inibir a ligação de um imunocomplexo (IC) IgG anti-DENV a um FCYR. O peptídeo pode inibir a formação de IC que contribui para a imunopatogênese de ADE das infecções com DENV. O peptídeo pode impedir a ligação de vírus DENV ao IC de IgG. O peptídeo pode inibir a ligação de uma proteína de DENV (por exemplo, NS1) a um imu- nocomplexo IgG. O peptídeo pode inibir a ligação de TNF-α ao IC de IgG. O peptídeo pode inibir a ligação de IC de IgG de DENV a FCYI, alelo H131 de FoylIa, alelo R131 de FoylIa, FcYRIIb, Fcylic, FcYRIIIa ou FCyYiiib. O peptídeo pode inibir a ligação de IC de IgG de DENV a mC1q ou sC1q.

[008] Os polipeptídeos podem conter um grupo estabilizante terminal. O grupo estabilizante terminal pode estar na terminação amino do polipeptídeo e pode ser um tripeptídeo contendo a sequência de aminoácidos Xaa-Pro-Pro, em que Xaa é qualquer aminoácido (por exemplo, Ala). O grupo estabilizante terminal pode estar na terminação carbóxi do polipeptídeo e pode ser um tripeptídeo com uma sequência de aminoácidos Pro-Pro-Xaa, em que Xaa é qualquer aminoácido (por exemplo, Ala).

[009] O método pode também compreender a etapa de monitorar o paciente quanto a uma ou mais características clínicas, histopatoló- gicas ou moleculares da febre hemorrágica. As uma ou mais características clínicas, histopatológicas ou moleculares da febre hemorrágica podem ser selecionadas do grupo que consiste em diminuição das plaquetas, concentração sanguínea ou um aumento das células efeto- ras FCYR+.

[0010] O polipeptídeo pode compreender a sequência de aminoá- cidos Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys- Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp- Cys-Thr (SEQ ID NO: 19), em que Xaa é qualquer aminoácido. O poli- peptídeo pode compreender a sequência de aminoácidos Ala-Pro-Pro- Asp- Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 20). O polipeptídeo pode compreender a sequência de aminoácidos Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu- Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 2).

[0011] A não ser que indicado o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui possuem o mesmo significado comumen- te entendido por um técnico no assunto. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática da invenção, métodos e materiais adequados são descritos a seguir. Todas as publicações, pedidos de patente e outras referências mencionadas aqui são incorporados a título de referência na íntegra. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, deverá prevalecer. Ademais, os materiais, métodos e exemplos são meramente ilustrativos e não têm por intenção a limitação.

[0012] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são dispostos nos desenhos acompanhantes e no relatório descritivo a seguir. Outras características, objetos e vantagens da invenção ficarão claros a partir da descrição e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0013] Este documento proporciona polipeptídeos e outros compostos capazes de interagir com a abertura CH2-CH3 em uma molécula de imunoglobulina, de tal modo que a interação da imunoglobulina com outras moléculas (por exemplo, efetoras ou outras imunoglobuli- nas) é bloqueada. Métodos para a identificação de tais polipeptídeos e outros compostos também são descritos, junto com composições e artigos manufaturados contendo os polipeptídeos e compostos. Ademais, este documento proporciona métodos para o uso dos polipeptí- deos e compostos para inibir a formação de imunocomplexos e para tratar doenças (por exemplo, doenças virais como a dengue) em que os imunocomplexos IgG se ligam a moléculas efetoras, como C1q ligado a membrana (mC1q), C1q solúvel (sC1q) e FCYRS (incluindo, sem limitação, FCYRI (e isoformas de FOYR), FoYRIIa, FoYRIIb/o, FoyRIIIa, FoYRIIIb e FoRn). Imunoglobulinas

[0014] As imunoglobulinas constituem uma classe de proteínas encontradas no plasma e em outros fluidos corporais que exibem atividade de anticorpo e se ligam a outras moléculas (por exemplo, antíge- nos e determinados receptores da superfície celular) com um alto grau de especificidade. Baseado em sua estrutura e atividade biológica, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco classes: IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. A IgG é a classe de anticorpos mais abundante no corpo; esta molécula assume uma configuração na forma de Y torcido. Com exceção das IgMs, as imunoglobulinas são compostas basicamente de quatro cadeias de peptídeos que são ligadas por diversas ligações de dissulfeto intra- e inter-cadeias. Por exemplo, as IgGs são compostas de duas cadeias pesadas de polipeptídeos (cadeias H) e duas cadeias leves de polipeptídeos (cadeias L), as quais são acopladas por ligações dissulfeto e ligações não covalentes de modo a formar uma molécula de proteína com um peso molecular de aproximadamente 150.000 Daltons (Saphire et al., "Crystal Structure of a Neutralizing Human IgG Against HIV-I: A Template for Vaccine Design," Science, 2001, 293: 1155- 1159). A molécula média de IgG contém cerca de 4,5 ligações de dissulfeto entre cadeias e aproximadamente 12 ligações internas de dissulfeto (Frangione e Milstein (1968) J. MoI. Biol. 33:893906).

[0015] As cadeias leves e pesadas de moléculas de imunoglobuli- na são compostas por regiões constantes e regiões variáveis (vide, por exemplo, Padlan (1994) MoI. Immunol. 31:169- 217). Por exemplo, as cadeias leves de uma molécula de IgG1 contêm cada uma um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL). As cadeias pesadas têm, cada uma, quatro domínios: um domínio variável amino terminal (VH), seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e o CH3 carbóxi terminal). Uma região hinge corresponde a uma junção flexível entre os domínios CH1 e CH2. A digestão com papaína de uma molécula de IgG intacta resulta na clivagem proteolítica no hinge e produz um fragmento Fc que contém os domínios CH2 e CH3, e dois fragmentos Fab idênticos em que cada um contém um domínio CH1, CL e VH e VL. O fragmento Fc tem atividade de ligação a complemento e tecido, enquanto os fragmentos Fab têm atividade de ligação à antígeno.

[0016] Moléculas de imunoglobulina podem interagir com outros polipeptídeos através de várias regiões. A maior parte de ligação a an- tígeno ocorre, por exemplo, através da região VL/VH do fragmento Fab. Acredita-se também que a região hinge seja importante, já que um dogma imunológico estabelece que os sítios de ligação para os recep- tores de Fc (FcR) são encontrados na região hinge da moléculas de IgG (vide, por exemplo, Raghavan e Bjorkman (1996) Annu. Rev. Dev. Biol. 12:181-200). Contudo, evidência mais recente sugere que FcR interage com o região hinge principalmente quando a imunoglobulina é monomérica (isto é, não imunocomplexada). Tais interações envolvem, tipicamente, os aminoácidos nas posições 234-237 da molécula de Ig (Wiens et al. (2000) J. Immunol. 164:5313-5318).

[0017] As moléculas de imunoglobulina podem interagir também com outros polipeptídeos através de uma abertura dentro do domínio CH2-CH3. A "abertura CH2" inclui tipicamente os aminoácidos nas posições 251-255 dentro do domínio 2 e os aminoácidos nas posições 424-436 dentro do domínio CH3. Como usada aqui, a numeração diz respeito a uma molécula de IgG intacta como descrito por Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição., Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD). Os aminoácidos correspondentes em outras classes de imunoglobulina podem ser prontamente determinados por aqueles de conhecimento ordinário da técnica.

[0018] A abertura CH-CH3 é incomum, pois ele é caracterizado tanto por um alto grau de acessibilidade a solvente como por um caráter predominantemente hidrofóbico, sugerindo que o enterro de uma superfície hidrofóbica exposta é uma força acionadora por trás da ligação neste sítio. Uma alteração tridimensional ocorre na abertura CH2-CH3 da IgG mediante ligação de antígeno, permitindo que certos resíduos (por exemplo, uma histidina na posição 435) para se tornarem expostos e disponíveis para ligação. Foi encontrada evidência direta de alterações estruturais tridimensionais que ocorrem mediante ligação de antígeno em um estudo usando anticorpos monoclonais sensíveis às alterações conformacionais na região Fc da IgG humana. Cinco epíto- pos de IgG foram alterados por ligação a antígeno: dois dentro da re- gião hinge e três dentro da abertura CH2-CH3 (Girkontraite et al. (1996) Cancer Biother. Radiopharm. 11:87-96). Portanto, a ligação a antígeno pode ser importante para determinar se uma imunoglobulina se liga a outras moléculas através do hinge ou da região Fc CH2-CH3.

[0019] A região Fc pode se ligar a várias moléculas efetoras e outras proteínas, incluindo as seguintes: (1) FcRn - O receptor de Fc neonatal determina a meia- vida da molécula de anticorpo na circulação geral (Leach et al., (1996) J. Immunol. 157:3317-3322; Gheti e Ward (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766). Camundongos que carecem geneticamente de FcRn são protegidos dos efeitos deletérios dos autoanticorpos patogênicos devido à meia-vida curta dos autoanticorpos (Liu et al. (1997) J. Exp. Med. 186:777-783). O único sítio de ligação de FcRn ao Fc de IgG é a abertura CH2-CH3 do Fc de IgG e HIS435 foi mostrado por estrutura tridimensional e varredura de alanina como sendo essencial para ligação de FcRN a Fc de IgG (Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:65916604 e Martin et al. (2001) Mol. Cell, 7:867-877). Já que os peptídeos descritos aqui se ligam com alta afinidade a abertura CH2-CH3 e HIS 435, os peptídeos são inibidores diretos de ligação de Fc de IgG (imu- nocomplexado) ao FcRn Um inibidor de ligação de FcRN aos imu- nocomplexos ou aos autoanticorpos patogênicos ou aos autoanticor- pos patogênicos seriam úteis no tratamento de doenças envolvendo autoanticorpos e/ou imunocomplexos. (2) FcR - O Receptor de Fc celular proporciona uma ligação entre a imunorresposta humoral e os sistemas efetores mediados por células (Hamano et al. (2000) J. Immunol. 164:6113-6119; Coxon et al. (2001) Immunity 14:693-704; Fossati et al. (2001) Eur. J. Clin. Invest. 31:821-831). Os receptores Fcy são específicos para moléculas de IgG, e incluem FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb/c, e FcyRIIIa/b (e alelos, fe- nótipos e genótipos destes). Esses isotipos se ligam com afinidades diferenciadoras a IgG monomérica e imunocomplexado. (3) C1g - O primeiro componente da via complementar clássica é C1, que existe no soro do sangue como um complexo de três proteínas, C1q, C1r e C1s. A via complementar clássica é ativada quando C1q se liga às regiões Fc de IgG ou IgM ligada ao antígeno. Embora a ligação de C1q a uma região Fc seja fraca, C1q pode formar ligações fortes com um grupo de regiões Fc. Nesse ponto, C1 se torna proteoliticamente ativo. Nesse ponto, C1 se torna proteoliticamente ativo.

