Hintergrund der Erfindung
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Autoimmunkrankheiten sind gekennzeichnet durch einen Angriff des. Immunsystems
eines Individuums gegen seine eigenen Gewebe. Autoimmunkrankheiten resultieren
üblicherweise aus einem Ausfall der Toleranz des Immunsystems gegenüber seinen eigenen
Antigenen. Die vom Immunsystem bei den verschiedenen Autoimmunkrankheiten erkannten
spezifischen Antigene können systematisch vorhanden oder organspezifisch sein. Die
systemische Schmetterlingsflechte (SLE) beispielsweise ist durch das Vorhandensein von
Autoantikörpern gegen DNA, Ribonucleoproteine, Histone und andere Moleküle, die nicht
organspezifisch sind, gekennzeichnet. Andere Autoimmunkrankheiten sind durch die
Zerstörung meist eines Organs gekennzeichnet. Solche Autoimmunkrankheiten schließen
Typ I-Diabetes ein, bei der die insulinerzeugenden β-Zellen der Langerhansschen Inseln in
der Bauchspeicheldrüse zerstört werden.
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Bei manchen Autoimmunkrankheiten tritt die Gewebezerstörung in erster Linie als
Ergebnis der Erzeugung hoher Pegel an Autoantikörpern ein. Solche Krankheiten schließen
die primärchronische Polyarthritis ein, die durch eine Zerstörung des Gelenksknorpels und
eine Entzündung der Gelenkshaut gekennzeichnet ist. Patienten mit primärchronischer
Polyarthritis weisen eine Ansammlung von Immunkomplexen in ihren Gelenken auf, die
durch eine Verbindung von Autoantikörpern gegen den Fc-Anteil von IgG und IgG-
Molekülen gebildet werden. Diese Immunkomplexe aktivieren die Komplementkaskade, was
zu einer Gewebeschädigung führt. Myasthenia gravis, eine Krankheit mit fortschreitender
Muskelschwäche, wird durch die Erzeugung von Autoantikörpern verursacht, die gegenüber
Acetylcholin-Rezeptoren in den motorischen Endplatten neuromuskulärer
Verbindungsstellen reaktionsfähig sind.
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Bei anderen Autoimmunkrankheiten scheint die Gewebezerstörung nicht primär
durch die Erzeugung von Autoantikörpern vermittelt zu sein, sondern vielmehr durch
autoreaktive T-Lymphozyten. Die experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE)
beispielsweise, ein tierisches Modell für multiple Sklerose und durch eine Entmarkung im
Gehirn und im Rückenmark gekennzeichnet, kann bei naiven Tieren durch eine Übertragung
von CD4+-T-Zellen aus erkrankten Tieren herbeigeführt werden. So meint man allgemein,
dass die EAE eine T-Zellen-vermittelte Autoimmunkrankheit darstellt und nicht eine B-
Zellen-vermittelte Autoimmunkrankheit (Ben-Nun, A., et al. (1981), Eur. J. Immunol. 11,
195).
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Die multiple Sklerose (MS) ist eine gewöhnliche Entmarkungskrankheit des Gehirns
und des Rückenmarks. Sie ist eine fortschreitende Krankheit, die durch Remissionen und
Verschlimmerungen einer neurologischen Funktionsstörung gekennzeichnet ist, welche
unterschiedliche Bereiche des Zentralnervensystems beeinträchtigt. Die Symptome der
Krankheit resultieren aus einem Herd entzündlicher Entmarkung, der später eine Narbe
bildet, wobei er als "Plaque" in der weißen Hirnsubstanz, im Hirnstamm oder im
Rückenmark erscheint Gegenwärtig steht kein definitiver Diagnosetest für MS zur
Verfügung, und Diagnosen und Behandlungsarten werden auf der Grundlage von Faktoren
wie dem Umfang der Symptome eines Patienten und/oder dem Alter des Patienten zum
Zeitpunkt des Beginns der Verschlimmerungen der neurologischen Funktionsstörung
formuliert.
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Patienten mit MS sind typischerweise mit Steroiden behandelt worden, mit dem Ziel,
entweder den Patienten in einen Remissionszustand zu bringen oder das Fortschreiten der
Krankheit beim Patienten zu verlangsamen. Andere Medikamente sind eingesetzt worden,
um spezielle Symptome der Krankheit zu behandeln, z. B. Muskelrelaxantien. Entwicklungen
aus jüngerer Zeit bei für MS zur Verfügung stehenden Behandlungen schließen die
Verabreichung von Beta-Interferon ein. Beta-Interferon hat sich als recht vielversprechend
zum Verlangsamen des Fortschreitens der Krankheit erwiesen. Es besteht jedoch nach wie
vor ein Bedarf an wirksamen Behandlungen für MS.
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Ein Kommentar zu den Auswirkungen von anti-gp39 auf das Herbeiführen von EAE
bei Mäusen ist in RESEARCH IN IMMUNOLOGY, Bd. 145, Nr. 3, März 1994, Seite 200-
205 und 244-249, F. Durie et al., veröffentlicht.
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Ein Abriss von Versuchen, die zur Bestimmung der Rolle von gp39 bei EAE und MS
unter Verwendung von Mäusen als Subjekten durchgeführt wurden, ist im JOURNAL OF
NEUROIMMUNOLOGY, Bd. 54, Nr. 1-2, 1994, S. 175, J. Laman et al., veröffentlicht.
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Die WO-A-9428912 offenbart eine Methode der Immunotherapie, die die
Regulierung der T-Zellen-Immunantwort durch die Aktivierung oder die
Unterdrückung/Deaktivierung des CD28-Pfads einbegreift. Ein Herbeiführen der Erzeugung
aktivierter T-Zellen-Lymphokine erfolgt auf eine stimulierende Bindung des CD28-
Oberflächenrezeptormoleküls hin, und zwar selbst in Gegenwart herkömmlicher
Immunsuppressiva. Eine Hemmung der CD28-Rezeptorbindung an einen geeigneten
stimulierenden Liganden oder eine Deaktivierung des CD28-Signaltransduktionspfads durch
andere Mittel reguliert die CD28-Pfad-bezogene T-Zellen-Lymphokinerzeugung und ihre
sich ergebenden Auswirkungen nach unten.
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Die WO-A-9506481 betrifft eine Methode zum Herbeiführen einer
antigenspezifischen T-Zellen-Toleranz. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die
Zelle, die der T-Zelle ein Antigen zeigt, eine B-Zeile, und der Rezeptor auf der Oberfläche
der T-Zelle, der eine kontaktabhängige Helfer-Effektor-Funktion vermittelt, ist gp39. Die
Methode kann dazu verwendet werden, die T-Zellen-Toleranz bei einem löslichen Antigen
oder einer allogenischen Zelle herbeizuführen.
Kurzfassung der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft Methoden zur therapeutischen Behandlung multipler
Sklerose. Die Methode umfasst es, dem Patienten eine therapeutisch oder prophylaktisch
wirksame Menge eines Antagonisten eines Rezeptors auf einer Oberfläche einer T-Zelle zu
verabreichen, der kontaktabhängige Helfer-Effektor-Funktionen vermittelt. Bei einer
bevorzugten Ausführungsform ist der verabreichte Antagonist ein Antikörper oder ein
Fragment davon, der/das sich speziell an den T-Zellen-Rezeptor gp39 bindet.
Kurze Beschreibung der Figuren
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Die Fig. 1 ist eine graphische Darstellung von DAS-Einheiten, die täglich bei
Mäusen gemessen wurden, denen am Tag 0 75 ug (Tafel A) oder 300 ug (Tafel B) PLP-
Peptid mit einem Anti-gp39-Antikörper (schwarze Balken) oder mit PBS (graue Balken)
injiziert wurden, die zeigt, dass eine anti-gp39-Verabreichung die Entwicklung
experimenteller allergischer Enzephalomyelitis EAE verhindert.
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Die Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der prozentualen Unterdrückung einer
EAE-Auslösung bei Mäusen, denen am Tag 0 PLP-Peptid und des Weiteren an den Tagen 0,
2 und 6 oder an den Tagen 4, 6 und 8 oder an den Tagen 7, 9 und 11 Anti-gp39-Antikörper
(schwarze Balken) oder PBS (graue Balken) injiziert wurden, die zeigt, dass eine
Verabreichung von anti-gp39 nach der Auslösung der Krankheit EAE im Wesentlichen
verhindert.
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Die Fig. 3 ist eine graphische Darstellung von DAS-Einheiten, die täglich bei
Mäusen gemessen wurden, denen Spendermilzzellen von Mäusen, denen PLP-Peptid und
Anti-gp39-Antikörper (schwarze Balken) injiziert worden waren, oder Spenderzellen von
Mäusen, denen PLP-Peptid allein (graue Balken) injiziert worden war, eingepflanzt wurden
und denen PLP-Peptid injiziert wurde.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft die Behandlung multipler Sklerose. Die Krankheit wird
behandelt, indem ein Antagonist zu einem Rezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen
verabreicht wird, der eine kontaktabhängige T-Zellen-Helfer-Effektor-Funktion vermittelt.
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Wie in dieser Beschreibung definiert ist ein "Molekül oder Rezeptor, der
kontaktabhängige Helfer-Effektor-Funktionen vermittelt" einer, der auf einer Th-Zelle
exprimiert wird und mit einem Liganden auf einer Effektorzelle (z. B. einer B-Zelle) in
Wechselwirkung steht, wobei die Wechselwirkung des Rezeptors mit seinem Liganden zur
Erzeugung einer Effektorzellenantwort (z. B. einer B-Zellen-Aktivierung) erforderlich ist. Es
ist gefunden worden, dass solch ein Molekül zusätzlich zu seiner Beteiligung an
Effektorzellenantworten an der Antwort der T-Zelle auf das Antigen beteiligt ist.
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Bei der vorliegenden Erfindung ist der Rezeptor auf der Oberfläche der T-Zelle, der
kontaktabhängige Helfer-Effektor-Funktionen vermittelt, gp39. Der Antagonist ist ein
Molekül, das die Wechselwirkung von gp39 mit seinem Liganden auf einer Zelle hemmt, die
der T-Zelle ein Antigen zeigt. Ein besonders bevorzugter gp39-Antagonist ist ein Anti-gp39-
Antikörper. Alternativ dazu ist der gp39-Antagonist eine lösliche Form eines gp39-
Liganden, zum Beispiel lösliches CD40.
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Die erfindungsgemäße Methode beruht zumindest teilweise auf der Beobachtung,
dass eine Verabreichung von Anti-gp39-Antikörpern an Mäuse die Auslösung von EAE
verhindert und die Krankheit bei Tieren mit EAE umkehrt. Auf diese Weise ist gefunden
worden, dass ein Mittel, das die Wechselwirkung von gp39 auf einer T-Zelle mit
seinem/seinen Liganden auf anderen Zellen hemmt, beim Behandeln einer typischen T-
Zellen-vermittelten Autoimmunkrankheit wirksam ist, und zwar sowohl prophylaktisch als
auch therapeutisch. Dieses Ergebnis kommt angesichts früherer Studien überraschend, die
gp39 eine primäre Rolle beim Regulieren von B-Zellen-Antworten zugeschrieben haben. Die
Erkenntnis, dass Anti-gp39-Antikörper beim Behandeln multipler Sklerose wirksam sind,
bildet die Grundlage für die vorliegende Erfindung. Gemäß der Erfindung werden Subjekte
mit multipler Sklerose durch eine Verabreichung von Mitteln behandelt, die die Wirkung
von Anti-gp39-Antikörpern nachahmen.
T-Zellen-vermittelte Autoimmunkrankheiten
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Der Terminus "Autoimmunstörung" soll Störungen einschließen, bei denen das
Immunsystem eines Subjekts auf Autoantigene reagiert, so dass es zu einer bedeutenden
Gewebe- oder Zellzerstörung im Subjekt kommt. Der Terminus "Autoantigen" soll jedes
Antigen eines Subjekts einschließen, das vom Immunsystem des Subjekts erkannt wird. Die
Termini "Autoantigen" und "Eigenantigen" werden in dieser Beschreibung untereinander
austauschbar verwendet. Der Terminus "Selbst" soll, so wie er in dieser Beschreibung
verwendet wird, jeden Bestandteil eines Subjekts meinen und schließt Moleküle, Zellen und
Organe ein. Autoantigene können Peptide, Nucleinsäuren oder andere biologische
Substanzen sein. Der Terminus "T-Zellen-vermittelte Autoimmunstörung" soll
Autoimmunstörungen einschließen, bei denen die Reaktion auf das Selbst in erster Linie
Zellen-vermittelte Immunmechanismen involviert, und zwar im Gegensatz zu humoralen
Immunmechanismen. Somit betreffen die erfindungsgemäßen Methoden Behandlungen einer
Autoimmmunstörung, bei der die Gewebezerstörung in erster Linie durch aktivierte T-Zellen
und andere Immunzellen als B-Lymphozyten vermittelt wird. Allerdings kann, wenngleich
die erfindungsgemäßen Methoden zur Behandlung einer Autoimmunstörung, bei der die
Reaktion auf das Selbst in erster Linie durch andere Zellen als B-Zellen vermittelt wird,
bestimmt sind, die Autoimmunstörung durch das Vorhandensein von Autoantikörpern
gekennzeichnet sein. EAE zum Beispiel, eine T-Zellen-vermittelte Autoimmunstörung, die
durch eine erfindungsgemäße Methode behandelt werden kann, steht oft in Verbindung mit
dem Vorhandensein von Autoantikörpern zu Bestandteilen des Zentralnervensystems, wie
z. B. Myelin-Grundprotein.