[0020] A formação de imunocomplexo via interações entre as regiões Fc da imunoglobulina e outros anticorpos ou outros fatores (por exemplo, aqueles descritos acima) é referida aqui como "formação do imunocomplexo mediado por Fc" ou como "a formação mediada por Fc de um imunocomplexo". Imunocomplexos contendo tais interações são denominados "imunocomplexos mediados por Fc". Imunocomplexos mediados por Fc podem incluir moléculas de imunoglobulina com ou sem antígeno ligado, e incluem tipicamente ligantes específicos da abertura CH2-CH3 que têm afinidade mais alta por anticorpos imu- nocomplexados que para anticorpos monoméricos. Polipeptídeos purificados

[0021] Como usado aqui, um "polipeptídeo" é qualquer cadeia de resíduos de aminoácidos, independente da modificação pós- traducional (por exemplo, fosforilação ou glicosilação). Os polipeptí- deos proporcionados aqui estão tipicamente entre 10 e 50 aminoáci- dos de comprimento (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos de comprimento). Os polipeptídeos que estão entre 10 e 20 aminoácidos de comprimento (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos de comprimento) podem ser particularmente úteis.

[0022] As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos proporci- onados aqui são pouco restritas, mas podem ter alguma variabilidade. Por exemplo, os polipeptídeos proporcionados aqui incluem tipicamente a sequência de aminoácidos Xaa1-Cys-Ala-Xaa2-His-Xaa3-Xaa4- Xaa5-Leu-Val-Trp-Cys-Xaa6 (SEQ ID NO: 1), em que os resíduos representados por Xaan podem exibir variabilidade. Por exemplo, Xaa1 pode estar ausente ou pode ser qualquer aminoácido (por exemplo, Arg ou Asp). Xaa2 pode ser Phe, Tyr, Trp, 5-Hidroxitriptofano (5-HTP), ou Arg. Xaa3 pode ser qualquer aminoácido. Xaa4 pode ser Gly our Ala, enquanto Xaa5 pode ser Glu ou Ala. Como Xaa1, Xaa6 pode também estar ausente ou pode ser qualquer aminoácido.

[0023] Em uma modalidade, um polipeptídeo pode incluir a sequência de aminoácidos Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val- Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 2). Alternativamente, um polipeptídeo pode incluir a sequência de aminoácidos Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu- Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 3)) ou Asp-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly- Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 4). Em outra modalidade, um polipeptídeo pode incluir a sequência de aminoácidos Arg-Cys-Ala- Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 5), Arg-Cys- Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 6), ou Arg- Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 7).

[0024] Em outra modalidade, um polipeptídeo pode incluir a sequência de aminoácidos Cys-Ala-Xaa-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp- Cys (SEQ ID NO: 8), na qual Xaa pode ser Phe, Tyr, Trp, ou Arg. Por exemplo, esse documento proporciona polipeptídeos que incluem as seguintes sequências de aminoácidos: Cys-Ala-Xaa-His-Leu-Gly-Glu- Leu-Val-Trp-Cys (SEQ ID NO: 8), Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu- Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 9), Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu- Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 10), e Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu- Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 11).

[0025] Os polipeptídeos proporcionados aqui podem ser modifica- dos para uso in vivo por adição, na extremidade amino ou carbóxi terminal, de um agente estabilizante para facilitar a sobrevivência do poli- peptídeo in vivo. Isso pode ser útil em situações nas quais as terminações dos peptídeos tendem a se degradarem por proteases antes da absorção celular. Tais agentes bloqueadores podem incluir, sem limitação, sequências de peptídeos relacionadas ou não relacionadas que podem ser ligadas aos resíduos amino-e/ou carbóxi terminal do poli- peptídeo (por exemplo, um grupo acetila ligado ao aminoácido N- terminal ou um grupo amida ligado ao aminoácido C-terminal). Tal ligação pode ser obtida tanto quimicamente, durante a síntese do polipep- tídeo, como por tecnologia de DNA recombinante usando métodos familiares àqueles com conhecimento ordinário da técnica. Alternativamente, agentes bloqueadores, tais como ácido piroglutâmico ou outras moléculas conhecidas da técnica podem ser ligados aos resíduos amino e/ou carbóxi terminal, ou o grupo amino na terminação amino ou o grupo carbóxi na terminação carbóxi podem ser substituídos com uma fração diferente.

[0026] Uma prolina ou uma sequência de Xaa-Pro-Pro (por exemplo, Ala-Pro-Pro) na terminação amino pode ser particularmente útil (vide, por exemplo, WO 00/22112). Por exemplo, um polipeptídeo pode incluir a sequência de aminoácidos Xaa1-Pro-Pro-Cys-Ala-Xaa2-His- Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 12), na qual Xaa1 é qualquer aminoácido (por exemplo, Ala), e Xaa2 é Trp, Tyr, Phe, ou Arg. Por exemplo, um polipeptídeo pode incluir a sequência de amino- ácidos Xaa-Pro-Pro-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 13), Ala-Pro-Pro-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val- Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 14), Xaa-Pro-Pro-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly- Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 15), Ala-Pro-Pro-Cys-Ala-Arg- His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 16), Xaa-Pro-Pro- Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 17), ou Ala-Pro-Pro-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 18). Alternativamente, um polipeptídeo pode incluir a sequência de aminoácidos Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly- Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 19), Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala- Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 20), Xaa-Pro- Pro-Asp-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 21), Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp- Cys-Thr (SEQ ID NO: 22), Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly- Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 23), Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala- Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 24), Xaa-Pro- Pro-Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 25), Ala-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp- Cys-Thr (SEQ ID NO: 26), Xaa-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly- Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 27), Ala-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala- Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 28), Xaa-Pro- Pro-Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 29), ou Ala-Pro-Pro-Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val- Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 30), em que Xaa na primeira posição é qualquer aminoácido.

[0027] Os polipeptídeos proporcionados aqui podem ter uma sequência Pro-Pro-Xaa (por exemplo, Pro-Pro-Ala) nas suas terminações carbóxi. Por exemplo, um polipeptídeo pode incluir a sequência de aminoácidos Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro- Pro-Xaa (SEQ ID NO: 31), Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp- Cys-Thr-Pro-Pro-Ala (SEQ ID NO: 32), Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu- Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 33), Cys-Ala-Arg-His- Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala (SEQ ID NO: 34), Cys- Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 35), Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro- Ala (SEQ ID NO: 36), Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp- Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 37), Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly- Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala (SEQ ID NO: 38), Asp-Cys-Ala- Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 39), Asp-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro- Ala (SEQ ID NO: 40), Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp- Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 41), Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly- Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala (SEQ ID NO: 42), Arg-Cys-Ala- Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro- Pro-Xaa (SEQ ID NO: 43), Arg-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro- ProAla (SEQ ID NO: 44), Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp- Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 45), Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly- Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Ala (SEQ ID NO: 46), Arg-Cys-Ala- Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 47), ou Arg-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Pro- Pro-Ala (SEQ ID NO: 48), em que Xaa pode ser qualquer aminoácido.

[0028] Em algumas modalidades, os polipeptídeos proporcionados aqui podem incluir sequências de aminoácidos adicionais na terminação amino da sequência estabelecida em SEQ ID NO: 1, a terminação carbóxi da sequência estabelecida em SEQ ID NO: 1, ou ambas. Por exemplo, um polipeptídeo pode conter a sequência de aminoácidos Trp-Glu-Ala-Xaa1-Cys-Ala-Xaa2-His-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Leu-Val-Trp-Cys- Xaa6-Lys-Val-Glu-Glu (SEQ ID NO: 49), em que os resíduos denotados por Xaan podem exibir variabilidade. Quanto à sequência estabelecida em SEQ ID NO: 1, Xaa1 pode estar ausente ou pode ser qualquer aminoácido (por exemplo, Arg ou Asp); Xaa2 pode ser Phe, 5- http, Trp, ou Arg; Xaa3 pode ser qualquer aminoácido; Xaa4 pode ser Gly ou Ala; Xaa5 pode ser Glu ou Ala; e Xaa6 pode estar ausente ou pode ser qualquer aminoácido. Em alguma modalidade, um polipeptí- deo pode incluir a sequência de aminoácidos Trp-Glu-Ala-Asp-Cys- Ala-Xaa-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Lys-Val-Glu-Glu (SEQ ID NO: 50), em que Xaa é Arg, Trp, 5-http, Tyr, ou Phe. Por exemplo, um polipeptídeo pode incluir a sequência de aminoácidos Trp-Glu-Ala- Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Lys-Val-Glu-Glu (SEQ ID NO: 51).

[0029] Em outra modalidade, um polipeptídeo pode consistir na sequência de aminoácidos (Xaa1)m-Xaa2-Cys-Ala-Xaa3-His-Xaa4-Xaa5- Xaa6-Leu-Val-Trp-Cys-(Xaa7)n (SEQ ID NO: 52), em que os resíduos denotados por Xaa podem exibir variabilidade, e m e n podem ser, independentemente, números inteiros de 0 a 10 (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10). Por exemplo, Xaa1 pode ser qualquer aminoáci- do; Xaa2 pode estar ausente ou pode ser qualquer aminoácido (por exemplo, Arg ou Asp); Xaa3 pode ser Phe, Tyr, 5-http, Tpr, ou Arg; Xaa4 pode ser qualquer aminoácido; Xaa5 pode ser Gly ou Ala; Xaa6 pode ser Glu ou Ala; Xaa7 pode ser qualquer aminoácido; e m e n pode ser de 0 a 5 (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4 ou 5). Alternativamente, um polipeptídeo pode consistir na sequência de aminoácidos (Xaa1)m-Cys- Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n (SEQ ID NO: 53), em que Xaa1 é qualquer aminoácido, Xaa2 é Phe ou Arg, Xaa3 é qualquer aminoácido, e m e n são, independentemente, números inteiros de 0 a 5 (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, ou 5). Exemplos de polipeptí- deos dentro dessas modalidades incluem, sem limitação, polipeptídeos consistindo na sequência de aminoácidos Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Asp- Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala (SEQ ID NO: 54), Ala-Ala-Arg-Cys-Ala-Arg-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val- Trp-Cys-Thr-Ala-Ala (SEQ ID NO: 55), ou Ala-Ala-Ala-Asp-Cys-Ala- Phe-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr-Ala-Ala (SEQ ID NO: 56).

[0030] As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos descritos aqui contêm tipicamente dois resíduos de cisteína. Os polipeptídeos contendo essas sequências de aminoácidos podem ciclizar devido à formação de uma ponte de dissulfeto entre os dois resíduos de cisteí- na. A pessoa versada na técnica pode, por exemplo, usar o Reagente de Ellman para determinar se um peptídeo contendo resíduos múltiplos de cisteína é ciclizado. Em algumas modalidades, esses resíduos de cisteína podem ser substituídos com outros resíduos de aminoáci- dos naturais ou não-naturais que podem formar ligações de lactam em vez pontes de dissulfeto. Por exemplo, um resíduo de cisteína poderia ser substituído com ácido aspártico ou ácido glutâmico, enquanto o outro poderia ser substituído com ornitina ou lisina. Qualquer uma dessas combinações poderia render uma ponte de lactam, um polipep- tídeo proporcionado aqui pode ser gerado o qual contém uma ponte aproximadamente igual em comprimento à ponte de dissulfeto que seria a formação se dois resíduos de cisteína estivessem presentes no polipeptídeo.