gp3 9-Antagonisten
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Nach den erfindungsgemäßen Methoden wird ein gp39-Antagonist einem Subjekt
verabreicht, um mit der Wechselwirkung von gp39 auf T-Zellen mit einem gp39-Liganden
auf Antigen-zeigenden Zellen, wie z. B. B-Zellen, zu interferieren und dadurch die Störung
zu verhindern, zu erleichtern oder zu bessern. Ein gp39-Antagonist ist als Molekül definiert,
das mit dieser Wechselwirkung interferiert. Wie unten vollständiger beschrieben kann der
gp39-Antagonist ein gegen gp39 gerichteter Antikörper (z. B. ein monoklonaler Antikörper
gegen gp39), ein Fragment oder ein Derivat eines gegen gp39 gerichteten Antikörpers (z. B.
Fab- oder F(ab)'2-Fragmente, chimärische Antikörper oder humanisierte Antikörper),
lösliche Formen eines gp39-Liganden (z. B. lösliches CD40), lösliche Formen eines
Fusionsproteins eines gp39-Liganden (z. B. lösliches CD40Ig) oder pharmazeutische Mittel,
die die gp39-CD40-Wechselwirkung durchbrechen oder mit ihr interferieren, sein.
A. Antikörper
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Um Anti-gp39-Antikörper herzustellen, kann ein Säugetier (z. B. eine Maus, ein
Hamster oder ein Kaninchen) mit einer immunogenen Form eines gp39-Proteins oder
-proteinfragments (z. B. eines Peptidfragments) immunisiert werden, die eine Antikörper-
Antwort im Säugetier auslöst. Eine Zelle, die gp39 auf ihrer Oberfläche exprimiert, kann
ebenfalls als Immunogen verwendet werden. Alternative Immunogene schließen gereinigtes
gp39-Protein oder -proteinfragmente ein. gp39 kann von einer gp39-exprimierenden Zelle
durch standardmäßige Reinigungsverfahren gereinigt werden, z. B. kann gp39 cDNA
(Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992), Lederman et al., JJ Exp. Med., 175: 1091-1101
(1992), Hollenbaugh et al., EMBO J, 11: 43134319 (1992)) in einer Wirtszelle, z. B.
Bakterien oder eine Säugetierzelllinie, exprimiert und gp39-Protein von der Zellkultur durch
standardmäßige Verfahren gereinigt werden. gp39-Peptide können auf der Basis der
Aminosäuresequenz von gp39 (geoffenbart in Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992),
Lederman et al., J. Exp. Med., 175: 1091-1101 (1992), Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:
4313-4319 (1992)) unter Einsatz bekannter Verfahren (z. B. F-moc- oder T-boc-
Chemosynthese) synthetisiert werden. Verfahren zum Verleihen von Immunogenizität auf
einem Protein schließen eine Konjugation an Träger oder andere in der Fachwelt
wohlbekannte Verfahren ein. Beispielsweise kann das Protein in Gegenwart eines Adjuvans
verabreicht werden. Der Fortschritt der Immunisierung kann durch eine Detektion von
Antikörpertitern in Plasma oder Serum überwacht werden. Ein standardmäßiger ELISA oder
ein anderer Immunoassay kann verwendet werden; und zwar mit dem Immunogen als
Antigen, um die Antikörperpegel zu bewerten.
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Im Anschluss an die Immunisierung können Antisera erhalten und, falls gewünscht,
polyklonale Antikörper aus den Sera isoliert werden. Um monoklonale Antikörper zu
erzeugen, können antikörpererzeugende Zellen (Lymphozyten) von einem immunisierten
Tier geerntet und durch standardmäßige Somazellfusionsverfahren mit Myelomzellen
verschmolzen werden, wobei auf diese Weise diese Zellen unsterblich gemacht werden und
sich Hybridomzellen ergeben. Solche Verfahren sind in der Fachwelt wohlbekannt,
beispielsweise das ursprünglich von Kohler und Milstein entwickelte Hybridom-Verfahren
(Nature (1975), 256: 495-497) sowie andere Verfahren wie z. B. das menschliche B-Zellen-
Hybridom-Verfahren (Kozbar et al.; Immunol. Today (1983), 4: 72), das EBV-Hybridom-
Verfahren, um menschliche monoklonale Antikörper zu erzeugen (Cole et al., Monoclonal
Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Bliss, Inc., Seite 77-96)), und das Screening
kombinatorischer Antikörper-Bibliotheken (Huse et al., Science (1989), 246: 1275).
Hybridomzellen können immunchemisch auf die Erzeugung von Antikörpern hin gescreent
werden, die mit dem Protein oder Peptid und den isolierten monoklonalen Antikörpern
spezifisch reaktionsfähig sind.
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Der Terminus "Antikörper" soll, so wie er in dieser Beschreibung verwendet wird,
Fragmente davon einschließen, die mit einem gp39-Protein oder einem Peptid davon oder
einem gp39-Fusionsprotein spezifisch reaktionsfähig sind. Antikörper können unter Einsatz
herkömmlicher Verfahren fragmentiert werden, und die Fragmente können auf Nützlichkeit
hin gescreent werden; und zwar auf die gleiche Weise wie oben für ganze Antikörper
beschrieben. F(ab')&sub2;-Fragmente zum Beispiel können durch Behandeln des Antikörpers mit
Pepsin erzeugt werden. Das sich ergebende F(ab')&sub2;-Fragment kann behandelt werden, um
Disulfidbrücken zu reduzieren, um Fab'-Fragmente zu erzeugen: Der Antikörper nach der
vorliegenden Erfindung soll ferner bispezifische und chimärische Moleküle mit einem
Antigp39-Anteil einschließen.
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Wenn in nicht-menschlichen Subjekten erzeugte Antikörper bei Menschen
therapeutisch verwendet werden, werden sie bis zu verschiedenen Graden als fremd erkannt,
und eine Immunantwort kann beim Patienten hervorgerufen werden. Ein Ansatz zum
Minimieren oder Beseitigen dieses Problems, der einer generellen Immunsuppression
vorzuziehen ist, besteht darin, chimärische Antikörper-Derivate zu erzeugen, d. h.