[0031] Os polipeptídeos proporcionados aqui podem conter um marcador de aminoácido. Um "marcador" é geralmente uma sequência curta de aminoácidos que proporciona meio rápido de detecção ou de purificação através de interações com um anticorpo contra o marcador ou através de outros compostos ou moléculas que reconhecem o marcador. Por exemplo, marcadores tais como c-myc, hemaglutinina, poli- hisitidina, ou Flag® podem ser usados para auxiliar a purificação e detecção de um polipeptídeo. Como exemplo, um polipeptídeo com um marcador de poli-histidina pode ser purificado com base na afinidade de resíduos de histidina por íons níquel (por exemplo, em uma coluna de Ni-NTA), e pode ser detectado em Western blots por um anticorpo versus poli-histidina (por exemplo, o anticorpo Penta-His; Qiagen, Valencia, CA). Os marcadores podem ser inseridos em qualquer local dentro da sequência de polipeptídeos, embora a inserção na terminação amino ou carbóxi seja particularmente útil.

[0032] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais, aminoácidos não-naturais, e análogos de aminoácidos, todos em seus estereoisômeros D e L se suas estruturas assim permitirem. Aminoáci- dos naturais incluem alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gln), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano (Trp), tirosina (Tyr), e valina (Val). Aminoáci- dos não-naturais incluem, mas sem limitação, 5-hidroxitriptofano, ácido azetidinacarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, be- ta-alanina, ácido aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4- aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-amino-heptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 30aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxiisi- na, allo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilsioleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina, e ácido pipecólico.

[0033] Um "análogo" é um composto químico que é estruturalmente similar a outro, mas difere levemente na composição (como na substituição de um átomo por um átomo de um elemento diferente ou na presença de um grupo funcional particular). Portanto, um "análogo de aminoácido" é estruturalmente similar a uma molécula de aminoá- cido de ocorrência natural conforme é tipicamente encontrada em poli- peptídeos nativos, mas difere na composição de modo que ou o grupo carbóxi C-terminal, o grupo amino N-terminal, ou o grupo funcional de cadeia lateral foi quimicamente modificado para outro grupo funcional. Análogos de aminoácidos incluem aminoácidos naturais e não-naturais que são quimicamente bloqueados, reversível ou irreversivelmente, ou modificados em seu grupo amino N-terminal ou em seus grupos de cadeia lateral, e incluem, por exemplo, sulfóxido de metionina, metio- nina sulfona, S-(carboximetil)-cisteína, sulfóxido de S-(carboximetil)- cisteína e S-(carboximetil)-cisteína sulfona. Análogos de aminoácidos podem ser naturais, ou podem ser sinteticamente preparados. Exemplos não limitativos de análogos de aminoácidos incluem 5- Hidroxitriptofano (5-http), ácido aspártico-(éster beta-metílico), um análogo do ácido aspártico; N-etilglicina, um análogo de glicina; e alanina carboxamida, um análogo de alanina. Outros exemplos de aminoáci- dos e análogos de aminoácidos foram listados por Gross e Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., New York (1983).

[0034] A estereoquímica de um peptídeo pode ser descrita em termos do arranjo topoquímico das cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos em torno da cadeia principal do polipeptídeo, que é definida pelas ligações peptídicas entre os resíduos de aminoácidos e os átomos de α-carbono dos resíduos ligados. Além disso, as cadeias principais dos polipeptídeos têm terminações distintas e assim direção. A maioria dos aminoácidos naturais é de L-aminoácidos. Polipeptídeos naturais são amplamente compreendidos de L-aminoácidos.

[0035] D-aminoácidos são os enantiômeros de L-aminoácidos e podem formar peptídeos que são aqui referidos como polipeptídeos "inversos" (ou seja, peptídeos correspondentes aos peptídeos nativos, mas preparados de D-aminoácidos em vez de L-aminoácidos). Um po- lipeptídeo "retro" é preparado de L-aminoácidos, mas tem uma sequência de aminoácidos na qual os resíduos de aminoácidos são montados na direção oposta da sequência dos peptídeos nativos.

[0036] Modificação "retro-inverso" de polipeptídeos naturais envolve a montagem sintética dos aminoácidos com estereoquímica de a- carbono oposta àquela dos L-aminoácidos correspondentes (isto é, Dou D-alo-aminoácidos), na ordem inversa com respeito à sequência de polipeptídeos nativos. Um análogo retro-inverso tem assim termina ções reversas e direção reversa das ligações peptídicas, enquanto mantém a topologia das cadeias laterais como nas sequências de pep- tídeos nativos. O termo "nativo" refere-se a qualquer sequência de L- aminoácidos usados como sequência de partida para a preparação de análogos retros, inversos ou retro-inversos parciais ou completos.

[0037] Análogos de polipeptídeos, retro-inversos, parciais são po- lipeptídeos nos quais somente parte da sequência está revertida e substituída com resíduos de aminoácidos enantioméricos. Já que a porção retro-invertida de tal análogo tem amino e carboxil terminações revertidas, os resíduos de aminoácidos que flanqueiam a porção retro- invertida podem ser substituídos por diaminometanos geminais a- substituídos, análogos de cadeia lateral e malonatos, respectivamente. Alternativamente, um polipeptídeo pode ser um análogo retro-inverso completo, no qual a sequência inteira é revertida e substituída com D- aminoácidos.

[0038] Este documento também proporciona compostos peptido- miméticos que são desenhados com base nas sequências de aminoá- cidos de polipeptídeos. Compostos peptidomiméticos são compostos não peptídicos, sintéticos tendo conformação tridimensional (isto é, um "motivo de peptídeo") que é substancialmente a mesma que a conformação tridimensional de um peptídeo selecionado, e pode assim conferir função igual ou similar àquela do peptídeo selecionado, e pode assim conferir. Compostos peptidomiméticos podem ser desenhados para mimetizar qualquer um dos polipeptídeos proporcionados aqui.

[0039] Os compostos peptidomiméticos que são resistentes a proteases são particularmente úteis. Além disso, os compostos peptido- miméticos podem ter características adicionais que intensificam a utilidade terapêutica, tais como permeabilidade celular aumentada e meia- vida biológica prolongada. Tais compostos têm tipicamente uma cadeia principal que é parcial ou completamente não peptídica, mas com gru- pos laterais que são idênticos ou similares aos grupos laterais dos resíduos de aminoácidos que ocorrem no peptídeo no qual o composto peptidomimético é baseado. Vários tipos de ligações químicas (por exemplo, éster, tioéster, tioamida, retroamida, carbonila reduzida, di- metileno e cetometileno) são conhecidos da técnica como substituintes úteis para ligações peptídicas na construção de compostos peptido- miméticos.

[0040] As interações entre um polipeptídeo conforme descrito aqui e uma molécula de imunoglobulina ocorrem tipicamente através da abertura CH2-CH3 da imunoglobulina. Tais interações são engendradas através da proximidade física e são mediadas, por exemplo, por interações hidrofóbicas. A "afinidade de ligação" de um polipeptídeo por uma molécula de imunoglobulina refere-se à resistência da interação entre o polipeptídeo e a imunoglobulina. Afinidade por ligação é tipicamente expressa como uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd), que é calculada como Kd = koff/kon, em que koff = a constante de dissociação cinética da reação. Kd é expressa como concentração, com um valor de Kd baixo (por exemplo, menos que 100nM) que significa afinidade alta. Os polipeptídeos que podem interagir com uma molécula de imunoglobulina têm tipicamente uma afinidade de ligação de pelo menos 1μM (por exemplo, pelo menos 500nM, pelo menos 100nM, pelo menos 50nM, ou pelo menos 10nM) para a abertura CH2- CH3 da imunoglobulina.

[0041] Os polipeptídeos proporcionados aqui podem se ligar com afinidade substancialmente equivalente às moléculas de imunoglobuli- na que são ligadas por antígeno e às imunoglobulinas monoméricas. Alternativamente, os polipeptídeos descritos aqui podem ter uma afinidade de ligação maior (por exemplo, pelo menos 10 vezes, pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes a afinidade de ligação) para moléculas de imunoglobulina que são ligadas por antígeno que para as imunoglobulinas monoméricas. Alterações conformacionais que ocorrem dentro da região Fc de uma molécula de imunoglobulina mediante a ligação de antígeno à região Fab estão provavelmente envolvidas na diferença de imunidade. As estruturas de cristais de Fab NC6.8 ligado e não ligado (proveniente de um anticorpo monoclonal de murino) mostraram que a cauda de cadeia pesada do Fab foi deslocada de 19 angstroms em cristais do complexo de antígeno/anticorpo, em comparação sua posição no Fab ligado (Guddat et al. (1994) J. Mol. Biol. 236-247-274). Já que a cauda C-terminal da região Fab está conectada à região de um anticorpo intacto, seria esperado que esse deslocamento afetasse a conformação da abertura CH2-CH3. Além disso, o exame de várias estruturas tridimensionais de imunoglobulinas intactas revelaram uma conexão física direta entre a cadeia pesada do Fab e a abertura CH2-CH3 do Fc ((Harris et al. (1997) Biochemistry 36:1581-1597; Saphire et al. (2001) Science 293:1155-1159).

[0042] A modelação molecular da abertura CH2-CH3 da IgG mo- nomérica (isto é, não ligada) e imunocomplexada descreve que a abertura CH2-CH3 de Fc monomérico tem uma configuração fechada, que pode impedir a ligação a resíduos de aminoácidos críticos (por exemplo, His 435; vide, por exemplo, O'Brien et al. (1994) Arch. Biochem. Biophys. 310:25-31; Jefferies et al. (1984) Immunol. Lett. 7:191-194; e West et al. (2000) Biochemistry 39:9698-9708). Contudo, IgG imu- nocomplexada (não ligada a antígeno) tem configuração mais aberta e assim tem maior tendência à ligação de ligante. A afinidade por ligação de RF para IgG imunocomplexada é, por exemplo, muito maior que a afinidade de ligaçaõ de RF para IgG monomérica (Corper et al. (1997) Nat. Struct. Biol. 4:374; Sohi et al. (1996) Immunol. 88:636). Tipicamente, o mesmo é verdadeiro para os polipeptídeos proporcionados aqui.

[0043] Devido ao fato de os polipeptídeos descritos aqui poderem se ligar à abertura CH2-CH3 de moléculas de imunoglobulina, eles podem ser úteis para bloquear a interação de outros fatores (por exemplo, FcRn, FcR, C1q, histonas, MPD, SOD1 e outras imunoglobulinas) à região Fc da imunoglobulina e assim podem inibir a formação do imunocomplexo mediado por Fc. Por "inibir" se quer dizer que a formação do imunocomplexo mediada por Fc é reduzida em presença de um polipeptídeo proporcionado aqui, em comparação com o nível de formação de imunocomplexo na ausência do polipeptídeo. Tal inibição pode ocorrer in vitro (por exemplo, em um tubo de ensaio) ou in vivo (por exemplo, em um indivíduo). Qualquer método adequado pode ser usado para avaliar o nível de formação do imunocomplexo. Muitos de tais métodos são conhecidos da técnica, e alguns destes estão descritos aqui.

[0044] Os polipeptídeos descritos aqui interagem, tipicamente, com a abertura CH2-CH3 de uma molécula de imunoglobulina em modo monomérico (isto é, interagem somente com uma molécula de imuno- globulina e assim não ligam duas ou mais moléculas de imunoglobuli- na juntas) com 1:2 de Fc de IgG para estequiometria do peptídeo. Portanto, as interações com outras moléculas de imunoglobulina através da região Fc são impedidas pela presença do polipeptídeo. A inibição da formação do imunocomplexo mediado por Fc pode ser avaliado in vitro, por exemplo, incubando-se uma molécula de IgG com uma molécula de imunoglobulina marcada (por exemplo, fluorescentemente ou com Receptor de Fc marcado com enzima (ELISA) ou C1q ) em presença ou na ausência de um polipeptídeo, e medindo-se a quantidade de imunoglobulina marcada que é incorporada em um imunocomplexo. Outros métodos adequados para detectar a formação do imunocom- plexo podem ser usados também, conforme discussão abaixo. Preparação e Purificação de Polipeptídeos

[0045] Os polipeptídeos podem ser produzidos por vários méto- dos, muitos dos quais são bem conhecidos da técnica. A título de exemplo e não de limitação, um polipeptídeo pode ser obtido por extração de uma fonte natural (por exemplo, de células isoladas, tecidos ou fluidos corporais), por expressão de um ácido nucleico recombinan- te que codifica o polipeptídeo (como, por exemplo, descrito abaixo, ou por síntese química ou outros métodos bem conhecidos da técnica, incluindo a síntese com um sintetizador de peptídeo ABI; Applied Biosystems, Foster City, CA). Os métodos para sintetizar análogos de polipeptídeos retro-inversos (Bonelli et al. (1984) Int. J. Peptide Protein Res. 24:553-556; e Verdini e Viscomi (1985) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I:697-701), e alguns processos para a síntese em fase sólida de análogos de peptídeos retro-inversos parciais foram também descritos (vide, por exemplo, a Patente EP0097994).

[0046] Esse documento proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os polipeptídeos descritos aqui. Como usado aqui, "ácido nucleico" refere-se tanto ao RNA como ao DNA, incluindo cDNA, DNA genômico, e DNA sintético (por exemplo, quimicamente sintetizado). O ácido nucleico pode ser de fita dupla ou de fita simples (isto é, uma fita simples sentido ou antissentido). O termo "isolado", como usado aqui com referência a um ácido nucleico, refere-se a um ácido nucleico de ocorrência natural que não está imediatamente contíguo a ambas as sequências com as quais ele está imediatamente contíguo (uma na extremidade 5' e uma na extremidade 3') no genoma de ocorrência natural do organismo do qual é derivado. O termo "iso-lado", como usado aqui com respeito aos ácidos nucleicos, inclui também qualquer sequência de ácido nucleicos de ocorrência não natural, já que tais sequências de ocorrência não natural são encontradas na natureza e não têm sequências imediatamente contíguas em um ge- noma de ocorrência natural.

[0047] Um ácido nucleico isolado pode ser, por exemplo, uma mo- lécula de DNA, desde que uma das sequências de ácidos nucleicos que não está normalmente contígua à molécula de DNA em um geno- ma de ocorrência natural seja removida ou esteja ausente. Assim, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, uma molécula de DNA que existe com uma molécula separada (por exemplo, um ácido nucleico quimicamente sintetizado, ou um cDNA ou fragmento de DNA genômi- co produzido por PCR ou tratamento com endonuclease de restrição) independente de outras sequências bem como do DNA que está in-corporado em vetor, um plasmídeo autonomamente replicador, um vírus (por exemplo, um retrovírus, lentivírus, adenovírus, ou vírus do herpes), ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto. Além disso, um ácido nucleico isolado pode incluir um ácido nucleico enge- nheirado tal como uma molécula de DNA recombinante que é parte de um híbrido ou ácido nucleico de fusão. Um ácido nucleico existente entre centenas a milhões de outros ácidos nucleicos dentro de, por exemplo, bibliotecas de cDNA ou bibliotecas genômicas, ou fatias de gel contendo digestão de restrição de DNA genômico, não é considerado um ácido nucleico isolado.

[0048] Este documento proporciona também vetores contendo os ácidos nucleicos descritos aqui. Como usado aqui, um "vetor" é um replicon, tal como um plasmídeo, fago, ou cosmídeo, no qual outro segmento de DNA pode ser inserido para produzir a replicação do segmento inserido. Os polipeptídeos podem ser desenvolvidos usando-se, por exemplo, phage display. Métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica podem usar phage display para desenvolver os polipeptídeos descritos aqui. Os vetores podem ser, por exemplo, vetores de expressão nos quais os nucleotídeos codificam os polipeptídeos descritos aqui com metionina iniciadora, operavelmente ligada a sequências de controle de expressão. Como usado aqui, "operavelmente ligado" significa incorporado a uma construção genética de modo que as sequências de controle de expressão controlam eficazmente uma sequência de codificação de interesse. Uma "sequência de controle de expressão" é uma sequência de DNA que controla e regular a transcrição e tradução outra sequência de DNA, e um "vetor de expressão" é um vetor que inclui sequências de controle de expressão, de modo que um segmento de DNA relevante incorporado no vetor é transcrito e traduzido. Uma sequência de codificação está "operavelmente ligada" e "sob o controle" de sequências de controle transcricionais ou tra- ducionais em uma célula quando a RNA polimerase transcreve a sequência de codificação para mRNA, que então é traduzida para a proteína codificada pela sequência de codificação.

[0049] Métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica podem ser usados para subclonar moléculas isoladas de ácidos nu- cleicos que codificam polipeptídeos de expressão em vetores de expressão contendo sequências de codificação relevantes e sinais de controle transcricionais/traducionais apropriados. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edição), Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York (1989). Vetores de expressão podem ser usados em uma variedade de sistemas (por exemplo, bactérias, leveduras, células de insetos, e células de mamíferos), conforme descritos aqui. Exemplos de vetores de expressão adequados incluem, sem limitação, plasmídeos e vetores virais derivados de, por exemplo, vírus do herpes, retrovírus, vírus da vacínia, adenovírus e vírus adeno- associados. Uma ampla variedade de vetores de expressão e sistemas adequados estão comercialmente disponíveis, incluindo a série pET de vetores de expressão bacteriana (Novagen, Madison, WI), o sistema de expressão Adeno-X (Clontech), o sistema de expressão de baculovírus Baculogold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) e o vetores pCMV-Tag (Stratagene, La Jolla, CA).

[0050] Vetores de expressão que codificam os polipeptídeos descritos aqui podem ser usados para produzir os polipeptídeos. Sistemas de expressão que podem ser usados em produção de pequena ou larga escala de polipeptídeos incluem, sem limitação, micro-organismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B.subitilis) transformadas com DNA bacteriofágico recombinante, DNA de plasmídeo, ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo contendo as moléculas de ácidos nucleicos proporcionadas aqui; levedura (por exemplo, S. cerevisae) transformada com vetores de expressão de levedura recombinantes contendo as moléculas de ácido nucleico da invenção; sistemas de células de inseto infectadas com vetores de expressão de vírus re- combinantes (por exemplo, baculovírus) contendo as moléculas de ácido nucleico proporcionadas aqui; sistemas celulares vegetais com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico do tabaco) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo as moléculas de ácido nucleico proporcionadas aqui; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células primárias ou linhagens de células imortalizadas tais como células COS, células CHO, células HeLa, células HEK 293, e células 3T3 L1) compreendendo construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, o promotor de metalotioneína) ou de vírus mamíferos (por exemplo, o promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor recente de adenovírus ou o promotor de citomegalovírus), juntamente com os ácidos nuclei- cos proporcionados aqui.

[0051] A expressão "polipeptídeo purificado", como usada aqui, refere-se a um polipeptídeo que ou não tem equivalente de ocorrência natural (por exemplo, um peptidomimético), ou foi quimicamente sinte- tizado e foi assim descontaminado por outros polipeptídeos, ou que tenha sido separado ou purificado de outros componentes celulares dos quais ele é naturalmente acompanhado (por exemplo, outras proteínas celulares, polinucleotídeos, ou componentes celulares). Tipicamente, o polipeptídeo é considerado "purificado" quando ele é pelo menos 70% em peso seco, isento das proteínas e moléculas orgânicas de ocorrência natural com as quais ele se associa naturalmente. Portanto, uma preparação de polipeptídeo purificado pode ser, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 99%, em peso seco, do polipeptídeo. Métodos adequados para purificar polipeptídeos podem incluir, por exemplo, cromatografia por afinidade, imunoprecipi- tação, cromatografia por exclusão de tamanho, e cromatografia de troca iônica. A extensão da purificação pode ser medida por qualquer mé-todo apropriado, incluindo, mas sem limitação: cromatografia em coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida, ou cromatografia líquida de alto desempenho. Métodos de modelação, desenho, e identificação de compostos

[0052] Este documento proporciona métodos para desenhar, modelar e identificar compostos que podem se ligar à abertura CH2-CH3 de uma molécula de imunoglobulina e assim servem como inibidores de formação de imunocomplexo mediado por Fc. Tais compostos são também referidos aqui como "ligantes". Os compostos desenhados, modelados e identificados por estes métodos podem tipicamente interagir com uma molécula de imunoglobulina através da abertura CH2- CH3, e têm tipicamente afinidade de ligação de pelo menos 1μM (por exemplo, pelo menos 500nM, pelo menos 100nM, pelo menos 50nM, ou pelo menos 10nM) para a abertura CH2-CH3 da imunoglobulina. Tais compostos têm geralmente maior afinidade de ligação (por exemplo, pelo menos 10 vezes, pelo menos 100 vezes, ou pelo 1.000 vezes de afinidade de ligação) para moléculas de imunoglobulina imunocom- plexadas que para moléculas de imunoglobulina monoméricas.

[0053] Os compostos interagem com a abertura CH2-CH3 de uma molécula de imunoglobulina de um modo monomérico (isto é, interagirem com somente uma molécula de imunoglobulina e assim não se ligam a duas ou mais moléculas de imunoglobulina juntas). As interações entre um composto e uma molécula de imunoglobulina envolvem tipicamente os resíduos de aminoácidos nas posições 252, 253, 435, e 436 da imunoglobulina (número de acordo com Kabat, supra). Por exemplo, SEQ ID NO: 20 (NB-406) pode ter empacotamento hidrofóbi- co Fc de Ig Met-252, Ile-253, Ser-254, His-435 e Tyr-436 (por exemplo, o anel de indol de Trp-14 em SEQ ID NO: 20 pode ter uma interação hidrofóbica com Fc de IgG His-435). Substituição de alanina de Fc de IgG Asn-434, His-435 ou Tyr-436 pode romper a ligação (ΔΔ G> 1,5 kcal/mol). Além disso, a substituição de alanina da Val-13 ou Trp-14 da SEQ ID NO: 20 pode resultar no rompimento de ligação (ΔΔG>2,0 kcal/mol).

[0054] A interação entre os compostos e a abertura CH2-CH3 produz os compostos de inibir a formação mediada por Fc de imunocom- plexos por bloqueio da ligação de outros fatores (por exemplo, interações de Fc:Fc, FcyRs, histonas, MPB, MOG, RF, proteína Tau, α- sinucleína, SODI, TNF e C1q) a abertura CH2-CH3.

[0055] Os compostos identificados pelos métodos proporcionados aqui podem ser polipeptídeos, tais como, por exemplo, aqueles descritos. Alternativamente, um composto pode ser qualquer tipo adequado de molécula que pode se ligar especificamente a abertura CH2-CH3 de uma molécula de imunoglobulina.