Antikörper-Moleküle, die eine nicht-menschliche tierische variable Region und eine
menschliche konstante Region kombinieren. Chimärische Antikörper-Moleküle können
beispielsweise die Antigen-Bindungsdomäne aus einem Antikörper einer Maus, einer Ratte
oder einer anderen Spezies einschließen, und zwar mit menschlichen konstanten Regionen.
Eine Vielzahl an Ansätzen zum Herstellen chimärischer Antikörper ist beschrieben worden
und kann dazu herangezogen werden; chimärische Antikörper herzustellen, die die gp39
erkennende Immunglobulin-variable Region enthalten. Siehe zum Beispiel Morrison et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81: 6851 (1985), Takeda et al., Nature, 314: 452 (1985),
Cabilly et al., US-Patent Nr. 4,816,567, Boss et al., US-Patent Nr. 4,816,397, Tanaguchi et
al., europäische Patentveröffentlichung EP 171496, europäische Patentveröffentlichung
0173494, Patent im Vereinigten Königreich GB 2177096B. Es wird erwartet, dass solche
chimärische Antikörper in einem menschlichen Subjekt weniger immunogen als der
entsprechende nicht-chimärische Antikörpersein würden.
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Zu therapeutischen Zwecken beim Menschen können die mit einem gp39-Protein
oder -peptid spezifisch reaktionsfähigen monoklonalen oder chimärischen Antikörper durch
Erzeugen von Chimären menschlicher variabler Regionen weiter humanisiert werden, bei
denen Teile der variablen Regionen, insbesondere die erhaltenen Gerüstregionen der
Antigen-Bindungsdomäne, menschlichen Ursprungs sind und lediglich die hypervariablen
Regionen nicht-menschlichen Ursprungs sind. Solche veränderte Immunglobulin-Moleküle
können durch jedes von mehreren in der Fachwelt bekannten Verfahren hergestellt werden
(z. B. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 80: 7308-7312 (1983), Kozbor et al.,
Immunology Today, 4: 7279 (1983), Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16 (1982)) und
werden vorzugsweise gemäß den Lehren der PCT-Veröffentlichung WO92/06193 oder der
EP 0239400 hergestellt. Humanisierte Antikörper können beispielsweise von Scotgen
Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex; Großbritannien, kommerziell erzeugt
werden.
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Eine andere Methode zum Erzeugen von spezifischen Antikörpern oder
Antikörperfragmenten, die gegenüber einem gp39-Protein oder -peptid reaktionsfähig sind,
besteht darin, Expressionsbibliotheken zu screenen, die Immunglobulin-Gene oder Teile
davon kodieren, und zwar exprimiert in Bakterien mit einem gp39-Protein oder -peptid.
Beispielsweise können unter Verwendung von Phagen-Expressionsbibliotheken vollständige
Fab-Fragmente, VH-Regionen und FV-Regionen in Bakterien exprimiert werden. Siehe zum
Beispiel Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989), Huse et al., Science, 246: 1275-1281
(1989), und McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Durch ein Screening solcher
Bibliotheken mit beispielsweise einem gp39-Peptid können mit gp39 reaktionsfähige
Immunglobulin-Fragmente identifiziert werden. Alternativ dazu kann die SCID-hu-Maus
(erhältlich von Genpharm) dazu eingesetzt werden, Antikörper oder Fragmente davon zu
erzeugen.
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Methodologien zum Erzeugen gegen gp39 gerichteter monoklonaler Antikörper,
einschließlich menschlichem gp39 und Maus-gp39, sowie geeigneter monoklonaler
Antikörper zur Verwendung im Rahmen der erfindungsgemäßen Methoden sind in der PCT-
Patentanmeldung Nr. WO 95/06666 mit dem Titel "Anti-gp39 Antibodies and Uses
Therefor" beschrieben. Besonders bevorzugte anti-menschliche gp39-Antikörper nach der
Erfindung sind mAbs 24-31 und 89-76, jeweils von den Hybridomen 24-31 und 89-76
erzeugt. Die Hybridome 89-76 und 24-31, die jeweils die Antikörper 89-76 und 24-31
erzeugen, würden am 2. September 1994 unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags
bei der American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., in Verwahrung
gegeben. Dem 89-76-Hybridom wurde die ATCC-Akzessionsnummer HB 11713 und dem
24-31-Hybridom die ATCC-Akzessionsnummer HB11712 gegeben.
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Rekombinante Anti-gp39-Antikörper, wie z. B. chimärische und humanisierte
Antikörper, können durch Manipulieren von Nucleinsäure (z. B. DNA), die einen Anti-gp39-
Antikörper kodiert, erzeugt werden, und zwar nach standardmäßigen rekombinante DNA-
Verfahren. Demgemäß betrifft ein anderer Gesichtspunkt dieser Erfindung isolierte
Nucleinsäuremoleküle, die Immunglobulin-schwere oder -leichte Ketten oder Teile davon
kodieren, wobei sie mit gp39, insbesondere menschlichem gp39, reaktionsfähig sind. Die
Immunglobulin-kodierende Nucleinsäure kann eine variable Region Immunglobulin-leichter
oder -schwerer Ketten kodieren, und zwar mit oder ohne eine konstante Region gebundener
schwerer oder leichter Ketten (oder einen Teil davon). Eine solche Nucleinsäure kann aus
einer ein anti-menschliches gp39 mAb erzeugenden Zelle (z. B. einem Hybridom) durch
standardmäßige Verfahren isoliert werden. Beispielsweise kann eine Nucleinsäure, die das
24-31- oder das 89-76-mAb kodiert, jeweils aus dem 24-31- oder dem 89-76-Hybridom
isoliert werden, und zwar durch cDNA-Bibliotheksscreening, PCR-Amplifikation oder ein
anderes standardmäßiges Verfahren. Im Anschluss an eine Isolation und eine mögliche
weitere Manipulation von ein anti-menschliches gp39 mAb kodierender Nucleinsäure kann
ein Einbau in einen Expressionsvektor und ein Einbringen in eine Wirtszelle erfolgen, um
die Expression und die Erzeugung rekombinanter Formen anti-menschlicher gp39-
Antikörper zu erleichtern.
B. Lösliche Liganden für gp39
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Andere gp39-Antagonisten, die eingesetzt werden können, um eine T-Zellen-
Toleranz herbeizuführen, sind lösliche Formen eines gp39-Liganden. Ein monovalenter
löslicher Ligand von gp39, wie z. B. lösliches CD40; kann gp39 binden, wodurch die
Wechselwirkung von gp39 mit CD40 auf B-Zellen gehemmt wird. Der Terminus "löslich"
gibt an, dass der Ligand nicht dauerhaft mit einer Zellmembran in Verbindung steht. Ein
löslicher gp39-Ligand kann durch Chemosynthese oder vorzugsweise durch rekombinante
DNA-Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch ein Exprimieren lediglich der
extrazellulären Domäne (bei Fehlen der Transmembran- und der cytoplasmatischen
Domäne) des Liganden. Ein bevorzugter löslicher gp39-Ligand ist lösliches CD40.