[0056] "Modelação" significa análise quantitativa e/ou qualitativa da estrutura do receptor-ligante/função com base em informação estrutural tridimensional e modelos de interação de receptor-ligante. Isso significa modelos dinâmicos moleculares com base numérica e de mi- nimização de energia, convencionais, modelos gráficos por computação interativa, modelos de mecânica molecular modificada, geometria de distância e outros modelos de restrição com base em estrutura. Tipicamente, a modelação é realizada usando-se um computador e pode ser ainda otimizada usando-se métodos conhecidos.

[0057] Os métodos para desenhar ligantes que se ligam especificamente (isto é, com alta afinidade) a abertura CH2-CH3 de uma molécula de imunoglobulina tendo antígeno ligado são tipicamente baseados em computador, e envolvem o uso de um computador tendo um programa capaz de gerar um modelo atômico. Programas de computador que usam dados de cristalografia por raios X são particularmente úteis para desenhar ligantes que podem interagir com uma abertura CH2-CH3. Programas, tal como TasMol, por exemplo, podem ser usados para gerar um modelo tridimensional de uma abertura CH2-CH3 e/ou para determinar as estruturas envolvidas na ligação de ligante. Os programas de computador, tais como INSIGHT (Accelrys, Burlington, MA), GRASP (Anthony Nicholls, Columbia Universtity), Dock (Molecular Design Institute, University of California em São Francisco), e Auto-Dock (Accelrys) permitem subsequente manipulação e a capacidade de introdução de novas estruturas.

[0058] Os métodos podem incluir, por exemplo, proporcionar a um computador as coordenadas estruturais atômicas para resíduos de aminoácidos dentro da abertura CH2-CH3 (por exemplo, resíduos de aminoácidos nas posições 252, 253, 435 e 436 da abertura) de uma molécula de imunoglobulina em um imunocomplexo mediado por Fc, usando o computador para gerar um modelo atômico da abertura CH2- CH3, proporcionando, assim, as coordenadas estruturais atômicas de um composto candidato e gerando um modelo atômico do composto otimamente posicionado dentro da abertura CH2-CH3, e identificando o composto candidato como um ligante de interesse se o composto inte rage com os resíduos de aminoácidos nas posições 252, 253, 435 e 436 da abertura. Os dados fornecidos ao computador podem também incluir as coordenadas atômicas de resíduos de aminoácidos nas posições além de 252, 253, 435, e 436. "Posicionado otimamente" significa posicionado para otimizar as interações hidrofóbicas entre o composto candidato e os resíduos de aminoácidos nas posições 252, 253, 435 e 436 da abertura CH2-CH3.

[0059] Alternativamente, um método para desenhar um ligante que tem afinidade de ligação específica para a abertura CH2-CH3 de uma molécula de imunoglobulina pode utilizar um computador com um modelo atômico da abertura CH2-CH3 armazenado em sua memória. Então as coordenadas atômicas de um composto candidato podem ser fornecidas ao computador, e um modelo atômico do composto candidato otimamente posicionado pode ser gerado. Conforme descrito, um composto candidato pode ser identificado como um ligante que tem afinidade de ligação específica para a abertura CH2-CH3 de uma molécula de imunoglobulina se, por exemplo, o composto interage com os resíduos nas posições 252, 253, 435, e 436 da abertura.

[0060] Tais métodos mostraram que Fc de IgG monomérica (ligado a não-antígeno) se liga em um sítio distinto da abertura CH2-CH3 do Fc da IgG, tal como a região hinge inferior (Wines et al. (2003) Immunol. 109:246-254), enquanto o Fc da IgG (ligado a antígeno) imu- nocomplexada que se liga a FcyIIa é inibido por um fator reumatoide IgM (RF-AN), que tenha sido mostrado por estrutura tridimensional para se ligar somente a abertura de interface Ch2-CH3 de Fc de IgG (Sohi et al. (1996) Immunology 88:636-641; e Corper et al. (1997) Nature Struct. Biol. 4(5):374-381). FcyIIa solúvel inibe a ligação de Fc da IgG (mas não monomérica, não imunocomplexada) imunocomplexada a RF-AN (Wines et al. (2003) Immunol. 109:246-254), e inibidores que se ligam a abertura CH2-CH3 de Fc da IgB, tais como os peptídeos descritos aqui, inibem a ligação de Fc da IgG (ligada a antígeno) imu- nocomplexado.

[0061] Os compostos podem ser também interativamente desenhados a partir da informação estrutural dos compostos descritos aqui usando outras técnicas de desenho/modelação com base na estrutura (vide, por exemplo, Jackson (1997) Seminars in Oncology 24:L164- 172; e Jones et al. (1996) J. Med. Chem. 39:904-917).

[0062] Os compostos e polipeptídeos podem ser também identificados, por exemplo, por identificação dos compostos candidatos por computador como por espacialidade de montagem e preferencialmente (isto é, com afinidade alta) para a abertura CH2-CH3 de uma molécula de imunoglobulina, e então seleção daqueles compostos in vitro ou in vivo quanto à capacidade de inibir a formação de imunocomplexo mediado por Fc. Métodos adequados para tal seleção in vitro e in vivo incluem aqueles descritos aqui. Composições e Artigos Manufaturados

[0063] Este documento proporciona composições e artigos manufaturados que podem ser usados em métodos para o tratamento de condições que surgem da formação anormal de imunocomplexo mediado por Fc (por exemplo, superprodução de imunocomplexos mediados por Fc). Os polipeptídeos, compostos e composições proporcionadas aqui podem ser administrados a um paciente (por exemplo, um humano ou outro mamífero) com infecção viral, por exemplo, que pode ser aliviada por modulação da formação de imunocomplexo mediado por Fc e inibir um Fc de IgG imunocomplexada para mC1q, sC1q, FcyRs e FcRn. Tipicamente, um ou mais polipeptídeos ou compostos podem ser administrados a um paciente suspeito de estar com doença ou condição associada à formação de imunocomplexo. As composi-ções contêm geralmente um ou mais polipeptídeos e compostos descritos aqui. Um polipeptídeo de ligação de CH2-CH3, pode ser, por exemplo, um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, e pode ser administrado em quantidades e por períodos de tempo que variarão dependendo da natureza da doença particular, sua gravidade, e da condição geral do paciente. Tipicamente, o polipeptídeo é administrado em uma quantidade inibidora (isto é, em uma quantidade que é eficaz para inibir a produção de imunocomplexos nas células ou tecidos contatados pelo polipeptídeo). Os polipeptídeos e métodos descritos aqui podem ser também usados profilaticamente, por exemplo, para minimizar a imunorreatividade de um paciente em risco de produção anormal ou superprodução de imunocomplexos (por exemplo, um recipiente de transplante).

[0064] A capacidade de um polipeptídeo de inibir a formação do imunocomplexo mediado por Fc pode ser avaliada, por exemplo, por medição dos níveis do imunocomplexo no paciente antes e depois do tratamento. Vários métodos podem ser usados para medir os níveis do imunocomplexo em tecidos ou amostras biológicas, incluindo aqueles que são bem conhecidos da técnica. Se o paciente é um animal de pesquisa, por exemplo, os níveis do imunocomplexo nas articulações podem ser avaliados por imuno-coloração depois da eutanásia. A eficácia de um polipeptídeo inibidor pode ser também avaliada por métodos diretos tal como medição do nível de imunocomplexos circulantes nas amostras de soro. Alternativamente, métodos indiretos podem ser usados para avaliar a eficácia dos polipeptídeos em pacientes vivos. Por exemplo, a formação reduzida do imunocomplexo pode ser inferida a partir do aperfeiçoamento clínico de doenças imunomediadas ou de modelos in vitro ou in vivo os quais tenham mostrado serem essenciais no uso terapêutico no tratamento de aterosclerose.

[0065] Métodos para formular e subsequentemente administrar composições terapêuticas são bem conhecidos daqueles versados na técnica. A dosagem é geralmente dependente da gravidade e respon- sividade do estado doentio a ser tratado, com o curso do tratamento durando de vários dias a vários meses, ou até a cura ser efetuada ou uma diminuição do estado doentio ser alcançado. Aqueles com conhecimento ordinário da técnica determinarão rotineiramente as dosagens ótimas, metodologias de dosagem e taxas de repetição. As dosagens ótimas podem variar dependendo da potência relativa dos polipeptí- deos individuais, e podem ser geralmente estimadas com base na EC50 que já se sabe ser eficaz nos modelos animais in vitro e in vivo. Tipicamente, a dosagem é de 0,01 μg a 100 g por kg do peso corporal e pode ser dada uma vez ou mais diariamente, bissemanalmente, se-manalmente, mensalmente, ou ainda com frequência menor. Depois do tratamento com sucesso, pode ser desejável que o paciente seja submetido à terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estado doentio.

[0066] O presente documento proporciona composições e formulações farmacêuticas, que incluem os polipeptídeos e/ou compostos descritos aqui. Portanto, os polipeptídeos podem ser misturados, encapsulados, conjugados ou, de outro modo, associados a outras moléculas, estrutura moleculares, ou misturas de compostos tais como, por exemplo, lipossomos, polietileno glicol, moléculas marcadas com receptor, ou formulações orais, retais, tópicas ou outras, para auxiliar na captura, distribuição e/ou absorção.

[0067] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" (também aqui referido como "excipiente") é um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão, ou qualquer outro veículo farmacologica- mente inerte para distribuir um ou mais compostos farmacêuticos (por exemplo, polipeptídeos de ligação de CH2-CH3) a um paciente. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos ou sólidos, e podem ser selecionados com o modo planejado de administração em mente, de forma a proporcionar o volume desejado, consistência, ou outras propriedades de transportes e químicas desejadas, quando em combinação com um ou mais compostos terapêuticos e quaisquer outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Veículos farmaceuticamente aceitáveis que não reagem de modo prejudicial com os aminoácidos incluem, a título de exemplo e sem limitação, água; solução salina; agentes de ligação (por exemplo, polivinilpirroli- dona ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (por exemplo, lactose e outros açúcares, gelatina, ou sulfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, amido, polietileno glicol, ou acetato de sódio); desintegrado- res (por exemplo, amido ou amido glicolato de sódio); e agentes mo- lhantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio).

[0068] As composições farmacêuticas podem ser administradas por vários métodos dependendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser, por exemplo, tópica (por exemplo, transdérmica, sublingual, oftálmica, ou intranasal); pulmonar (por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis); oral; ou parenteral (por exemplo, por injeção subcutânea, intratecal, intraventricular, intramuscular, ou intraperitoneal, ou gotas intravenosas). A administração pode ser rápida (por exemplo, injeção) ou pode ocorrer em um período de tempo (por exemplo, por infusão lenta ou administração de formulações de liberação lenta). Para o tratamento de tecidos no sistema nervoso central, os polipeptí- deos de ligação de CH2-CH3 podem ser administrados por injeção ou infusão no fluido cerebroespinhal, preferivelmente com um ou mais agentes capazes de promover a penetração dos polipeptídeos através da barreira sangue-cérebro.

[0069] Formulações tópicas para polipeptídeos de ligação de CH2- CH3 incluem, por exemplo, soluções aquosas estéreis ou não estéreis, soluções não aquosas em solventes comuns tais como alcoóis, ou soluções em bases líquidas ou bases oleosas sólidas. Tais soluções po- dem conter também tampões, diluentes ou outros aditivos adequados. As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Sprays nasais são particularmente úteis, e podem ser administrados, por exemplo, por um nebulizador ou outro dispositivo de spray nasal. Administração por inalador é também particularmente útil. Veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis.

[0070] As composições e formulações para administração oral incluem, por exemplo, pós, grânulos, suspensões ou soluções em meios aquosos ou não aquosos, cápsulas, sachês, ou comprimidos. Tais composições podem incorporar também espessantes, aromatizantes, diluentes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou ligantes.

[0071] As composições e formulações para administração parenteral, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis, que podem conter também tampões, diluentes e outros aditivos adequados (por exemplo, intensificadores de penetração, compostos de veículos e outros veículos farmaceuticamente aceitáveis).

[0072] As composições farmacêuticas incluem, sem limitação, soluções, emulsões, suspensões aquosas, e formulações contendo li- possomos. Essas composições podem ser geradas a partir de vários componentes que incluem, por exemplo, líquidos pré-formados, sólidos auto-emulsificantes e semissólidos auto-emulsificantes. As emulsões são frequentemente sistemas bifásicos compreendendo duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersas uma na outra; em geral, as emulsões são da variedade de água em óleo (a/o) ou óleo em água (o/a). As formulações das emulsões têm sido usadas amplamente para distribuição oral de produtos terapêuticos devido à sua facilidade de formulação e eficácia de solubilização, absorção e biodisponibilidade.

[0073] Lipossomos são vesículas que têm uma membrana formada de material lipofílico e um interior aquoso que pode conter a composição a ser distribuída. Os lipossomos podem ser particularmente úteis devido à sua especificidade e à duração que eles oferecem do ponto de vista de distribuição do fármaco. As composições de lipos- somos podem ser formadas, por exemplo, a partir de fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidil- glicerol, ou dioleil fosfatidiletanolamina. Numerosos agentes lipofílicos estão comercialmente disponíveis, incluindo Lipofectin® (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA) and EffecteneTM (Qiagen, Valencia, CA).

[0074] Os polipeptídeos englobar ainda quaisquer sais, ésteres ou sais de tais ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro composto que, mediante administração a um animal incluindo um humano, seja capaz de proporcionar (direta ou indiretamente) o metabóli- to biologicamente ativo ou resíduo deste. Por conseguinte, por exemplo, este documento proporciona sais farmaceuticamente aceitáveis de polipeptídeos, profármacos e sais farmaceuticamente aceitáveis de tais profármacos, e outros bioequivalentes. O termo "profármaco" indica um agente terapêutico que é preparado na forma inativa e é convertido na forma ativa (isto é, fármaco) dentro do corpo ou células deste pela ação de enzimas endógenas ou de outros produtos químicos e/ou condições. A expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais fisiológica e farmaceuticamente aceitáveis dos polipeptídeos proporcionados aqui (isto é, sais que retêm a atividade biológica desejada do polipeptídeo parente sem conferir efeitos toxicológicos indese- jados). Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem limitação, sais formados com cátions (por exemplo, sódio, potássio, cálcio, ou poliaminas tal como espermina); sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ou ácido nítrico); e sais formados com ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido palmítico ou ácido fumárico).

[0075] As composições farmacêuticas contendo os polipeptídeos proporcionados aqui podem incorporar também intensificadores de penetração que promovem a distribuição eficaz de polipeptídeos à pele dos animais. Intensificadores de penetração podem intensificar a difusão de ambos os fármacos lipofílicos e não lipofílicos através das membranas celulares. Intensificadores de penetração podem ser classificados como pertencentes a uma das cinco amplas categorias, isto é, tensoativos (por exemplo, lauril sulfato de sódio, polioxietileno-9-éter laurílico e polioxietileno-20-éter cetílico); ácidos graxos (por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, e ácido esteárico); sais da bile (por exemplo, ácido cólico, ácido desidrocólico, e ácido desoxicólico); agentes quelantes (por exemplo, etilenodiaminote- traacetato dissódico, ácido cítrico, e salicilatos); e não-tensoativos (por exemplo, ureias cíclicas insaturadas). Alternativamente, polipeptídeos inibidores podem ser distribuídos via iontoforese, que envolve adesivo transdérmico com carga elétrica para "direcionar" o polipeptídeo atra-vés da derme.

[0076] Algumas modalidades proporcionadas aqui incluem composições farmacêuticas que contêm (a) um ou mais polipeptídeos e (b) um ou mais de outros agentes que funcionam por mecanismo diferente. Por exemplo, fármacos anti-inflamatórios que incluem, mas sem limitação, fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais e corticosteroi- des, e fármacos antivirais, incluindo, mas sem limitação, ribivirina, vi- darabina, aciclovir e ganciclovir, podem ser incluídas nas composições. Outros agentes não-polipeptídicos (por exemplo, agentes quimi- oterapêuticos) estão também dentro do escopo deste documento. Tais compostos combinados podem ser usados juntos ou sequencialmente.

[0077] Adicionalmente, as composições podem conter outros componentes adjuvantes convencionalmente encontrados nas composições farmacêuticas. Assim, as composições podem incluir também materiais compatíveis, farmaceuticamente ativos, tais como, por exemplo, antiprurí- ticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou materiais adicionais úteis para formular fisicamente várias formas de dosagens das composições proporcionadas aqui, tais como, corantes, aro- matizantes, conservantes, antioxidantes, opacificadores, agentes espes- santes e estabilizantes. Além disso, a composição pode ser misturada com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabi- lizantes, agentes molhantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, flavorizantes e substâncias aromáticas. Contudo, quando adicionados, tais materiais não devem interferir indevidamente nas atividades biológicas dos componentes polipeptídicos dentro das composições proporcionadas aqui. As formulações podem, se desejado, ser esterilizadas.

[0078] As formulações farmacêuticas, que podem ser apresentadas convenientemente na forma de dosagem unitária podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas das indústrias farmacêuticas. Tais técnicas incluem a etapa de se associar ingredientes ativos (por exemplo, polipeptídeos de ligação de CH2-CH3 proporcionados aqui) ao(s) veículo(s) ou excipiente(s) farmaceuticamente aceitá- vel(veis). Tipicamente, as formulações podem ser preparadas uniformemente e levando os ingredientes ativos à associação íntima com os veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, conformando o produto, As formulações podem ser esterilizadas, se desejado, desde que o método de esterilização não interfira na eficácia do polipeptídeo contido na formulação.

[0079] As composições descritas aqui podem ser formuladas em quaisquer das várias formas de dosagem possíveis, tais como, mas sem limitação, comprimidos, cápsulas, xaropes líquidos, géis moles, supositórios e enemas, As composições podem ser também formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem conter ainda substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboxilmetilcelu- lose sódica, sorbitol, e/ou dextrana. As suspensões podem conter também estabilizantes.

[0080] Os polipeptídeos de ligação de CH2-CH3 podem ser combinados com material de embalagem e vendidos como kits para reduzir a formação de imunocomplexo mediado por Fc. Os componentes e métodos para produzir artigos manufaturados são bem conhecidos. Os artigos manufaturados podem combinar um ou mais dos polipeptídeos e compostos descritos nas seções acima. Além disso, o artigo manufaturado pode incluir ainda, por exemplo, tampões ou outros reagentes de controle para reduzir ou monitorar a formação de imunocomplexo reduzido. Podem também ser incluídas em tais kits as instruções descrevendo como os polipeptídeos são eficazes para reduzir a formação de imunocomplexo mediado por Fc. Febre de Dengue

[0081] A Febre de Dengue é a doença viral contida em mosquito mais predominante no mundo, com mais que 2,5 bilhões de pessoas em risco de infecção nas regiões tropicais. A dengue é transmitida para humanos principalmente pelo mosquito Aedes aegypti (também chamado de Stegomyia aegypti), que habita as cidades, que transmite também o vírus da febre amarela. Na era da Segunda Guerra Mundial programas para eliminar a febre amarela tiveram o benefício de também controlar a Dengue em áreas alvo. Contudo, nas três décadas passadas, a interrupção desses programas e a rápida urbanização das áreas tropicais permitiram que a Dengue ressurgisse.

[0082] O vírus da dengue (DENV) tem quatro sorotipos, cada um sendo capaz de infectar a mesma pessoa. As infecções da dengue podem ser assintomáticas ou podem causar um espectro de sintomas, variando de febre debilitante à Febre Hemorragia da Dengue (DHF) potencialmente fatal e a SÍNDROME DO CHOQUE DA DENGUE (DSS). Cerca de 1% dos casos de Febre de Dengue progride para DHF.

[0083] Um modelo in vivo da Febre de Dengue foi gerado por xe- noenxerto de camundongos RAG2-/-YC-/- neonatais com células tronco hematopoiéticas CD34+ humanas, resultantes do desenvolvimento de novo da maior parte das células funcionais do sistema imunológico adaptativo humano (Kuruvilla et al. (2007) Virol. 369:143-152). Para avaliar a suscetibilidade à infecção com DENV, os camundongos humanizados foram desafiados com o sorotipo DEN-2. Viremia durando até 3 semanas foi detectada em camundongos infectados com títulos virais de até 106.3 cópias de RNA/mL, e febre característica da dengue foi também observada. Além disso, ELISA de captura de anticorpo pa-ra avaliar a presença de anticorpos humanos anti-dengue mostrou IgM anti-dengue por duas semanas pós-infecção. Seguido por IgG em 6 semanas. Os soros de alguns dos camundongos infectados mostraram também serem capazes de neutralização do vírus da dengue.

[0084] Macrófagos são importantes na patogênese da dengue, mas parece que a inibição das infecções com DENV começa antes do envolvimento dos macrófagos. Em partículas, células dendríticas (DC) mostraram que são 10 vezes mais permissivas à infecção com DENV que monócitos e macrófagos. Mastócitos estão também presentes nos tecidos dérmicos e subdérmicos, os quais são esperados entrarem em contato com Vírions da Dengue logo depois da mordida do mosquito. Além das DC e monócitos do sangue e macrófagos, os mastócitos são suscetíveis à infecção com o vírus da dengue intensificado por anticorpos, produzindo vários mediadores inflamatórios (por exemplo, IL-1, IL-6, e CCL5). FcRs participantes da infecção com vírus da dengue de mastócitos intensificados com anticorpos parecem ser FCyRIIa/b. Como mostrado na tabela 3 do exemplo 2 aqui, a SEQ ID NO: 20 era cerca de 90% eficaz no bloqueio da ligação dos imunocomplexos ao FCyRIIa/b. Assim, o polipeptídeos tais como este podem ter impacto significante no ADE da infecção com DENV em DC, mastócitos, ma- crófagos, e monócitos.

[0085] Complexos imunocirculantes (CIC) podem desempenhar também um papel importante na imunopatogênese da DHF. CIC foram detectados no soro de pacientes com DHF com base na atividade ini- bidora dos CIC na aglutinação de partículas de látex revestidas com IgG por Clq (Agnello et al. (1970) Immunol. 19:909-919; dAgnello et al. (1971) J. Exp. Med. 134:228-241). Essa técnica com látex proporciona um método semi-quantitativo simples que pode demonstrar a presença de IC no soro de pacientes durante o curso precoce da DHF (Ruangji- rachuporn et al. (1979) Clin. Exp. Immunol. 36:46-53). Além disso, o método imunofluorescente de células Raji grandes (Theophilopoulos (1976) J. Clin. Invest. 57:169-82) mostrou que CIC de grandes dimensões se desenvolvem no estágio mais tardio da DHF. A remoção desses complexos por absorção com células Raji reduziu ou eliminou a reatividade no ensaio de imunofluorescência de células Raji, bem como na técnica de látex. Assim, esses estudos confirmaram a especificidade da reação entre os complexos de antígeno da dengue- anticorpo no soro de DHF e na superfície das células Raji. Além disso, IC contendo vírus mostram que persistem na defervescência para pacientes com DHF.