Alternativ dazu kann ein löslicher gp39-Ligand in Form eines Fusionsproteins vorliegen. Ein
solches Fusionsprotein umfasst zumindest einen Teil des gp39-Liganden, und zwar an ein
zweites Molekül angeheftet. CD40 zum Beispiel kann als Fusionsprotein mit Immunglobulin
exprimiert werden (d. h. ein CD40Ig-Fusionsprotein). Bei einer Ausführungsform wird ein
Fusionsprotein erzeugt, das Aminosäurereste eines Teils der extrazellulären Domäne des
CD40-Moleküls umfasst, die verbunden sind mit Aminosäureresten einer dem Gelenk
entsprechenden Sequenz, sowie CH2- und CH3-Regionen einer Immunglobulin-schweren
Kette, z. B. Cγl, um ein CD40Ig-Fusionsprotein zu bilden (siehe z. B. Linsley et al. (1991), J.
Exp. Med., 1783: 721-730, Capon et al. (1989), Nature, 337: 525-531, und Capon, US
5,116,964). Das Fusionsprotein kann durch Chemosynthese oder vorzugsweise durch
rekombinante DNA-Verfahren auf der Grundlage der cDNA von CD40 erzeugt werden
(Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 1403-1410 (1989)).
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Ein erfindungsgemäßer Antagonist wird Subjekten in einer biologisch kompatiblen
Form verabreicht, die für eine pharmazeutische Verabreichung in vivo geeignet ist. Unter
"biologisch kompatible Form, die für eine Verabreichung in vivo geeignet ist" wird eine
Form des zu verabreichenden Antagonisten verstanden, bei der die therapeutischen
Wirkungen des Proteins gegenüber allfälligen toxischen Wirkungen überwiegen. Ein gp39-
Antagonist kann in jeder pharmakologischen Form verabreicht werden, gegebenenfalls in
einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Verabreichung einer therapeutisch aktiven
Menge des Antagonisten ist definiert als Menge, die bei notwendigen Dosierungen und
während erforderlicher Zeiträume zum Erzielen des gewünschten Ergebnisses wirksam ist.
Beispielsweise kann eine therapeutisch aktive Menge eines Antagonisten von gp39 je nach
Faktoren wie z. B. dem Krankheitsstadium, dem Alter, dem Geschlecht und dem Gewicht des
Individuums sowie der Tauglichkeit des Antagonisten zum Auslösen einer gewünschten
Antwort im Individuum unterschiedlich sein. Dosierungsschemata können abgestimmt
werden, tun die optimale therapeutische Antwort zu geben. Zum Beispiel können täglich
mehrere geteilte Dosen verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional vermindert
werden, und zwar wie von den Erfordernissen der therapeutischen Situation angezeigt.
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Die aktive Verbindung (z. B. der Antagonist) kann auf eine zweckgerechte Art und
Weise verabreicht werden, wie z. B. durch Injektion (subcutan, intravenös usw.), orale
Verabreichung, Inhalation, percutane Anwendung oder rektale Verabreichung. Je nach
Verabreichungsweg kann die aktive Verbindung in ein Material eingehüllt sein, um die
Verbindung vor der Einwirkung von Enzymen, Säuren und anderen natürlichen
Bedingungen zu schützen, die die Verbindung deaktivieren können. Ein bevorzugter
Verabreichungsweg ist jener durch intravenöse Injektion.
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Um einen Antagonisten von gp39 durch eine andere als die parenterale
Verabreichung zu verabreichen, kann es erforderlich sein, den Antagonisten mit einem
Material einzuhüllen oder den Antagonisten zusammen mit einem Material zu verabreichen,
um seine Deaktivierung zu verhindern. Beispielsweise kann ein Antagonist einem
Individuum in einem zweckmäßigen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht werden,
und zwar zusammen mit Enzym-Inhibitoren oder in einem zweckmäßigen Träger, wie z. B.
Liposome, verabreicht. Pharmazeutisch akzeptable Verdünnungsmittel schließen
physiologische Kochsalzlösung und wässerige Pufferlösungen ein. Enzym-Inhibitoren
schließen Bauchspeicheldrüsentrypsin-Inhibitor, Diisopropylfluorophosphat (DEP) und
Trasylol ein. Liposome schließen Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen sowie herkömmliche
Liposome ein (Strejan et al. (1984), J. Neuroimmunol., 7: 27).
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Die aktive Verbindung kann auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden.
Dispersionen können auch in Glycerol, flüssigen Polyethylenglycolen und Mischungen
davon sowie in Ölen hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Lager- und
Einsatzbedingungen können diese Präparate ein Konservierungsmittel enthalten, um das
Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
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Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für eine Verwendung durch Injektion
geeignet sind, schließen keimfreie wässerige Lösungen (wo wasserlöslich) oder
Dispersionen und keimfreie Pulver zur Herstellung aus dem Stegreif keimfreier injizierbarer
Lösungen oder Dispersionen ein. In allen Fällen muss die Zusammensetzung keimfrei und in
dem Maße flüssig sein, dass eine leichte Verwendbarkeit mit einer Spritze gegeben ist. Sie
muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil und gegen die verunreinigende
Einwirkung von Mikroorganismen wie z. B. Bakterien und Pilzen geschützt sein. Der Träger
kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser,
Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol
und dergleichen) und geeignete Mischungen davon enthält. Die zweckgerechte Fluidität
kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Überzugs wie z. B. Lecithin, durch die
Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Fall einer Dispersion und durch den
Einsatz grenzflächenaktiver Mittel aufrechterhalten werden. Die Vorbeugung gegen die
Einwirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und Anti-Pilz-
Mittel erreicht werden, zum Beispiel Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Ascorbinsäure,
Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen wird es vorzuziehen sein, isotonische Mittel in
die Zusammensetzung einzuschließen, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole wie z. B. Manitol
Sorbitol, Natriumchlorid. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen
kann bewirkt werden, indem in die Zusammensetzung ein Mittel eingeschlossen wird, das
die Absorption verzögert, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
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Keimfreie injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem die aktive
Verbindung (z. B. ein Antagonist von gp39) in der erforderlichen Menge in ein
zweckmäßiges Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination der oben aufgeführten
Inhaltsstoffe eingebaut wird, und zwar wie es erforderlich ist, gefolgt von einer filtrierten
Sterilisation. Im Allgemeinen werden Dispersionen hergestellt, indem die aktive Verbindung
in ein keimfreies Vehikel eingebaut wird, das ein basisches Dispersionsmedium und die
notwendigen anderen Inhaltsstoffe aus den oben aufgeführten enthält. Im Fall keimfreier
Pulver zur Herstellung keimfreier injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten
Herstellungsmethoden Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, was ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffs
(z. B. des Antagonisten) plus jedes gewünschten zusätzlichen Inhaltsstoffs aus einer zuvor
sterilfiltrierten Lösung davon ergibt.
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Wenn die aktive Verbindung auf geeignete Weise wie oben beschrieben geschützt ist,
kann das Protein oral verabreicht werden, zum Beispiel mit einem inerten
Verdünnungsmittel oder einem assimilierbaren genießbaren Träger. "Pharmazeutisch
akzeptabler Träger" schließt, so wie der Terminus in dieser Beschreibung verwendet wird,
jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und Anti-Pilz-
Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen ein. Der Einsatz
solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Fachwelt
wohlbekannt. Außer in dem Maße, als jedwedes herkömmliche Medium oder Mittel mit der
aktiven Verbindung inkompatibel ist, wird die Verwendung davon in den therapeutischen
Zusammensetzungen ins Auge gefasst. Zusätzliche aktive Verbindungen können ebenfalls in
die Zusammensetzungen eingebaut werden.
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Es ist besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Dosiseinheitsform zu
formulieren, und zwar zugunsten einer leichten Verabreichung und einer einheitlichen
Dosierung. So wie in dieser Beschreibung verwendet bezieht sich "Dosiseinheitsform" auf
physisch diskrete Einheiten, die sich als Einheitsdosen für die zu behandelnden
menschlichen Subjekte eignen; jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge der aktiven
Verbindung, von der berechnet wurde, dass sie in Verbindung mit dem notwendigen
pharmazeutischen Träger die gewünschte therapeutische Wirkung erzeugt. Die
Spezifikationen für die Dosiseinheitsformen nach der Erfindung werden bestimmt und sind
direkt abhängig von (a) den einmaligen Kennzeichen der aktiven Verbindung und der
besonderen zu erzielenden therapeutischen Wirkung und (b) den dem Gebiet des
Zusammensetzens einer solchen aktiven Verbindung zur Behandlung einer Empfindlichkeit
bei Individuen inhärenten Beschränkungen.
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Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele, die nicht als einschränkend
gedeutet werden sollten, weiter veranschaulicht.
BEISPIEL 1: EAE-Vorbeugung durch Anti-gp39-Antikörper-Verabreichung
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Dieses Beispiel zeigt auf, dass die Verabreichung von Anti-gp39-Antikörpern an
Mäuse die Auslösung experimenteller allergischer Enzephalomyelitis (EAE), einem
tierischen Modell für multiple Sklerose, verhindert.
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EAE ist ein gut gekennzeichnetes Modell für eine T-Zellen-vermittelte
Autoimmunkrankheit und ein lehrreiches Modell für die menschliche Autoimmunkrankheit
multiple Sklerose. EAE kann bei anfälligen Tieren, wie z. B. Mäusen, herbeigeführt werden,
indem man die Tiere mit Myelin-Grundprotein (MBP), Proteolipidprotein (PLP), Myelin-
Oligodendrozytenprotein (MOG) oder synthetischen Peptiden auf der Basis der Sequenzen
dieser Myelin-assoziierten Proteine immunisiert, und zwar gemeinsam mit einem
Pertussisbakterien enthaltenden Adjuvans. Ein bis zwei Wochen nach der Immunisierung
entwickeln die Tiere Enzephalomyelitis, gekennzeichnet durch perivaskuläre, Lymphozyten
und Makrophagen enthaltende Infiltrate und die Entwicklung einer Entmarkung im Gehirn
und im Rückenmark. Die Tiere zeigen eine akute, eine chronische oder eine chronische
rezidivierende Lähmung. Im Rahmen dieses Beispiels wurde die Wirkung einer
Verabreichung von Anti-gp39-Antikörpern auf die Entwicklung von EAE bei anfälligen
Mäusen analysiert.
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EAE wurde bei anfälligen Mäusen ausgelöst durch subcutane Injektionen (Tag 0)
einer Emulsion, die 70 ug oder 300 ug PLP-Peptid in 50 ul PBS und 25 ug Mycobacteria
tuberculosis (H37RA, Difco) in 50 ul vollständigem Freuds-Adjuvans enthielt, an zwei
Stellen an den Bauchflanken der Mäuse. 200 ul Bordetella pertussis-Suspension (10.10¹&sup0; in
1 ml PBS) wurden zur gleichen Zeit wie das Peptid sowie zwei Tage später intravenös
gegeben. Das den Mäusen injizierte PLP-Peptid weist eine Aminosäuresequenz auf, die den
Aminosäureresten 139 bis 151 von Ratten-PLP entspricht (Dautigny et al., FEBSLett., 188:
33, 1985). PLP-Peptid wurde mit f-moc-geschützten Aminosäuren nach der Festphasen-
Synthesemethode synthetisiert (Merrif eld, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149, 1963). Die
Immunisierung mit diesem Peptid führt zur Entwicklung akuter EAE, die klinisch und
pathologisch ident mit der durch Sensibilisierung mit Myelin des gesamten
Zentralnervensystems (CNS) oder mit MBP ausgelösten ist (Tuohy et al., J. Immunol.; 142:
1523, 1989; Sobel et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 49: 468, 1990).
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Um die Wirkung von anti-gp39 auf den Verlauf der Krankheit zu bestimmen, wurden
Mäusen am Tag 0 PLP-Peptid wie oben beschrieben und ferner an den Tagen 0, 2 und 4 125
ug Hamster-anti-gp39 Mabs (Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6550, 1992) in
200 ul PBS oder 125 ug normale Hamsterantikörper (Serva Feinbiochemica) in 200 ul PBS
(Kontrolltiere) intraperitoneal injiziert. Die Schwere der EAE-klinischen Symptome wurde
jeden Tag beurteilt und gemäß den Ergebniswerten auf der Skala der durchschnittlichen
Beeinträchtigung (DAS) eingestuft: Stufe 0 = keine klinischen Symptome, Stufe 1 =
Schwanzschwäche, Stufe = leichte Paraparese und Ataxie der Hinterbeine, Stufe 3 =
schwere Paraparese oder Ataxie der Hinterbeine, Stufe 4 = sterbend, Stufe 5 tot infolge
von EAE.