[0086] Conforme discutido no exemplo 3 aqui, vírions de DENV2 desativados (cepa de DENV2 16681) podem se ligar com avidez a imunocomplexos de peroxidase-antiperoxidase associados a não- DENV. Uma razão provável para a ligação com avidez, com base na análise estrutural (Zhang et al. (2004) Structure 12:1607-1618) é que o domínio III da proteína envelope pode ser responsável pela ligação do imunocomplexo homólogo e heterólogo. A segunda proteína 1 (NS1) de ligação de IC fraca, que é liberada em altas quantidades ao soro de indivíduos infectados com DENV e também é encontrado dentro do próprio vírion DENV e na superfície das células infectadas com DENV. Os resultados de NSI do DENV que se liga ao imunocomplexos relacionados a não-DENV (PAP-IC), e a inibição da NS1 que se liga a IC por NB406 (SEQ ID NO: 20; APPDCAWHLGELVWCT) são mostrados no Exemplo 6 abaixo. Além disso, a Tabela 3 do Exemplo 2 mostra que a SEQ ID NO: 20 inibiu a ligação ou de FCyRIIa ou do FCyRIIb ao Fc da IgG imunocomplexado em mais que 90%, sugerindo que a SEQ ID NO: 20 pode eliminar ADE nas DC causadas por sub-neutralização dos títulos de anticorpos do DENV. Métodos para usar polipeptídeos de ligação de CH2-CH3

[0087] Polipeptídeos de ligação de CH2-CH3 podem ser usados em ensaios in vitro da formação de imunocomplexo (IC) mediado por Fc. Tais métodos são úteis para, por exemplo, avaliarem a capacidade do polipeptídeo de ligação a abertura CH2-CH3 de bloquearem a formação de IC mediado por Fc. Métodos in vitro podem envolver, por exemplo, contatar uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, uma molécula de imunoglobulina ligada a antígeno) com uma molécula efetora (por exemplo, mC1q, sC1q, FcRs e FcRn, ou outro anticorpo) em presença ou na ausência de um polipeptídeo conforme proporcionado aqui, e determinar o nível de formação de IC em cada amostra. Os níveis de formação de IC podem ser avaliados, por exemplo, por eletroforese em gel de poliacrilamida com azul de Coomassie ou coloração com prata, ou por co-imunoprecipitação. Tais métodos são conhecidos da-queles com conhecimento ordinário da técnica, e podem ser usados para testar a capacidade de um polipeptídeo candidato ou composto em inibir a formação de IC associada a uma doença viral infecciosa, por exemplo.

[0088] Os métodos proporcionados aqui podem ser usados também para inibir a formação de IC em um paciente, e tratar a doença viral infecciosa no paciente por inibição da formação de IC mediada por Fc. Tais métodos podem incluir, por exemplo, administrar qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui, ou uma composição que contém qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui, a um paciente que tem ou está em risco de ter ou de desenvolver doença viral infecciosa (por exemplo, Febre de Dengue). Por exemplo, o método pode incluir administrar a um indivíduo uma composição que contém um polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu- Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 10). Alternativamente, o método pode incluir administrar ao paciente um polipeptídeo que contém a sequência de aminoácidos Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val- Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 2), Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu- Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 19; em que Xaa ié qualquer aminoácidos), ou Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu- Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 20).

[0089] Em algumas modalidades, quando a doença viral é a Febre de Dengue, o polipeptídeo pode ser administrado para inibir a formação de IC que está associada à ADE da Febre de Dengue ou a infecção com DENV, ou contribui para a intensificação de uma infecção com DENV. Por exemplo, o polipeptídeo pode resultar em melhora clínica ou histológica de infecção com DENV, resultar na melhora ou retardo do início de uma ou mais características histológicas da infecção com DENV, e/ou diminuir a ADE de uma infecção com DENV (por exemplo, infecção com DENV tais como DHF ou DSS). Em alguns casos, o polipeptídeo pode inibir a ligação de um IC com IgG heterólogo anti-DENV a um FCyR, inibir a formação de IC que contribui para a imunopatogênese da ADE de infecções com DENV, inibir a ligação de vírions de DENV ao IC com IgC, inibir a ligação de uma proteína do DENV (por exemplo, NS1) a um imunocomplexo de IgG, inibir a ligação de TNF-α ao IC de IgG, inibir a ligação de um IC de DENV-IgC a FCyI, alelo FcYlIa H131, alelo FcYlIa R131, FcYRIIb, FCYRIIC, FcyRIIIa, ou FcyYIIIb, e/ou inibir a ligação de IC de DENV-IgG a mC1q ou sC1q.

[0090] A invenção será ainda descrita nos seguintes exemplos que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações. EXEMPLOS

[0091] Ensaios in vitro para medir a ligação de ligante a abertura CH2-CH3. Ensaios in vitro envolvendo ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) têm sido usados para demonstrar a inibição (competitiva) de ligação de Fc de IgG imunocomplexado a fatores imunomedi- adores tais como FcRs: (FcKRI, FcKIIa, FcKRIIb/c, FcKRIIIa/b), FcRn, mC1q, e sC1q pelo polipeptídeos e compostos descritos aqui. Vide, por exemplo, Exemplos daqui, bem como as Publicações de Patente US 2007225231 e US 20070276125 e a Publicação de PCT WO2007/030475. Reagentes padronizados e kits de ELISA são úteis para reduzir custos e aumentar a reprodutibilidade dos experimentos.

[0092] Em um ELISA padrão, um antígeno é imunoabsorvido em uma micropoço de plástico. Depois do bloqueio e lavagem adequados, é adicionado ao micropoço um anticorpo primário com especificidade direcionada ao antígeno. Depois de outra fase de lavagem, um anticorpo secundário que é direcionado ao anticorpo primário e conjugado a um marcador de enzima tal como raiz forte peroxidase (HRP) é adicionado ao micropoço. Depois de outro ciclo de lavagem, o substrato de enzima apropriado é adicionado. Se um conjugado de anticorpo primário para anticorpo secundário/HRP é formado, a enzima conjugada catalisa uma reação química polimérica com o substrato, que é lido em um leitor de microplacas ou em espectrofotômetro. Ao se padronizar os ní- veis do antígeno e o conjugado de anticorpo secundário/HRP, é estabelecido um título do anticorpo primário (a variável). Em um sistema ELISA padrão, o anticorpo primário se liga ao antígeno através de suas regiões determinantes de complementaridade (CDR) localizadas nos braços do Fab. Igualmente, o conjugado de anticorpo secundário/HRP se liga ao anticorpo primário via sua região Fab de CDR. Devido ao fato da HRP estar conjugada à região Fc do segundo anticorpo secundário, ligação de Fc direta fica muito limitada ou é eliminada.

[0093] Por esse motivo, a técnica de "ELISA reversa" tem sido usada para avaliar a ligação da região Fc a ligante que se ligam ao Fc de IgG imunocomplexado. Em ELISA reversa, a enzima (por exemplo, HRP) não está ligada covalentemente à porção de Fc do anticorpo secundário. De preferência, um imunocomplexo pré-formado de peroxi- dase-IgG antiperoxidase de coelho (ou camundongo) (complexo "PAP") é usado. Nesse método, HRP serve tanto como o antígeno como o marcador de enzima, mas não bloqueia a região Fc. No sistema de ELISA reverso, um ligante de ligação da abertura CH2-CH3 de Fc (por exemplo, C1q humano purificado) foi ligado a placas de micro- poços. Na ausência de competidor, os complexos PAP ligados ao li- gante imobilizado e a reação entre HRP e seu substrato produz um sinal. Esse sinal foi reduzido pelo polipeptídeos e compostos que inibiram a ligação de PAP ao ligante imobilizado. Exemplo 1 - Inibição da ligação de C1q

[0094] Complexos de PAP foram formados misturando-se 2 μL de anti-peroxidase de coelho (Sigma Chemicals Produto P 7899) com 50 μL de peroxidase (Sigma-Aldrich P6782) em 1 mL de água destilada. PAP (100 μL) foram pré-incubados com 100 μL de peptídeo por uma hora, 100 μL foram pré-incubados com 100 μL de peptídeo ou C1q humano (Quidel Corp.) por uma hora. As misturas de C1q/PAP e pep- tídeo/PAP (100 μL) foram incubadas com placas revestidas com C1q por 30 minutos. Depois da lavagem, as placas foram incubadas com ATBS (Quidel Crop.) por 15 minutos e lidas em 405 nm. Os resultados são mostrados na tabela 1. Tabela 1

[0095] APPDCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 20) resultou na maior inibição da ligação de C1q, quase se igualando ao próprio C1q. O peptídeo APPCARHLGELVWCT (SEQ ID NO: 16) deu o próximo melhor resultado. Exemplo 2 - Inibição da ligação de FcR ao PAP-IC por SEQ IN NO:20

[0096] Uma vez estabelecido o protocolo de ELISA usando o ensaio de C1q, o ensaio foi redesenhado usando-se FcyIIa, FcyIIb e FcyIII no lugar de C1q. FcyIIa, FcyIIb e FcyIII altamente purificados (R&D Systems, Minneapolis, MN) foram imunoadsorvidos sobre micropoços. Depois da otimização do sistema de ELISA reversa com FcyR, experimentos de inibição competitivos simples usando os polipeptídeos proporcionados aqui foram conduzidos para investigar sua capacidade de inibidor a ligação de imunocomplexos a FcyR purificado.

[0097] Placas de microtítulos Falcon foram revestidas com diluições 1:10 de FcyIIa, FcyIIb e FcyIII altamente purificados e incubados por 24 horas. As placas foram lavadas e então bloqueadas com 5x de solução de bloqueio de BSA (Alpha Diagnostic International, San An- tonio, Texas) durante 24 horas. Os imunocomplexos de PAP foram formados conforme descrição no Exemplo 1. PAP (100 μL) foram pré- incubados com 100 μL de peptídeo, por uma hora. As misturas de PAP/peptídeo foram adicionadas às placas revestidas com FcyR e incubadas por uma hora. Depois da lavagem, as placas foram incubadas com substrato ABTS (Quidel Corp.) por 15 minutos e lidas em 405 nm. Os resultados são mostrados na tabela 2. Tabela 2

[0098] O peptídeo APPDCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 20) pareceu resultar na maior inibição total de FcR se ligando ao PAP, seguido pelo peptídeo DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 2).