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Die Fig. 1 stellt den Verlauf der Krankheit bei Mäusen dar, denen 70 ug PLP-Peptid
(Tafel A) oder 300 ug PLP-Peptid (Tafel B) injiziert und die mit anti-gp39 oder einem
Kontrollantikörper behandelt wurden. Die DAS-Ergebniswerte, die die Schwere der
Krankheit widerspiegeln, von Kontrollmäusen und anti-gp39-behandelten Mäusen sind
jeweils in grauen und schwarzen Balken dargestellt.
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Die Ergebnisse zeigen an, dass Tiere, die den Kontrollantikörper erhalten hatten,
EAE entwickelten, wohingegen Tiere, die den Anti-gp39-Antikörper erhalten hatten, vor
einer Auslösung der Krankheit geschützt waren. Bei Tieren, die den Kontrollantikörper
erhalten hatten, wurden die ersten klinischen Symptome von EAE am Tag elf ersichtlich. Bei
diesen Tieren war der höchste DAS-Ergebniswert 2,33, beobachtet an den Tagen 15-22 bei
Tieren, denen 75 ug PLP-Peptid injiziert worden waren (Fig. 1, Tafel A, graue Balken), und
3,6, beobachtet an den Tagen 16-23 bei Tieren, denen 300 ug PLP-Peptid injiziert worden
waren (Fig. 1, Tafel B, graue Balken). Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, die die anti-gp39-
monoklonalen Antikörper erhalten hatten, keine klinischen Symptome nach einer Auslösung
von EAE mit 75 ug PLP-Peptid (Fig. 1, Tafel A, schwarze Balken) und lediglich
geringfügige klinische Symptome, die am Tag 31 vollständig verschwanden, nach einer
Auslösung der Krankheit mit 300 ug PLP-Peptid (Fig. 1, Tafel B, schwarze Balken).
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Somit hemmte die Verabreichung von Anti-gp39-Antikörpern an Mäuse die
Auslösung von EAE bei diesen Mäusen zur Gänze.
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Die Auslösung von EAE durch passive Immunisierung Myelin-reaktiver T-Zellen,
die aus mit Myelinbestandteilen immunisierten Tieren isoliert oder nach einer in vitro-
Aktivierung mit Myelinbestandteilen erhalten wurden, zeigt an, dass insbesondere aktivierte
T-Zellen für die Entwicklung klinischer Kennzeichen nach der Auslösephase verantwortlich
sind (Pettinelli und McFarlin, J. Immunor, 127: 1420, 1979; Mokhtarion et al., Nature, 309:
356, 1984, Veen et al, J. Neuroimmunol., 21: 183, 1989). Die in dieser Beschreibung
beschriebenen Versuche zeigen indes; dass eine Verabreichung von anti-gp39-monoklonalen
Antikörpern die Entwicklung von EAE verhindert. Bei Kontrollgruppen wurden bedeutsame
Anti-PLP-Peptid-Antikörper-Antworten am Tag 14 (Absorptionsmaß 1,92) und am Tag 21
(Absorptionsmaß 2,15) beobachtet, und zwar bei Tieren, bei denen EAE mit jeweils einer
niedrigen und einer hohen PLP-Peptid-Dosis herbeigeführt worden war. Im Gegensatz dazu
wurden bedeutsame Anti-PLP-Peptid-Antikörper-Antworten bei den gp39-behandelten
Tieren erstmalig am Tag 14 beobachtet und erreichten Plateauhöhen am Tag 31
(Absorptionsmaß 0,928) und am Tag 40 (Absorptionsmaß 1,54) bei Tieren, denen jeweils
eine niedrige und eine hohe PLP-Peptid-Dosis injiziert worden war. Die Erzeugung
bedeutsamer Anti-PLP-Peptid-Antikörper-Antworten bei mit anti-gp39-monoklonalen
Antikörpern behandelten Mäusen wurde bis zum Tag 14 verzögert, was anzeigt, dass die
anti-gp39-monoklonalen Antikörper eine gewisse Wirkung auf die Antikörpererzeugung
hatten.
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Somit zeigt dieses Beispiel auf, dass anti-gp39 die Entwicklung von EAE verhindern
und anzeigen, dass Anti-gp39-Antikörper zum Behandeln multipler Sklerose eingesetzt
werden können.
BEISPIEL 2: Umkehr von EAE durch Anti-gp39-Antikörper-Verabreichung
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Das Beispiel 1 zeigte die hemmende Wirkung eines Anti-gp39-Antikörpers auf die
Auslösung von EAE. Somit wurde aufgezeigt, dass eine Immunisierung der Mäuse zum
Zeitpunkt der Auslösung der Krankheit die Entwicklung der Krankheit verhindert. Dieses
Beispiel zeigt, dass die Verabreichung des Antikörpers nach der Auslösung der Krankheit zu
einem Nachlassen der Krankheit führt.
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Bei diesem Beispiel wurde EAE bei weiblichen SJL/j-Mäusen (10-12 Wochen alt)
herbeigeführt, indem eine Emulsion injiziert wurde, die 150 ug wie oben beschrieben
hergestelltes PLP-Peptid enthielt. Um die Wirkung der Anti-gp39-Antikörper zu bestimmen,
wenn sie den Mäusen nach der Auslösung der Krankheit verabreicht werden, wurden
Mäusen 125 ug anti-gp39-monoklonale Antikörper (Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89: 6550, 1992) in 200 ul PBS (anti-gp39-behandelte Mäuse) oder 200 ul PBS allein
(Kontrollmäuse) intraperitoneal injiziert, und zwar an den Tagen 0, 2 und 4, an den Tagen 4,
6 und 8 oder an den Tagen 7, 9 und 11. Die Ergebnisse sind als prozentuale Unterdrückung
dargestellt und sind ein Vergleich der Gesamtheit an täglichen DAS-Ergebniswerten (vom
Tag 12 bis zum Tag 28) bei anti-gp39-behandelten Tieren und bei Kontrolltieren.
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Die Ergebnisse, die in der Fig. 2 dargestellt sind, zeigen an, dass eine
Verabreichung der ersten Dosis Anti-gp39-Antikörper erst 7 Tage nach der Injizierung von
PLP-Peptid in die Mäuse zu einer mehr als 60%igen Unterdrückung der Krankheit führt.
Somit sind Anti-gp39-Antikörper fähig, EAE umzukehren oder zu unterdrücken.
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Die Ergebnisse zeigen ferner an, dass eine Anti-gp39-Behandlung etwas wirksamer
ist, wenn nach der Auslösung der Krankheit die erste Dosis Antikörper früher verabreicht
wird, selbst wenn eine Verabreichung einer ersten Dosis Antikörper erst 7 Tage nach der
Auslösung der Krankheit bei Mäusen zu einer wesentlichen Unterdrückung der
Krankheitsentwicklung führt.
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Somit schützt die Verabreichung von Anti-gp39-Antikörpern an Mäuse diese Mäuse
davor, auf die Auslösung der Krankheit hin EAE zu entwickeln, und unterdrückt die
Krankheit bei Mäusen mit EAE.
BEISPIEL 3: Unterdrückung von EAE nach Milzzellenübertragung gp39-
behandelter Mäuse
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Regulator-Suppressor-T-Zellen sind bei Lewis-Ratten detektiert worden, die sich von
EAE (Pesoa et al., J. Neuroimmunol., 7: 131, 1984) und nach einer oralen Verabreichung
von Myelinbestandteilen (Lider et al.; J. Immunol., 142: 748, 1989, Hafler et al., Ann. NY
Acad. Sci:, 636: 251; 1991) erholt hatten. Es wurde von Karpus und Swanborg (J. Immunol.,
143: 3492, 1989) postuliert, dass aus Ratten, die sich von EAE erholt hatten, isolierte CD4+-
Suppressor-T-Zellen EAE-T-Effektorzellen durch eine differenzielle Hemmung der
Lymphokinerzeugung nach unten regulieren können. Im Gegensatz dazu wird eine
Unterdrückung von EAE bei Lewis-Ratten durch eine orale Verabreichung von MBP von
CD8+-T-Zellen vermittelt (Miller et al., J. Exp. Med., 174: 791, 1991). Um zu bestimmen, ob
T-Zellen von Mäusen, die vor EAE durch die Verabreichung eines Anti-gp39-Antikörpers
geschützt worden sind, fähig sind, naive Tiere vor EAE zu schützen, wurde das
nachstehende Beispiel ausgeführt.
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Im Rahmen dieses Beispiels wurden einer ersten Gruppe von Mäusen 150 ug PLP-
Peptid und einer zweiten Gruppe von Mäusen 150 ug PLP-Peptid und Anti-gp39-Antikörper
injiziert, und zwar gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Protokoll. Vier Monate später
wurden die Mäuse durch CO&sub2; getötet, und die Milz wurde entfernt. Erythrozyten wurden
durch eine standardmäßige Ammoniumchlorid-Behandlung beseitigt (Mishell und Shiigi,
Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, 1980). Zellen
einzelner Milzen (500 ul) wurden i.v. in naive 5 Gy-bestrahlte weibliche SLJ/j-
Empfängermäuse (10-12 Wochen alt) injiziert. Zwei Tage nach der Zellübertragung
wurden die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion mit 150 ug PLP-Peptid nach dem im
Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensgang herausgefordert und die DAS-Ergebniswerte
bestimmt.
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Die Fig. 3 stellt die DAS-Ergebniswerte der Tiere dar. Die Ergebnisse zeigen auf,
dass Mäuse, denen Milzzellen von Tieren eingepflanzt wurden, denen am Anfang PLP-
Peptid und Anti-gp39-Antikörper injiziert worden waren, vor der Entwicklung der Krankheit
geschützt sind, wohingegen Mäuse, denen Milzzellen von Tieren eingepflanzt wurden,
denen am Anfang bloß PLP-Peptid injiziert worden war, EAE entwickeln. Darüberhinaus
kann angesichts des Umstands, dass die geschätzte Halbwertszeit von Antikörpern 12 Tage
beträgt, erwartet werden, dass in den in die Mäuse verpflanzten Milzzellen keine Antikörper
vorhanden waren. Daher kann die von Spendermilzzellen von Tieren, die PLP-Peptid und
Anti-gp39-Antikörper empfangen haben, verliehene Schutzwirkung nicht durch das
Vorhandensein von Anti-gp39-Antikörpern erklärt werden. Die DAS-Ergebniswerte dieser
Mäuse zeigen an, dass die Unterdrückung von EAE bei den Empfängermäusen
höchstwahrscheinlich durch das Vorhandensein einer T-Suppressorzellpopulation in der
übertragenen Milzzellensuspension bedingt ist und dass diese T-Suppressorzellpopulation in
effizienter Weise über die T-Effektorzellpopulation die Oberhand behält.
BEISPIEL 4: Detektion gp39-positiver Th-Zellen
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Dieses Beispiel zeigt das Vorhandensein gp39-positiver Zellen im
Zentralnervensystem menschlicher Subjekte mit multipler Sklerose auf.
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Von Autopsien von Menschen stammende Zentralnervensystem (CNS)-Gewebe
wurden von der niederländischen Gehirnbank, Amsterdam, Niederlande, erhalten. Gp39-
positive Zellen wurden mit einem CD40-Ig-Fusionsprotein gemäß in der Fachwelt bekannten
Methoden detektiert. CNS-Gewebeabschnitte eines MS-Patienten und eines Alzheimer-
Patienten wurden mit CD40-Ig gefärbt. Bei diesem Beispiel wurden nur CNS-Gewebe von
MS-Patienten verwendet, bei denen zuvor Anti-MBP-Antikörper-bildende Zellen detektiert
worden waren. Die Ergebnisse des Färbens zeigen das Vorhandensein gp39-positiver Zellen
in einem kranzförmigen Großhirnabschnitt mit 8 um eines MS-Patienten an, aber es wurden
keine gp39-positiven Zellen in kranzförmigen Großhirnabschnitten von Alzheimer-Patienten
detektiert. Somit wurden gp39-positive Zellen lediglich in CNS-Gewebeabschnitten von
MS-Patienten detektiert. Das Vorhandensein gp39-positiver Zellen in CNS-Gewebe von
MS-Patienten zeigt in Verbindung mit der Detektion von Anti-MBP-Antikörper-bildenden
Zellen lediglich in CNS-Geweben von MS-Patienten und nicht in Kontroll-CNS-Geweben
an, dass solche Zellen eine Rolle in den pathologischen betroffenen CNS-Geweben von MS-
Patienten spielen.
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Bei dieser Untersuchung haben wir gezeigt, dass die Unterdrückung der B-Zellen-
Aktivierung durch die Verabreichung von anti-gp39 Mabs zur vollständigen Verhinderung
der EAE-Entwicklung führen kann, und zwar in Abhängigkeit der Antigendosis, durch die
EAE ausgelöst wurde, und des Zeitraums zwischen der EAE-Auslösung und der
Verabreichung von anti-gp39 Mabs. Wenngleich die genauen Mechanismen, die für die
EAE-Auslösung und die Entwicklung verantwortlich sind, nicht geklärt sind, zeigen diese
Daten an; dass ein Anti-gp39-Antikörper zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten
verwendet werden kann.