[0099] Os experimentos com SEQ ID NO: 20 repetidos. As placas de microtítulo Costar foram revestidas com diluições 1:10 de FcyIIa purificada (His 131 alelo aka H161), FcyIIb e FcyIIb e incubadas por 24 horas. As placas foram lavadas e então bloqueadas com 10 mg/mL de solução bloqueadora por 24 horas. Os imunocomplexos PAP foram formados conforme descrição no Exemplo 2. PAP (100 μL) foram pré- incubados com 100 μL de peptídeo por uma hora. Misturas de PAP/peptídeo foram adicionadas às placas revestidas com FcyR e in- cubadas por uma hora. Depois da lavagem, as placas foram incubadas com substrato ABTS por 15 minutos e lidas em 405 nm. Os resultados são mostrados na tabela 3. Tabela 3

*Nota: (alelo H131).

[00100] Assim, a SEQ ID NO: 20 inibiu a ligação de todas as três maiores classes do receptor de Fc (FcyI, Fcylla/Fcyllb, e Fcylll) aos imunocomplexos PAP solúveis. Exemplo 3 - Virions DENV2 inativados se ligam a imunocomplexos não DENV

[00101] Cerca de 1 ng de DENV2 (cepa 16681; Microbix Corp.) foi revestido em placas de microtítulo Costar usando tampão de revestimento de ELlSA (Alpha Diagnostic lnternational) por 24 horas, a 4oC. Depois de 24 horas, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem ELlSA (Quidel Corp.), e bloqueadas com BSA altamente purificados, por 1 hora. Depois de 5 lavagens, PAP lC foram incubados com placas de microtítulo revestidas com DENV, por uma hora. Depois de uma hora, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com solução de lavagem ELlSA Quidel, e então incubadas com ABTS (lmmu- nochem Corp.), por vinte minutos. Quanto maior o OD405nm maior a ligação do imunocomplexo não-relacionado ao DENV (PAP-lC) aos ví- rions DENV2 (16681). Os resultados são mostrados na tabela 4. Tabela 4

[00102] Assim, vírions DENV2 (16681) ligado com avidez a imu- nocomplexos relacionados a não-DENV, tornando possível a ADE de DENV em não DENV em indivíduos IC+ em áreas endêmicas DENV. Exemplo 4 - Inibição de ligação de DENV-IgG-IC ligando às Placas Revestidas com FcyIIa

[00103] FcyIIa humano recombinante altamente purificado (R&D Systems) foi imunoadsorvido nos micropoços de plástico (Placas de Microtítulos Costar) usando tampão de revestimento ELISA (Alpha Diagnostic International) por 24 horas, a 4oC. Depois de 24 horas, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem ELISA (Quidel Corpl), bloqueadas com BSA altamente purificado por 1 hora, e lavadas 5 vezes. Anti-DENV1 IC humanos foram formados combinando-se vírions de DENV-2 inativados (cepa 16681, Microbix Corp.) com IgG purificada por afinidade, reunida, policlonal, neutralizante de indivíduos convalescentes de DENV (Calbiotech IgG da Febre de Dengue ELISA; Catálogo No DE050G4). Os resultados de diluições seriais de 1:250 e 1:500 (ADE foi mais evidente em diluições séricas de 1:250 a 1:500) dos DENV-IgG-IC foram testados contra a inibição de ligação de DENV-IgG-IC aos poços de microtítulos revestidos com huFcyRIIa. Os resultados usando poços revestidos com huFcyRIIa ou com uma diluição de 1:250 de DENV-IgG-IC sem inibidor, uma diluição de 1:250 de DENV-IgG-IC com SEQ ID NO: 20, uma diluição de 1:500 de DENV- IgG-IC sem inibidor, e uma diluição de 1:500 de DENV-IgG-IC com SEQ ID NO: 20 são mostrados na tabela 5. Tabela 5

[00104] Assim, a SEQ ID NO: 20 mostrou uma capacidade acentuada para inibir de IC compreendido de IgG-IC convalescente policlo- nais anti-DENV de DENV2 (cepa 16681) inativado às Placas Revestidas com FcyIIa. A ligação de IgG-IC convalescente policlonal anti- DENV de DENV (heterólogo) ao FcyIIa é considerada como sendo o mecanismo imunológico principal levando à ADE das infecções da Febre de Dengue e a causa que leva a DHF/DSS mais séria possível e ameaçadora de vida, fazendo com que a SEQ ID NO: 20 um candidato a produto terapêutico para tratamento e/ou prevenção de DHF/DSS. Exemplo 5 - Inibição de ligação de não-DENV IC (PAP-IC) à NS1 da DENV

[00105] DENVs recombinantes altamente purificados (100 μg da NS1 recombinante do Vírus da Dengue; Propec Tech) foram imunoad- sorvidos em micropoços de plástico (Placas de Microtítulo Costar) usando-se tampão de revestimento ELISA (Alpha Diagnostic International, San Antonio, Texas), por 24 horas, a 4oC. Depois de 24 horas, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem ELISA (Quidel Corp), bloqueadas com BSA altamente purificado, por 1 hora, e lavadas 5 vezes novamente. PAP IC foram incubados ou sem peptídeo ou com SEQ ID NO: 20, por uma hora. Depois de uma hora, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem ELISA Quidel e então incubadas com ABTS (Immunochem Corp.), por vinte minutos. Quanto maior o OD405nm, maior a ligação do imunocomplexo (PAP-IC) não relacionado ao DENV à proteína NS1 de DENV. Os resultados estão mostrados na tabela 6. Tabela 6

[00106] Assim, a SEQ ID NO: 20 mostrou uma capacidade acentuada de inibir a ligação de PAP-IC compreendidos de IC às placas revestidas com NS1 de DENV recombinante. Exemplo 6 - Inibição de ligação de PAP-IC às Placas Revestidas com TNF-a por SEQ ID NO: 20

[00107] TNF-a recombinante altamente purificado (Sigma-Aldrich) foi imunoadsorvido em micropoços de plástico (Placas de microtítulo Costar) usando tampão de revestimento ELISA (Alpha Diagnostic International) por 24 horas a 4oC. Depois de 24 horas, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem ELISA (Quidel Corp) bloqueadas com BSA altamente purificado por 1 hora, e lavadas 5 vezes. Depois de uma hora, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem ELISA Quidel e então incubadas com ABTS (Immunochem, Corp), por vinte minutos. Quando maior o OD405nm maior a ligação do imunocomplexo (PAP-IC) não relacionado a TNF-a foi observado. Os resultados são mostrados em Tabela 7. Tabela 7

[00108] Assim, a SEQ ID NO: 20 mostrou uma capacidade aumentada de inibir a ligação PAP-IC compreendidas de IC para placas revestidas de TNF-a recombinante. Exemplo 7 - Demonstração de ADE em DENV(2) infectado em modelo de camundongo in vivo

[00109] O modelo de camundongo RAG2-/-YC-/- (RAG-hu) para vírus da dengue descrito acima proporciona uma pesquisa única para resolver muitas questões importantes e convenientes sobre infecção e imunidade contra o Vírus de Dengue (Kuruvilla et al. (2007) Virology 369:143-152). Os camundongos RAG-HU são passivamente imunizados com IgG do DENV heterólogo (isto é, neutralizando IgG para DENVq; os soros podiam ser de qualquer DENV heterólogo neutrali- zante de infecção com DENV, tais como IgG de DENV1 e vírions infecciosos de DENV2 ou IgG de DENV2 e vírions infecciosos de DENV1. Os camundongos são passivamente imunizados com IgG an- ti-DENVI, por exemplo, e então inoculados com uma dose letal de, por exemplo, vírus DENV2. Um peptídeo tendo a sequência APPD- CAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 20) ou XPPDCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 19) é administrado i.p em uma dose diária, por exemplo, 1 mg/kg, 100 mg/kg e 1.000 mg/kg a partir do momento da infecção com DENV. Sinais clínicos totais, temperatura, etc., são monitorados diariamente. ELISA soro ou RT-PCR para NS1 de DENV ou replicação de DENV e a presença de IC de NS1 de DENV e DENV-IC são realizados diariamente. Um subconjunto de camundongos moribundos in-fectados com DENV é sacrificado diariamente e as contagens de plaquetas, valores de HCT/PCV, AST/ALT são checados, além das medições da replicação de DENV descrita acima. Uma quantidade igual de camundongos infectados com DENV e tratados com APPDCAWHL- GELVWCT (SEQ ID NO: 20) são sacrificados e examinados como acima para fins de comparação. No final do estudo, todos os perfis imunológicos e necrópsia incluindo biópsias de tecidos permissivos de DENV são realizados. Uma análise final, ADE de camundongos infectados com DENV é comparada com ADE de camundongos infectados com DENV e tratados com SEQ ID NO: 20. OUTRAS MODALIDADES

[00110] É entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada desta, a descrição acima tem o objetivo de ilustrar e não de limitar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações apensas. Outros aspectos, vantagens, e modificação estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (12)

1. Uso de um polipeptídeo purificado compreendendo a sequência de aminoácidos (Xaa1)m-Cys-Ala-Xaa2-His-Leu-Gly-Glu-Leu- Val-Trp-Cys-Thr-(Xaa3)n (SEQ ID NO: 53), em que Xaa1 é qualquer aminoácido, Xaa2 é Trp, Tyr ou Phe, 5-Hidroxitriptofano (5-HTP), 5- hidroxitriptamina (5-HT), ou outro derivado de aminoácido, Xaa3 é qualquer aminoácido, e m e n são, independentemente, 0, 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para tratar infecção pelo Vírus da Dengue (DENV) em um indivíduo.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo causa melhora clínica ou histológica de infecção por DENV, causa melhora ou retardos no início de uma ou mais características histológicas de uma infecção por DENV, ou diminui a Intensificação Dependente de Anticorpo (ADE) de uma infecção por DENV.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a infecção por DENV é Febre Hemorrágica da Dengue (DHF) ou Síndrome do Choque da Dengue (DSS).

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo inibe a ligação de um imunocomplexo (IC) de IgG heterólogo anti-DENV a um FcyR, inibe a formação de IC que contribui para a imunopatogênese da ADE de infecções por DENV, inibe a ligação dos vírions de DENV ao IC de IgG, ou inibe a ligação de uma proteína do DENV a um imunocomplexo de IgG.

5. Uso de acordo com reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo inibe a ligação de uma proteína do DENV a um imunocomplexo de IgG e, em que a dita proteína do DENV é segunda proteína 1 (NS1).

6. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo inibe a ligação de TNF-α ao IC de IgG, inibe a ligação de um IC de DENV-IgG a FCYI, alelo FcYlIa H131, alelo FcKIIa R131, FcKRIIb, FcKRIIc, FcKRIIIa, ou FcyKIIIb, ou inibe a ligação de IC de DENV-IgG a mC1q ou sC1q.

7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende um grupo estabilizador de terminal.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito grupo estabilizador de terminal está na terminação amino do dito polipeptídeo e é um tripeptídeo que apresenta a sequência de aminoácidos Xaa-Pro-Pro, em que Xaa é qualquer amino- ácido, e opcionalmente em que Xaa é Ala.

9. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito grupo estabilizador de terminal está na terminação carbóxi do dito polipeptídeo e é um tripeptídeo que tem a sequência de aminoácidos Pro-Pro-Xaa, em que Xaa é qualquer aminoácido, e opcionalmente em que Xaa é Ala.

10. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma sequência de ami- noácidos Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp- Cys-Thr (SEQ ID NO: 19), em que Xaa é qualquer aminoácido.

11. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoá- cidos Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys- Thr (SEQ ID NO: 20).

12. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoá- cidos Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO: 2).